ESPECTROSCOPA LUMINISCENTE:

Existe tres
de mtodos pticos relacionado entre s llamados
fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos
n
tipos
s
:
ellos,
las molculas de analto se excitan para dar una especie cuyo
Los mtodos se conocen colectivamente como procedimientos
espectro de
luminiscentes
emisin suministra informacin para el anlisis cualitativo y cuantitativo
La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitacin se
moleculares.
consigue

mediante la absorcin de fotones. Como consecuencia, con

frecuencia
se alude a los dos fenmenos con el trmino ms
La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las
general de fotoluminiscencia.
transiciones

electrnicas responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en

el espn

del electrn. Como consecuencia, la fluorescencia presenta

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia estn acompaadas

por un
cambio en el espn del electrn, que hace que la radiacin se mantenga
durante
un

tiempo

fcilmente

detectable,

despus

de

haber

acabado

la

irradiacin a
menudo varios segundos despus o ms. En la mayora de los casos, la
emisin
fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia,
Por de
esta razn las medida luminiscente se suelen combina
es
extraordinarias
tcnicas
de
cromatografa
y
s
s
r
mayor longitud de onda que la radiacin utilizada para
su
electroforesis.
excitacin.

En general los mtodos luminiscentes se

Uno
los aspectos
msmtodos
atractivos
aplicande menos
que los
de de la
luminiscencia
es analitos
su inherente
sensibilidad,
con lmites
absorcin en los
cuantitativos
debido
de
deteccin
que suelen
ser de que
uno absorben
a tres rdenes de
a que
el nmero
de especies
magnitud
inferiores /a visible
los encontrados
radiacin ultravioleta
es mucho en la

con
las

Teora de la Fluorescencia y de la
Fosforescencia
La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, lquidos y
slidos, tanto
El
tipo ms
sencillo
de fluorescencia es el que presentan los vapores
sencillos
como
complejos.
atmicos
diluidos. Por ejemplo:
Los electrones 3s de los tomos de sodio vaporizados pueden ser
Despus de
excitados
al 10-8 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental
radiacin de estas mismas longitudes de onda en todas las
a
emitiendo
estado
3p mediante la
absorcin de radiacin de longitudes de onda de 5
direcciones.
Este atipo de fluorescencia, en la cual la radiacin absorbida es
896
cambio de frecuencia, se conoce como radiacin de resonancia o
reemitida
sin
5
890 .
de
fluorescencia
resonancia.

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para diferenciar entre los fenmenos de fotoluminiscencia se

requiere una
revisin del spn del electrn y de los estados excitados singulete /
El principio de exclusin de Pauli establece que en un tomo no puede
triplete.
haber

- Espn del electrn:

dos electrones con los cuatro nmeros cunticos iguales. Esta

restriccin

requiere que no haya ms de dos electrones en un orbital, y

adems, los dos deben tener los estados de espn opuestos.
Cuando esto ocurre, se dice que los espines estn apareados.
Debido al apareamiento de espines, la mayora de las
molculas no presentan un campo magntico neto y se dice,
por tanto, que son diamagnticas, es decir, no son atradas
ni repelidas por campos magnticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones
desapareados,
tienen
un
momento
magntico
y,
consecuentemente, son atrados cuando se encuentran en un
campo magntico; por ello, se dice que los radicales libres son

- Estados excitados
Un estado electrnico molecular en el cual todos los espines de los
singulete/triplete
electrones
estn apareados se llama singulete y cuando la molcula se expone
a un
campo magntico no se produce un desdoblamiento de niveles de
energa.

Por otro lado, el estado fundamental para un radical

libre, es un estado doblete, porque el electrn impar
puede tomar dos orientaciones en un campo magntico, lo
que comunica ligeras diferencias de energa al sistema.
Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado
a un nivel de energa superior, se forma un estado
singulete o triplete. En el estado singulete excitado, el
espn del electrn promocionado continua apareado con el
electrn del estado fundamental; sin embargo, en el estado
triplete los espiones de los dos electrones se han
desapareado y, por tanto, estn paralelos. Estos estados

Velocidades de absorcin y de emisin

La velocidad a la cual se absorbe un fotn de radiacin

proceso
requiere
es
enorme,
el del orden 10-15 a 10- s. Por otro lado, la
fluorescente, tiene lugar a una14velocidad significativamente ms
de
emisin
lenta. El
tiempo de vida del estado excitado se relaciona inversamente
y 105, los tiempos de vida del estado excitado
10-9 a 10-7s.
con la
sistemas dbilmente absorbentes, donde la probabilidad del
son de
Para
absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al
proceso
de
de 10-6 a 10-5 s. Como se ha sealado, la velocidad promedio
proceso de
transicin es
triplete
a singulete
menorde
que
la pueden
correspondiente
ms pequea,
loses
tiempos
vida
ser tan largos
de una
excitacin. Por tanto, para absortividades molares comprendidas
transicin
como
entre 103
singulete a singulete. Por ello, la emisin fosforescente requiere
tiempos
comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores

Una molcula excitada puede volver a

estado fundamenta mediant
una
su
combinacin de varias etapas
l
e
Como
las flecha verticale
mecansticas.
rectas de la Figura, dos de estas
muestran
s
s
etapas,
etapas
desactivaci
indicadas
fluorescencia
y fosforescencia,
flecha onduladas,
proceso no
de
por
conllevan lan,
radiantes. El camino ms propicio
s
son
s
emisin de un fotn de radiacin. Las
hacia el
otras
estado fundamental es aquel que
minimiza
Por
otro de
lado,
si del
la estado
desactivaci
no
el tiempo
vida
excitado.
radiante tiene una constante de
n
Por
velocidad
ello, si la desactivacin por
ms favorable, la fluorescencia
fluorescencia es
desaparece
ms rpida que los procesos no

La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente

pequeo
de sistemas que incorporan caractersticas estructurales y
emisin puede competir cinticamente
ellos.
informaci
ambientales
referente a los procesos de emisin es suficientemente completa
con
La
n
que hacen que la velocidad de los procesos de relajacin
para
desactivacin
permitir un clculo cuantitativo de estas velocidades. Sin
no radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la
embargo, la
reaccin de
comprensin de los otros caminos de desactivacin es, en el
mejor de
los casos, rudimentaria; para estos procesos, slo se pueden
realizar

afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las

velocidades y los mecanismos.

Fosforescen
puede incluir

cia

la

estado
La desactivacin del
Una
transicin
que
estado
electrnico singulete es mucho menos probable
triplete
conversin
excitado singulete/singulete;
tambin una como se ha dicho, el tiempo de vida
triplete
de
un estado triplete excitado respecto a la emisin oscila
por 10-4 y 10
fosforescencia.
medio
o
ms. Por tanto,
emisin causada por una transicin de este tipo
Despus
del lacruce
entre
s
conversin
persisti
durante a untiempo despu que
irradiaci se hay
entre
sistemas
puede
interrumpido.
la
rexcitado,
algn
s
la
n
a
desactivacin
Las conversiones externas e internas compiten con tanto xito
posterior puede tener
con
lugarla
interna
o
externa
o
por
fosforescencia que este tipo de emisin se observa normalmente
fosforescencia.
slo a
bajas temperaturas, en medios altamente viscosos o por
molculas que

Variables que afectan a la fluorescencia y a la

fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entorno qumico van
a influir en que una sustancia sea o no luminiscente; estos
factores tambin determinan la intensidad de emisin
cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de
algunas
de estas variables.
Rendimiento

cuntico
El
rendimiento
cuntico, o la eficacia
cuntica,
de
fluorescencia
de
fosforescencia
es
simplemente
la
relacin
entre
el
nmero de molculas
que
emiten
luminiscencia

INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA

FLUORESCENCIA Y DE LA
FOSFORESCENCIA
Los distintos componentes de los
fotoluminiscencia son similares a los
para
espectrofotmetro ultravioleta/visibl
fotmetros o
configuracin caracterstica de estos
s
e.
y los

instrumentos
la medida de la
que se encuentran en los
La siguiente
muestr una
componentes en los fluormetros
grfica
a

espectrofluormetros. Casi todos los instrumentos de

fluorescencia utilizan pticas de doble haz tal como se
muestra, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la
fuente.

Radiacin
dispersada

Filtro o
Monocromador
de excitacin

Fuent
e

Muestr
a

Filtro o
Monocromador
de emisin

Atenua
do
rdel
haz

Fotomultiplicador
de
referencia

Fotomultiplica
dor de la
muestra
Amplificad
or
diferencial

Dispositivo de
lectura

El haz de la muestra pasa primero a travs de un filtro o un

monocromador de
excitacin, que transmite la radiacin que provocar la
fluorescencia pero

excluye o limita la radiacin de la longitud de onda de la

emisin fluorescente. La fluorescencia se propaga desde la
muestra en todas las direcciones pero lo ms conveniente es
observar la que forma un ngulo recto con el haz de
excitacin; a otros ngulos, la dispersin producida en la
disolucin y en las paredes de las cubetas aumenta y se
pueden cometer grandes errores en la medida de la
reduce
en un
de 100
o ms.
procedente del
intensidad.
La factor
radiacin
emitida
llegaLas
a un fotodetector
fotomultiplicador
de lapasado
muestra por
y delundesegundo
referencia filtro
se dirigen
a un
despus de haber
o
seales
s
monocromador
que asla la fluorescencia para su medida.
amplificador
El
haz de referencia pasa a travs de un atenuador que
diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro.
reduce su potencia a aproximadamente la de la radiacin
Algunos
fluorescente (normalmente la potencia se
instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condicin se
consigue con

Espectrometra de luminiscencia molecular

Componentes de los fluormetros y de los

espectrofluormetros
- Fuentes
En la mayora de las aplicaciones se necesitan fuentes ms
intensa
que las lmparas de wolframio o hidrgeno utilizadas en las
medidas
de absorcin.
De hecho, la magnitud de la seal de salida y, por tanto, la
sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente Po
de mercurio a baja presin equipada con una ventana de slice
- arco
Lmparas
fundida.
Esta
fuente
emite
tiles para de
producir
La lmpara
ms
comn
paralneas
los fluormetros
filtro esla la lmpara
de
previa
a excitacin
lneas individuales
se pueden
aislar313,
con546,
filtros
la fluorescencia
a 254, 302,
578,de
691interferencia
y 773 nm. o
absorcinLasadecuados. Ya que, en la mayora de los compuestos
fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas
longitudes
de onda, al menos una de las lneas del mercurio suele resultar
adecuada.

- Lseres
Desde los comienzos de los aos setenta, se utilizan tambin
diversos
tipos de lseres como fuentes de excitacin para medidas de
fotoluminiscencia.
Un
particular
colorante que
pulsante o un
inters tienen los
lseres
sintonizables
La
mayora de
de los espectrofluormetros comerciales utilizan
utilizan,
como
lmparas
sistema
de fuentes, por ser menos caras y menos complicadas
(ya
descritas) como
bombeo,
de uso. un
Sinlser
embargo, las fuentes de lser ofrecen importantes
de
nitrgeno
ventajas
en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras
lser
de Nd:YAG.
son muy
pequeas como en cromatografa con microcolumnas y en
electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o
menor; (2) en los sensores de control remoto, como en la deteccin
fluorimtrica de radicales hidroxilo en la atmsfera de clorofila en seres
vivos acuticos, donde la naturaleza colimada de los haces de lseres
vital: o (3) cuando se requiere una radiacin de excitacin altamente
monocromtica para minimizar los efecto de las interferencias
fluorescentes.

- Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorcin se han utilizado
en los fluormetros para la seleccin de la longitud de onda del haz de
excitacin y de la radiacin fluorescente resultante, mayora de los
espectrofluormetros estn equipados con al menos uno y a veces dos
monocromadores de red.
- Detectores
La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por ello, para su
medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos
fotomultiplicadores son los detectores ms
utilizados en
instrumentos
de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento
de fotones para mejorar la relacin seal/ruido. Tambin
utiliza, a
se
veces,
la refrigeracin de los detectores para mejorar la relacin
seal/ruido. Tambin
han propuesto, para los espectrofluormetros,
en serie y de transferencia de carga. Este tipo
se
los detectores
detectores permite
de
de
el registro rpido de los espectros de excitacin y
diodos
de emisin y particularmente son tiles en cromatografa y en
electroforesis

APLICACIONES Y MTODOS FOTOLUMINISCENTES

Es inherente a los mtodos fluorescentes y fosforescentes el ser
aplicables a
intervalos

de

concentracin

ms

bajos

que

las

medidas

espectrofotomtricas
de absorcin y se encuentran entre las tcnicas analticas ms sensibles
de Po y de P, ya que la absorbancia, es proporcional a la
de las
cantidades. La sensibilidad un
que
concentracin,
que
puedan
disponerpuede
los cientficos. aumentand
El aumentoPodeo sensibilidadl
mtodo
fluorimtrico
de
amplificacin
la seal
depende de laadicional
relacin de
entre
estas de fluorescencia. Por el
a
surge delmejorarse
o
mediante
espectrofotometra, un aumento en Po da lugar a un cambio
e
contrario,
dos
hecho de que el parmetro relacionado con la concentracin
n
proporcional
en P
en fluorimetra
y en fosforimetra F se puede medir

independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el

y, por ello, no afecta a la A. Por tanto, los mtodos fluorimtricos
contrario, una medida de absorbancia requiere la evaluacin
tienen,
generalmente, sensibilidades que son de uno a tres rdenes de
magnitud

superiores a los correspondientes de absorcin. Por otro lado,

Determinacin fluorimtrica de especies

Los mtodos inorgnicos fluorimtricos son de dos tipos. Los mtodos
inorgnicas
directos
que conllevan la formacin de un quelato fluorescente y la medida
de su
emisin.
Un segundo
grupo, que
se basa
enen
el el
descenso
Los reactivos
fluorimtricos
de ms
xito
anlisisde
delacationes son
fluorescencia
que
los que

resulta
de laestructuras
accin amortiguadora
la sustancia
a
presentan
aromticasdecon
dos o que
msva grupos
ser
determinada.
La ltima
tcnica la
se formacin
ha utilizado
en la con
funcionales
dadores
que permitan
dems
quelatos
determinacin
aniones.
el ion metlico.de
A continuacin
se muestran
El
nmero de
aplicaciones del anlisis fluorimtrico a especies
Reactivos
fluorimtricos
Determinacin
fluorimtrica
de
orgnicas
especiesyorgnicas
Por ejemplo,
y White han recopilado los
para
determinacin
de 200 sustancias, incluyendo una amplia
bioqumicas es de
impresionante.
Weissler
mtodos
la
ms
variedad de
importantes
encuentran
en elmedicinales,
campo del
compuestos de la fluorimetra
enzimas y se
coenzimas,
agentes
anlisis
de
orgnicos,

productos

productos
farmacuticos,
muestras clnicas
y productos
naturales, alimentarios,
esteroides vitaminas.
Es incuestionable
que las
aplicaciones

BIBLIOGRAF
A
Principio de Anlisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y
NIEMAN
Quinta
AnlisisEdicin.
Instrumental.
KENNETH
A. RUBINSON y JUDITH F.
Mc Graw
Hill.
RUBINSON
Prentice Hall. Madrid 2001.