Producción de especies reactivas

de oxígeno y sistema de defensa

antioxidativo de la raíz de arveja
tratado con iones de plomo a
nivel mitocondrial y peroximal”

Integrantes: Francisco Ortiz

Valentina Romo
Karen Venegas R
 Introducción
 Se ha demostrado que los metales pesados tales como Cd,
Pb, Cu y Zn causan la generación de las especies
reactivas de oxígeno (ROS) y contribuyen a la aparición
de condiciones de estrés oxidativo en las células
vegetales


 Existen numerosas fuentes potenciales de ROS en las

células vegetales, es decir, los cloroplastos, mitocondrias,
los peroxisomas, la membrana celular, membrana nuclear
y el retículo endoplásmico, y apoplasto.


 El sistema enzimático en plantas se compone de:

superóxido dismutasa (SOD), catalasa
(CAT), ascorbato peroxidasa (APOX), y el sistema no
enzimático consiste en componentes de baja masa
 Objetivos

 Determinar que especies

reactivas de oxígeno y
sistema de defensa
antioxidativo responde
a distintas
concentraciones de
iones de plomo (Pb)
[0.1 mM y 0.5 mM] a
nivel de mitocondria y
peroxisoma en el
tejido de la raíz de
arveja.
 Materiales y métodos
 Materiales y métodos:  Plántulas de arvejas
hidropónicamente . Para plantas tratadas con Pb, la solución
era complementada con los iones de plomo [0,1 ó 0,5 mM de
Pb(NO3)2]. El aislamiento de las mitocondrias de las células
de la raíz del guisante se llevó a a cabo con las raíces de las
plantas frescas cosechadas después de 48 y 72 h de cultivo.
 El aislamiento de las mitocondrias y los peroxisomas 
 Se realizo mediante gradiente de Percoll.
 Determinación de peróxido de hidrógeno
 En las fracciones aisladas de las raíces de arvejas,
mitocondriales, peroxisomales y citosomales, se determinó el
nivel de peróxido de hidrógeno de acuerdo a Becana. 
  Determinación de la actividad de enzimas antioxidantes
 La actividad de SOD fue ensayada mediante la medición de
inhibir la reducción fotoquímica de nitro azul de tetrazolio (NBT),
adoptando el método de Beauchamp y Fridovich. Para el CAT se
uso el método de Aebi. En tanto para el APOX fue mediante el
método de Nakano y Asada.
  Electroforesis PAGE de las enzimas antioxidantes : Las
fracciones de mitocondria purificada de peroxisomas y el
citosol fueron analizadas por electroforesis. El SOD fue
determinado mediante Beauchamp y Fridovich. APOX fue
detectada siguiendo el procedimiento de Mittler y Zilinskas
(1993), y la actividad de CAT se ha detectado de acuerdo a
Woodbury.
  
 Aislamiento de RNA total y RT-PCR: En la reacción de PCR, se
utilizó primers específicos: AOX2d y AOX2r. Como gen de
referencia, se utilizó el gen de la tubulina, (no hay
cambio influenciado por el estrés frente al plomo). Las
condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: 94 ºC-2
min de desnaturalización, de alineamiento 54°C - 30 s de
cebadores, 72 °C - 1 min de la elongación de primers, 10 min de
la elongación final. Los ciclos fueron 30 veces.

 Secuenciación de ADN : La ligadura con pGEM-T Easy (Promega).
Se utilizó enzima restrictiva EcoRI. La secuenciación se realizó
con un sistema de análisis de ADN secuenciador Beckman
Coulter

 Cuantificación de proteínas: El contenido total de proteínas
 Resultad
os

 Figura 1:
Cambios ultraestructuralesen la mitocondria
y
Peroxisomas de celulas de raiz de Pisum

sativum por
Microscopia electronica de transmisión

A. Mitocondria y peroxisomade control

B. Mitocondria y peroxisomade tratado con
iones de Pb [0.1 mM]
C. Mitocondria y peroxisomade tratado con
iones de Pb [0.5 mM]
D.
 Resultados

 Figura2: Efecto de la produccion de peroxido de hidrçogeno en

el citosol (C), peroxisomas (P) y mitocondrias (P)en fracciones
de 0.1 y 0.5 mM Pb(NO3)2 tratadas 48 y 72 horas en tejido de
raiz de arvejas
Resultados
 Discusiones
 En el funcionamiento de una célula vegetal la presencia de
Pb causa inactivación de enzimas, disminución de las
crestas mitocondriales, trastornos en el funcionamiento
de succinato deshidrogenasa, formación de ROS.

 Como defensa se genera H2O2 en las mitocondrias. Así, la
mitocondria y peroxisoma son generadores básicos de
peróxido de hidrógeno, lo cual está relacionado con la
función de la oxidación mediante el uso de oxígeno
molecular.

 El estrés oxidativo, provocado por la influencia de plomo
de 0,5 mM Pb(NO3)2, extendido a 72 horas resultó en
una disminución de la producción de H2O2 en todas las
fracciones celulares, al mismo tiempo se observó una
disminución de la actividad de SOD y CAT en estas
condiciones de estrés mas intensas.
 Discusiones y
conclusiones
 Las células vegetales su protegen a sí mismos contra
la influencia perjudicial de la los metales pesados
mediante la activación de los mecanismos que van
a restringir la fitotoxicidadde los metales a través
de vacuolas de y reparar los efectos negativos
que ha causado como es el caso de antioxidantes
enzimáticos o no enzimáticos.


 La protección eficaz contra el estrés causado por los

metales pesados es posible debido a la presencia
de mecanismo de defensa eficientes, con la
participación tanto de desintoxicación y los
procesos de antioxidantes. Los más activos en la
protección antioxidante es la forma MnSOD
mitocondrial y en el citosol, la forma Cu, ZnSOD.
 Discusiones y
conclusiones
 De la secuenciación del gen AOX se encontró una similitud del
80% al genes AOX en A. thaliana y plantas de G. max, esto se
debe a los dominios conservados.


 La falta de similitud de aminoácidos de P. sativum y A. thaliana no

es sorprendente ya que estas especies pertenecen a dos
familias diferentes: Fabaceae y Brassicaceae.


 Es necesario mantener el equilibrio intracelular entre la

generación y eliminación de ROS. El mantenimiento del redox
como la homeostasis requiere una coordinación eficaz de las
reacciones que ocurren en los compartimentos celulares
diferentes y también su mantenimiento a través de la
cooperación compleja de pro y los sistemas antioxidantes.


 No obstante, existen estudios que no confirman la participación