CLONACION MOLECULAR

Tema 7.4
Presenta: Maritza Payan Parra
197446
RESULTADOS DE APRENDIZAJE

 Comprende y explica los elementos y

fundamentos de la clonación molecular.
 Explica los procedimientos básicos
para la clonación molecular.
 Conocer y discutir aplicaciones de la
clonación molecular en diferentes
campos y actividades humanas.
 ERRORES FRECUENTES

 Confundir la acción de las enzimas

que participan en la clonación.

 No comprender el procedimiento de la
clonación molecular.
 CLONACION DEL DNA
 Comporta la separación de un gen
especifico o de un fragmento de DNA
de un cromosoma mucho mayor y su
unión a una pequeña molécula de
DNA portador, para después replicar
este DNA modificado miles o millones
de veces, mediante el aumento del
numero de células y la creación de
múltiples copias del DNA clonado en
cada célula.
 ELEMENTOS

 Segmento de DNA
 Vector
- Plasmido
- Porción del genoma de un virus
bacteriano (l)
 Célula
 Enzimas
 ENZIMAS UTILIZADAS EN LA
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
ENZIMA
Endonucleasas de restricción tipo II
DNA ligasa
DNA polimerasa I (E. coli)
Transcriptasa inversa
Polinucleotido quinasa
Transferasa terminal
Exonucleasa III
Exonucleasa del bacteriófago l
Fosfatasa alcalina
FUNCION
Cortan el DNA en secuencias especificas
Une dos moléculas o fragmentos de DNA
Rellena los huecos en el DNA duplex por adición
secuencial de nucleótidos en los extremos 3`
Hace una copia del DNA a partir de una molécula de
RNA
Añade un grupo fosfato al grupo OH del extremo
5`de un polinucleótido para marcarlo o para permitir
su ligación
Añade colas homopolimericas al grupo OH del
extremo 3`de un duplex lineal
Elimina nucleótidos de los extremos 5`de una hebra
de DNA
Elimina nucleótidos de los extremos 5`de un duplex
para exponer los extremos 3`monohebra
Elimina fosfatos terminales tanto del extremo 5`como
del 3`(o de ambos)
 TIPOS DE
ENDONUCLEASAS
- Las del tipo I cortan el DNA al azar.*
- Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de
la secuencia de reconocimiento.*
- Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el
DNA en la misma secuencia de
reconocimiento.
* Se mueven a lo largo del DNA mediante un
mecanismo que requiere ATP
 ESQUEMA BASICO
Vector + Fragmento de DNA

DNA Recombinante

Replicación del DNA recombinante dentro de

las células huésped

Aislamiento, secuenciación y manipulación del

fragmento de DNA purificado
CLONACION EN E. coli
 E. coli fue el primer organismo utilizado y
todavía es la célula huésped mas común.
 Tiene muchas ventajas:
- Se conoce bien el metabolismo de su DNA.
- Muchos vectores de clonación que se
encuentran asociados de manera natural,
están bien caracterizados
- Se dispone de técnicas efectivas para la
transferencia de DNA de una bacteria a
otra.
 INTERACCION DE LA ENDONUCLEASA
DE RESTRICCION EcoRV CON SU
SECUENCIA DIANA

 Se muestra la enzima unida a los productos de corte de DNA

en la secuencia reconocida por la endonucleasa.
 La proteína se ha eliminado y el DNA se ha rotado 180. La
enzima crea extremos romos. Átomos de Mg en naranja.
1. Cortar el DNA en lugares
determinados. Las endonucleasas
especificas de secuencia
(endonucleasas de restricción)
hacen las veces de tijeras
moleculares.
2. Selección de una pequeña molécula
de DNA capaz de autoreplicarse.
Vectores de clonación (plásmidos o
DNA vírico).
3. Unión covalente de dos fragmentos
de DNA: La ligasa une el vector de
clonación y el DNA que se desea
clonar.
4. Traslado del DNA del tubo de ensayo
a una célula huésped que
proporcionara la maquinaria
enzimática necesaria para la
replicación.
5. Selección o identificación de las
células huésped que contienen DNA
recombinante.
CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.

 Los
fragmentos
pueden
ligarse a un
plasmido
 CORTE DE MOLECULAS DE DNA
MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION

Un fragmento sintético de
DNA que contenga las
secuencias de
reconocimiento de
varias endonucleasas
de restricción se
puede insertar en un
plásmido tratado
previamente con una
endonucleasa de
restricción
 DISEÑO DEL PLASMIDO
pBR322
1. Posee un origen de replicación,
en el cual las enzimas celulares
inician la replicación (10-20
copias por célula)
2. Contiene dos genes que
confieren resistencia a
antibióticos.
3. Varias secuencias únicas de
reconocimiento para diferentes
endonucleasas suministran los
sitios donde cortar para insertar
las secuencias de DNA foráneo.
4. Su pequeño tamaño facilita su
entrada en la célula y la
manipulación bioquímica del
DNA.
CLONACION E IDENTIFICACION
DE DNA FORANEO EN E. coli
1. pBR322 se corta en el elemento de
resistencia a ampicilina.
2. El DNA foráneo se liga al pBR322
cortado. Si tiene éxito, el elemento
de resistencia a la penicilina es
inactivado.
3. Se transforman las células de E.
coli. Después se cultivan en placas
de agar que contienen tetraciclina
para seleccionar aquellas que han
incorporado el plásmido.
4. Las colonias individuales se
transfieren a posiciones
equivalentes de placas adicionales.
Una placa contiene tetraciclina y la
otra ampicilina.
 Los plasmidos recombinantes se agregan a
un cultivo bacteriano que se trato antes con
iones de calcio.
 Se someten a un breve golpe de calor y las
bacterias se estimulan para que capten el
DNA del medio.
 El plasmido se replica en forma autónoma
en la célula receptora y se pasa a la
progenie durante la división celular.
CLONACION DE DNA EUCARIOTA EN
GENOMAS DE FAGOS
 El DNA digerido se
fracciona por
electroforesis en gel
o centrifugación con
gradiente de
densidad y los
fragmentos de 20 kb
de largo (aprox) se
incorporan
EL FRAGMENTO LAMBDA

1. El DNA se empaca bien en una forma

que es facil de almacenar y extraer.
2. Todo paquete que contenga un DNA
recombinante es capaz de infectar
una celula bacteriana.
3. Una caja Petri puede contener mas
de 100,000 placas diferentes.
 EL CROMOSOMA
ARTIFICIAL BACTERIANO

 Puede aceptar
grandes fragmentos de
DNA (hasta 500 kb)
 Son plasmidos
bacterianos
especializados
 EL CROMOSOMA
ARTIFICIAL DE LEVADURA

 Puede aceptar
segmentos de DNA
de hasta 1000 kb
 Son versiones
artificiales de un
cromosoma
artificial de
levadura
 APLICACIONES
 El 24 de febrero de 1997 el Instituto Roslin, de Escocia, se
anuncia la reproducción con éxito de la oveja "Dolly".
 En julio de 1997 los mismos científicos que habían clonado a
"Dolly" produjeron el cordero "Polly" que porta genes
humanos.
 En noviembre de 2001 la empresa Advanced Cell Technology
(ACT) consiguió clonar el primer embrión humano de la
historia, aunque su desarrollo se detuvo de forma natural
cuando sólo contaba con seis células, mucho antes de
alcanzar la fase de blastocito, necesaria para obtener las
llamadas células madre. El objetivo era el de obtener células
madre para la investigación de terapias génicas.
 En enero 2002, la empresa escocesa PPL Therapeutics
anuncia el nacimiento de unos cerditos, a los que se les pudo
eliminar el gen que causa que el sistema inmunológico del ser
humano rechace transplantes de los órganos del cerdo.
 En enero de 2002, los creadores de la oveja Dolly, anuncian que el
animal sufre artritis, por el envejecimiento prematuro que padece, a
sus cinco años de edad.
 En febrero de 2002 un equipo investigador que había clonado una
docena de ratones informó de que ninguno de ellos logró sobrevivir.
Además un equipo investigador japonés llamó la atención sobre la
mayor frecuencia de abortos, deformidades, sobrepeso y muertes
prematuras entre otros animales que habían sido clonados.
 También en febrero de 2002, la Universidad A&M de Texas presentó
el primer gato clonado del mundo, un cachorro de dos meses de
edad al que llamaron "CC", siglas de "copia al carbón". Según los
científicos "los gatos tienen una forma felina del síndrome de
inmunodeficiencia humana que es un buen modelo para el estudio
del sida humano".
 En noviembre de 2002 el experto italiano en fertilidad Severino
Antinori dice que espera que una paciente dé a luz un bebé clonado
en enero de 2003.
RATONES TRANSGENICOS
 Se muestra un par de
hermanos de la misma
camada de 10 semanas
de edad.
 El mas grande se
desarrollo con un huevo
inyectado con DNA + GH.
 El mas grande pesa 44 gr,
y el pequeño 29 gr.
 El gen GH se transmitió a
los descendientes.
 BIBLIOGRAFIA
 Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE
BIOQUIMICA. 4ª edicion. Edit. Omega. Pags. 306-
317.
 Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA
CELULA. 4ª edicion. Ediciones Omega. Pags. 500-
504.
 Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR.
5ª edicion. Ed. Medica Panamericana. Pags.
 Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4ª
edicion. Edit. Mc Graw Hill. Pags. 822-835
 http://laguna.fmedic.unam.mx/lenpres/CH29.ppt#286
 http://cultura.terra.es/cac/articulo/html/cac1321.htm