ANTICUERPOS MONOCLONALES

HEMOCLASIFICADORES
Lic. Ren A. Rivero Jimnez, MSc.

INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E
INMUNOLOGIA

SISTEMAS DE GRUPOS SANGUNEOS DE

MAYOR IMPORTANCIA CLNICA

ABO
RH

Sistema ABO
1901: Primer sistema descubierto por Karl
Landsteiner
Solo dos antgenos, A y B podan
explicar la existencia de 4 grupos:

A
,
B
,
A
B
,
O
Pero los antgenos A y B son el resultado del funcionamiento
sinergstico de dos sistemas genticos independientes:
El Hh, donde el gen activo H (cromosoma 19)
crea una enzima que funciona aadiendo
azcares a un substrato precursor, antes de la
accin de los genes A y B (cromosama 9)

Sistema ABO
Antgeno H

Antgeno
A

Antgeno B

Ceramida

Glucosa

Galactosa

N-acetilglucosamina

N-acetilgalactosamina

Fucosa

Sistema ABO
Eritrocitos
Genotipos

Suero
Fenotiposa Anticuerpos

Glucosiltransferasas

A1A1, A1A2, A1O

A1

Anti-B

-3-N-acetilgalactosaminil

A2A2, A2O

A2

Anti-Bb

-3-N-acetilgalactosaminilc

BB, BO

Anti-A

-3-galactosil

A1B

A1B

---

-3-N-acetilgalactosaminil
y -3-galactosil

A2B

A2B

---b

-3-N-acetilgalactosaminil
y -3-galactosil

OO

Anti-A
y Anti-B

----

Leyenda: aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces presente en el
suero de individuos de los grupos A y A B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del

Sistema ABO

Fenotipo A1

Fenotipo A2

Sistema ABO
Expresin antignica:
Forma soluble
lquidos
excepto el LCR
Otras clulas
(adsobidos
plasma).
Tejidos
sobre
Amplia
tejidos

(secretores)

Saliva

sanguneas Linfocitos,

todos los
corporales,

plaquetas
del

En casi todas la cel epiteliales

(epitelio
glandular)
y
clulas
endoteliales.
distribucin en
(Histo-

sanguneos)

Sistema ABO
Los heterocigotos no se distinguen de los
homocigotos: A1A1, A1A2 y A1O: todos reaccionan igual
con Anti-A.

Frecuencia de los grupos ABO en

Cuba:
Grupo
A

A1

27,67

A2

8,26

variantes dbiles

0,75

B
AB

11,2
A1 B

2,28

A2 B

0,81
49,03

36,68

3,0
9

Sistema ABO
Caractersticas Generales de los
Anticuerpos ABO:
Alta importancia clnica.
Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los
individuos que no portan el antgeno en sus eritrocitos
(evento nico en la serologa de los grupos sanguneos).
Se usan de forma habitual para la determinacin de los
grupos sanguneos (grupo reverso).
Son aglutininas fras usualmente clase IgM.
Activan el Complemento.
Causan hemlisis cuando son activos a 37 C (calientes).

Sistema ABO
Anticuerpos ABO:
Desarrollo con la edad:
En

sangre de cordn umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de

origen materno.

Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase

IgM).
Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 aos de edad.

Epitopo D

exterior
membrana
interior
Protena Rh

Cadena lateral

Banda 3 transportador de aniones

Cadena lateral

Banda 4 transportador de glucosa

Sistema Rh
Se descubri en 1940 por Weiner y
Landsteiner.
Despus del ABO, el ms
importante en la clnica:
Anti-Rh causa reaccin
transfusional hemoltica
Incompatibilidad madre-hijo:
enfermedad hemoltica del feto y
del recien nacido.
Se han descrito hasta 52 antgenos.

Sistema Rh
Cromosoma: 1p36.13-p34.3
Nombre de genes: RHD, RHCE
Nombre del producto de los genes: polipptido
RhD, polipptido RhCE.
No. de exones: RHD 10, RHCE 10.
Expresin:
Eritrocitos de sangre de cordn.
No formas solubles.
Tejidos:

Especficos de la lnea
eritroide.

Sistema Rh
El polimorfismo del RhD es nico.
La mayora de los que portan el gen D, tienen
un polipptido D completo.
Pero existen variantes dbiles, por expresin
disminuda o incompleta.

Anticuerpos vs. Rh(D):

. Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes
por su origen (no naturales).
Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3.
Pocas veces fijan Complemento
Aparecen en individuos D negativos o en D

Produccin de reactivos
hemoclasificadores basados en
sueros humanos policlonales:
Cada lote es una mezcla diferente de molculas
obtenidas de distintos donantes.
Cada lote se comporta de forma diferente frente a las
expresiones dbiles del Ag.
Hay diferente avidez.
Pueden presentar poli aglutinacin frente al antgeno
crptico Tn.
Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para
corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B.

Generacin
de
hibridomas
:

Ventajas de los Reactivos basados

en AcM:
Cada reactivo monoclonal es:
Una aglutinina directa.
Slo una clase de Inmunoglobulina
(IgM, IgA o IgG).
De slo una especificidad
epitpica.
De slo una avidez

Produccin de los AcM:

Altamente laboriosa e intensiva en la
etapa de generacin de hibridomas,
clonajes y caracterizacin de las lneas
clulares.
Ms simple
enreactivo
la etapapuede
de produccin
a
Cada
ser:
gran escala.
Un nico AcM
Una mezcla de AcM
Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B
son mezclas., para que funcionen mejor en
los distintos mtodos de hemaglutinacin.

Especificaciones para
garantizar la calidad de los
reactivos hemoclasificadores
basados en AcM:
Establecer la concentracin o titulo de AcM y condiciones de la
solucin amortiguadora (pH, conc. Salina).
Clonaje celular por 3 veces, garanta de la monoclonalidad.
Crear bancos de clulas semilla Maestros y de Trabajo.
Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma
congelado. Cultivar y expandir las clulas mediante pases seriados
por no mas de 3 meses. Despus de este tiempo: desechar los
cultivos.

Errores que se deben evitar:

1. AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenmenos B(A) o A(B):
cantidades muy pequeas del antgeno contrario presentes
normalmente en algunos individuos. Solucin: diluir los AcM.
2. Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino
una estructura estrica muy similar, que produce alta reaccin). Se
adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades
reumticas, etc. Solucin: formular el reactivo en pH alcalino.
3. Algunos AcM producen reaccin en monocapa en tubos y
microplacas. Solucin: Tratar microplacas y tubos con Tween.
Aadir albmina o gelatina a la formulacin en un bajo %
(albmina como mximo 3%, gelatina como mximo 1%). Mejor:
albmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.

Problemas para la obtencin

del anti-D monoclonal:
Mosaico D:
Ag D es un mosaico de mas de 30 eptopos.
Cada AcM detecta un solo eptopo.
No todas las clulas D+ expresan todos los eptopos de
D.
Du= D normal pero con bajo numero de sitios en
eritrocitos.
Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningn AcM AntiD detecta a todas las variantes, todos dejan algo.
El problema es escoger al que detecta a los mas
importantes eptopos para una correcta clasificacin.
Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes

Ag D no es inmunognico para ratones BALB/c:

imposible obtener monoclonales murinos anti-D.
Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG
(poco aglutinantes): se debe seleccionar molculas
IgG3: molcula mas abierta mejor aglutinante.

Produccin de AcM anti-D humanos:

Sangre de
donantes
inmunizados
Leucocitos + VEB

AcM Anti-D
IgG - IgM

Lnea celular B transformada

+ / -fusin
Clonajes

Reglas de Oro de la Calidad en

reactivos hemoclasificadores:
Nivel seguro en el titulo de anticuerpos.
La especificidad, potencia, y avidez
dependen de la concentracin.
Medicin de la concentracin de Ac por
ELISA. Ej. Uso de conjugado anti-IgM o IgG de
ratn.
Garanta del pH final del producto: rango
general 6.5-7.2.
Se adiciona HEPES cuando se cosechan los
sobrenadantes.
Fortaleza inica elevada, incrementa la

ADITIVOS:
EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos
no lavados. Tambin previene la degradacin por
proteolisis
Gelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen
monocapa con eritrocitos.
Colorantes: Coloracin intensa
resultados en microplacas.

puede

afectar

Control de Calidad:
Chequeo sistemtico para demostrar que todo se hizo
correctamente en la produccin:
Pruebas:
Especificidad

Reaccin completa: 4+

Potencia: A o B
fuertes A1 o B
Titulacin con 2% de SAB
A2B

1/64 con fenotipos

1/8-16 con fenotipos dbiles:
o A 1B

para mantener la conc. de

protenas mientras se diluye.
Avidez:
segundos.

segn protocolo 5-10

Adicional: medir concentracin de azida, conc. protenas,

Mtodos de Produccin:
En animales de experimentacin: Liquido asctico murino
(LAM).
Ej. Anti-A, Anti-B.
En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular
el anti-D.(Mejores que los tanques agitados para la
concentracin de Ac).
Chequear niveles de glucosa en el medio.
Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio
extracapilar (las clulas y el SBF deben estar en el EE,
mientras el medio se bombea al espacio intracapilar.
La estabilidad de las lneas celulares mejora con los
reclonajes.

NUEVAS TECNOLOGIAS:

Nos vemos en Hematologa Habana

2005!!
16-20, 2005
4toMayo
Congreso
de la
Sociedad Cubana de
Hematologa