1. Definir los conceptos de clulas competentes y transformacin. 2.

Comparar y contrastar las ventajas y desventajas de los diferentes

mtodos utilizados para preparar clulas competentes. 3. Preparar clulas competentes usando el mtodo de cloruro de calcio.

Introduccin
En muchas ocasiones el DNA purificado es introducido en clulas eucariotas y microorganismos, con la intensin de alterar el genotipo del recipiente. Existen varios mecanismos por los cuales las bacterias pueden recombinar informacin genticamente. Uno de estos procesos es la transformacin, definido como la habilidad que posee una bacteria de obtener una molcula de DNA exgeno e insertarla en su propio genoma (figura 1). En algunas bacterias la transformacin es un proceso natural en otras es un proceso creado por la manipulacin humana.

Figura 1. Transformacin de bacterias.

La tcnica de transformacin es muy utilizada en los laboratorios especializados en Biologa Celular y Molecular para introducir artificialmente una molcula de DNA dentro de una clula bacteriana. Este procedimiento permite amplificar clones de DNA que sern utilizados para estudios y anlisis posteriores. Otra razn para el uso de esta tcnica es la obtencin de grandes cantidades de una protena en particular. La bacteria es transformada con un vector de expresin que contiene la secuencia de DNA que codifica para la protena. Junto a la expresin de los genes de la bacteria ser expresado el DNA exgeno resultando en la produccin de la protena en grandes cantidades.

A. Clulas competentes La membrana plasmtica se compone de una doble capa de fosfolpidos, que crea un interior hidrofbico (figura 2) que no permite el paso de molculas exgenos a travs de ella. Varios mtodos son utilizados para aumentar la permeabilidad de la membrana plasmtica y que el DNA exgeno pueda atravesar la barrera. Entre los ms utilizados se encuentran el mtodo qumico y electroporacin. A las bacterias a las que se les ha aplicado uno de estos mtodos se les conocen como clulas competentes.

Figura 2. Bicapa de fosfolpidos de la membrana plasmtica.

I. Mtodo qumico En este mtodo la bacteria es tratada con altas concentraciones de Cloruro de Calcio (CaCL2) y temperaturas fras para aumentar la permeabilidad de la membrana. Los iones de cloruro de calcio neutralizan la repulsin entre la carga negativa de las cabezas de los fosfolpidos y la carga negativa de los grupos fosfatos del DNA. De esta manera no existe un impedimento para que la molculas de DNA exgeno pueda atravesar la membrana plasmtica. Este procedimiento puede ser utilizado con varias de las cepas de Echerichia coli como son la DH1, DH5 y MM294, entre otras. Las clulas competentes producidas por este mtodo pueden ser almacenadas a -70 C. Si son preparadas con cautela, las clulas competentes pueden producir entre 107 y 109 colonias transformadas/g de plsmido super-enrollado. Este mtodo es uno sencillo y rpido de efectuar en el laboratorio. II. Electroporacin El mtodo de electroporacin fue desarrollado originalmente para transformar clulas eucariotas. Desde el 1988 se esta utilizando para transformar E. coli y otras bacterias. Este mtodo capitaliza la naturaleza dbil de las interacciones hidrofbicas e hidroflicas de la bicapa de fosfolpidos y la capacidad espontnea de la membrana de auto-sellarse despus de un disturbio. En el mtodo de electroporacin la clula recibe una corriente elctrica que altera temporalmente la estabilidad de ciertas reas de la membrana plasmtica, permitiendo que molculas polares puedan atravesar la membrana. Al poco tiempo la membrana tiene la capacidad de auto-sellarse rpidamente dejando la clula intacta. La electroporacin produce una transformacin ms eficiente que los mtodos qumicos. En general, la eficiencia de la electro-transformacin es 10-20 veces ms alta que la obtenida utilizando mtodos qumicos. Las clulas competentes producidas por electroporacin pueden producir de 109-1010 colonias transformadas/g de DNA. La eficiencia de este procedimiento depende de la fuerza del campo elctrico, el largo del pulso elctrico y la concentracin del DNA. Una mayor eficiencia ha sido observada a voltajes altos y pulsos elctricos largos. Un aumento excesivo de cualquiera de estos dos parmetros disminuye la viabilidad de la clula. El nivel ms alto de transformacin se alcanza con una combinacin de fuerza del campo elctrico y un largo del pulso elctrico que resultan en un por ciento alto (50 75 %) de muerte celular.

Se ha observado que las clulas competentes producidas por electroporacin pueden ser transformadas con plsmidos-super enrollados con tamao entre 25130 kb. La eficiencia de transformacin con molculas de bacterifagos lineales es solo 0.1% de la obtenida con plsmidos-super enrollados.

Materiales
Centrfuga clnica Cloruro de Calcio 0.1 M Cultivo de E. coli Hielo Microtubos de 1.5 ml Pipetas desechables de 5 ml Pipetas desechables de 1 ml

Procedimiento (Actividad experimental)

A. Mtodo qumico 1. Obtenga un tubo con cultivo de E. coli y colquelo por 10 minutos

a 0 C (hielo). 2. Centrifugue el tubo con el cultivo de E. coli por 10 minutos a 4,000 rpm. 3. Decante el sobrenadante. Debe observar las clulas formando un precipitado en el extremo inferior del tubo. 4. Invierta el tubo sobre un papel toalla. Djelo reposar por un minuto. Esto permite eliminar cualquier residuo del medio que quede en el tubo. 5. Resuspenda el precipitado en 5 ml de 0.1 M CaCl2 (fro). Colquelo en hielo por 10 minutos. 6. Centrifugue el tubo por 10 minutos a 4,000 rpm. 7. Decante el sobrenadante. Invierta el tubo sobre un papel toalla y djelo reposar por un minuto. 8. Resuspenda el precipitado de clulas competentes en 500 l de 0.1M CaCl2 (fro). 9. Transfiera los 500 l de clulas competentes a un microtubo de 1.5 ml. 10. Rotule correctamente su microtubo y gurdelo a 70 C.

Preguntas
1. Compare y contraste las semejanzas y diferencias entre los dos

2. 3. 4. 5.

mtodos principales por los cuales las bacterias son inducidas al estado de competencia. Explique porqu algunas cepas de la bacteria E. coli pueden ser inducidas al estado competente y otras cepas no. Tendr el CaCl2 el mismo efecto en una bacteria gram positiva que en una bacteria gram negativa? Explique su respuesta. Qu efecto tienen las temperaturas fras en la preparacin de clula competente a travs del mtodo qumico? Usted prepar clulas competentes por el mtodo de cloruro de calcio. Cmo usted comprobara que estas clulas se encuentran en su estado de competencia? Explique su respuesta.