OBTENCIÓN DE BLASTOCISTOS

HUMANOS POR PARTENOGENESIS A

PARTIR DE OVULOS
CRIOPRESERVADOS NO
INSEMINADOS
I. INTRODUCCCION
La criopreservación de oocitos humanos ahora se
está volviendo cada vez más común en la práctica
diaria de los procedimientos de tecnología de
reproducción asistida, gracias a sus posibles
aplicaciones terapéuticas (1-7). También puede ser
una gran fuente de ovocitos para la investigación
en diferentes campos.
Los usos terapéuticos de las células madre embrionarias
humanas derivadas de preembriones viables son muy
prometedores (8-11). Sin embargo, algunos países
argumentan en contra de este uso debido a los dilemas
éticos que puede causar. Uno de los protocolos
alternativos propuestos es la partenogénesis, en la que el
desarrollo embrionario se inicia sin la contribución de
espermatozoides. Partenogenético activación
principalmente estaba estudió en Especie Experimental
(12-14).
La criopreservación de oocitos humanos ahora
se está volviendo cada vez más común en la
práctica diaria de los procedimientos de
tecnología de reproducción asistida, gracias a
sus posibles aplicaciones terapéuticas (1-7).
También puede ser una gran fuente de ovocitos
para la investigación en diferentes campos.

 El objetivo de esta presentación es reportar el primer caso de obtención

de blastocistos partenogenéticos humanos y su adhesión in vitro,
generados a partir de la activación química de óvulos criopreserva- dos
no inseminados.
ALGUNOS CONCEPTOS:
El blastocisto no
debe confundirse con
blastocitos, células
El BLASTOCISTO es uno de los que componen el
primeros estadíos del desarrollo embrión.
embrionario. Es común en todos los
mamíferos. El blastocisto se situa
entre el 5º y el 7º día en los seres
humanos. Este estado embrionario
caracteriza el momento en el que las
células periféricas se unen para
crear el embrión.El blastocisto se
compone de unos centenares de
células llamadas células madre.
 Un oocito u ovocito es un
gametocito hembra o célula
germinal que participa en la
Ovocito no fertilizado
reproducción. En otras palabras,
es un precursor inmaduro del
óvulo, o célula huevo. El ovocito
se produce en el ovario del
embrión durante la
gametogénesis femenina.
CRIOPRESERVACION DE OVULOS
Proceso mediante el cual se
congelan uno o más óvulos no
fecundados (óvulos que no se
combinaron con espermatozoides) a
fin de guardarlos para su uso en el
futuro.
Los óvulos se descongelan y se
fecundan en el laboratorio para
producir embriones que se colocan
en el útero de una mujer.
Puede ser útil para las
mujeres con cáncer que
quieren tener hijos después
de recibir radioterapia,
quimioterapia o ciertos
tipos de cirugía, que
pueden causar esterilidad.
También se llama
almacenamiento de óvulos,
congelamiento de óvulos, y
crioconservación de
ovocitos.
II. MATERIALES Y METODOS

Los ovocitos fueron
proporcionados de cinco
donantes sanos y fértiles
(edad media fue de
32,2 +/- 3.4).
Todas las donantes que
participaron del presente
estudio firmaron
consentimientos
informados previamente
aprobados por un Comité
de Ética Institucional como
así tam- bién por Comités
externos pertenecientes a
Michigan State University y
Harvard Medical School.
Los donantes recibieron un
chequeo médico completo, que
consta de un historial médico
personal y familiar detallado,
evaluación psicológica, examen
ginecológico y ecografía.  DONANTES DE
OVOCITOS
Se realizó una prueba de
sangre completa para detectar
virus de inmunodeficiencia
humana, hepatitis y sífilis, y se
realizó un análisis de cariotipo,
así como pruebas hormonales,
para garantizar la viabilidad de
los posibles donantes.
PROCEDIMIENTO

ESTIMULACION
OVARICA
SELECCIÓN DE
OOCITOS.
CONGELACION Y
DESCONGELACION
Después de la recuperación de oocitos, los donantes se revisaron
periódicamente y cuidadosamente, y se les dio de alta después de obtener
una ecografía normal después de la menstruación. Estimulación ovárica
 PROCEDIMIENTO DE CONGELAMIENTO/

Se usó treinta y ocho ovocitos humanos frescos

no inseminados en metafase II (MII) fueron usando el método de con- gelamiento rápido
criopreservados con 1,2 propanediol y 0.3M sacarosa

A partir de lo cual los

ovo- citos fueron Luego fueron
transferidos a la colocadas en 1,2 Todas las gametas fueron lavadas en una solución de PBS
solución de capa que PrOH 1.5M con suplementada con 30% de Suero Sustituto Sérico (SSS)
contiene 1.5M PrOH, 30% SSS por 10
30% SSS y 0.3M minutos.
sacarosa, y fueron
La temperatura continuó
inmediatamente
bajando hasta -35ºC
cargados en pajuelas En este mismo se redujo la temperatura (0.3ºC/min). Las pajuelas fueron
de plástico y gradualmente desde 16ºC a -6.5ºC (- finalmente sumergidas en
colocados en un 2ºC/min) hasta el pun- to en que se realizó nitrógeno líquido (-196ºC) y
freezer biológico el seeding manual. almacenadas para uso posterior.
 PROCEDIMIENTO DE DESCONGE- LAMIENTO

El procedimiento de descongelamiento se llevó a acabo en

temperatura ambiente.

Las pajuelas fueron aireadas por 30 segun- dos y luego

sumergidas en un baño de agua a 30ºC por 40 segundos.

El crioprotector fue removido al transferir los

ovocitos a través de concentraciones decrecientes de
solución de propanediol (1-0.5M en cada una)
conteniendo 0.3M sacarosa, seguido por una disolución
de 0.3M sacarosa sola y finalmente lavadas en PBS.

Todas las soluciones fueron suplementa- das con 30% SSS.

Finalmente, los ovocitos viables fueron cultivados en el medio
HTF suplementado con 0.5% HSA a 37ºC en una atmósfera de
5% CO2 por lo menos durante 3 horas antes de la activación.
 Activación de Ovocitos Artificiales
Luego del descongelamiento 36 ovocitos no inseminados
fueron partenogenética- mente activados usando una
combinación de Ionomicina y 6-Dimetilamino Purina. Fueron
expuestos a un medio de manipu- lación (HTF-Hepes) con 10
uM de Iono- micina sobre una platina a 37ºC.

Luego los ovocitos fueron ubicados en medio de culti- vo KSOM

+ HSA con 2mM de 6-Dimeti- lamino Purina. Los embriones
partenogené- ticos obtenidos fueron cambiados al medio KSOM
+ HSA y luego a otro medio fresco KSOM + HSA a 37ºC, 6%
CO2. Los blas-tocistos partenogenéticos fueron colocados
sobre una capa de fibroblastos humanos de cordón umbilical
mitóticamente inactivados y cultivados con KO-DMEME
suplemen- tado con suero, penicilina/estreptomicina y
aminoácidos no esenciales.
.
 Todos los partenotes fueron periódica- mente
chequeados para monitorizar su cre- cimiento y
su adhesión. Se llevó un registro diario completo
de todo el proceso.
RESULTADOS

• Treinta seis de los 38 ovocitos criopresevados no inoculados sobrevivieron

después de la descongelación (tasa de supervivencia, 94.7%).

• Treinta y uno de 36 ovocitos mostró solamente un pronúcleo (activación tarifa,

86.1%; Fig. 1ª). Treinta de 31 (tasa de escisión, 96.8%; Fig. 1B).

• Después de la activación, tres embriones en el día 6 y dos embriones en el día 7

mostraron cavitación. De acuerdo con la clasificación de Gardner et al. 2000, la
calidad de los blastocistos fue principalmente pobre (Fig. 1C). La tasa de blastocisto
fue del 16,7%.

• Blastocistos partenogenéticos humanos fueron plateados. Después de la siembra

en placa, un blastocito mostró una unión incipiente, y el otro mostró unión
completa (Fig. 1D).
• No se observó desarrollo adicional.

• Quince partenotes escindidos no volátiles se colocaron en

placas el día 9 después de la activación. Seis de 15 mostraron
apego.

• Después de 63 días en cocultivo, tres de tres partenotes

mostraron unión. No se observaron signos de crecimiento,
medidos en el número de células y / o el tamaño de la colonia.
DISCUSION
• Durante los últimos años, el principal desafío en esta área ha sido mejorar la tasa de
supervivencia de ovocitos crio preservados.
• La tasa de supervivencia de ovocitos después de la crio preservación se ha
informado a ser variable (27% -64%). Fabbri y sus coinvestigadores informaron que mayor
concentración de sacarosa (0.3 M) dramáticamente mejora la tasa de supervivencia de
ovocitos crio preservados (83%), otros investigadores repitieron el mismo
procedimiento, con resultados similares.
• En el presente estudio, utilizamos 0.3 M de sacarosa para crio conservar 38 ovocitos
frescos no inoculados, y la tasa de supervivencia después de la descongelación fue del
94.7%. Estos resultados son una evidencia adicional de los efectos beneficiosos de
mayores concentraciones de sacarosa sobre la tasa de supervivencia después de la
descongelación de ovocitos crio conservados.
Hasta la fecha, la activación partenogenética de los ovocitos se realizó en la mayoría de los mamíferos, incluidos
ratones, cabras, vacas, monos y seres humanos.

La mayoría de la literatura publicada sobre activación

partenogenética en humano seres es basada en el utilizar de ovocitos que no pudo fertilizar después de los
procedimientos IVF-ICSI. Por lo tanto, eran ovocitos humanos no fertilizados que fueron expuestos a diferentes
técnicas de activación, consideramos ese esta es no el más apropiado material que evaluar activación
partenogenética en ovocitos humanos, porque estuvieron en contacto con los espermatozoides y también
experimentaron efectos adversos del envejecimiento. En nuestro laboratorio, 164 de 197 ovocitos humanos
frescos fueron activado (activación tarifa, 83.25%) a comparar diferentes técnicas de activación (Polak de Fried,
inédito).

En el presente estudio, la fuente de los ovocitos humanos para la activación partenogenética fueron los ovocitos humanos no
inoculados, crio conservados, y la tasa de activación partenogenética estaba 86.1%, el escote tarifa estaba 96.8%, y la tasa de
cavitación fue del 16,7%. De acuerdo con este estudio, el procedimiento de crioconservación no afecta la tasa de activación
partenogenética y el desarrollo tardío de la parthenotes.
• Congelación ovocitos podría ser un bueno técnica para la preservación de hembra fértil.
• La partenogenética activación podría brindar la oportunidad de trabajar en este campo
para científicos de países que tienen restricciones sobre el uso de gametos humanos
y embriones.
• La alta tasa de supervivencia permitió una significativa formación partenogenética y el
desarrollo y el apego de los blastocitos.Actualmente, nosotros continuamos
los experimentos porque nuestra misión es lograr la posibilidad de obtener células
madre de esta fuente.
• GRACIAS