REACCIN EN CADENA DE

LA POLIMERASA P. C. R.

INTRODUCCIN

 Qu es PCR?
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es
una tcnica enzimtica que permite la amplificacin in
vitro de una regin especfica del ADN dando como
resultado la obtencin de millones de copias.

Se desarroll a principios de 80s por el Dr. Kary Mullis.

El gran poder del PCR reside en su elevada especificidad,
sensibilidad y a la vez versatilidad.
La especificidad y la versatilidad del PCR permiten que
cualquier secuencia de ADN pueda ser detectada utilizando
un corto oligonucletido

ESTRUCTURA DEL
ADN

FUNDAMENTO
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de losADN polimerasaspara
replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y
bajastemperaturasalternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre
s tras cada fase dereplicaciny, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan
a unirse para poder duplicarlas nuevamente
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas sedesnaturalizabanal realizar
los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Las temperaturas del ciclo (95C en las fases dedesnaturalizacindel ADN) suponen
la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extradas de microorganismosadaptados a vivir a esas temperaturas,
restrictivas para la mayora de los seres vivos. como:Thermus aquaticus(polimerasa
Taq),

Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado

mediante un aparato llamadotermociclador, que
permite calentar y enfriar los tubos de reaccin
para controlar la temperatura simplemente
invirtiendo la corriente elctrica. Necesaria para
cada etapa de la reaccin.

Los tubos usados para PCR tienen una pared muy

fina, lo que favorece una buenaconductividad
trmica, permitiendo que se alcance rpidamente
elequilibrio trmico. Casi todos los termocicladores
calienta la tapa de cierre con el fin de evitar
lacondensacinsobre los tubos de reaccin

PROCESO DE P. C. R.

COMPONENTES PARA EL P.C.R.

 QU ES UN OLIGONUCLEOTIDO, PRIMER O CEBADOR?

Un oligonucleotido es un muy pequeo

fragmento de ADN
El oligonucletido puede ser tan corto
como 10 bases de longitud.

CMO ELEGIR LOS

PRIMERS??
18-30 bases de largo Complementarios a ADN
Flanquean la regin a amplificar
No deben formar estructuras secundarias solos o
con su par (Ej. Horquillas, dimeros)
La temperatura de fusion (Tm) de los primers
deben ser similares
Tm: Temperatura a la cual los primers estan 50%
unidos a la hebra molde.
% G-C deben ser similares entre ambos primers

ETAPAS DEL P. C.
R.
Denaturacin inicial
Denaturacin
Hibridacin o Anillamiento
Extensin
Extensin final

Como se descontamina una superficie de DNA?

-

Detergentes o jabones
NaOCl
Calor
Acidos
Bases
Luz ultravioleta
Radiacin actnica
DNAsas

94oC
72oC
55oC

Perfil tipico de
temperaturas en el
PCR

94oC
72oC
55oC

Perfil tipico de
temperaturas en el
PCR

94oC
72oC
55oC

Perfil tipico de
temperaturas en el
PCR

Primer ciclo de amplificacin

5

2 ADN moldes

El segundo ciclo de amplificacin produce 4 ADN molde