CINETICA ENZIMATICA

Cinética Enzimática
• Es el estudio de las velocidades de las reacciones
catalizadas por enzimas.

• Para muchas reacciones químicas.

velocidad = k1 [ A ] Reacción de Primer Orden

velocidad = k0 [ A ]0 Reacción de Orden Cero

 Cinética Enzimática
Velocidad de reacción
• Cambio de la [S] ó de [P] en función del tiempo
• Unidades de velocidad: concentración molar/ tiempo
M/min, milimoles/L.s, etc.
• Notación de velocidad:
- d [S] ó d [P]
dt dt
Unidades de actividad enzimática (U): umoles [S] o [P]/min
Katal: moles [S] o [P]/s
 Cinética Enzimática
Factores que afectan la Velocidad de Reacción
Enzimática
• [S] (Cinética Michaeliana)
• [E]
• pH
• Temperatura
• Concentración de Cofactor ( Si se requiere)
• Presencia de Inhibidores
– Competitivos: se unen en el mismo sitio que el sustrato
– No competitivos: se unen en un sitio diferente que el
sustrato pero disminuyen la actividad catalítica
 Estructura terciaria: fuerzas no covalentes
Actividad enzimática

pH Temperatura °C
Cambios en pH alteran el Puentes de hidrógeno se
estado de ionización de rompen por incrementos
aa cargados (e.g., Asp, de temperatura: altera la
Lys): unión a sustrato o conformación 3D
acción catalítica
Cinética Michaeliana
 Teoría de la acción enzimática

Aportes :
1. Definición de la trayectoria de la reacción
enzimática
2. Identificación del comportamiento hiperbólico
rectangular y definición de Km
3. Definición de la ecuación de Michaelis y Menten
para cálculo de velocidades de reacción
1. Definición de la trayectoria de reacción
enzimática

k1 k2
E + S E-S E + P
k -1
k-2
1. Definición de la trayectoria de reacción
enzimática

• [ E ], [ S ], [ ES ], están en equilibrio
• La concentración de S es mayor que la
concentración de E
• k2 < < k-1
• k-2 es despreciable al inicio de la reacción, pues la
concentración del producto es insignificante
• El paso limitante de la velocidad es la
transformación de ES a E+P
2. Identificación del comportamiento hiperbólico
rectangular
2. Identificación del comportamiento hiperbólico
rectangular
 Efecto de la Concentración de Sustrato:
Cinética Michaeliana

En una reacción enzimática donde va a

aumentando la [S] manteniéndose los otros
factores óptimos y constantes :

•Comportamiento hiperbólico rectangular

•Hipérbole que tiene como límites los
parámetros cinéticos de Vmax y Km
 k1 k2
E + S E-S E + P
k -1
k-2

v formación = k1 [ E ] [ S ]

v descomposición = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]
v descomposición = (k-1 + k2) [ ES ]
En el estado k1 [ E ] [ S ] = (k-1 + k2) [ ES ]
estacionario:
[ E ] [S ] = (k-1 + k2) [ ES ]
k1
(k-1 + k2) / k1 = Km
 VALORES DE Km DE ALGUNOS ENZIMAS

Enzima Sustrato Km (mM)

Quimotripsina Acetil-L-triptofanamida 5000
Lisozima Hexa-N-acetilglucosamina 6
bGalactosidasa Lactosa 4000
Treonina Desaminasa Treonina 5000
Anhidrasa Carbónica CO2 8000
Penicilinasa Bencilpenicilina 50
Piruvato Carboxilasa Piruvato 400
HCO3- 1000
ATP 60
Arginina-tRNA Sintetasa Arginina 3
tRNA 0,4
ATP 300
 La Constante de Michaelis - Km
• Es la concentración de sustrato que rinde la mitad
de la velocidad máxima
• Es un criterio de afinidad de una enzima por un
sustrato en particular. Mayor afinidad, menor Km
• Si es pequeño: requiere poco sustrato para
alcanzar la mitad de Vmax, se logra máxima
eficiencia catalítica
• Valores de Km se expresan en Molaridad en un
rango entre 1 x10-7M a 0.1 M
• Depende de cada enzima
sustrato
temperatura y pH
M-M postularon que:
- La E y S se combinan en forma reversible
- ES se descompone en un paso mas lento,
limita la V global
- V será proporcional a ES
- Si:
[ S ] ↓ → [ E ] libre ↑ → V ≈ [ S ]
K1
E + S E-S
K -1
- Si:
[ E ] → [ ES ] → V ≈ Vmax
La E esta saturada
 Gráfica de Michaelis Menten. Cinética de saturación:

Velocidad de reacción

Nivel de saturación de la enzima

Concentración de sustrato
3. La ecuación de Michaelis Menten

V = Vm . [ S ]
Km + [ S ]

Donde :
V = Velocidad de una reacción enzimática
Vm = Velocidad máxima
Km = Constante de Michaelis
[ S] = Concentración de Sustrato
 CINETICA ENZIMATICA
S = Km

v = Vmáx [ S ] = Vmáx [ S ] = 1 Vmáx

[S]+[S] 2[S] 2

S = 10 Km

v = Vmáx (10 Km) = Vmáx x 10 Km = 0.91 Vmáx

Km + (10 Km) 11 Km
 CINETICA ENZIMATICA
S << Km

v = Vmáx [ S ] = Vmáx [ S ]
Km + [ S ] Km

Vmáx y Km constantes

v = k1 [ S ]

En estos casos :
La Velocidad de la reacción enzimática
es de primer orden
 CINETICA ENZIMATICA
S >> Km

v = Vmáx [ S ] = Vmáx [ S ] = Vmáx

Km + [ S ] [S]

En estos casos :
La Velocidad de la reacción enzimática es de orden
cero
La velocidad de reacción a esta concentración de
sustrato es la Velocidad máxima
 Transformaciones matemáticas a la ecuación de
Michaelis Menten

Gráfico de Lineweaver y Burck:

V = Vm . [ S ] 1/V = Km . 1 + 1
Km + [ S ] Vm [ S ] Vm

Y = m. x +b
Gráfico de Lineweaver y Burck:
 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a
través de interacciones con el centro activo u otros
centros específicos.
 Tipos de Inhibición Enzimática
Según Reversibilidad del efecto inhibitorio
- Reversible
- Irreversible

Según mecanismo de acción del inhibidor

• Inhibición Competitiva
• Inhibición No competitiva
• Inhibición Acompetitiva
 Inhibidores
reversibles
competitivos
 Inhibidores reversibles competitivos
Unión del inhibidor al centro activo
- ↑ Km
- No cambia Vmax
 Inhibidores
reversibles
competitivos

Vmx s
v
 i 
Km  1    s
 Ki 
Características:

- Las fijaciones de substrato e inhibidor son

mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato
desaparece la inhibición
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un
análogo químico del sustrato
- El inhibidor es tan específico como el
substrato
- La intensidad del efecto inhibitorio depende de
la concentración del inhibidor.
L-B
Gráfico de Lineweaber - Burk para al inhibición competitiva
Por tanto, en la inhibición competitiva:

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento

aparente de la Km, que aparece multiplicada
por el factor (1 + [i]/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para

concentraciones muy altas del substrato, v =
Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor

será la potencia del inhibidor competitivo.
 Inhibidores
reversibles no
competitivos
 Inhibidores reversibles NO competitivos
Unión del inhibidor no se da en el centro activo, el
inhibidor no compite por el sustrato.
- No cambia Km
- ↓ Vmax
 Inhibidores
reversibles
NO
competitivos

𝑉𝑚𝑥
𝑆
(1 + [i]/𝐾𝑖 )
𝑣=
𝐾𝑚 + 𝑆
Características:

- Se unen a la enzima en lugares diferentes al

centro activo
- Alteran la formación de la enzima
- No impide la fijación del substrato a la enzima
- La catálisis se ve afectada
- La intensidad del efecto depende de la
concentración del inhibidor.
Gráfico de Lineweaber - Burk para al inhibición NO competitiva
Inhibición competitiva Inhibición NO competitiva
 Inhibidores
reversibles
acompetitivos
 Inhibidores reversibles acompetitivos
Se fija únicamente al complejo enzima-substrato una
vez formado, impidiendo la acción catalítica.
 Inhibidores
reversibles
acompetitivos

V = Vm . [ S ]
Km + S (1 +[I])
Ki
Características:

- Se fijan únicamente al complejo enzima-

sustrato.
- No impide la fijación del substrato a la enzima
- La catálisis se ve afectada
- Baja la Km y Vmax, pero el cociente Km/Vmax
no se altera
- Ocurre en reacciones multisustratos
Gráfico de Lineweaber-Burk para inhibición acompetitiva
 Inhibidores irreversibles
- Reaccionan con un grupo químico de la
enzima, modificándola covalentemente.
- Bloquean unión al sustrato
- Inhiben la actividad catalítica
- El efecto depende del tiempo de actuación
del inhibidor.
- Por lo general son altamente tóxicos.
- Algunos tipos:
• Reactivos de grupos -SH
• Organofosforados
• Ligandos de metales
• Metales pesados
Inhibición por su sustrato
 Inhibición por su sustrato
- Ciertas E pueden ser inhibidas por su S.
- La reacción no llega a alcanzar Vm.
- Se forman SE y SES , complejos inactivos.
- Un mecanismo probable:
 Regulación de la actividad
enzimática
La célula regula la eficacia catalítica:

1- Disponibilidad de sustrato
2- Modificación covalente
3- Múltiples formas de la enzima
4- Modificación alosterica
 1- Disponibilidad de sustrato

Las características cinéticas de la enzima

determinan la velocidad de la reacción, en
dependencia de los niveles de
concentración del sustrato.
 2- Modificación covalente

La enzima posee un grado de actividad

notablemente diferente según se
encuentre unido o no a un grupo atómico
a ella. Es muy común el grupo fosfato
unido por enlace éster al grupo OH de la
serina.
Modificación covalente reversible
 3- Múltiples formas de la enzima

Integradas por las isoenzimas y complejos

multienzimáticos.
Las isoenzimas o isozimas son las
diferentes formas estructurales de una
enzima que catalizan la misma reacción.
 Las isoenzimas o isozimas
• Difieren en sus secuencias de aa, en sus
parámetros cinéticos y/o propiedades
reguladoras
• Juegan un papel importante en la regulación
de procesos metabólicos
• Codificados por diferentes loci
• Ejm: Lactato deshidrogenasa
Acidosis Láctica
4- Modificación alostérica
 Enzimas alostéricas

Las enzimas alostéricas poseen, además del

centro catalítico, otro espacio al que se enlaza
de modo reversible y no covalente el
efector o modulador. En general, el centro
alostérico es tan específico para la unión del
modulador como el centro catalítico (o centro
activo) lo es para la unión del sustrato.
 Enzimas alostéricas

Características:

• Denominadas enzimas reguladoras

• Herramienta de la célula para regular la actividad
de las enzimas dependiendo del estado
metabólico del organismo
• Muestran una cinética sigmoidal y no hiperbólica
rectangular como las enzimas michaelianas
 Teoría alostérica

• Sustentada por Monod,

Jacob y Changeux
• Explica el
comportamiento
sigmoidal y la capacidad
de regulación de la
actividad enzimática de
las enzimas alostéricas
 Teoría alostérica
Principios:
a) Son proteínas
- Son oligoméricas (varias
subunidades)
- Con centros reguladores:
- Para unión de un ACTIVADOR
- Para unión de un INHIBIDOR
- Con centro activo (en una o varias
subunidades)
b) Formas
– R: forma activa (se forma producto)
– T: forma inactiva
 Teoría alostérica
c) Cada oligómero dispone de un centro activo y un sitio de
unión con modulador

Los moduladores son compuestos químicos que al

unirse a la enzima pueden aumentar o disminuir la
actividad catalítica de la enzima /( Moduladores
positivos y Moduladores negativos)
Sitio de unión con modulador

II

Centro activo
I
 Teoría alostérica
d) Cada enzima alostérica puede estar en dos estados
conformacionales : Inactivo o Activo

+
Centro activo

II
I
II
I

Conformación Inactiva Conformación Activa

 Teoría alostérica
e) En principio los dos estados conformacionales están
en equilibrio
Teoría alostérica
 Teoría alostérica

f) La existencia de un determinado tipo de

modulador hace que el equilibrio se desplace a
la izquierda o a la derecha
g) La existencia de modulador positivo hace que
se estabilice el estado conformacional activo y
por tanto la velocidad suba abruptamente
 ENZIMAS ALOSTERICAS

Vm

[sustrato]
Efecto cooperativo
 ENZIMAS ALOSTERICAS

Cinética
Sigmoidal
Vm

_
Vm/2 +

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Km1 Km2 Km3
Proteína kinasa A (PKA): un enzima alostérico con
subunidades catalíticas (C) y reguladoras (R)
disociables
Inhibición Feedback en via abierta

E1 E2 E3 E4
A B C D E

Otro compuesto

+
E1
A B C D E
Inhibición Feedback en via bifurcada

E4 E5
D E F
E3

E1 E2
A B C
E7 E8
E6 G H I
 Inhibición Feedback

• Llamada también Inhibición por el producto o

Inhibición por retroalimentación
• Permite a la célula activar una vía metabólica
cuando requiere un determinado metabolito
y sintetizarlo en la cantidad que necesita
• Puede darse en vía abierta lineal o en via
bifurcada