CROMATOGRAFIA

LIQUIDA
DE ALTA
RESOLUCION
(HPLC)

RAFAEL PELAYO
YESSICA LEDESMA
OSCAR SANCHEZ
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado
en los componentes de una mezcla analizada en dos fases:
mvil y estacionaria. La fase mvil es el liquido que fluye
atraves de una columna que contiene la fase estacionaria

El tamao de las partculas de la fase estacionaria ir

disminuyendo hasta hubo necesidad de utilizar presiones para
hacer que la fase mvil fluya por la columna

De esta manera surgi la HPLC, que requiere de

instrumentacin especial para trabajar con las altas presiones
requeridas y que haya varias interacciones con la sustancia
analizada y la columna cromatografa
La cromatografa liquida es utilizada en los laboratorios gracias
a que tiene la ventaja de ser excelente tanto cualitativa como
cuantitativamente. Pero gracias a sus distintas modalidades y
las tcnicas para su realizacin permiten realizar anlisis
precisos, para optimizarlos y hacer que cumplan con
protocolos y parmetros de calidad.

Comprende una gran variedad de muestras utilizables, entre

ellas aminocidos, protenas, carbohidratos, terpenoides,
esteroides, anablicos, y determina mas de un grupo en una
sola muestra, generalmente en cantidades pequeas
 SOLVENTE INDICE DE FUERZA MOMENTO
POLARIDAD DISPERSIVA DIPOLAR

Hexano 0.0 0 0.0

Diclorometano 3.4 -0.20 0.49

Isopropanol 4.3 -0.30 0.26

Cloroformo 4.4 -0.10 0.33

Acetonitrilo 6.2 0.04 0.41

Metanol 6.6 0.03 0.30

Agua destilada 9.0 - 0.26

*Eliminacin de gases y slidos
*Desgasificador al vacio
*Regulador de termostato
*Agitador de presin
*inyector a base de gas helio
*filtros para partculas en suspensin
RECIPIENTES DE DISOLVENTES Y DESECHOS
Deben de ser de vidrio o acero inoxidable de aproximadamente 500 ml a
1L
Eliminan y filtran l gases, partculas solidas presentes en los disolventes
y los burbujean a travs de liquido para desecho

SISTEMA DE BOMBEO
Posee un generador de presiones por encima de 400 kg/cc
Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min
La bomba puede ser: Reciproca: (usa pistones y succiona unos 35-400 ml
De desplazamiento: (usa un embolo impulsado por un motor
y su capacidad es de 250 ml
 AMORTIGUADOR DE PULSOS

Suaviza la energa de pulsacin

INYECTOR DE MUESTRA
Tiene una capacidad de 50-200 uL y deben ser resistentes a la
presurizacin

COLUMNAS CROMATOGRAFICAS
Tubos de acero inoxidable de 10-30 cm con un dimetro interno de 3-
10 mm, pueden ser:
PRECOLUMNAS: Eliminan posible contaminacin de los disolventes
Saturan la fase mvil con la estacionaria y evitan
perdidas de relleno

TERMOCOLUMNAS: Incluyen un termostato permitiendo mejores

cromatogramas (T.A 100 C)

DETECTORES
Los diferentes detectores responden a caractersticas del soluto
maestral como densidad, constante dielctrica, ndice de refraccin,
fluorescencia, espectrometra de masas, dispersin de luz,
fotoionizacin

DETECTORES DE ABSORBANCIA
Pueden ser de luz IR, visible o UV
 PRODUCTOS DE FASES MOVILES
Eluato: liquido que sale de la columna

Elucion: movimiento de las soluciones a lo largo de la columna

Eluyente: fase mvil que origina la elucin.

Elucin isocrtica: movimiento en el que la composicin de la fase

mvil no se ve alterada

Gradiente de elucin: tcnica en la cual la composicin de la fase

mvil varia durante la elucin.

Tiempo de retencin: tiempo que tarda cada sustancia analizada

en abandonar el cromatgrafo, esta varia segn el compuesto
 INFLUENCIA CINETICA

La eficacia de la columna para separar los componentes de

la muestra influye en dos factores

* La diferencia de la velocidad de movimiento de los solutos

de la mezcla que origina la separacin entre los picos

*La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada

plato terico que traer consigo un ensanchamiento del pico
cromatogrfico
 CUANTIFICACION

Altura del pico: su principal ventaja es la simplicidad y

rapidez de los clculos al efectuar la cuantificacin. Las
desventajas son la mayor variabilidad de la altura con
respecto al rea del pico, y la perdida de informacin cuando
el pico se sale de la escala

rea de pico: su empleo se basa en el hecho de que la

concentracin de un componente en la muestra es
directamente proporcional a su rea. La determinacin por
rea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento. Por lo tanto es el parmetro analtico mas
adecuado para realizar el anlisis cuantitativo.
 mi = Ki * Ai

mi = masa del compuesto inyectado en la columna.

Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i.
Ai = rea del pico de elucin del compuesto correspondiente
al compuesto i
 VENTAJAS QUE OFRECE LA HPLC
Elevada sensibilidad
Permite una altsima exactitud cualitativa
Es adecuada para la separacin de no voltiles y
termolbiles
No tiene limitaciones en cuanto al tipo de muestra
En cuanto a anlisis cuantitativo, presenta amplia
aplicacin en cuanto a materiales voltiles,
adems de mltiples componentes de la muestra
 CONCLUSIONES
Una de las principales ventaja del HPLC frente a otras
metodologas analticas clsicas es su especificidad,
permitiendo la separacin, identificacin y cuantificacin de
los componentes orgnicos ms complejos.

La HPLC analtica ha adquirido una especial importancia en

el campo de la investigacin y desarrollo cientfico,
encargndose del control de calidad farmacutico y el anlisis
medioambiental.

Una de las caractersticas resaltantes del HPLC es su alta re-

solucin, reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de
automatizacin que presentan; lo cual la hace ser una de
las tcnicas ms empleadas en el anlisis de diversas
formulaciones cosmticas y alimentarias
 GRACIAS
POR SU
ATENCION!!