Ingenieria genética

Ingeniería genética
o Campo de estudio en el cual se desarrollan procedimientos para el aislamiento, manipulación y
expresión de material genético
o Conjunto de técnicas empleadas para introducir DNA foráneo o extraño a una célula y lograr que
se replique y/o exprese en ella
 Antecedentes (comienzo de la
ingeniería genética)
• 1970- R Jhonsos y P. Rao: proponen dos puntos de control en el ciclo
celular (G/S y G/M).
• R.J. Britten y D.E. Kohne diseñan las técnicas de reasociación del DNA
eucariótico repetitivo
• H.O. Smith y K.W. Wilcox. Decubren primer enzima de restricción
• 1975- Estructura de tRNAs: anticodón (triplete en el asa media) es
complementarioal codón (triplete en el mRNA) E.M. Southem
desarrolla su técnica de hibridación de ácidos nucleicos.
• A.M. Dozy, m.D. Golbus, Y.W.Kan y S.Mitchell hacen el primer
diagnóstico parental de una enfermedad genética.
Dogma central de la biología
molecular
- Francis Crick:.
- Flujo de información genética y la utilización celular de dicha información.
Genética bacteriana.

Transducción.
Conjugación

Transformación
Obtención gen de interes
• PCR
• Síntesis de cDNA
• Síntesis química
• Digestión con enzimas de restricción
Estrategia experimental.
Clonación

Vector de clonación Vector de expresión

• Dar copias del gen que interesa • Tendra secuencia promotora,
favorecera gen de interés para
hacer porteina recombinante.
Transformación.
• Modificación genética de un organismo por la incorporación de DNA
desnudo en bacterias anfitrionas.
Tipos de tratamiento: - físico químico (CaCl2)
- Incorporación pasiva del DNA.
Tabla. Tipos de transformación artificial
Bacterias transformantes
• Bacterias células Mock.
• Bacterias con Construcción 5´-3´.
• Bacterias con Construcción 3´-5´.
Objetivos
• Obtener DNA de doble cadena de los plásmidos recombinante y no
recombinante derivados del pCR2.1-TOPO.
• Obtener células competentes de E. coli y transformarlas.
• Diferenciar un vector recombinante de uno no recombinante por
pruebas fenotípicas y de restricción.
 Artículo.
Expresión en Escherichia coli de un Gen sintetizado químicamente para
la hormona somatostatina
Objetivo general.
• Lograr la síntesis de un polipéptido de un gen de origen químicamente sintetizado para la
hormona de somatostatina en E. coli.

Objetivo particulares.
• Encontrar la secuencia de codones adecuada para la síntesis del gen de la
somatostatina.
• Evitar la degradación de la somatostatina por enzimas proteolíticas endógenas.
• Conocer bajo que operones esta regido la actividad de la somatostatina.
• Conocer los factores de la variabilidad del rendimiento de la somatostatina.
Somatostati
na
• Esquema del plan experimental.
 Ocho oligonucleótidos marcados de A a H sintetizados por el método de triester modificado. Con
reconocimiento para las endonucleasas de restricción Eco RI y Bam HI

Figura 1. Síntesis química del gen de la somatostatina.

 acoplamiento

desprotección desprotección

acoplamiento

Figura 1.1. Síntesis química del gen de la somatostatina

Figura 2.Construcción de plásmidos recombinantes.
Figura 3.Construcción de plásmidos recombinantes.
Figura 4. Actividad radioimune de las diferentes clonas.
Figura 5. Elución de la somatostatina sintetizada y de la
somatostatina comercial.
Figura 6. Competencia de pSOMII – 5 por el anticuerpo en
radioimunoensayos.
Tabla Actividad especifica radioimune de la
somatostatina
 1) Fragmentos A, B, E y F
2) Fragmentos C, D, G y H
3) Ambos fragmentos juntos
4) Inactivación de la ligasa
5) Bam HI
6) Eco RI
7) Gen de la somatostatina

Figura 7. Electroforesis de los fragmentos de la somatostatina.

Materiales y cepas
• Caldo luria (L)
• Agar Luria (L)
• Agar Luria con ampicilina (L-Ap)

• Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO.

• Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO-ape.
(plásmido recombinante con un inserto de 1.2 kpb que contiene el gene que
codifica la aminopeptidasa del hongo Ustilago maydis).
 Desarrollo experimetal.
Condiciones de reacción para la obtención del DNA de los plásmidos pCR2.1-TOPO
•
recombinante y no recombinate.

Reactivo Cantidad Función

•0
Birnboim y Doly (IBD) 100μL
II BD 200μL Lísis celular, a condiciones alcalinas
desnaturalización de las moléculas
lineales de ADN
III BD 150μL Neutralizado del extracto celular,
bajo condiciones de alta
concentración salina
Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 400μL Remover proteínas por
precipitación, desnaturalización
RNA, remoción DNA
TE 30 μL Resuspensión.

(Stefan Surzycli.Human Molecular Biology Laboratory, 2003)

• Condiciones de reacción para la obtención de las células competentes
de la cepa E.coli DH10B
Reactivo Cantidad Función
Solución de transformación 25ml

Solución de transformación 2ml

Glicerol 500μL Eliminar proteínas.

*Solución de transformación (CaCl2 100 mM; MgCl2 5mM; Tris-HCl

5mM pH7.5).
Vectores clonación
• Los vectores se pueden replicar de forma autónoma
(independientemente de la replicación del genoma del hospedador)
• En las células hospedadoras, facilitan la manipulación de la molécula
de ADN recombinante recién creada.
Tabla. Principales características y aplicaciones de diferentes
sistemas de vectores de clonación.
Vector de expresión
pCR2.1-TOPO

• Permite la clonación de
productos amplificados con la
enzima Taq polimerasa.
• No requiere de una ligasa para
unir el DNA foráneo con el
vector.
• Contiene topoisomerasa que
realiza la ligación.
Eco RI
• EcoRI funciona como un homodímero de dos idénticas subunidades
de peso molecular y cataliza la escisión de una secuencia de doble
cadena d (GAATTC).

Figura $: Estructura de Eco RI

• Figua&: Centros catalíticos del complejo EcoRI-DNA