CENTRO DE

INVESTIGACION
CIENTIFICA DE
YUCATAN DETERMINACION
DEL GRADO DE
ACETILACION DEL
QUITOSANO POR
ESPECTROSCOPIA
HRMN

MTODO DE HIRAI Y
MTODO DE VARUM
El quitosano es un polisacrido obtenido por
desacetilacin parcial o completa de la quitina, y su
estructura molecular y las propiedades son en gran
medida afectada por el grado de desacetilacin.

Hirai et al. presenta un nuevo mtodo para

determinar el grado de deacetilacion del quitosano
por espectros de 1H RMN .

Adems, se describen las asignaciones de espectros

de RMN 1H y 13C del quitosano.
MATERIALES.
Muestra de quitosano (TKL) se adquiri de Tokyo
Kasei Ltd

La muestra TKI se sumergi en solucin acuosa de

NaOH al 50% en peso, y desacetil por 1 hr en
atmsfera de argn a 110C. (repite el proceso)

Se filtra y se lava con agua destilada y se seca al

vacio
La nueva muestra TK2 es altamente deacetilada.
MEDICIN:
Mediciones de RMN 1H y 13C se realizaron en un
espectrmetro JEOL JNM-GX400 NMR (400 MHz)
bajo un campo magntico esttico de 9.4T a 70
C.

ca. 5 mg de la muestra se sec a vaco a 50C

durante 2 das dentro del tubo de ensayo de RMN
de 5 mm de dimetro.

a la que se le aadi 0.5 ml al 2% en peso de

solucin de CD3COOD/D2O o al 2% en peso DCl/
D20, y finalmente el tubo de ensayo se mantuvo a
70 C para disolver el polmero en solucin.
Los desplazamientos qumicos 1H del sodio 3-
(trimetil sililo) propano sulfonato (TSP) se expresaron
en ppm usado como una referencia externa.

Para las mediciones de RMN de 13C, se utiliz un

tubo de ensayo I0mm de dimetro, y la
concentracin de polmero en el tubo es de 50
mg/ml.
 RESULTADOS Y DISCUSIN.
Protones
IH2_IH6

H1
GlcNAc

La figura 1 representa el espectro H NMR de la muestra

del quitosano a 400 MHz y a 70C (TK2) (Ddeac = 97%)
disuelto en 2% en peso de CD3COOD/D2O.
Por lo tanto, el grado de desacetilacin (Ddeac)
se evalu a partir de la siguiente ecuacin
mediante el uso de la intensidad integral, ICH3,
de este residuo CH3, y la suma de las
intensidades integrales, IH2_H6, de H2, H3, H4,
H5, H6, y protones H6 '.

1
3
D (%) = 1 3 100
1
6 26
 Protones
IH2_IH6

H1
GlcNAc

La Figura 2 muestra el espectro de RMN IH medido a 70 C para

TKI quitosano (Ddeac = 77%) disuelto en solucin CD3COOD/D20 al
2% en peso.
Tabla 2 da el grado de desacetilacin (%) determinada a
partir de la ecuacin (I), junto con los resultados obtenidos
del anlisis elemental y los mtodos de valoracin de
coloide.
El espectro de 1H RMN 70C para el TK2 quitsano en 2% en
peso DCl/D20 (Ddeac= 97%)
 Ddeac=78%

cuando la muestra se mantuvo a 70C durante mucho

tiempo, se promueve la hidrlisis cida, lo que resulta en el
aumento del contenido de CH3COOH, disminucin del
contenido de N-acetilo, y la produccin de oligmeros.
Las Figuras 5 y 6 indican el espectro IH-IH correlacin de desplazamiento
qumico (COSY) y el desplazamiento qumico espectro de correlacin
13C-IH, tanto para KBO04 quitosano, respectivamente. Las asignaciones
se realizaron tomando en consideraciones de los resultados
experimentales mostrados en las figuras 5 y 6, los datos de Domard et al.
(5), y los datos de desplazamiento qumico en oligosacridos
Varum et al. Trabaj con cascaras de
camarn fresco, obteniendo el quitosano para
deterninar el d.a por medio de espectroscopia
R.M.N. De alto campo

La N- deacetilacion de la quitina bajo

condiciones homogneas involucr el
procedimiento de Sannan et al.
Para N-deacetilacion bajo condiciones
heterogneas, la quitina (1.0 gr) fue tratada
con solucin acuosa al 50% en peso de NAOH
(100ml) a 70C por 20, 40 y 70 min. Cada
solucin se desairea y se agit continuamente.
 ESPECTROSCOPA N.M.R.-

Las muestras de quitosano se disolvieron cada una

en D2O en tubos de 5mm con pD 3-4.

La resonancia de deuterio se utiliz como un

bloqueo de campo de frecuencia y los
desplazamientos qumicos fueron referenciados al
sodio 3-(trimetilsilil) propionato-d4 interna (TMPS).

Los espectros 'H-RMN se registraron con un Bruker

WM-500 (500 MHz) o Jeol FX 100 (99,4 MHz) en 90
con el fin de disminuir la viscosidad de las
soluciones y, por tanto, la anchura de lnea de las
seales.
 RESULTADOS Y DISCUSIN.

La despolimerizacin limitada de las muestras de

quitosano con cido nitroso disminuye la
viscosidad de sus soluciones, una mejora de la
solubilidad, y redujo los anchos de lnea de las
seales.

El cido nitroso ataca unidades GlcN pero no

unidades de GlcNAc en las molculas de
quitosano, el siguiente enlace glicosdico se
escinde, y un residuo de 2,5-anhidro-o-manosa se
genera en el nuevo extremo reductor.
 3 protones
de NAc

H-1 H-1 H-2

GlcN GlcNAc GlcN

La figura 1 muestra H-RMN 500 MHz ". espectro de una quitosana

con D.A. 47%.
Determinacin del grado de N-acetilacin (d.a). -
A partir de la identificacin de las resonancias (a-e
en la figura l), fue posible determinar el d.a.

Con el fin de utilizar todas las intensidades de a-e,

el siguiente mtodo fue desarrollado. Sea f
definido como:

( ) + + + +
= =
( 1 + ) +
Si FA es la fraccin molar de las unidades N-acetiladas,
entonces la fraccin molar para unidades N-
deacetiladas es 1 - FA. expresando f en trminos de de
FA :
1 + + 6 + 3 7 + 3
= =
+ 3 4

Ic + Id incluyen los 6 protones para cada unidad

monomerica (GlcN or GlcNAc), y Ie es 3 veces la
fraccin molar de GlcNAc.

La fraccin molar de unidades de N-acetilados (FA) se

puede expresar como:
7( + )
=
4( + + ) + +
Frecuencias diada en quitosanos homogneos N-
desacetilizado. - Con el fin de estudiar el efecto de
residuos vecino en el 'Hn.m.r resonancia, se
prepararon muestras de una serie de quitosano
con grados de N-desacetilacin (d.d) dentro del
rango de 51 a 96% (FA) desde 0,49 hasta 0,04. Las
fracciones de menor d.d. son insolubles en medio
cido. La Figura 2 muestra la regin de las
resonancias de protones anomricos de estas
muestras registraron a 500 MHz.
Estas resonancias sugieren que la
resonancia H1 de una unidad de
GlcNAc es sensible a un vecino ms
cercano, la mayora
probablemente al siguiente residuo
de la cadena.

En consecuencia, las dos

frecuencias diada deben ser AD
(GlcNAc-GlcN) y AA (GlcNA-
GlcNAc). Las diada AA prepondera
a bajo d.d. y la diada AD en mayor
d.d.
Frecuencias Diada en quitosanos obtenidos por N-
akacetylation en condiciones heterogneas. -
Kurita y co-trabajadores, inform que quitosanas
de este tipo tenan una distribucin por bloques
de grupos NAC y eran insolubles en agua.

Las muestras de quitosana con d.d. 50-95% eran

todos solubles en cido diluido, y aquellos con dd
50% eran solubles tambin a pH neutro.