SECCIN 2.6.

ENFERMEDADES PORCINAS EN LA LISTA B

CAPTULO 2.6.1.

RINITIS ATRFICA PORCINA

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: La rinitis atrfica es una enfermedad infecciosa porcina que se caracteriza por la secrecin nasal purulenta, el acortamiento o deformacin de la jeta, la atrofia de los cornetes (concha nasal) y la reduccin de la productividad. Dependiendo de diversos factores, que incluyen la inmunidad del rebao, la enfermedad puede aparecer de forma enzotica o ms espordicamente. La forma progresiva, que es ms grave, est causada por la infeccin por cepas toxignicas de Pasteurella multocida sola, o en combinacin con Bordetella bronchiseptica. Las infecciones por B. bronchiseptica sola pueden causar una forma de la enfermedad, que vara de leve a moderada, con atrofia no progresiva de los cornetes. La atrofia de los cornetes puede ser slo evidente al sacrificar el animal, o en el animal vivo mediante radiografa o tomografa. Factores medioambientales y de manejo pueden contribuir a la gravedad y a la incidencia de esta enfermedad. Una gran proporcin de los rebaos porcinos, aparentemente normales, estn infectados por B. bronchiseptica y, posiblemente, por P. multocida no toxignica, algunos de los cuales presentan evidencia de atrofia de los cornetes. Identificacin de los agentes: El diagnstico de la rinitis atrfica depende de las observaciones clnicas y post-mortem, completado con el aislamiento y caracterizacin de P. multocida y B. bronchiseptica de cerdos afectados. Con frecuencia, el aislamiento de ambos organismos es complicado, debido al crecimiento ms abundante de otros. Los ndices de aislamiento han mejorado debido a la conservacin de los hisopos tonsilares y nasales a 48C en un medio de transporte no nutritivo, y a la utilizacin de un medio de cultivo selectivo. Pasteurella multocida y B. bronchiseptica se pueden identificar mediante pruebas bioqumicas tradicionales. Los aislados de Pasteurella multocida pueden caracterizarse posteriormente por sus antgenos capsulares. El tipo capsular D es el ms frecuente en muchas partes del mundo, pero en algunas regiones predomina el tipo A. Los antgenos capsulares pueden distinguirse serolgicamente mediante hemaglutinacin indirecta o inmunofluorescencia, y qumicamente por precipitacin con acriflavina, o por sensibilidad a la hialuronidasa. La toxigenicidad de los aislados de P. multocida puede demostrarse mediante el ensayo de la citotoxicidad en cultivos celulares. Para diferenciar los aislados toxignicos de los que no lo son, en algunas partes del mundo se utiliza actualmente un enzimoinmunoensayo (ELISA) disponible comercialmente. Adems, es apropiado para detectar la produccin de toxina a partir de placas de cultivos primarios, sin necesidad del aislamiento e identificacin previos de las colonias individuales. Este ELISA se utiliza cada vez ms como ensayo preferido para el control de la forma progresiva de la enfermedad. Recientemente, el desarrollo de sondas de ADN y de las tcnicas de reaccin en cadena de la polimerasa ha proporcionado mtodos de deteccin sensibles y especficos para aquellos laboratorios con capacidad para realizarlos. Pruebas serolgicas: La deteccin de anticuerpos contra P. multocida y B. bronchiseptica tiene escaso valor, ya que las cepas de P. multocida no toxignicas comparten antgenos que presentan reaccin cruzada con cepas toxignicas, y B. bronchiseptica puede aislarse en muchos rebaos

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porcinos. Se dispone de una prueba comercial basada en la deteccin de anticuerpos contra la toxina de P. multocida, pero su utilidad es limitada, ya que no todos los cerdos infectados desarrollan dichos anticuerpos. La vacunacin generalizada con el toxoide de P. multocida induce la aparicin de anticuerpos de origen vacunal, complicando la interpretacin de los resultados. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Hay varias vacunas comercialmente disponibles que contienen bacterinas de B. bronchiseptica y una mezcla de cepas de P. multocida toxignicas y no toxignicas, o un toxoide derivado de P. multocida o de una cepa de Escherichia coli recombinante.

A. INTRODUCCIN
La rinitis atrfica es una enfermedad infecciosa porcina que se caracteriza por secreciones nasales purulentas, combinadas con acortamiento o deformacin de la jeta, atrofia de los cornetes (conchas nasales) y productividad reducida. Se han reconocido dos formas de la enfermedad (9): a) b) Una forma progresiva grave, causada por cepas toxignicas de Pasteurella multocida, ms frecuentemente de los tipos capsulares D o A, solas o en combinacin con Bordetella bronchiseptica. Una forma menos grave, con atrofia de los cornetes, que vara de leve a moderada, y a menudo sin cambios significativos en la jeta, es la causada por B. bronchiseptica.

El aumento de la gravedad de estas infecciones se asocia con la produccin intensiva, el hacinamiento, el manejo inadecuado y las condiciones de alojamiento y medioambientales. La productividad reducida se relaciona generalmente con la rinitis atrfica, que vara de moderada a grave, aunque no se ha aclarado completamente la relacin precisa entre la infeccin por estas bacterias y el reducido aumento de peso. Bordetella bronchiseptica y P. multocida toxignica se encuentran frecuentemente en muchas especies animales domesticadas y silvestres, que potencialmente podran transmitir las bacterias a los las explotaciones porcinas. Bordetella bronchiseptica o P. multocida toxignica pueden estar presentes en un rebao sin signos clnicos de la enfermedad, especialmente, cuando estn ausentes otros patgenos respiratorios y las condiciones medioambientales y de manejo son ptimas. Dichos rebaos portadores representan un riesgo para la transmisin de estos agentes a otros rebaos, en los que puede producirse la evolucin hacia a una enfermedad grave. El diagnstico de la rinitis atrfica depende de las investigaciones clnicas, patolgicas y microbiolgicas, siendo las ltimas particularmente importantes en las explotaciones con infeccin subclnica. Hoy se acepta que un rebao en el que est presente P. multocida toxignica se considere como afectado por rinitis atrfica progresiva, tanto si los signos clnicos son evidentes o como si no (21). Por lo tanto, en muchos pases, el control se ha centrado en la deteccin de la infeccin, incluso en animales asintomticos considerados potenciales portadores. Los signos clnicos incluyen estornudos, secreciones nasales y acortamiento o deformacin de la jeta, acompaados por atrofia de los huesos de los cornetes nasales, tasa de crecimiento reducida y, en los casos graves, dificultad al comer. La atrofia de los cornetes slo puede verse en el sacrificio, cuando se examinan secciones del de la jeta a nivel del segundo premolar, pero tambin se han utilizado la radiografa (11) y la tomografa para la deteccin en animales vivos. A menudo, para el seguimiento de los rebaos, es conveniente y til la valoracin subjetiva de la atrofia de los cornetes. (9, 27). Se han descrito escalas objetivas de medida de los cornetes (14), y son ms adecuadas para los estudios que requieren anlisis de datos. El diagnstico se complementa con la deteccin de cambios histopatolgicos caractersticos, que incluyen la sustitucin fibrosa de las placas seas de las conchas ventrales, con variacin en el grado de los cambios inflamatorios y reparadores.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.
a)

Identificacin de los agentes

Cultivo
Los hisopos tonsilares o las biopsias proporcionarn los ndices de aislamiento ms elevados, ya que P. multocida coloniza preferentemente las tonsilas (1). Para el aislamiento de B. bronchiseptica, se prefieren los hisopos nasales. Cuando no es posible el muestreo de las tonsilas, los hisopos nasales son suficientes para el aislamiento de ambos organismos. Se utiliza un nico hisopo para muestrear ambos lados de la cavidad nasal, a continuacin se coloca en un medio de transporte no nutritivo (por ejemplo, tampn fosfato salino), y se conserva a 48C durante el transporte, para impedir el crecimiento en exceso de otras bacterias que crecen ms rpidamente. El transporte no exceder de las 24 horas.

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Aunque P. multocida y B. bronchiseptica crecen fcilmente en agar sangre, se prefiere un medio selectivo, ya que el crecimiento en exceso de otras bacterias, que estn presentes en mayor cantidad, interfiere, a menudo, con su deteccin. Una dificultad aadida relacionada con B. bronchiseptica es que este organismo crece ms lentamente que la mayora de las otras bacterias presentes en las muestras clnicas. Se han utilizado diferentes formulaciones de medios que contienen antibiticos para el aislamiento de P. multocida, pero la comparacin de los resultados de diferentes estudios reflejados en la bibliografa indica que los ndices de aislamiento ms altos se obtienen con medio de Knight modificado (agar sangre bovina conteniendo 5 g/ml de clindamicina, 0,75 g/ml de gentamicina) (18) o KPMD (agar sangre bovina conteniendo 3,75 U/ml de bacitracina, 5 g/ml de clindamicina, 0,75 g/ml de gentamicina y 2,25 g/ml de anfotericina B) (1). Para el crecimiento selectivo de B. bronchiseptica, a partir de hisopos nasales, muchos laboratorios utilizan agar de MacConkey con glucosa al 1% y 20 g/ml de furaltadona, sin embargo un medio de SmithBaskerville modificado (una formulacin de agar peptona que contiene 20 g/ml de penicilina, 20 g/ml de furaltadona y 0,5 g/ml de gentamicina) parece mejor, especialmente, cuando la cantidad presente de B. bronchiseptica es baja (18, 29). Se ha descrito una mejora adicional en el ndice de aislamiento empleando agar sangre conteniendo 40 g/ml de cefalexina (18). Se ha descrito tambin un medio selectivo de agar sangre para el aislamiento simultneo de P. multocida y B. bronchiseptica, que contiene 5 mg/litro de clindamicina-HCl, 0,75 mg/litro de gentamicina sulfato, 2,5 mg/litro de telurito potsico, 5 mg/litro de anfotericina-B y 15 mg/litro de bacitracina (10). Sin embargo, se ha observado que el telurito potsico inhibe a veces el crecimiento del tipo D de P. multocida (18).

b)

Caractersticas bioqumicas
Pasteurella multocida es un bacilo Gram negativo pleomrfico, bipolar, que forma colonias grisceas no hemolticas en agar sangre, de un caracterstico olor dulzn (24). No crece en agar MacConkey , da positivas las reacciones de oxidasa y catalasa, y produce indol. Bordetella bronchiseptica tambin es un bacilo Gram-negativo, que forma colonias convexas de 12 mm de dimetro, generalmente hemolticas, en agar sangre o en medio BordetGengou, despus de 48 horas de cultivo (25). No es fermentativa, es positiva para oxidasa, catalasa, citrato y urea, y crece en NaCl al 6,5%. Se han descrito pruebas de aglutinacin en las que se emplean antisueros especficos para confirmar la identidad de presuntos aislados de B. bronchiseptica, pero los antisueros idneos frecuentemente no se encuentran disponibles para su uso. Tipificacin capsular de Pasteurella multocida

La tipificacin capsular de P. multocida es til con fines epidemiolgicos. Tradicionalmente se ha utilizado la serotipificacin por hemaglutinacin indirecta (3), pero slo unos pocos laboratorios en todo el mundo producen y mantienen los antisueros que se requieren. Sin embargo, la mayora de las cepas porcinas pueden distinguirse normalmente por mtodos qumicos ms sencillos. Los que producen la cpsula del tipo D forman un floculado abundante en solucin acuosa de acriflavina 1/1.000 (5), mientras que las cepas capsulares del tipo A se pueden identificar por inhibicin del crecimiento en presencia de hialuronidasa (4). Una pequea proporcin de las cepas porcinas no tiene cpsula. i) Procedimiento del ensayo con acriflavina para el tipo capsular D de Pasteurella multocida Para cada aislado de P. multocida que se ensaya, se inocula un tubo conteniendo 3ml de caldo cerebro corazn, utilizando un cultivo fresco en agar sangre. Como controles positivo y negativo se incluyen cepas conocidas de los tipos D y A. Los tubos inoculados se incuban a 37C durante 1824 horas. Las bacterias se sedimentan por centrifugacin y se toman 2,5 ml del sobrenadante. Se aaden 0,5 ml de una solucin acuosa 1/1.000 de acriflavina neutra. La solucin de acriflavina debe prepararse cada semana y conservarse a 4C, protegida de la luz. Se mezcla para resuspender el sedimento bacteriano y se incuba el tubo a temperatura ambiente, sin agitacin. Al cabo se 5 minutos se observa para detectar la presencia de un precipitado floculante abundante. Procedimiento del ensayo con hialurodinasa para el tipo capsular A de Pasteruella multocida Se preparan cultivos frescos de los aislados que se ensayan en agar sangre bovina. Como controles positivo y negativo se incluyen cepas conocidas de los tipos D y A. Cada cepa a examinar se siembra, por separado, en una placa de agar sangre tripticasa soja con sangre bovina al 6%, haciendo varias estras paralelas, con una separacin de 35 mm aproximadamente, a travs del dimetro de la placa. Para la mxima produccin de cido hialurnico, es importante que las placas sean recientes y no estn deshidratadas.

ii) iii) iv) v) vi) i) ii)

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iii) iv)

Se siembra en estras con abundancia de una cepa de Staphylococcus aureus productora de hialuronidasa en ngulos rectos con respecto a las lneas de crecimiento de P. Multocida. Se incuban las placas a 37C, en una atmsfera hmeda, y se observan durante 24 horas. Las cepas del tipo A exhibirn una marcada inhibicin del crecimiento en la regin contigua a las lneas de crecimiento de S. aureus. Deteccin de la toxina de Pasteurella multocida

El diagnstico de la rinitis atrfica progresiva depende de la caracterizacin como toxignicos de los aislados de P. multocida. La toxina termolbil de P. multocida produce dermonecrosis en cobayas, y es letal en ratones ECP la inyeccin intraperitoneal. La toxigenicidad se puede demostrar tambin in vitro, ensayando los efectos citopticos sobre monocapas de clulas de pulmn de embriones bovinos (EBL) (28), o en clulas de rin de mono verde africano (clulas Vero) (23). Las bacterias se cultivan en caldo infusin de cerebro y corazn a 37C, durante 24 horas, y se sedimentan por centrifugacin. El sobrenadante se esteriliza por filtracin, y se titula en cultivos monocapa preparados en placas de microtitulacin. Despus de la incubacin a 37C, durante 23 das, se tien las monocapas con cristal violeta y se examinan al microscopio para detectar los efectos citopticos. Una prueba rpida de cultivo celular, en la que las colonias sospechosas se cultivan sobre una capa de agar de clulas EBL (6), permite el anlisis ms eficaz de grandes cantidades de aislados. La toxina se puede detectar en mezclas de bacterias recuperadas de medios de aislamiento primarios mediante un enzimoinmunoensayo (ELISA), utilizando anticuerpos monoclonales (12, 13). Esto constituye una ventaja importante, ya que los cerdos pueden ser colonizados simultneamente por una mezcla de cepas toxignicas y no toxignicas (1, 9). Los mtodos de cultivo celular exigiran que se ensayaran todas las colonias de P. multocida de la muestra lo que claramente es inviable para alcanzaran el mismo nivel de sensibilidad que el ELISA. Este ELISA est comercialmente disponible en toda Europa y Amrica Latina1 (aunque no lo est en los Estados Unidos de Amrica) y ha sido ampliamente adoptado en muchos sitios como el mtodo preferido para la identificacin de portadores, y para el control de la rinitis atrfica progresiva. Aunque sea muy especfico, un resultado positivo, sin historia previa de enfermedad o sin signos sospechosos, deber investigarse a fondo para recuperar aislados toxignicos de los animales muestreados.

c)

Mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos

En la mayor parte de los laboratorios, el anlisis bioqumico y el de la morfologa de la colonia siguen siendo la base para la identificacin de P. multocida toxignica y de B. bronchiseptica. Sin embargo, varios mtodos para la deteccin de P. multocida o B. bronchiseptica en cerdos, descritos recientemente, que se basan en el uso de sondas de ADN (16, 26), o de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (15,19,20), son prometedores como herramientas diagnsticas ms rpidas, ms especficas y ms sensibles. Recientemente se ha descrito una tcnica de PCR mltiple para la tipificacin capsular de P. multocida, que parece proporcionar resultados ms fiables que los mtodos fenotpicos (30), y puede resultar de utilidad en los laboratorios equipados para llevar a cabo ensayos de PCR.

2.

Pruebas serolgicas

Actualmente no hay pruebas serolgicas satisfactorias en las que se pueda confiar para detectar aquellos animales infectados por P. multocida toxignica, y que puedan desarrollar o propagar la enfermedad. La deteccin de anticuerpos contra P. multocida no es til, ya que las cepas no toxignicas comparten muchos antgenos que dan reaccin cruzada con cepas toxignicas. Se ha descrito un ELISA para la deteccin de anticuerpos contra la toxina de P. multocida (12), que est comercialmente disponible en Europa y Amrica Latina (vase nota a pie de pgina 1). Sin embargo, muchos animales infectados no producen anticuerpos contra la toxina, y el uso generalizado de vacunas conteniendo toxoides limita el valor diagnstico de este ELISA a los rebaos sin historial de vacunacin, o a la deteccin de la respuesta vacunal en los rebaos vacunados. La infeccin por B. bronchiseptica puede detectarse serolgicamente mediante el ensayo de aglutinacin con bacterias tratadas con formalina, o con un ELISA ms sensible (31). Si no se controla el estado de un rebao negativo, la serologa de B. bronchiseptica puede resultar de escaso valor, ya que el organismo est presente en muchos rebaos porcinos, aparentemente normales.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Hay varias vacunas disponibles comercialmente que contienen bacterinas de clulas completas de B. bronchiseptica y una mezcla de P. multocida toxignica y no toxignica, o un toxoide de P. multocida. Tambin
1 Disponible en Dako A/S, Produktionsvej 42, DK-2600 Gloistrup, Dinamarca.

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estn disponibles las vacunas vivas atenuadas de B. bronchiseptica. Las vacunas que contienen B. bronchiseptica sola no son adecuadas para el control de la rinitis atrfica progresiva, pero pueden resultar beneficiosas en rebaos con la forma no progresiva. Las vacunas de Pasteurella multocida y B. bronchiseptica parecen reducir el nivel de colonizacin por estas bacterias, pero no las eliminan ni impiden la infeccin. La toxina de P. multocida es el antgeno protector ms importante con respecto a la rinitis atrfica progresiva. Las vacunas basadas en un toxoide de P. multocida ofrecen proteccin especfica contra la accin de la toxina, que por s misma puede ocasionar los principales signos clnicos (para revisin, vase la referencia 12). El nivel de toxina producida por P. multocida es relativamente bajo, y la respuesta de anticuerpos especficos de la toxina, inducida por las vacunas que solo tienen bacterinas, puede no ser ptima. La dificultad y el gasto que conllevan la purificacin a gran escala impiden la incorporacin de toxoides purificados en las vacunas. Recientes estudios de campo han demostrado que un derivado recombinante de la toxina de P. multocida, que no es txico, pero s inmunognico, tiene una eficacia superior en el cerdo (2, 22). Bordetella bronchiseptica produce diversas toxinas y adhesinas que son potenciales factores de virulencia en el cerdo. Se ha demostrado que slo una protena, la pertactina de la membrana externa, protege contra la enfermedad en cerdos (17). A pesar de este hecho, tradicionalmente se ha considerado una toxina dermonecrtica producida por B. bronchiseptica, no comparable con la toxina producida por P. multocida, como el principal factor de virulencia e inmungeno protector para porcino (9). Varios estudios implican a la toxina como un factor de virulencia, e indudablemente aquella juega un papel en la patognesis y, quizs, en la proteccin. Sin embargo, no puede excluirse el papel de la pertactina y de varios factores de virulencia adicionales en la inmunidad protectora. Bordetella bronchiseptica est sometida a variacin fenotpica bajo determinadas condiciones de crecimiento (por ejemplo, a temperaturas por debajo de 37C, o en presencia de moduladores qumicos como el MgSO4 o el cido nicotnico), en las que la produccin de la mayora de los factores de la virulencia est intactivada reversiblemente. Los mutantes espontneos, permanentemente incapaces de producir la mayora de los factores de virulencia, aparecen tambin con una baja frecuencia durante el cultivo. Para mantener los cultivos en fase I (conocida tambin como Bvg+), o virulenta, es imprescindible prestar una cuidadosa atencin a la morfologa de la colonia en una zona de la placa donde las colonias estn bien separadas. Las colonias de la fase I son pequeas (12 mm de dimetro), abombadas, y hemolticas en agar sangre. La prdida de la capacidad hemoltica y la aparicin de colonias ms grandes y planas indican la conversin a la forma no virulenta. En la medida de lo posible, los cultivos se propagarn utilizando colonias hemolticas individuales para minimizar la lenta acumulacin de clones no virulentos en el cultivo. No se dispone de los detalles precisos de estndares para la produccin de vacunas comerciales eficaces, pero se sabe que contienen 1010 clulas de B. bronchiseptica muertas con formalina y 10 g de toxoide de P. multocida por dosis. Tambin est claro que el toxoide purificado (inactivado con formaldehdo) es ms inmunognico que el toxoide puro, y que la inmunogenicidad de la forma inactivada no se ve afectada por la mezcla con una bacterina de B. bronchiseptica. El derivado recombinante de la toxina de P. multocida ha sido inactivado por deleccin de una porcin del gen que no compromete la inmunogenicidad protectora. Todas las vacunas comercialmente disponibles contienen un adyuvante oleoso o gel de hidrxido de aluminio. Para la produccin de la vacuna se emplear un cultivo virulento de fase I de Bordetella bronchiseptica, y los aislados de P. multocida utilizados debern ser toxignicos. Deben conservarse por los medios convencionales alcuotas de los inculos de B. bronchiseptica y de P. multocida toxignica, con identidad de pases e historial a los utilizados en la vacuna. Para realizar el cultivo de produccin, se utilizar un nmero de pases definido. Bordetella bronchiseptica debe inactivarse con formaldehdo. Puesto que la toxina de P. multocida tiene una localizacin intracelular y se libera en la lisis celular durante la fase estacionaria, el sobrenadante del cultivo debe recogerse aproximadamente 48 horas despus de finalizar la fase exponencial de crecimiento.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Se emplear el sistema de lotes de inculo para las cepas bacterianas utilizadas para preparar bacterinas de clulas completas, as como para las cepas a partir de las que se obtienen los antgenos purificados. En el caso de las bacterinas de clulas completas, se describir el origen y el historial de las cepas de P. multocida y de B. bronchiseptica, y se establecer la caracterizacin completa de los inculos originales en un protocolo del lote de inculo original. Los inculos de trabajo utilizados para la produccin de vacuna derivarn del inculo original, y se controlarn con relacin a todas las propiedades pertinentes, como se describe en el protocolo del lote de inculo original.

b)

Mtodo de cultivo
Todas las cepas bacterianas se cultivarn en medios apropiados que faciliten el crecimiento de forma eficaz y la expresin de los antgenos ms relevantes.

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c)

Validacin como vacuna

i) Pureza El inculo original y el inculo de trabajo deben ser cultivos puros y deben estar libres de contaminacin por bacterias, hongos, micoplasmas y virus. Debe confirmarse la identidad de la especie bacteriana y la produccin de los antgenos relevantes. ii) Inocuidad Aunque la inactivacin de los cultivos bacterianos por un mtodo validado es un procedimiento estndar, las dos cepas bacterianas producen toxinas dermonecrticas; la detoxificacin de estas toxinas se confirmar cuando los toxoides se utilicen como componentes de vacunas. Se realizarn pruebas estndares de inocuidad para las vacunas inactivadas (7, 8). iii) Eficacia La eficacia de la vacuna de ensayo deber medirse mediante la vacunacin de grupos de cerdas gestantes. Su progenie se ensayar con cultivos virulentos de B. bronchiseptica y de P. multocida productora de toxina. Deber obtenerse una proteccin significativa contra los signos clnicos de la forma progresiva de la rinitis atrfica, es decir, la atrofia de los cornetes. Los signos clnicos inducidos en los controles y en los vacunados pueden compararse segn el sistema de puntuacin de Done (11).

2.

Mtodos de produccin

Los cultivos de B. bronchiseptica y de P. multocida se propagarn en medios que faciliten el crecimiento eficaz, y permitan la expresin ptima de los antgenos que son relevantes para la produccin de anticuerpos protectores. Deber confirmarse que Bordetella bronchiseptica es un cultivo de fase I, y, en el caso de P. multocida, que el cultivo contiene niveles suficientes de toxina. Las clulas de Bordetella bronchiseptica y las clulas de P. multocida y/o la toxina, se inactivan, se detoxifican y se formulan con un adyuvante. Los adyuvantes comnmente utilizados son las sales de aluminio y las emulsiones de aceite.

3.
a)

Control durante el proceso

Pureza e identidad de los cultivos del inculo
Los cultivos se inoculan en placas de agar sangre y se incuban. En estas placas no debern crecer colonias no especficas.

Durante el proceso de produccin se llevan a cabo los siguientes controles.

b)

Pureza e identidad de los cultivos de produccin

Los cultivos se inoculan en placas de agar sangre y se incuban. En estas placas no debern crecer colonias no especficas.

c)

Inactivacin de los cultivos antes de procesamientos posteriores

Los cultivos se inactivan con formaldehdo. Se realizan pruebas para comprobar la eficacia del proceso de inactivacin y para detectar la presencia de formaldehdo residual.

d)

Cuantificacin de los antgenos

La cuantificacin se lleva a cabo mediante la realizacin de un recuento total de clulas, utilizando una cmara de recuento de bacterias para contar clulas completas, o mediante la determinacin de la masa antignica para antgenos concretos, por ejemplo, la toxina de P. multocida, mediante enzimoinmunoensayo cuantitativo.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Cada lote de vacuna se probar en relacin a su esterilidad segn los mtodos normalizados (vase el Captulo I.1.5.) descritos en la Farmacopea Europea o en el Cdigo Federal de Normas de los Estados Unidos.

b)

Inocuidad
Cada lote de vacuna se deber probar en relacin a su inocuidad en el animal diana, administrndole una dosis doble por la va recomendada de vacunacin, y una segunda dosis nica dos semanas ms tarde. No deben producirse reacciones locales o sistmicas anmalas.

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c)

Potencia
Cada lote de vacuna se probar en relacin a su potencia empleando una prueba serolgica validada que se correlaciona con la proteccin obtenida en el experimentos de eficacia, segn se describe en la Seccin C.1.c.iii. La prueba de potencia no se lleva a cabo necesariamente en el animal diana se pueden utilizar ratones o conejos. En estos casos la correlacin, se tiene que demostrar con los niveles de anticuerpos protectores en el animal diana.

d)

Duracin de la inmunidad
La vacuna se aplica normalmente durante la ltima etapa de gestacin, de forma que la progenie quedar protegida mediante la incorporacin de los anticuerpos del calostro. En el caso de que la vacuna pueda aplicarse con independencia de la etapa de gestacin, la duracin de la inmunidad deber ser, al menos, de 6 meses, de forma que las vacunaciones de recuerdo dos veces al ao mantengan niveles eficaces de anticuerpos.

e)

Estabilidad
Cada lote de vacuna debe someterse a una prueba acelerada del perodo de validez, que se ha correlacionado con pruebas del perodo de validez a tiempo real.

f)

Conservantes
Cuando se utilice un conservante, debe calcularse su concentracin para cada lote. sta no debe exceder del nivel mximo permitido.

g)

Precauciones
La inyeccin accidental del operador, cuando se utiliza una emulsin de aceite como adyuvante, puede producir una reaccin local grave. Debe solicitarse atencin mdica inmediata, tratando la herida como la producida por una pistola de engrase.

5.
a) b)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Cada lote de vacuna se debe probar con relacin a la inocuidad, como se describe en la Seccin C.4.b.

Potencia
Cada lote de vacuna se debe probar con relacin a la potencia, como se describe en la Seccin C.4.c.

REFERENCIAS
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004