Metodología Avanzada en

Fisiología Celular
3.1 Modificación de la expresión de proteínas
3.1.1 Vectores de clonación.
3.1.2 Plásmidos.
3.1.3 Métodos de transfección
3.1.1 Vectores de clonación
¿Qué es un vector de clonación?
Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que
transfieren y replican fragmentos de DNA que llevan
insertados.
• Capacidad de replicarse de forma autónoma junto con el
fragmento de DNA que transporta.
• Deben contener secuencias de corte para enzimas de
restricción para facilitar la inserción del DNA a transportar.
• Deben contener como mínimo un marcador de selección
para poder seleccionar las células huésped que transportan
el vector.
• Deben recuperarse de la célula huésped con facilidad.
3.1.1 Vectores de clonación
Tipos de vectores de clonación
• Plásmidos.

• Vectores víricos

• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13.

• Cósmidos.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNA-recombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf
http://www.springer.com/cda/content/document/cda_downloaddocument/9781588291516-
c2.pdf?SGWID=0-0-45-434072-p173728492
3.1.2 Plásmidos

¿Qué es un plásmido?

Los plásmidos son moléculas de ADN de doble

cadena extracromosómico circular o lineal
que se replican y transcriben independientes
del ADN cromosómico.
3.1.2 Plásmidos

Marcador de selección
Promotor
• Gen
EsOrigen deque
laderegión replicación
permite
Resistencia (ORI)
seleccionar
a Antibióticos
las• células
Región donde se unirá
transfectadas que la RNA
contiene
polimerasa
•el plásmido.
Secuencia
Secuencia ypermite
quey controla
que inicia
que regula la la
que las
iniciación
bacterias
replicación delde la transcripción
transformadas
plásmido. adquieran
• •La resistencia
del cDNA
resistencia
Determina el
ainsertado
a unantibióticos
número
determinado
dea mRNA.es el
copias.
antibiótico.
principal marcador de selección
• Determina la incompatibilidad
entre• plásmidos
Puromicina.
Kanamicina.
• Higromicina
Estreptomicina.
B.
• Neomicina.
Ampicilina.

ORI
3.1.2 Plásmidos

CONSTITUTIVOS
• SV40 (Simian virus 40).
• CMV (cytomegalovirus)
• hEF-1A (Human elongation factor-1 α)

INDUCIBLES
• Promotores regulados por agentes químicos.
• Metales pesados.
• Alcohol
• Esteroides
• Promotores regulados por estimulos físicos.
• Ausencia/presencia de luz.
• Temperatura
3.1.2 Plásmidos

Sitio de clonado múltiple

Contiene secuencias de corte para

enzimas de restricción que facilitan la
inserción del material genético.

ORI
3.1.2 Plásmidos

TAGS
• Glutation-S-transferasa
• His
• V5
• Hemoaglutinina (HA)
• Myc
• Flag
• EGFP
3.1.2 Plásmidos

• Plásmido de sobreexpresión.
Se inserta el cDNA que codifica a nuestra proteína objeto de estudio.

Mutagénesis dirigida
http://dharmacon.gelifesciences.com/
https://www.addgene.org/
https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/200523.pdf
http://www.origene.com/cDNA/
https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-
Plásmido de sobreexpresión de nuestra proteína
science/cloning/gene-synthesis/geneart-plasmid-services.html
mutada .
3.1.2 Plásmidos

• Plásmido de silenciamiento.
sobreexpresión.
Se inserta un
el cDNA
constructor
que codifica
shRNAapara
nuestra
queproteína
bloquee objeto
la expresión
de estudio.
del
mRNA de nuestra proteína objeto de estudio.
• Plásmido de silenciamiento.
Se inserta un constructor shRNA para
Promotores deque
la bloquee la expresión del
mRNA de nuestra proteína
RNA objeto de estudio.
polimerasa III
Inicia la transcipción del shRNA
shRNA constructor
CONSTITUTIVOS
• H1
• U6
 3.1.2 Plásmidos
PLÁSMIDO DE SOBREEXPRESIÓN
Los plásmidos entran en la célula

El cDNA se transcribe a mRNA

El mRNA se traduce en nuestra

proteína diana
 3.1.2 Plásmidos
shRNA
Los plásmidos entran en la célula y
posteriormente son transcritos

Los siRNA
shRNAsetranscritos
asocian alson procesados
complejo por la
RISC (RNA- DICER
enzima DICER
induced en unidades
silencing complex) mas pequeñas
provocando la
(siRNA) de 19-25
separación de las pares
hebrasdedel
bases
siRNA. RISC

antisentido
La hebra 3’-5’ (3’-5’)
del siRNA quedaaunida
se asocia su al
complejo
mRNA RISC activándolo,
complementario mientras que
y el complejo RISC
la hebra sentido
promueve (5’-3’) es de
la degradación mRNA por mRNA
hidrolizada
una endonucleasa.
3.1.3 Métodos de transfección

Transfección transitoria: Los plásmidos no se

integran en los cromosomas eucarióticos.

Transfección estable: Los plásmidos se integran

en uno ó más cromosomas eucariotas.
3.1.3 Métodos de transfección

MÉTODOS QUÍMICOS
Fosfato de calcio
Liposomas catiónicos
Mediado por receptores
MÉTODOS FÍSICOS
Biobalística
Microinyección
Electroporación
3.1.4 Métodos de transfección

Liposomas catiónicos
Basado en la formación de complejos entre los lípidos
catiónicos y el DNA. El complejo tiene afinidad por la cargas
negativas de la membrana celular, permitiendo la entrada del
plásmido al citosol.
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0013147_TurboFect_Tr
ansfection_Reagent_UG.pdf

Electroporación
La aplicación de una corriente eléctrica provoca la apertura de
poros en la membrana y permite la entrada del plásmido.
http://bio.lonza.com/fileadmin/groups/marketing/Downloads/Protocols/Generat
ed/Optimized_Protocol_225.pdf
 JOSÉ JAVIER LÓPEZ BARBA
PERSONAL DOCENTE INVESTIGADOR “JUAN DE
LA CIERVA”