Resumen

 DNA total

 DNA de plasmidio

 DNA de fagos
 Aislamiento de DNA de bacteria
 Las bacterias se cultivan en medio favorable a
temperatura óptima

 Se lisan las células y se libera el contenido

 Tratamiento del extracto celular para remover todos los

componentes excepto el DNA

 Se concentra la solución de DNA

DNA Purification > Total Cell
 Crecimiento de la bacteria
 Crecimiento de medio líquido
 Medio definido
 Medio complejo

 Crecimiento en medio sólido

 Monitoreo del crecimiento

Growth can be monitored by optical density

 Monitoreo del crecimiento

Growth can be monitored by optical density

Separación de células
 Colecta de células
 Centrifugación
 Monitoreo del crecimiento
 Preparación del extracto celular
 Las células deben lisarse para liberar el DNA

 Métodos Físicos
 Fuerza mecánica es aplicada para romper la pared y la
membrana
 Mortero, sonicación

 Métodos Químicos
 Ataque químico a la pared y membrana celular
 Pared- lisozima, EDTA o ambos
 Membrana- detergente (SDS)
Lisis celular
 Rompimiento de la pared
 La lisozima digiere los polisacáridos, componentes
estructurales de la pared

 EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de

magnesio esenciales en preservar la estructura de la célula
e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA
 Rompimiento de la
membrana
SDS es un
detergente que
remueve las
moléculas de
lípidos
DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell
DNA Purification > Total Cell

Centrifuge removes insoluble cell debris

 Purificación del DNA
 Además del DNA, todavía se encuentran una gran
cantidad de proteínas y de RNA

 La remoción de éstas es importante para evitar

interferencia en el análisis
Remoción de proteínas y RNA
 Extracción orgánica
 Adición de fenol ó fenol/cloroformo
 Se precipitan las proteínas; formación de una capa blanca en
la interfase entre la capa orgánica y la acuosa
 Se remueve la solución acuosa
DNA Purification > Total Cell > Purification

Organic Extraction
 Extracción orgánica
 ¿Qué tal si hay un exceso de proteínas?
 Se repiten las extracciones con fenol
 No favorable; destrucción del DNA con el movimiento
 Rompimiento con proteasa antes de la extracción
 Pronasa o proteinasa K
 Extracción orgánica
 Parte del mRNA es removido con el tratamiento a fenol.

 El remanente del RNA puede ser digerido con

ribonucleasas (si es necesario).
DNA Purification > Total Cell

Concentration of DNA
 Extracción por Silica
 Guanidium thiocyanate
 Desnaturaliza el material que no es DNA
 Hace que el DNA se enlace a las partículas de silica

 Se añade silica directamente o la muestra se pasa por una

columna de silica

 Remoción de DNA al añadir agua

DNA Purification > Total Cell > Purification

Purificación de DNA con

partículas de silica
 Extracción de DNA de otros tipos
de células
 Células vegetales: alto contenido de carbohidratos
 Lisozima no tienen efecto
 Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une a los ácidos
nucléicos y los precipita
 Se centrifuga y se remueve el sobrenadante

 Células animales: no tienen pared, lisan con SDS

DNA Purification > Total Cell

Purification of Plant DNA

 DNA de plasmidio
 Se crece la bacteria y se colecta

 Se rompen las células y se libera el contenido

 Se trata el extracto celular para remover todos los

componentes excepto el DNA de plasmidio

 Se concentra la solución de DNA

 DNA de plasmidio
 Separación basada en diferencias entre el plasmidio y el
DNA bacterial
 tamaño- plasmidios son mucho más pequeños
 Separación por tamaño
 En orden de maximar las diferencias, rompimiento
mínimo del DNA bacterial

 Cuando el rompimiento es mínimo, el DNA formará parte

del debris celular

 Rompimiento mínimo se logra utilizando técnicas de

rompimiento suave
 Rompimiento suave de la célula
 Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa
evita el rompimiento inmediato

 Al formar esferoplastos, la célula puede lizarse con la

adición de detergentes no-íonicos
DNA Purification > Plasmid DNA
 Separación basado en
conformación
 Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños
plasmidios circulares
 Separación basada en
conformación
 Rango de pH más estrecho cuando el DNA
¨superenrrollado¨es desnaturalizado y el DNA regular no.

 Se usa un lisado claro

 Al añadir base; DNA regular es desnaturalizado
 Al añadir ácido; DNA regular es una masa ¨enredada¨
 El DNA ¨enredado¨es ¨pellet¨
DNA Purification > Plasmid DNA
 Separación basado en
conformación
 DNA ¨superenrrollado¨
también puede ser
separado del DNA
regular utilizando
bromuro de etidio en
asociación con un
gradiente de densidad
con cloruro de cesio
(CsCl)
 Separación basado en
conformación
 Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero sólo en
cantidad limitada a DNA ¨superenrrollado¨

 Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de

DNA ¨normal¨
DNA Purification > Plasmid DNA
DNA Purification > Plasmid DNA
 DNA de fagos
 El DNA de fagos puede estar fuera de la célula; no hay que
comenzar con un extracto celular

 Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el

fago en suspensión

 La dificultad es obtener una concentración grande de

fagos por ml de cultivo
 Para obtener títulos altos
 El fago debe estar en fase lítica

 Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el

ciclo de crecimiento
 Purificación de DNA fagos
 Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno
(PEG)

 Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver.

 Purificar por gradiente de densidad de CsCl.

www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web
S572,FL06,MPurifyDNA.pdf