DESARROLLO

Y MANEJO DE
INCULO
1. MODELO DE CRECIMIENTO
MICROBIANO
El modelo matemtico de
crecimiento microbiano
relaciona la variacin del substrato con los
microorganismos que lo consumen dentro
de un reactor biolgico que supone un
sistema completamente mezclado
Los modelos matemticos permiten predecir
la velocidad de crecimiento de los
microorganismos en funcin de
determinadas condiciones ambientales.


Algunos de los factores principales que
afectan el crecimiento microbiano son la
temperatura y el pH, por lo cual deben
tenerse en cuenta para lograr una
determinada prediccin.

La aplicacin de modelos matemticos
se realiza en dos etapas principales:

1. Modelado de la curva de crecimiento
del microorganismo
2. Descripcin de la variacin de los
distintos parmetros que afectan a
dicha curva.

Se pueden clasificar en tres niveles:
1. Modelos de nivel primario
2. Modelos de nivel secundario
3. Modelos de nivel terciario

Modelos Matemticos de Nivel
Primario
Se ocupan de la descripcin de los
cambios del nmero microbiano en
funcin del tiempo (crecimiento,
supervivencia, inactivacin).
Muchos de los modelos primarios
desarrollados hasta ahora son modelos
deterministas de poblacin. En estos
modelos, la evolucin del nmero total
de clulas de una poblacin es descrita
a travs de un sencillo conjunto de
parmetros (mxima densidad
poblacional, velocidad de crecimiento
especfico, fase de latencia).
Modelos Matemticos de Nivel
Primario
Modelos Matemticos de Nivel
Secundario
Caracterizan los parmetros que pueden
aparecer en los modelos primarios en
funcin de las condiciones del medio
(temperatura, pH, actividad del agua, etc.).
Permiten considerar cmo dos o ms
factores interactan sobre el crecimiento
microbiano.
Modelos Matemticos de Nivel
Secundario
En el pasado los modelos secundarios para
el tiempo de latencia solamente incorporaban
el efecto del ambiente de incubacin. Hoy en
da han surgido muchos ms modelos que
incluyen otros factores relevantes como las
condiciones de pre incubacin. Estos
podemos agruparlos en dos secciones:
Modelos que calculan la duracin de la fase de
latencia en funcin de las condiciones de
incubacin.
Modelos que calculan la duracin de la fase de
latencia en funcin de las condiciones de pre
incubacin y de incubacin.
Un ejemplo de modelo secundario lo es
el valor Z, que es el cambio de
temperatura necesario para disminuir el
valor D un 90 %, y que es el que se usa
en los procesos tcnicos.

Modelos Matemticos de Nivel
Secundario
Modelos Matemticos de Nivel
Terciario
En estos destacan los llamados sistemas
expertos, al cual corresponde los
programas computacionales que emulan
el razonamiento y la toma de decisiones
de expertos humanos.

2. REQUERIMIENTOS
NUTRICIONALES
Los microorganismos necesitan de:
Agua, energa, carbono, nitrgeno,
minerales, vitaminas, oxgeno (en el
caso de aerobios)
Fuente de energa
Fuente de carbono
El constituyente principal de los
microorganismos
Los microorganismos se pueden
clasificar, con base en su capacidad de
asimilacion de la fuente de carbono, en :
Autotrfos: el co
2
es su unica fuente de
carbono.
Heterotrfos: los compuestos organicos
constituyen su fuente de carbono. Son
los de mayor importancia comercial.

Las fuentes de carbono mas comunes
incluyen melazas de caa y de
remolacha, granos de cereales,
almidn, glucosa, sacarosa y lactosa.
La sacarosa, a su vez, se obtiene del
azcar de caa o remolacha
La fuente de carbono se elige segn una
serie de aspectos, entre los que se
encuentran:
El precio de venta del producto final.
La presencia de impurezas en la fuente
de carbono y el grado de facilidad con el
que se logra eliminar.
La legislacin gubernamental sobre el
tema.
El mtodo de esterilizacin empleado,
pues afecta la naturaleza de ciertas
sustancias.

La fuente de nitrgeno

Despus del carbono y del oxgeno, el nitrgeno es el elemento
ms abundante en la composicin de los microorganismos.
A escala industrial se utilizan fuentes complejas de nitrgeno,
como por ejemplo: el licor de maceracin del maz, la harina de
soya, los frijoles de soya, la harina de maz, la harina de semillas
de algodn (nombre comercial: Pharmamedia y Proflo), el
hidrolizado de casena, los desechos de matadero, la harina de
pescado y el extracto de levadura.
Las fuentes de otros elementos

Adems de carbono y nitrgeno, los microorganismos requieren
otros elementos para subsistir, aunque en menor cantidad; entre
ellos se hallan azufre, el fosforo, el potasio, el magnesio, el calcio
y el cloro.
Los fosfatos son la principal fuente de fsforo para la nutricin
microbiana. Estos compuestos son reguladores de pH; se agregan
en exceso que no se agoten durante el proceso.
Son necesarios en la estimulacin de crecimiento; se deben
adicionar al medio de cultivo, ya que no todos los
microorganismos pueden sintetizarlos. Se clasifican en tres
grupos: vitaminas, aminocidos y factores miscelneos de
crecimiento.
Vitaminas
(1)
Aminocidos
(1)
Factores
miscelneos
(1)
Tiamina Arginina cidos grasos
Biotina Lisina cidos grasos
Acido nicotnico Triptfano Tween 80
Riboflavinas Metionina Esteroles
Piridoxal Cistina
cido pantotenico Tirosina
cido lipoico Fenilalanina
Acido p-
aminobenozoico
Acido glutmico
ELEMENTOS TRAZA

Se define como elemento traza esencial a elementos inorgnicos
necesarios en pequeas cantidades en el organismo, para la
utilizacin de los macronutrientes. Para definirlos como
esenciales deben cumplir con una de las siguientes caractersticas:

Estar presente en los tejidos sanos de cualquier ser vivo.
Tener una concentracin constante en las diferentes especies.
La ausencia de uno de estos elementos debe producir
alteraciones funcionales o estructurales reproducibles.
Prevenir la anormalidad con la adicin del elemento
La anormalidad producida debe asociarse a cambios
bioqumicos especficos reversibles con la sustitucin del
elemento.
3. NECESIDADES LOGSTICAS
PARA EL DESARROLLO DE
INCULO
Tanque de Semillas (seeding tank)
Cilindro interior, mas recubierto exterior material
de aislamiento trmico.
material de acero inoxidable.
Diseo de estructura ideal, fcil
operacin.
Garanta de sanidad, la tapa superior se
abre en forma giratoria, estructura
totalmente
hermtica para capacidades de
mas de 400L








Parmetros del tanque de
semillas(seeding tank)
Volumen
efectivo (L)
Altura total
(mm)
Capa aislante
(mm)
Potencia
del motor
(kw)
Velocidad de
mezclar/min

100 1700 38 0.45 40
200 1850 38 0.55 40
300 2100 38 0.55 40
400 2150 38 0.55 40
500 2300 38 0.75 40
600 2300 38 0.75 40
DISEO DEL BIORREACTOR
El tanque debe disearse para que funcione
aspticamente durante varios das.
Debe permitir una mayor rea de contacto entre las fases
bitica y abitica.
El consumo de energa debe ser
el mnimo posible
El crecimiento microbiano es
generalmente exotrmico
Suministrar oxigeno a una velocidad tal
que satisfaga el consumo.
El diseo debe ser tal que permita
mantener el cultivo puro.


Los biorreactores mas utilizados a
nivel industrial estn provistos de
mecanismos de agitacin, dispersin
y aireacin as como de sistemas
para el control de la temperatura, pH.


Los biorreactores deben ser
optimizados para obtener la
mxima concentracin de
productos de la fermentacin.

BIORREACTORES PARA
FERMENTACIN EN MEDIO
SOLIDO
Biorreactor en columna
El equipo esta conectado a una
columna de cromatografa de
gases para monitorear la
produccin de CO2.
La demanda de oxigeno se
cubre por medio de aireacin
forzada.

BIORREACTOR DE COLUMNA ESTERIL
(1) tapa de calefaccin, (2) termmetro, (3)
tamiz de acero, (4) medidor de temperatura
del aire en la entrada, (5) medidor de
humedad relativa, (6) resistencia, (7)
medidor de temperatura de agua, (8)
medidor de flujo msico,
(9) medidor de nivel, (10) chaqueta aislante.
Trabaja con un volumen de 1 litro.
Cuenta con un muestreador de
humedad relativa y un sistema de
calefaccin en la cabeza de la columna.
En el circuito de operacin se
encuentra un sistema de enfriamiento,
utilizando agua fra, el cual rodea una
resistencia de calentamiento.
(a) Rotatorio.
(1) Entrada de aire, (2) embalaje
rotatorio, (3) conector, (4) boquillas
de entrada de aire, (5) lnea de aire,
(6) rodillos, (7) tambor rotatorio, (8)
medio slido, (9) aro. (Durand,
2003)
(b) Con paletas.
(1) entrada de aire, (2) medidor de
temperatura, (3) chaqueta de agua,
(4) paletas, (5) salida de aire, (6)
motor para agitacin, (7) reactor, (8)
medio slido, (9) rbol de agitacin.
TAMBOR HORIZONTAL
Uno de los biorreactores en estado slido ms utilizado
Se ha diseado de varias formas: como un contenedor rotatorio,
perforado o con paletas, con el fin de obtener una agitacin continua
del sustrato slido para incrementar el contacto entre las paredes del
biorreactor y el sustrato, as como, proveer mayor oxigeno al
microorganismo
(1) Platos verticales intercambiadores de calor, (2)
cama de sustrato, (3) entrada de agua, (4) salida
de agua, (5) termostato.
BIORREACTOR ZYMOTIS
Consiste de platos verticales por
donde internamente hay transferencia
de calor debido a la circulacin de
agua fra.
El aire previamente temporizado es
introducido por el fondo del sistema
Este sistema es parecido a los
biorreactores de columna, con la
diferencia de que las capas de sustrato
estn verticalmente fijas, por lo tanto
es difcil trabajar en condiciones
aspticas.

BIORREACTOR COLUMNA CHAROLA.
(1) Entrada de aire estril, (2) entrada de agua
estril, (3) distribuidor de aire, (4) entrada para el
termmetro, (5) charola, (6) chaqueta para el
control de temperatura, (7) columna de acrlico, (8)
entrada de agua, (9) salida de agua
Consiste de una columna de
13 pulgadas de altura y un
dimetro de 10 pulgadas.
En su interior se encuentran
ocho charolas perforadas, las
cuales tienen una capacidad de
140 mL cada una.
La transferencia del oxgeno
es por burbujeo a travs de un
distribuidor de aire, permitiendo la
transferencia a un flujo de 194
mL/min
(1) Camas de esponja de loofa, (2) medio
de cultivo, (3) difusor de aire, (4) entrada
de aire, (5) Entrada de agua, (6) salida de
agua.
BIORREACTOR DE LECHO FLUIDIZADO
Sistema de operacin en modo
continuo el cual puede ser operado
por altos periodos de tiempo a un alto
valor de productividad.
Utilizan pedazos de esponjas,
troncos naturales (loofa, coyonoxtle),
polmeros sintticos (espumas de
poliuterano, poliestireno), as como
tambin canastas o cajas delgadas de
acero inoxidable, que cuenten con
perforaciones que permiten tener una
eficiente inmovilizacin de las clulas
en el soporte con el medio de cultivo.
El principio del diseo se basa en
proveer agitacin y aireacin por
flujo forzado de aire proveyndolo
por la parte del cilindro a travs de
una bomba
4. CASOS
4.1 DESARROLLO DE INOCULO
PARA PROTEINA UNICELULAR
(SCP)

M.O inoculado en condiciones favorables y
nutricionales previamente esterilizado.
El pre tratamiento inicial no debe alterar
indeseablemente al substrato.
Debe garantizar y favorecer el desarrollo de
la SCP.
Se pueden utilizar diferentes tipos de
substratos.



Reduccin del tamao y homogeneizado mecnico
Eliminado de agentes inhibidores del crecimiento
microbiano
Suplementacin del medio con nutrientes como fsforo
y sales nitrogenadas
Ajuste del pH y de la humedad del substrato de modo
que favorezcan el crecimiento de los microorganismos
involucrado
Tratamiento trmico del substrato para eliminar la flora
bacteriana patgena y/o competitiva de la matriz.

Se requiere de un pre tratamiento
inicial e implica:

Recomendaciones
Para el tratamiento de suero especfico se recomienda
emplear Kluyveromyces fragilis, el cual puede ser
cultivado inicialmente en medio papa-dextrosa-agar
nutritivo a 72 C durante 3-5 das (Garca et al. 1994).
Se pueden adicionar sales para garantizar la nutricin
de la levadura. Las sales podran ser de sulfato de
amonio 0,4% p/v y 0,1% p/v de sulfato cido de potasio.
Otras sales de magnesio (0,232 g/l), calcio (0,011 g/l),
hierro (0,007 g/l), zinc (0,002 g/l) y manganeso (0,002
g/l) podran experimentarse tambin (Hernndez et al.
1979).
Para regular el ph inicial optimo de 4.5, caracteristico
del medio puede usarse hidroxido de sodio para
dismunuir el pH.
Se puede preparar un cultivo madre apartir de 100ml
de suero e inocular una asada de k. fragilis a 72c a
rotacin constante de 320 rpm por 72 h.

4.2 DESARROLLO DE
INCULO PARA LA
PRODUCCION DE PENICILINA
Cepas, medios de
mantenimiento:

Las cepas de P. chrysogeytum es mantenida como esporas,
liofilizados o en nitrgeno lquido. Otra alternativa es mantener
el desarrollo vegetativo en N
2
lquido o congelado a -70 C.

Antes del proceso a partir de un cultivo, se determinar el:

Grado de esporulacin
Productividad
Caractersticas morfolgicas.
Ensayos en agitadores y en fermentadores de laboratorio.

Factores que se asocian en la sntesis de antibiticos:
Esporulacin
Velocidad de crecimiento
Niveles de intermediarios

Mejoramiento de cepas


Modificaciones en la cepa
La ingeniera de aireacin
Sistema de mezclado en fermentadores
Alimentacin continua de glucosa
Electrodos de pH
Sistema continuo.
Tcnicas genticas
Mutantes.
Fusin de protoplastos y procesos
parasexuales



Etapas del desarrollo del
inoculo.

Se llevan a cabo a 25 C en
erlenmeyers y fermentadores
agitados.
Los medios empleados en estas
etapas incluyen:
Licor macerado de maz
Glucosa o sacarosa 2% (p/v)
Carbonato de calcio 0.5 - 1% (p/v) como
"buffer"
Sales inorgnicas.

Requerimientos nutricionales
y especficos
4.3 DESARROLLO DE INCULO
PARA LA PRODUCCION DE
CEFALOSPORINA
LAS CEFALOSPORINAS

Las cefalosporinas al
igual que las penicilinas
son estructuras beta
lactmicas, poseen dos
anillos fusionados los
cuales les brindan su
actividad biolgica:

- El anillo beta-lactmico
- El anillo dihidrotiazinico.



ORIGEN
La historia de las cefalosporinas se inicia en
1948, con G. Brotzu con el aislamiento de un
hongo Cephalosporium acremonium. Los
lquidos donde se cultivaba este hongo
contena tres tipos de antibiticos definidos:

Cefalosporina P
Cefalosporina N
Cefalosporina

Tambin producida por hongos como
Emericellopsis y Paecilomyces.
Baja toxicidad.
Amplio espectro.
Cephalosporium acremonium
Estructura Qumica

Contienen un ncleo:
cido 7-
aminocefalospornico
formado por un anillo
betalactmico unido a
un anillo di-hidrotiazida.
Distintos cambios en la
molcula modifican su
farmacocintica, el perfil
de resistencia a las
betalactamasas, el
espectro
antimicrobiano, etc.

MTODOS DE
PRODUCCIN


La produccin de
cepalosporina es afectada por
la regulacin por fosfato, as
como por regulacin de
nitrgeno y de regulacin
catablica por carbohidratos.

Las fuentes de carbono
rpidamente metabolizables
,como glucosa ,maltosa o
glicerol reducen la formacion de
cefalosporinas.
Fig. 12 Efecto de la concentracin de lisina sobre
la formacin de cepalosporina C por
Cephalosporium acremonium
MTODOS DE
PRODUCCIN



La fermentacin es similar
a las penicilinas, se
utilizan medios complejos
con lquido de maceracin
de maz, extracto de
carne, sacarosa, glucosa y
acetato amnico, se lleva
a cabo a pH de 7.0 y
temperatura de entre 24
28 C.

El desarrollo de cepas a sido llevado a cabo
con la cepa original de Brotzo, C.acremoniun
CMI49137, utilizando mutacin, seleccin y
tcnicas parasexuales.

La recombinacin parasexual en
C.acremoniun es dificil debido a que los
compartimientos de las hifas son casi
siempre mononucleados.

Utilizando protoplastos de diferentes cepas,
en experimentos de fusin han sido aislados
haploides recombinantes que mostraban un
40% de aumento en la produccin de
cefalosporina C, asi como mejor crecimiento y
esporulacin.

DESARROLLO DE CEPAS
Cephalosporium acremonium
4.4 DESARROLLO DE INCULO
PARA LA PRODUCCION DE
YOGURT
PUREZA DEL CULTIVO:

Lactobacillus
bulgaricus
Caractersticas
Microscpicas:
Son bastones
delgados y largos.
Casi todos son
inmviles.
Son bacilo
microaerfilos,
gram positivos y
catalasa
negativos.
Caractersticas
Macroscpicas:
colonias de
aspecto rugoso
con bordes
irregulares.
Streptococcus
thermophilus
Caractersticas
Microscpicas:
Gram Positiva,
oxidasa y catalasa
negativa
Caractersticas
Macroscpicas:
Colonias tpicas,
circulares, compactas
y con bordes
uniformes (1 a 3 mm.
de dimetro)
Preparacin del Inculo para yogurt: