2012

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL

Ganiveth Manjarrez Paba, Msc

PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PROGRAMA DE GESTIN AMBIENTAL INDUSTRIAL

Ganiveth Manjarrez Paba, Docente Microbiloga, Universidad de Cartagena

TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIN.................................................................................................................................... 1 PRACTICA N 1...................................................................................................................................... 2 1. MICROSCOPA ........................................................................................................................ 2 2. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 2 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ........................................................................... 2 4. MARCO TERICO................................................................................................................... 2 5. METODOLOGA ....................................................................................................................... 4 6. CUESTIONARIO ...................................................................................................................... 6 7. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 6 8. BIBLIOGRAFA ......................................................................................................................... 6 PRACTICA N 2...................................................................................................................................... 7 1. PREPARACIN DE FROTIS - TINCIONES Y MORFOLOGIA BACTERIANA ............ 7 2. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 7 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ........................................................................... 7 4. MARCO TERICO................................................................................................................... 7 5. METODOLOGA ....................................................................................................................... 9 6. CUESTIONARIO .................................................................................................................... 14 7. RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 14 8. BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 14 PRACTICA N 3.................................................................................................................................... 15 1. MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIN .................................................................... 15 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 15 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ......................................................................... 15 4. MARCO TERICO................................................................................................................. 16 5. METODOLOGA ..................................................................................................................... 23 6. CUESTIONARIO .................................................................................................................... 24 7. BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 25 PRCTICA N 4.................................................................................................................................... 26 1. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ....................................................................... 26 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 26 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ......................................................................... 26 4. MARCO TERICO................................................................................................................. 26 5. METODOLOGA ..................................................................................................................... 28 6. CUESTIONARIO .................................................................................................................... 30 7. BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 30 PRCTICA N 5.................................................................................................................................... 31 1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MOHOS DEL AIRE......................................... 31 2. OBJETIVO ............................................................................................................................... 31 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ......................................................................... 31 4. MARCO TERICO................................................................................................................. 31

5. METODOLOGIA ..................................................................................................................... 32 6. CUESTIONARIO .................................................................................................................... 32 7. BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 33 PRCTICA N 6.................................................................................................................................... 34 1. RECONOCIMIENTO DE NEMATODOS ............................................................................ 34 2. OBJETIVO ............................................................................................................................... 34 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ......................................................................... 34 4. MARCO TERICO................................................................................................................. 34 5. METODOLOGIA ..................................................................................................................... 35 6. CUESTIONARIO .................................................................................................................... 35 7. BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 36 PRCTICA N 7.................................................................................................................................... 37 1. DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE ......................................................................... 37 2. OBJETIVO ............................................................................................................................... 37 3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. ......................................................................... 37 4. MARCO TERICO................................................................................................................. 38 5. METODOLOGA ..................................................................................................................... 39 6. CUESTIONARIO .................................................................................................................... 40 7. BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 41

INTRODUCCIN

La microbiologa ambiental permite comprender la funcin de los microorganismos en el ambiente, sus beneficios y perjuicios. Para ello desarrolla metodologas apropiadas que permiten su deteccin, caracterizacin y estudio. La microbiologa ambiental naci en la era ambiental a principio de los aos 1970. En estos ltimos aos, el campo de microbiologa ambiental ha tomado mayor importancia y transita quizs el mayor perodo de florecimiento, enriqueciendo la investigacin cientfica como as tambin el inters y conocimiento de toda la raza humana por nuestro universo.

La gua de prcticas para el laboratorio de microbiologa ambiental pretende que el estudiante reconozca e identifique la estructura, metabolismo y clasificacin de los microorganismos de inters ambiental con el fin de introducirlo al en la aplicacin de tcnicas de trabajo que armonicen con el medio, de prepararlo para la investigacin de las interacciones dinmicas de los microorganismos y permitirle la construccin de

conocimientos, habilidades y actitudes con referencia al nuevo tipo de sociedad.

PRACTICA N 1 MICROSCOPIA

1. MICROSCOPA 2. OBJETIVOS - General Reconocer la importancia del microscopio en el laboratorio de microbiologa ambiental. - Especficos Conocer las partes y funcionamiento de un microscopio. Reconocer el cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el laboratorio.

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. Microscopios

4. MARCO TERICO Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.

Adems de la ampliacin de la imagen, en microscopa, hay que tener en cuenta dos factores ms: el contraste y la resolucin. Los objetos deben poseer un cierto grado de contraste con su medio circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio. Por ello es que la mayora de los organismos necesitan ser previamente teidos para poder distinguirlos del medio (tinciones simples). Para contrastar o realzar de forma especfica distintas caractersticas morfolgicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. Estas tcnicas tienen un gran inters en la identificacin y clasificacin de las bacterias. La

tincin diferencial ms utilizada es la tincin de Gram. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias cido- alcohol resistentes, las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tincin negativa de cpsulas. Por otra parte, el grado de resolucin (la capacidad para ver separados dos objetos adyacentes muy prximos entre s, depende de las caractersticas del sistema de lentes que posea el microscopio. ste se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz emitida, el ndice de refraccin del medio en el que se realiza la visualizacin y la apertura numrica del objetivo.

EL MICROSCOPIO

El microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o ms lentes de aumento. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico. 1) Soporte. Es la pieza fija en la que slo la platina y el condensador tienen un cierto Movimiento. Sus principales partes son: a) Base. Normalmente alberga la fuente de iluminacin, en determinados modelos incorpora adems, un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. b) Brazo. Soporta todo el sistema ptico, el cabezal porta oculares y el revlver porta objetivos. En l se dispone tambin un sistema de anclaje de la platina (Movimiento de enfocado de la preparacin). c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su Observacin. d) El Macromtrico y el Micromtrico. Ambos permiten enfocar la preparacin. El primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con objetivo de menor aumento (x10), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100). 2) Sistema ptico. Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1) No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pauelos especiales para lente. 2) No dejar nunca una preparacin sobre la platina cuando no est usando el Microscopio.

3) Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revlver. 4) Despus de utilizar el objetivo de inmersin lmpielo. 5) No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (macro y micromtricos, platina, revlver y condensador). 6) No cambie nunca de objetivo mientras est observando a travs del ocular. 7) Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posicin de Observacin. 8) Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin de Prctica.

5. METODOLOGA Manejo y uso del microscopio

1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estn limpias: de no ser as, lmpielas cuidadosamente con papel especial para ptica. No tocar las lentes con los dedos.

2) Coloque la preparacin (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la platina sujetndola con el dispositivo mvil. Compruebe previamente, que el objetivo de menor aumento est en posicin de empleo.

3) Para microbiologa, iluminar la preparacin bajando el condensador (ms contraste), y con el diafragma abierto.

4) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el microscopio lo permite.

5) Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfocar:

a) Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando para ello el macromtrico. No realizar dicha operacin mirando por el ocular.

b) Enfoque con el micromtrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque ntido.

6) Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine el foco con el micromtrico. Si la imagen no est ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de x10. El objetivo de x40 trabaja muy cerca de la preparacin y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser clavado en la preparacin y resultar manchado con aceite de inmersin si se observa la preparacin ya usada con ste ltimo.

7) Empleo del objetivo de inmersin: a) Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el objetivo de x40 b) Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el punto de la luz. c) Termine de girar el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin, Asegurndose de que ste no toca la preparacin, pero s la gota de aceite.

d) Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. Recuerde que la distancia entre el objetivo y la preparacin es mnima.

e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersin sobre la preparacin ya no puede volverse a colocar los objetivos de x10 y de x40 sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersin girando el revlver hacia el objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde ste ltimo.

f) Finalizada la observacin de una preparacin, y antes de retirarla de la platina, se colocar el objetivo de menor aumento girando el revlver en el sentido hacia la lupa. Nunca retire la preparacin con el objetivo de inmersin en Posicin de observacin.

g) Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente con un papel especial para ptica. Compruebe tambin que el objetivo de x40 est limpio.

6. CUESTIONARIO 1) Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio: a) Observar un examen en fresco de microorganismos b) Observar preparaciones coloreadas suministradas por la ctedra. 2) Dibujar lo observado e identificar la morfologa celular observada. 3) El docente entregar fichas con las partes del microscopio; ubicarlas en la parte correcta correspondiente en el equipo y reconocer su funcin. Debe dibujar un microscopio con sus partes en el informe de laboratorio. 4) Investigue las semejanzas y diferencias entre microscopio ptico y electrnico

7. RECOMENDACIONES Los microscopios deben estar limpios, ubicados y conectados laboratorio.

en los mesones del

8. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Madrid: pearson.

Ecologia microbiana y microbiologia ambiental. 677 p.

Edicin: 4 ed.

2002.

BROOCK. 484 p.

Biologia de los Microorganismos.

Edicin: 10 ed.

Mxico.

2002.

PRACTICA N 2

PREPARACIN DE FROTIS - TINCIONES Y MORFOLOGIA BACTERIANA

1. PREPARACIN DE FROTIS - TINCIONES Y MORFOLOGIA BACTERIANA 2. OBJETIVOS - General Reconocer la morfologa bacteriana utilizando las tcnicas adecuadas de frotis y tinciones - Especficos Conocer el uso e importancia de la tincin de Gram en la diferenciacin bacteriana. Diferenciar la utilidad de las diferentes tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiologa ambiental.

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. Laminillas porta Objetos Laminillas cubre Objetos Aplicadores o hisopos Vela y fsforos Coloracin de Gram (Cristal Violeta, Solucin de Lugol, Alcohol Acetona, Safranina o fucsina) 4 goteros

4. MARCO TERICO Los colorantes se utilizan en microbiologa para:

Teir los microorganismos y sus estructuras (cpsulas, flagelos, esporas, grnulos) Para diferenciarlos en grupos segn la forma de tomar dichos colorantes. Para adicionarlos a los medios de cultivos con el fin de inhibir el crecimiento de un grupo determinado de grmenes.

Los colorantes bacterianos son anilinas que contienen radicales que imparten su propiedad cromgena al colorante y grupos auxcromos que permiten que el colorante se una a las fibras o tejidos. Si la porcin coloreada (cromgeno) acta como base, se les denomina colorantes bsicos (catinicos) y s el cromgeno acta como cido se llaman colorantes cidos (aninicos).

Los ncleos de las clulas se tien

mejor con colorantes bsicos y el citoplasma con

colorantes cidos. Como la clula bacteriana tiene su material nuclear distribuido por toda la clula se colorea bien con los colorantes bsicos.

Las bacterias son clulas transparentes y por su tamao (0.1 a 5 m) se pueden observar en el microscopio en aumento de 40 X o ms. Por su constitucin tienen una carga negativa y al observarlas en las preparaciones en fresco se ven en continuo movimiento ya que se rechazan unas a otras (movimiento browniano)

Algunas bacterias disponen adems de flagelos polares o periticos, lo que les permite un desplazamiento que se puede apreciar en el campo microscpico cuando se observan en fresco.

La coloracin de Gram ideada por Hans Cristian Gram en 1844, permite la diferenciacin de los microorganismos en dos grupos: Gram positivos y Gram negativos.

La diferencia de color que presentan los microorganismos tratados con estos colorantes, se debe a la formacin de un complejo Violeta-Yodo que es "atrapado" dentro de la bacteria segn las caractersticas de su pared.

Los Gram positivos tienen una pared predominantemente proteica que se deshidrata con la aplicacin del alcohol-acetona y no permite que el colorante violeta salga de la bacteria.

Los Gram negativos tienen una pared con una capa lipdica que se disuelve con el alcoholacetona, permitiendo la salida de complejo violeta-yodo. Para poder observar entonces estos microorganismos, se colorean luego con la Safranina que se agrega al final del procedimiento.

Nota: Para que esta reaccin ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear tengan su pared ntegra, para esto se deben utilizar cultivos jvenes.

5. METODOLOGA Preparacin del frotis:

1. Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo. 3. Colocar la muestra limpio y sobre sin un

portaobjetos

grasa,

debidamente marcado

2. Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de una asa o escobilln 4. Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia* Si la muestra no es lquida, colocar una pequea gota de solucin salina sobre el portaobjetos antes de realizar el frotis y disolver en ella la muestra

5. Calentar nuevamente el asa para desinfectarla.

6. Dejar secar el frotis al medio ambiente.

7. Fijarlo pasndolo tres veces a travs de la llama con la muestra hacia arriba.

8. Dejar enfriar el frotis antes de colorearlo

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Preparacin en fresco:

Desinfecte el asa redonda en el mechero y enfrela Si el cultivo es liquido coloque con el asa una pequea gota sobre una lamina portaobjetos Si el cultivo es slido coloque en la lamina portaobjetos una pequea gota de solucin salina Tome con el asa una pequea porcin de la colonia y disulvala en la solucin salina Desinfecte nuevamente el asa En cualquiera de los dos casos cubra la preparacin con una laminilla cubreobjetos Enfquela en el microscopio con objetivo de 40X Observe y describa lo observado

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Coloracin:

Verter el cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar actuar por 1 minuto.

1. Enjuagar con agua corriente y dejar escurrir

2. Agregar la solucin de Lugol y dejar actuar por 1 minuto

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3. Escurrir la solucin y enjuagar el portaobjetos con agua corriente

4. Decolorar con el alcohol-acetona por 5 segundos y enjuagar con agua corriente.

5. Agregar la solucin de Safranina y dejar actuar por 30 segundos, enjuagar, escurrir y dejar secar al aire.

6. Observar la preparacin al microscopio y dibujar. Tenga en cuenta morfologa bacteriana y su agrupacin.

la

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6. CUESTIONARIO 1. Cules son las caractersticas de los colorantes cidos, bsicos y neutros? 2. Cul es el fundamento de la coloracin de Gram? 3. Describa el procedimiento de la coloracin de Gram 4. Cmo se realiza el control e calidad de la coloracin de Gram? 5. Cules son las fallas que pueden presentarse en la coloracin?

7. RECOMENDACIONES Los microscopios deben estar limpios, ubicados y conectados en los mesones del laboratorio.

8. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Edicin: 4 ed.

Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. 2002. 677 p.

Madrid : pearson.

BROOCK. 2002.

Biologa de los Microorganismos.

Edicin: 10 ed.

Mxico.

484 p.

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PRACTICA N 3

MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIN

1. MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIN

2. OBJETIVOS Conocer la clasificacin, preparacin, esterilizacin y distribucin de los medios de cultivo.

Preparar

correctamente medios de cultivo necesarios para la prctica

microbiolgica.

Reconocer la necesidad de evitar la contaminacin tanto de los medios de cultivo como de los dems elementos utilizados en el laboratorio de microbiologa ambiental.

Manejar

adecuadamente

el

autoclave

como

mtodo

eficiente

de

esterilizacin de materiales en el laboratorio de microbiologa ambiental.

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. Balanza analtica Esptulas Erlenmeyers Vela y fsforos

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Medios de cultivo Algodn Cinta de enmascarar

4. MARCO TERICO Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn por la cual es difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos ltimos se basan muchos de los principios del aislamiento.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es cualquier medio que proporcione substancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.

El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan.

Las caractersticas de los microorganismos a tener en cuenta al momento de preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:

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 Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa, segn los cuales se los clasifica en autotrofos, heterotrofos, quimiotrofos (litotrofos u organotrofos) y fototrofos. Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y

microaerfilos. Temperatura ptima de crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrfilos, mesfilos y termfilos. Rango de pH: en general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias oscila entre 6,6 y 7,2.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU ORIGEN

Los medios de cultivos pueden clasificarse en: Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc. Artificiales: Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en sintticos y complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composicin qumica se denomina sinttico o qumicamente definido; puede ser una simple solucin de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgnicos. Un medio no sinttico o complejo es aquel del que se desconoce su composicin qumica exacta; se trata bsicamente de extractos de tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentracin no se conoce con exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo nutritivo.

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CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS ARTIFICIALES COMPLEJOS SEGN SU FINALIDAD

I. Comunes Medios Artificiales Complejos II. Especiales II.a. Enriquecidos II.b. Selectivos II.c. Diferenciales

I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, como el caldo carne y agar carne.

II. Medios especiales: se los clasifica segn su finalidad.

II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio comn, con el agregado de elementos nutritivos elegidos segn las necesidades. Tales como sangre, albmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos el agar sangre y el agar chocolate.

II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para que, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo tiempo inhiban la proliferacin de la flora acompaante. Para esto ltimo se busca establecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o

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por el agregado de inhibidores. El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayora de las bacterias. Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde brillante), los antibiticos, el alcohol fenil etlico y la azida de sodio.

II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son medios en los que los microorganismos crecen en libre competencia, vindose favorecidos aquellos para los cuales las condiciones de desarrollo son las ms apropiadas, no llegndose a inhibir totalmente el crecimiento del resto de microorganismos. Se logra as la multiplicacin de los microorganismos que se desea identificar, hasta un nmero suficiente tal que sea posible su aislamiento en medios selectivos apropiados.

II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos slidos, se utilizan para sembrar directamente con la muestra incgnita o a partir del medio selectivo para enriquecimiento.

II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que coexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o ms tipos de microorganismos pueden crecer en este medio, algn elemento presente en l permite diferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en alguna propiedad bioqumica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este tipo es el agar con eosina azul de metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus

respectivas colonias.

Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color blanco grisceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. coli son oscuras y con brillo metlico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas con un centro azul y rara vez presentan brillo. En su mayor parte los

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medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo-diferenciales resultan muy tiles para el aislamiento de un microorganismo separndolo de la flora acompaante. Se ponen en evidencia las colonias de los microorganismos que se desea aislar y a su vez se diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado provenientes de la flora acompaante.

CARACTERSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras.

Como ya se ha sealado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hbitat natural.

La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los microorganismos. En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio el lquidos y slidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma lquida, en cuyo caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega agar al caldo. En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de todos los microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacin del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 C, 15 minutos).

Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros

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procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 C. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

CONCEPTOS DE ESTERILIZACIN Por control del crecimientos microbiano, se entiende tanto la inhibicin del crecimiento (multiplicacin) microbiano como la destruccin de aquellos. En este contexto se emplean una serie de trmino:

Esterilizacin. Es el proceso de destruccin o eliminacin completa

de toda

forma de vida existente en el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del calor, radiaciones, filtracin, etc. Por lo tanto, la esterilizacin es un trmino absoluto e incluye la destruccin de las esporas y formas vegetativas, los virus, etc. Desinfeccin. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos ms comunes pero no necesariamente esporas. Generalmente los desinfectantes son productos qumicos excesivamente txicos para ser usados directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes llegan a esterilizar.

Asepsia. Se refiere a la ausencia de microorganismos de un objeto o rea. Por ejemplo, las tcnicas aspticas son las que evitan la contaminacin propia de otros o de los materiales durante el trabajo.

Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos patgenos ms comunes, pero no necesariamente esporas, presentes sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente empleado se denomina antisptico.

Microbiostasis. Es una condicin por la que el crecimiento o la multiplicacin de los microorganismos estn inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos.

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Si el agente microbiosttico es eliminado, el crecimiento

microbiano puede

resurgir. De igual definicin pero de aplicacin a la correspondiente categora de microorganismos son los fungistticos y los bacteriostticos.

Microbicida.

Es

el

agente

que

destruye

las

formas

viables

de

los

microorganismos. De igual significado pero con mbito ms restringido son los trminos fungicida y bactericida. Adems de agentes qumicos - desinfectantes y antispticos, como el xido de etileno, formaldehdo, perxido de hidrgeno, etc.hay una serie de posibilidades para el control de los microorganismos basadas en el empleo de agentes fsicos dainos para ellos (calor, radiaciones) o en retirarlos de las muestras (filtracin). El calor es uno de los agentes fsicos ms usados; su accin depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de aplicacin.

De la consideracin de stos dos aspectos surgen las siguientes expresiones: Punto trmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensin bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable). Tiempo trmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensin bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante). Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o esporuladas (de resistencia). Para eliminar las formas

vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la mayora se destruye a los 50 y 70C, especialmente las patgenas. Las bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100C.

Adems de la temperatura y el tiempo de exposicin es importante tener en cuenta la humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace ms efectivo el poder de penetracin del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullicin.

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Fundamento de la esterilizacin por calor: El calor acta desnaturalizando (coagulando) las protenas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta accin se ve disminuida por la presencia de lpidos formando parte de su estructura qumica, que protenas. acta protegiendo las uniones peptdicas de las

5. METODOLOGA La metodologa a desarrollar en la preparacin de medios de cultivo se realizar acorde con lo establecido en los recipientes de cada uno de los medios. Para el proceso de esterilizacin se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la vlvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante. Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de all se cuenta el tiempo de esterilizacin, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente.

El proceso completo de esterilizacin en un autoclave se compone de diferentes fase: FASE DE PURGADO. A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir por la vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilizacin. FASE DE ESTERILIZACIN. Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilizacin.

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FASE DE DESCARGA. Terminado el proceso de esterilizacin, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presin y temperatura del caldern empiezan a bajar poco a poco. Hay que tener en cuenta algunas normas para una correcta esterilizacin del material: Para que la esterilizacin de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el lquido. Como quiera que la transmisin del calor en el lquido de los recipientes se realiza de fuera hacia dentro, es evidente que la eficacia del proceso depender del volumen de lquido. En general, no conviene esterilizar juntos recipientes grandes y pequeos. En todo caso la seleccin de la temperatura y tiempo se efectuar segn sea el volumen de los recipientes Los recipientes con cierre hermtico deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapn, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al vaciar el autoclave despus de la esterilizacin procederemos a cerrar totalmente estos recipientes. Los recipientes vacos precisan de un tiempo de esterilizacin mayor que los recipientes con lquido en su interior

6. CUESTIONARIO 1. Cual es la importancia de los medios de cultivo en la microbiologa ambiental? 2. Cules son los constituyentes habituales de los medios de cultivo? 3. Que medidas se toman para mantener deshidratados los medios de cultivo en el laboratorio? 4. Defina: Cultivo, siembra, repique, aislamiento. 5. Dibuje un autoclave y seale sus partes.

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6. Porque consideras importante los procesos de esterilizacin en el laboratorio de microbiologa ambiental?

7. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Edicin: 4 ed.

Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. 2002. 677 p.

Madrid: pearson.

BROOCK. 2002.

Biologa de los Microorganismos.

Edicin: 10 ed.

Mxico.

484 p.

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PRCTICA N 4

AISLAMIENTO DE BACTERIAS

1. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

2. OBJETIVOS Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri. Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos. Estudiar la morfologa de cada colonia.

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. - Asa de siembra Pipetas Placas de Petri con medio de cultivo slido Cultivo de microorganismos Cuenta colonias

4. MARCO TERICO En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros.

Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en

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medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia.

Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Microbiologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

Aspectos ms comunes de las colonias microbianas

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5. METODOLOGA a) Extensin en superficie con cayado

b) Estra mltiple en superficie

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c) Dilucin en masa

REVISIN DEL TRABAJO

Se realizar a las 24 horas.

Extensin en superficie: Tras el perodo de incubacin se examinarn las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.

Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La expresin de este recuento se hace en "unidades formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio.

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Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se logra la separacin de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de m u e s t r a s h o m o g n e a s, pero en las que existe un elevado nmero. En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfologa colonial.

6. CUESTIONARIO 1. Identifique los aspectos ms relevantes de las colonias aisladas y reporte el recuento realizado con el cuenta colonias. 2. Como se realizan cultivos en medios de cultivo lquidos? 3. Como se realizan cultivos para el asilamiento de bacterias anaerobias?

7. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Edicin: 4 ed.

Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. 2002. 677 p.

Madrid: pearson.

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Biologa de los Microorganismos.

Edicin: 10 ed.

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484 p.

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PRCTICA N 5

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MOHOS DEL AIRE

1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MOHOS DEL AIRE

2. OBJETIVO Reconocer levaduras y mohos ambientales.

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. Cubre objetos Porta - Objetos KoH Azul de lactofenol Asas en aro Microscopios

4. MARCO TERICO Los hongos son microorganismos eucariotas pluricelulares filamentosos, no presentan pigmentos fotosintticos y son quimio hetertrofos aerobios estrictos. A diferencia de las plantas, presentan un bajo grado de diferenciacin en los tejidos. Poseen pared celular contiene quitina un polisacrido que le da rigidez y es responsable de su morfologa y en ocasiones celulosa. La estructura o cuerpo vegetativo de un hongo se denomina talo. El talo esta formado por filamentos, o hifas, que generalmente estn ramificadas. Las hifas son tubos largos que estn formadas por la pared celular de quitina (componente mayoritario) y el citoplasma con sus inclusiones y ncleos.

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En el citoplasma se realiza la actividad bioqumica del hongo. Las hifas pueden estar separadas en clulas por paredes transversales (septos) en los hongos superiores (Eumicetos), o carecer de paredes en los hongos inferiores (Ficomicetos).

El conjunto de hifas se llama micelio. En el micelio se distinguen dos partes: una que penetra en el medio de cultivo y se extiende por su superficie (micelio vegetativo), y otra que se proyecta y contiene las esporas (micelio reproductor o areo). Los hongos crecen por el extremo de las hifas (crecimiento apical). Una pequea cantidad de micelio es suficiente para la formacin de un nuevo talo.

5. METODOLOGIA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol y en otro una solucin de KOH; estas gotas no deben ser demasiado grandes para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. 2. Tomar el material a observar (tomado en el ecosistema sealado) en una mnima cantidad con asa, procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. 3. Trasportar el material con asa a la gota del portaobjetos. 4. Distribuir de manera que no quede amontonado. 5. Colocar el cubreobjetos poco a poco, evitando que se formen burbujas entre los vidrios.

6. CUESTIONARIO 1. Observar y dibujar lo observado en las cajas de petri (Colonias) y en las preparaciones microscpicas 2. Determinar la presencia de hifas y determinar si son septadas o aseptadas.

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3. Cual es la funcin del KOH y del Azul de lactofenol al visualizar hongos? 4. En que consisten las preparaciones de cinta adhesiva para observacin de hongos? 5. Que son hongos saprfitos y que son hongos parsitos? 6. Cmo se distingue entre una colonia bacteriana y una de levadura?

7. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Ecologa microbiana y microbiologia ambiental. Edicin: 4 ed. Madrid: pearson. 2002. 677 p. BROOCK. Biologa de los Microorganismos. Edicin: 10 ed. Mxico. 2002. 484 p.

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PRCTICA N 6

RECONOCIMIENTO DE NEMATODOS

1. RECONOCIMIENTO DE NEMATODOS

2. OBJETIVO Determinar los parmetros ecolgicos de prevalencia, abundancia e intensidad parasitaria en Lisas de la Cinaga de las Quintas.

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. 2 Lisa por grupo Equipo de diseccin (Tijeras, y Bistur) Lo suministra el Lab. Guantes Papel peridico 1 Bolsa de basura por grupo

4. MARCO TERICO La presencia de larvas de Aniskidos en peces es conocida desde el siglo XIII, pero slo hasta el siglo XX fue reconocido el problema sanitario que acarrea su presencia en el pez como agente etiolgico de la zoonosis denominada anisakidosis (Rodrick y Cheng, 1989).

El inters sanitario del gnero Anisakis no slo est asociado a su implicacin en infecciones accidentales humanas, sino a la afeccin directa de organismos acuticos y aves piscvoras; pues la transmisin est desarrollada en el agua y

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generalmente involucra invertebrados acuticos y peces como hospedadores intermediarios y paratnicos (Anderson, 1992).

Siguiendo los criterios de Hartwitch (1974) y Gibson (1983) para la clasificacin de nemtodos Ascaridoideos, los agentes causales de la Anisakidosis estn ubicados taxonmicamente en el Phylum Nemtoda, Clase Rhabditea, Orden Ascaridida, Superfamilia Ascaridoidea, Familia Anisakidae, Subfamilia Anisakinae, Gneros Pseudoterranova, Contracaecum y Anisakis.

5. METODOLOGIA El examen interno general de los peces ser realizado haciendo una incisin en la lnea media ventral del pez, desde el espacio nter opercular hasta el ano, seguido de la extraccin de las vsceras de la cavidad abdominal, recoleccin y conteo de larvas encontradas en vsceras, cavidad abdominal, peritoneo y planos musculares adyacentes.

Parmetros de infestacin parasitaria La prevalencia es el porcentaje de individuos infectados en el total de la muestra, La Intensidad media parasitaria es el promedio de parsitos en cada husped infectado La abundancia media parasitaria corresponde al promedio de parsitos por husped examinado.

6. CUESTIONARIO 1. Realiza el examen interno general del pez y cuenta los parsitos encontrados en cada rgano. Para facilitar el conteo puedes llenar la siguiente tabla.

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2. Determina la intensidad media parasitaria 3. Con los datos obtenidos por tus compaeros determina la prevalencia y la abundancia parasitaria.

7. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Edicin: 4 ed.

Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. 2002. 677 p.

Madrid : pearson.

BROOCK. 2002.

Biologa de los Microorganismos.

Edicin: 10 ed.

Mxico.

484 p.

www. Reactivos.com

OLIVERO, J Y BALDIRIS, R (2009). Parsitos en peces Colombianos: Estn enfermando nuestros ecosistemas?

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PRCTICA N 7 DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE

1. DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE

2. OBJETIVO Determinar la calidad microbiolgica de muestras de agua del ecosistema a trabajar en el semestre, estableciendo la presencia de bacterias coliformes por la tcnica del nmero ms probable (NMP)

3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS. Diluciones de la muestra Pipetas de 1 ml estriles Gradillas Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante al 2% Tubos de ensayo Campanas de Durhan Incubadora Asas bacteriolgicas en aro Reactivo de Indol segn Kovacs

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4. MARCO TERICO El grupo de microorganismos conocido como Coliformes est constituido por algunos gneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que se caracterizan por su capacidad de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 30-37C en incubacin por 48 horas. Todas las enterobacterias son bacilos gram negativos, no esporulados, anaerobios facultativos, habitantes del intestino del hombre y animales con un potencial patgeno limitado y tambin pueden encontrarse en ciertos ambientes como aguas, suelo, plantas etc.

Un nmero considerable de estas bacterias indica:

Tratamiento inadecuado y/o contaminacin posterior al tratamiento. Multiplicacin microbiana que pudiera haber permitido el crecimiento de toda la serie de microorganismos patgenos y toxignicos, por deficiente higiene.

Debido a la poca especificidad del grupo para indicar contaminacin fecal, es necesario aislar de los coliformes Totales a los coliformes fecales, por ser estas ltimas bacterias huspedes constantes del intestino humano y animal, cuya presencia en las aguas se asocia con una contaminacin fecal reciente. Para esto se han tenido en cuenta ciertas caractersticas propias de las bacterias de origen fecal como son la Escerichia coli y otros coliformes fecales. Estas caractersticas son:

Presentar crecimiento en medio lactosado biliado. Ser capaces de multiplicarse a 43,5C 45,5C. Producir Indol.

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5. METODOLOGA Tcnica del Nmero ms Probable de coliformes Totales

Inocule de cada una de las tres diluciones a utilizar, 1 ml en los tubos de caldo Brilla al 2%, empleando tres tubos por dilucin. Incube los tubos a 35C 2C por 24 48 horas. Anote como tubos positivos para la prueba aquellos que presentan produccin de gas y turbidez del medio.

Interpretacin de Resultados

Determine para cada una de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos con respuesta positiva.

Busque en la tabla del NMP de McCrady y anote el resultado.

Para obtener el NMP de organismos coliformes por mililitro, emplee la siguiente formula:

NMP de la tabla x factor de dilucin intermedia / 100

Nmero ms Probable (NMP) de Coliformes fecales: Test de Mac - Kenzie

A partir de los tubos positivos para coliformes totales, pase una asada a un tubo con caldo Brilla. Incubar los tubos a 45C 0.5C por 24 48 horas

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Lectura

Observar la produccin de gas en la campana de Durhan y la aparicin de turbidez en el caldo Brilla. Revelar el tubo adicionando 0.2ml del reactivo de Kovacs, agitar suavemente y observar la presencia de un anillo de color rojo cereza en la superficie cuando la prueba es positiva o el color original del medio cuando la prueba es negativa. Los tubos con produccin de gas y reaccin de indol positiva se tienen como coliformes fecales.

6. CUESTIONARIO 1. Cuales son los gneros representativos del grupo coliforme? 2. Explique el fundamento de cada una de las etapas de la tcnica para determinacin del NMP de coliformes totales. 3. En que se basa la reaccin del indol y porque es determinante para la diferenciacin de los coliformes fecales? 4. Haga el reporte correcto de los resultados del NMP de coliformes totales y de Coliformes fecales, realizado en la muestra de agua. 5. Teniendo en cuenta el NMP de coliformes totales y el NMP de coliformes fecales obtenido, definir si el agua se acepta o se rechaza para consumo humano, para fines recreativos mediante contacto primario y mediante contacto secundario, en relacin, con el decreto 1594. 6. Elaborar un resumen del contenido general de la resolucin n 2115 de 2007.

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7. BIBLIOGRAFA ATLAS, RONALD M. Edicin: 4 ed.

Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. 2002. 677 p.

Madrid: pearson.

BROOCK. 2002.

Biologa de los Microorganismos.

Edicin: 10 ed.

Mxico.

484 p.

Diario oficial 46679.

Resolucin N 2115 de 2007. Ministerio de la

proteccin social. Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo territorial.

Decreto 1594 de 1984.

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