SECUENCIAMIENTO

PRESENTADO Por:

IN TR O D U C C IO N

El trmino secuencia designa la

composicin de nucletidos en un
trozo de ADN.

Ese
trozo
de
ADN
puede
corresponder a un gen, un
genoma, o una parte de ellos.

Secuenciar permite determinar el

tipo y orden de sus nucletidos.

Para obtener el genoma basta

secuenciar una sola copia del ADN.

En el humano se secuencian aprox.

3.400 millones de pb.

Q U ES Y EN Q U E
C O N SISTE LA
SEC U EN C IA C I N D E A D N ?

Es una tcnica en la que se hace un

anlisis ms detallado de la estructura del

ADN y consiste en un conjunto de tcnicas
y mtodos bioqumicos que nos permiten
averiguar la secuencia de los nucletidos
(A, C, G, T) en el ADN.

P R IN C IP IO S EN Q U E SE
B A SA LA SEC U EN C IA C IO N

Las tcnicas de secuenciacin empleadas actualmente de forma

rutinaria estn basadas en metodologas publicadas en 1977:

El mtodo de Sanger y el de MaxamGilbert, siendo el primero el ms popular.

Ambos se basan en la generacin de una poblacin de molculas marcadas

radiactivamente, que representan todos los tamaos y combinaciones posibles.

H ISTO R IA

1976-1977, Allan Maxam y

Walter Gilbert desarrollan un
mtodo para secuenciar ADN
basado en la modificacin
qumica del ADN y posterior
escisin en bases especficas.

1975, Sanger presenta un

mtodo
de
secuenciacin
enzimtica.

1980, Sanger y Gilbert reciben

el premio Nobel de Qumica.

EL M TO D O D E D EG R A D A C I N
Q U M IC A (M A X A M A N D G ILB ERT,
1977)

Se usa P radioactivo para marcar el

ADN.

Se
fracciona
con
reacciones
especficas para cada base.

4 alcuotas de la misma muestras

se tratan en condiciones diferentes
(DMS (G), cido frmico (A+G),
hidrazina (C+T) e hidrazina ms
sales (C) ).

Tratamiento con piperidina rompe

en la base modificada.

Los productos se separan en gel por

electroforesis segn su tamao.

Las reacciones qumicas

que se utilizan para
fragmentar la molcula
de ADN son:
1. Corte de las purinas.
2. Corte de adeninas.
3. Corte de pirimidinas.
4. Corte de citosina.

M TO D O EN ZIM TIC O D E
SA N G ER

El mtodo de secuenciacin
ideado por Sanger est basado
en
el
empleo
de
dideoxinucletidos.

Cuando
uno
de
estos
nucletidos se incorpora a una
cadena de DNA en crecimiento,
esta
cadena
no
puede
continuar elongndose.

Esto es as ya que la DNA

polimerasa necesita un grupo
terminal 3 OH para aadir el
siguiente
nucletido
y
el
dideoxinucletido incorporado
carece de este grupo hidroxilo.

 Se asla y se clona el DNA que se desea secuenciar.

Se emplea una sola hebra para la secuenciacin.
Se utiliza un primer que se encarga de suministrar el terminal 3OH que

necesita la DNA polimerasa para comenzar a elongar.

Se preparan cuatro tubos de reaccin, cada uno con el DNA molde de hebra

sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el primer y con
los cuatro nucletidos trifosfatados.
A cada tubo se le aade dideoxinucletido trifosfato; ddATP, ddTTP, ddGTP y

ddCTP.
En cada tubo se producen cadenas de DNA de distintas longitudes.
Los productos de las 4 reacciones, son cargados en un gel y sometidos a

electroforesis.
As, obtendremos un patrn de bandas en orden, del que deducir la secuencia

del ADN introducido.

Existen
modificaciones
metodologa.

algunas
en
la

Se pueden usar cebadores

marcados por fluorencencia
o ddNTPs marcados.

Facilitan la deteccin de los

nucletidos.

Permite realizar una sola

reaccin.

 SECUENCIACIN POR TERMINADOR

FLUORESCENTE:

La mayor ventaja de este mtodo es que la

secuenciacin se puede llevar a cabo en
una sola reaccin, en lugar de en cuatro
reacciones como en el mtodo del cebador
marcado:

Se marcan cada uno de los cuatro

didesoxinucletidos que terminan la cadena
con un colorante fluorescente diferente, con
fluorescencias a diferentes longitudes de
onda.

Este mtodo es atractivo por su gran

capacidad y rapidez y actualmente es el
mtodo de referencia en la secuenciacin
automatizada con analizadores de secuencia
controlados por computadora.

SECUENCIACIN ALELO-ESPECFICA

POR BISULFITO:

Es una variante de la secuenciacin Sanger

utilizada para el mapeo de metilaciones
alelo-especficas en los sitios CpG.

P IR O SEC U EN C IA C I N

Mtodo de secuenciacin de
ADN en tiempo real.

Basado en la liberacin de los

pirofosfatos
(PPi)
en
la
reaccin de polimerizacin del
ADN a partir de sus dNTPs.

No requiere correr en un gel

los
fragmentos
de
ADN
generados.

A medida que la reaccin

transcurra, se obtiene una
serie de picos de seal en el
pirograma

P IR O SEC U EN C IA C I N
Tres pasos:
Adicin

de uno de los 4 dNTPs , si es el

complementario a la base de la hebra molde que
toca copiar, ser procesado, liberando un PPi.
PPi es convertido a ATP al reaccionar con adenosina
5- fosfosulfato por medio de la ATP-sulforilasa.
Emisin de radiacin como consecuencia de la
oxidacin de la luciferina a oxiluciferina catalizada
por la luciferasa de consumiendo el ATP

P IR O SEC U EN C IA C I N

La altura de los picks

se correlaciona con la
cantidad
de
nucletidos agregados.

A mayor altura mayor

nmero de nucletido
agregados de forma
consecutiva.

A U TO M ATIZA C I N Y PR EPA R A C I N
D E LA S M U ESTR A S
Los instrumentos modernos automticos de secuenciacin del ADN
(secuenciadores de ADN) pueden secuenciar ms de 384 muestras
marcadas por fluorescencia de una sola vez y llevar a cabo 24 ciclos
de secuenciacin al da. No obstante, los secuenciadores automticos
de ADN llevan a cabo solamente separacin del ADN basada en el
tamao (por electroforesis capilar), deteccin y registro de la
coloracin fluorescente, y los datos resultantes se dan como
cromatogramas que registran los picos de fluorescencia. Se efectan
por separado las reacciones de secuenciacin mediante una
termocicladora, lavado y resuspensin en una solucin tamponada
antes de pasar las muestras al secuenciador.

D ESCR IPCI N D EL M TO D O AU TO M TICO D E

SECU EN CIA CI N

La principal diferencia entre mtodo enzimtico de terminacin de cadena

y el mtodo automtico de secuenciacin radica, en primer lugar en el
tipo de marcaje.

En el mtodo automtico en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y

lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con
nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este
sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al
mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas
de reaccin.

La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los

fragmentos de ADN. La deteccin del tipo de fluorescencia
correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la
electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamao
que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este
sistema aumentar el nmero de nucletidos que se pueden determinar en
cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciacin.

 En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia

obtenida por el mtodo automtico de secuenciacin. Cuando

aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar
el nucletido existente en esa posicin de la secuencia.

N U EV O S M TO D O S D E SECU EN CIA CI N

La
elevada
demanda
de
secuenciacin de bajo coste ha
dado
lugar
a
las
distintas
tecnologas de secuenciacin de
alto rendimiento. Se pretende que
las tecnologas de secuenciacin de
alto rendimiento disminuyan los
costes de secuenciacin de las
bibliotecas de ADN ms all de lo
que se puede hacer con el mtodo
corriente del terminador marcado
basado en la separacin del ADN
por electroforesis capilar. Muchos de
los nuevos mtodos de alto
rendimiento usan mtodos que
paralelizan
el
proceso
de
secuenciacin, produciendo miles o
millones de secuencias a la vez.

AMPLIFICACIN CLONAL IN VITRO:

La mayora de los mtodos utilizan un paso

con clonacin in vitro para generar muchas
copias de cada molcula individual. Uno de
los mtodos es la PCR de emulsin, en la
que se aslan las molculas individuales de
ADN junto con microesferas recubiertas con
cebadores en burbujas acuosas dentro de
una fase oleosa.

ILLUMINA (SOLEXA):
En este mtodo, se usan polimerasas
diseadas por la empresa y nucletidos
fluorescentes y de terminador reversibles.
Las hebras de ADN y los primers se pegan a
un portaobjetos, y se lleva a cabo una
amplificacin por la polimerasa, de forma
que se crean colonias locales de ADN o
"clusters de ADN".

GRACIAS!!!
POR SU ATENCIN