Presentado por:

Dra. Irene A. Gómez Espinel

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA CLÍNICA
2007
El ADN y su duplicaciòn
Componentes del
ADN:
Azúcar
Bases
Grupo fosfato
Azùcares
Bases nitrogenadas
Complementariedad de las bases
 Bases
BASE
nitrogenadas
NUCLEÓSIDO Nucleótidos

A desoxiadenosina dAMP dATP desoxiadenosín trifosfato

Adenina
T desoxitimidina dTMP dTTP desoxitimidín trifosfato
Timina

G Guaninadesoxiguanisina dGMP dGTP desoxiguanosín trifosfato

C desoxicitidina dCMP dCTP desoxicitidín trifosfato

Citosina
U
Uracilo
DUPLICACIÒN DEL ADN
APLICACIÓN
 Tipificación
 En el Laboratorio de Biología Molecular del
departamento de patología clínica del HU.

 A partir de ADN obtenido de sangre periférica.

 La tipificación de los genes HLA (HLA-A, HLA-B,

HLA-DR).
Obtención de la muestra
EXTRACCIÓN DE ADN
ADN
omprobación cualitativa de la presencia de AD
Comprobación cualitativa de la presencia de
ADN
 Comprobación cuantitativa de la
presencia y pureza del ADN

FORMULA:
Ng/µl de ADN = (D.O 260 nm)(Factor de dilución)
(50)
Factor de dilución = volumen total de la celda (1005)/
volumen de muestra (5 µl) = 201
50 = factor para ADN de doble cadena
35 = factor para ADN de cadena sencilla

40 = factor para ARN

 Reacciòn en Cadena de la Polimerasa
(PCR)

Técnica de laboratorio simple y rápida de

amplificación del ADN que hace posible
obtener múltiples copias y la identificación de
secuencias específicas de ADN por medio de
ciclos repetitivos utilizando el termociclador

1983
 Historia de la PCR
•1983 Kary Mullis Inventa la PCR
•1985 Primera publicación científica
•1986 Cetus corparation y Perkin Elmer inician
desarrollo de reactivos e instrumentos para PCR
•1988 Se publica el uso de la Taq para PCR (Saiki et al)
•1990-1993 Batalla de las compañías por los derechos
de fabricación de reactivos.
•1993 Kary Mullis recibe el premio Nobel en Química.
 Componentes de la PCR

- DNA molde concentración de 25-200 ng/µ l.

-Iniciadores. (oligonucleotidos, primers, Cebadores).
- dNTP´S. (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
- DNA Polimerasa termoestable. (Taq, Tli, Pfu)
- Reguladores (Mg+2)
- Ciclos de temperatura (Termociclador)
Termocicladores
PCR: pasos y ciclos
 Pasos de la PCR
1.- Desnaturalización del DNA (95 0C)
 Pasos de la PCR
2.- Hibridación del Iniciador (50-70 0C)- Alineamiento
 Pasos de la PCR
3.- Polimerización (72 0C)
Ciclos de la PCR
PCR
Termocicladores MJ Research

PTC-100 Dyad

Tetrad Opticon
 Tipos de PCR

- PCR

- PCR-RFLP
- PCR in situ
- RTPCR
- PCR en tiempo real

-PCR POR GRUPOS ALÉLICOS

 IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE
LOS GENES HLA-A EN POBLACIÒN
DEL NORESTE DE MÈXICO
 Sistema HLA
Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA:

• Son moléculas que se encuentran en los

leucocitos y en la superficie de casi todas las
células de los tejidos de un individuo.

• Reconocen lo propio y lo ajeno

Moléculas
Complejo
Mayor de

• Aseguran la inmunidad.
Histocom
(CMH)
Clase I y
Clase II
 Sistema HLA
• Transmitidas de padres a hijos

• También denominado de Histocompatibilidad

• Existen tres clases de antìgenos HLA I, II, III

• En los de clase I, existen tres "lugares

estratégicos": HLA-A, HLA-B y HLA-DR
Moléculas
Complejo
Mayor de
Histocom
(CMH)
Clase I y
Clase II
Cromosoma No. 6
 Sistema HLA
• El tipo de antígeno presente en A, B y DR es lo que
determina la posibilidad de aceptación del tejido de
un donante por el organismo de un receptor.

• Para que dos personas sean compatibles, los

antígenos presentes en cada uno de los tres lugares
deben ser idénticos.

• Análisis del ADN en sangre.

Evoluciòn de los alelos
 Alelos de HLA identificados al 2006

Clase I A B C E F G H J K L Total

266 511 128 6 1 15 0 0 0 0 927

Clase II DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB

3 403 23 53 20 101 4 6 8 8 629

TOTAL 2532
 Genética

• Los genes del Sistema HLA se heredan siempre en bloque.

• Cada bloque se denomina haplotipo.

• El padre aporta un haplotipo (=mitad del genotipo) y la

madre otro, dando origen al genotipo, perfil genético propio
o individualidad del nuevo ser.
 Genética
Sistema HLA
Padre Madre

Haplotipo a Haplotipo b Haplotipo c Haplotipo d

Hijos

Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3 Combinación 4

Genotipo a-c Genotipo a-d Genotipo b-c Genotipo b-d

 Genética
 a b

c ac bc

d ad bd

25 % ac, 25% ad, 25% bc, 25% bd

25% de posibilidades de coincidir con un hermano

Gen de HLA
PCR
 ELECTROFORÈSIS
Es el movimiento de partículas eléctricamente cargadas, a
través de un gas, líquido y en soportes sólidos o semisólidos
(geles), como resultado de un campo eléctrico formado entre
los electrodos sumergidos en el medio acuoso.
 Corrimiento electroforético
Carril de
Cátod ejemplo
o EXON 3

Apilado
del gel MPM
EXON 2 Marco
Corrimien de
to del gel plástic
o
Ánod
o
 Revelado de los geles
• Pasos a seguir:
1.- Solución fijadora 10´
2.- Colorante AgNO3 5´
3.- Lavar de 2 a 3 veces con
H2O.
4.- Solución reveladora.
5.- Solución fijadora
 Interpretación de resultados.

Estos se realizan observando el DNA teñido

con bromuro de etidio en un gel de agarosa.
Interpretación de resultados.
Con Nitrato de plata
 Resultados
1° A*02 27.6 %
2° A*03 18.4 %
3° A*24 13.8 %
4° A*31 7.9 %
5° A*68.69 7.2 %
6° ¿ 6.6 %
7° A*29 4.6 %
8° A*68 3.9 %
9° A*26 3.3 %
10° A*30 2.6 %
11° A*01 2.6 %
12° A*2607 1.3 %
 Enfermedades asociadas a genes HLA

 Espondilitis anquilosante HLA-B27

 Síndrome de Reiter HLA-B27

 Enfermedad celìaca y hepatitis crónica activa HLA-B8

 Diabetes tipo 1 HLA-DR3 y DR4.

 Artritis reumatoide con HLA-DR4.

 Esclerosis múltiple HLA-DR2.

 VENTAJAS ESTUDIO DE ADN
1. Se puede detectar una mayor información que con la

serología
2. Los resultados pueden guardarse indefinidamente
3. Se pueden identificar todos los componentes del
sistema HLA
4. más fiable en cuanto a la identificación de cada
individuo.
5. Más exacto ya que se eliminan reacciones cruzadas
6. Rapidez en los resultados.
Puntos críticos en la técnica de PCR

1. Riesgo de contaminación:
• ADN de la muestra
• Moléculas de ADN previamente amplificadas
1. Alto costo de los reactivos y equipo
2. Espacio físico específico
Secuenciación automática
Secuenciaciòn de ADN
Cromosoma 6

GRACIAS