Estudio de La Estructura Antigénica de Contracaecum Multipapillatum (Sensu Lato) - TESIS

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
REA INTERDICIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MARINA
TESIS
ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA ANTIGNICA DE LA LARVA L3 DE Contracaecum multipapillatum (sensu lato)
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TTULO DE
BILOGO MARINO
PRESENTA:
MARCO ANTONIO SALAZAR BERMDEZ
DIRECTORA:
M en C. MARA DEL CARMEN GMEZ DEL PRADO ROSAS
LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, MARZO 2011
A mis padres
Mara Ins y Leonardo
Agradecimientos
Antes que a nadie, a mi Maestra, Mara del Carmen Gmez del Prado Rosas por su invaluable apoyo a nivel profesional y personal. Por la dedicacin, paciencia y congruencia con la que realiza su labor, lo cual me motiva a seguir su ejemplo y por lo que siempre estar en deuda. Mi primer y nica mam acadmica. Al Dr. Felipe de Jess Ascencio Valle, por su atencin y apoyo, indispensables para que este trabajo llegara a su culminacin y por sus comentarios para mejorarlo. Al Dr. Carlos Armando Snchez Ortiz por su disposicin y valiosos comentarios. A todos los que intervinieron directa e indirectamente en la realizacin de este trabajo en la UABCS, CIBNOR, y el Centro de Investigacin Biomdica de Oriente, CIBIOR. A Ma. de Jess Chula Romero Geraldo por toda su ayuda y a los que fueron mis compaeros durante mi estancia en el laboratorio de Patognesis Microbiana del CIBNOR, al Dr. Amaury Cordero Tapia y el resto del personal del bioterio. A las personas cuya amistad me ayud y sigue ayudando a continuar durante mis ya muchos y antisociales aos en La Paz, a Paola Prieta, Sr. Horacio, Paty, Isa y a todas las nias y no tan nias del Laboratorio de Parasitologa por estar ah y por aguantarme a m y a mi msica. A los que, estando lejos, llevo a todos lados conmigo, Eliana, Elena, Pepe, Lalo por su amistad y su apoyo. A toda mi familia Salazar y Bermdez y a mis abuelos Leonor y Antonio por su cario y apoyo. A Roberto primature (R-Bear), qu puedo decir que no sepas ya? Por ser un amigo y un hermano indispensable para m, todo este tiempo; por crecer y compartir lo bueno y lo malo conmigo (sobre todo lo bueno: apoyo, buena msica y jocosidad). No lo hubiera logrado sin vos. A mi mujer Ana Luisa, por ser mi motivo y voluntad da con da, para intentar ser mejor; por permitirme ser parte de tu vida y ser la mejor parte de la ma. Gracias por todos los aos de felicidad que me has dado. A mi familia; mi hermano Leonardo, mi primer ejemplo a seguir. A mis padres Leonardo y Ma. Ins por ser mi mayor ejemplo de amor, integridad y perseverancia; porque no sera lo que soy de no ser por ustedes.
Estudio de la estructura antignica de Contracaecum multipapillatum s. l.
NDICE
Lista de Figuras Lista de Tablas Resumen Introduccin Antecedentes Justificacin Hiptesis Objetivo general Objetivos particulares rea de estudio Material y Mtodos Recolecta de material biolgico Identificacin de las larvas Obtencin del extracto crudo de las larvas Obtencin de suero hiperinmune Anlisis electrofortico de los antgenos de larvas de Contracaecum sp. Inmunoblotting de los antgenos de larvas de Contracaecum sp. Resultados Identificacin taxonmica de hospederos y nemtodo Anlisis electrofortico de los antgenos de larvas Obtencin de suero hiperinmune e inmunoreconocimiento de los antgenos 26 20 22 22 23 18 II III IV 1 10 12 13 13 13 14 16 16 17 17 17
Discusin Identificacin taxonmica de los nemtodos Parasitismo por Contracaecum Estructura antignica e inmunogenicidad de Contracaecum multipapillatum s. l. Futuro de la lnea de investigacin Conclusiones Recomendaciones Trabajos Futuros Literatura Citada
29 29 30
36 41 42 43 45 46
LISTA DE FIGURAS
1 . Mugil cephalus 2 . Ciclo de vida probable de C. multipapillatum s. l. 3 . Morfologa de la larva L3 de C. multipapillatum s. l. 4 . Baha de La Paz 5 . Metodologa 6 . Perfiles proteicos del extracto crudo de C. multipapillatum s. l. 7 . Antgenos de C. multipapillatum s. l. reconocidos por anticuerpos en suero de conejo 27 24 2 7 9 15 21
II
LISTA DE TABLAS
1 . Estndar de pesos moleculares 2 . Prevalencia e Intensidad parasitaria de C. multipapillatum s. l. 3 . Pesos moleculares de los antgenos de C. multipapillatum s. l. 4 . Antgenos de C. multipapillatum s. l. reconocidos por suero de conejo 28 25 19 22
III
RESUMEN
El nemtodo Contracaecum multipapillatum (sensu lato) pertenece a la familia Anisakidae, cuyas larvas son un problema importante para la industria pesquera en diferentes pases, ya que son capaces de infestar el tracto digestivo del humano tras su ingestin accidental al consumir carne de pescado cruda o poco cocinada, produciendo la enfermedad conocida como Anisakidosis. Los nemtodos no llegan a hacerse adultos en el humano, pero sus antgenos pueden ser reconocidos por el sistema inmune, provocando reacciones alrgicas con niveles elevados de Inmunoglobulinas especficas. Debido a la alta prevalencia e intensidad parasitaria de C. multipapillatum s. l. observada en Mugil cephalus, un pez de importancia comercial en La Paz, Baja California Sur, se realiz el estudio de la composicin e inmunogenicidad de las protenas somticas de larvas en tercer estadio obtenidas de M. cephalus. Se prepar un extracto crudo de las larvas el cual se analiz por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida, obteniendo un perfil de 54 protenas con pesos moleculares entre 1.2 y 90.9 kilodaltones (kDa). Con el extracto se inmuniz a conejos de Nueva Zelandia para obtener suero hiperinmune con Inmunoglobulinas anti - C. multipapillatum s. l. y se analiz con la tcnica de inmunoblotting; el suero present IgGs capaces de reconocer 33 de los antgenos presentes en el suero, 19 (61%) de ellos (90.94 - 8.55 kDa) reconocidos por IgGs producidas por la presencia de los antgenos de C. multipapillatum s. l. y 14 reconocidos por IgGs presentes tambin en el suero del conejo control. Es necesario alertar a las autoridades y a la poblacin en general, para que adopten medidas precautorias, con el fin de disminuir el posible riesgo que representa C. multipapillatum s. l. a la salud pblica. A partir de la informacin obtenida es posible realizar un estudio que determine si existen casos de infeccin o reacciones alrgicas producidas por esta especie.
IV
INTRODUCCIN
Los peces, tanto en estado silvestre como en condiciones de laboratorio, estn sujetos a ser parasitados por organismos pertenecientes a diversos grupos taxonmicos. Las lesiones causadas por los parsitos, sobre todo en peces silvestres, por lo general pasan inadvertidas, a menos que el dao sea tan obvio que demerite su calidad comercial (Roberts, 1981). Los nemtodos frecuentemente parasitan peces, en ocasiones, como parte de ciclos de vida complejos que incluyen varios estadios larvarios. Se estima que cerca de 40,000 especies parasitan vertebrados; se han descrito cerca de 17,000, comprendidas en 256 familias y 2,271 gneros (Anderson, 2000). Los peces del gnero Mugil (Lisas) han sido estudiados en Baja California Sur (B.C.S.) desde 1995 en relacin con su helmintofauna, registrando elevada prevalencia y carga parasitaria por larvas L3 del nemtodo Contracaecum sp. (Gmez del Prado et al., 2008); estos parsitos parecen acumularse durante el tiempo de vida de los peces. En el estado de Baja California se ha observado que la intensidad parasitaria de Contracaecum spp. y otros parsitos combinados, aumenta respecto al tamao de Mugil cephalus, (Valles-Ros et al. 2000). Las especies de lisas son muy abundantes y valiosas en las costas de Mxico. En el Golfo de California en el periodo de 2001-2005 constituyeron la segunda mayor captura (en toneladas y ganancias promedio) de la flota riberea. En la Baha de La Paz, B.C.S., es posible encontrar Mugil cephalus (Fig. 1) y M. curema a lo largo del ao. A pesar de que no se encuentran entre las especies que aportan mayor porcentaje de captura en el rea, representan un recurso local
importante debido a que se consume a nivel popular por su bajo precio. (Prez y Ruiz-Luna, 1985; Plomozo-Lugo, 2011).
Figura 1. Mugil cephalus Lisa cabezona de la Baha de La Paz, B. C. S., Mxico.
Las larvas de nemtodos de la familia Anisakidae en peces, son un problema importante para las industrias pesqueras de varios lugares de Europa y Estados unidos de Amrica, siendo Anisakis, Contracaecum, Hysteothylacium y Pseudoterranova los gneros ms frecuentes. La presencia de los nemtodos aniskidos adultos est asociada a patologas ligeras en su hospedero definitivo (aves y mamferos piscvoros). De acuerdo con Stoskopf, 1993 y Anderson, 2000, las larvas de Anisakis y Contracaecum pueden causar considerable dao a los rganos viscerales y otros tejidos de su hospedero intermediario o paratnico (generalmente peces), debido a la conducta migratoria que tienen para su establecimiento en la serosa de varios rganos del aparato digestivo. El gnero Contracaecum en particular, puede provocar serios daos en hgado y tejidos mesentricos de sus hospederos, tales como inflamacin extensiva, fibrosis y adhesin visceral pero
sin impacto aparente en la condicin corporal. As ocurre en las lisas en la Baha de La Paz, las cuales no presentan alteraciones externas visibles a pesar de las concentraciones relativamente altas de parsitos en el cuerpo, por lo que su presencia no afecta significativamente su comercializacin, lo que constituye un peligro potencial de presentar una reaccin a los alrgenos en los alimentos que estuvieron en contacto con las larvas o incluso, contraer la Anisakidosis. (Mbahinzireki, 1980; Nadler et al., 2005; Gmez del Prado et al., 2008). La anisakidosis en humanos, es una infestacin parasitaria del tracto digestivo por nemtodos de la familia Anisakidae, resultado de la ingestin accidental de su tercer estadio larvario (L3) en carne de pescado cruda o poco cocinada, siendo Contracaecum, Pseudoterranova, Anisakis los gneros ms frecuentes. Se reserva el trmino anisakiasis a la patologa producida especficamente por el gnero Anisakis y ambos trminos son utilizados en la literatura (Gmez Senz et al., 1999; Noh et al., 2003). La anisakidosis fue endmica de Japn, pero debido al consumo mundial de pescado crudo, puede convertirse en una enfermedad cosmopolita, a pesar de que se conoce que las larvas se destruyen al cocer el pescado a una temperatura de 60C o por congelacin a -20C (Noh et al., 2003). Los nemtodos no llegan a hacerse adultos en el humano, pero su presencia expone al hospedero a antgenos que pueden ser reconocidos por el sistema inmune, estos antgenos son usualmente protenas y glicoprotenas localizadas en la superficie o en los productos de secrecin. La inmunidad contra las infecciones por nemtodos, al igual que muchas otras helmintiasis, es en su mayor parte humoral (Perec y Okulewicz, 2006)
Tras la ingestin de la larva, sta penetra activamente la pared del estmago o del intestino delgado, causando sntomas gastrointestinales agudos que generalmente se confunden con apendicitis o lcera gstrica, dichos sntomas pueden presentarse desde una hora hasta dos semanas despus de consumir el pescado contaminado (Kim et al., 1991; Noh et al., 2003). La anisakidosis provoca episodios que pueden variar desde una ligera urticaria hasta anafilaxia recidivante; pueden dar origen a granulomas eosinfilos en la pared gastrointestinal, adems de reacciones alrgicas de tipo 1, con niveles elevados de Inmunoglobulina tipo E especfica (IgE), diagnosticadas generalmente por serologa (Roberts, 1981; Gmez Senz et al., 1999; Anderson, 2000; Lorenzo et al., 2000; Cuellar et al., 2001; Rodero et al., 2001). En algunos pocos casos, se han encontrado larvas L3 de Anisakis simplex y de Contracaecum sp. en alvolos o bronquolos produciendo hemorragia y enfisema que se ha llegado a confundir con asma (Matsuoka et al., 1994). Desde hace varios aos, en Espaa, ha sido posible diagnosticar varios casos de Anisakidosis gstrica e intestinal con endoscopa y tratndose con ciruga (Sugimachi et al., 1985; Isishukura, 1989; Sakamari, 1990) Se ha observado que los nemtodos del orden Ascaridida, que incluye a los aniskidos, son capaces de infectar mamferos, aun cuando su hospedero definitivo no sea un organismo de sangre caliente; Contracaecum multipapillatum parasita el proventrculo de aves piscvoras y al igual que la mayora de los miembros del gnero, no afecta naturalmente a mamferos terrestres, aunque varias especies de Contracaecum se presentan en mamferos marinos (VidalMartnez et al., 1994). Se ha demostrado que C. multipapillatum puede madurar
en un mamfero terrestre de manera experimental, sealando el peligro potencial a la salud pblica. Aun cuando los juveniles de esta especie se encuentran generalmente encapsulados en hgado, riones y mesenterio de los peces hospederos, tambin pueden encontrarse en cualquier otro lugar e incluso permanecer dentro de ellos despus de eviscerar, por lo que podran ser ingeridos posteriormente por el humano; si bien las larvas de Contracaecum spp. no son ingeridas tan frecuentemente como las que se presentan tpicamente en la carne de los peces (ej. Anisakis spp.), esto ha provocado que sean menos estudiados (Fagerholm, 1988; Vidal-Martnez et al., 1994). Contracaecum multipapillatum es un parsito de pelcanos, cormoranes y garzas en Amrica, aunque los registros de juveniles indican que la especie pudiera extenderse a Asia y frica (Vidal-Martnez et al., 1994). El ciclo de vida del gnero Contracaecum ocurre en el agua e involucra a invertebrados acuticos y peces como hospederos intermediarios o paratnicos (Anderson, 2000). Las hembras adultas depositan los huevos en el tracto digestivo para ser expulsados junto con sus excretas. En el agua, los huevos embrionados contienen el primer estadio larvario, ste muda poco despus, dando lugar al segundo estadio; esta larva eclosiona en el agua y es ingerida por un invertebrado crustceo, generalmente coppodos que actan como primer hospedero intermediario, la larva migra a su hemocele en donde aumenta ligeramente su tamao y presenta un desarrollo parcial de los rganos. Posteriormente los peces que se alimentan de coppodos, actan como segundos hospederos intermediarios o paratnicos, donde alcanzan el tercer estadio (L3), las larvas crecen notoriamente, atraviesan las paredes del intestino
hacia la cavidad corporal y se encapsulan en el mesenterio y diferentes rganos (hgado, gnadas, rin); se ha demostrado que la transferencia de las larvas de un pez a otro es posible mediante depredacin. Finalmente, el pez infectado es ingerido por el ave hospedera, las larvas son liberadas en el tracto digestivo y se adhieren a la pared del estmago donde se alimentan de lo ingerido por el ave. El desarrollo posterior de las larvas y paso a la adultez probablemente sucede ya dentro del proventrculo del ave (Huizinga, 1967; Anderson, 2000) (Fig. 2).
Figura 2. Ciclo de vida probable de Contracaecum multipapillatum (sensu lato).
Las larvas L3 de Contracaecum miden entre 4 y 16 mm, con un extremo posterior cnico y cola postanal con espina terminal (mucrn). Presentan una cutcula gruesa con estriaciones transversales. En la parte anterior se encuentran tres labios poco desarrollados (dos ventrolaterales y uno dorsal) y un diente cuticular ligeramente romo cerca de los labios ventrolaterales y el poro excretor inmediatamente posterior al diente. Presentan una faringe muscular y un ventrculo glandular pequeo y esfrico del que deriva un apndice ventricular dirigido hacia el extremo posterior. Tambin presenta un ciego intestinal ms grande que el apndice ventricular, dirigido haca el extremo anterior (Berland, 1989) (Fig. 3). El gnero Contracaecum Railliet y Henry, 1912 incluye aproximadamente 100 especies con una distribucin mundial, la cual ocurre de manera natural debido, probablemente, a las aves migratorias y la baja especificidad para elegir hospederos intermediarios y definitivos (Deardorff y Overstreet, 1980; Mhaisen et al., 1988; Anderson, 2000). Es muy complicada la identificacin de anisakidos hasta nivel especie basada en las caractersticas morfolgicas de adultos (muchas relevantes solo en machos), y es ms difcil aun para las fases larvarias; adems algunos de los caracteres morfolgicos que se han usado para diferenciar especies carecen de valor interespecfico, lo que ha llevado, en parte, a que algunas morfoespecies de ste y otros gneros de la familia Anisakidae formen, en realidad, parte de complejos de varias especies diferenciadas genticamente, en ocasiones, con distribucin geogrfica y hospederos distintos (Labriola y Suriano, 1996; Nadler et al., 2005; Mattiucci y Nascetti, 2008; Shamsi et al., 2008; Shamsi et al., 2009).
Figura 3. Morfologa de la larva L3 de Contracaecum multipapillatum (sensu lato) en Mugil cephalus. Ambos ciegos visibles (flechas). Extremo anterior con diente cuticular. Extremo posterior con espina caudal (mucrn)
Dentro de los complejos multiespecficos de Contracaecum se ha observado un nivel bajo de variacin en las secuencias genticas, por lo que es necesario una caracterizacin gentica que demuestre aislamiento reproductivo entre especies que en ocasiones son simptricas en sus hospederos definitivos (Shamsi et al., 2009; Mattiucci et al., 2010). Existen varios estudios de caracterizacin gentica de las especies de Contracaecum parsitas de aves piscvoras, en los que se utilizaron aloenzimas y las secuencias como las del primer y segundo espaciador transcrito (ITS1, ITS2) y las subunidades 18s y 28s del ADN ribosomal; as como el citocromo B (Cyt-B) y citocromo oxidasa 1 y 2 (COx1, COx2) del ADN mitocondrial. Dentro del complejo multiespecfico de C. multipapillatum propuesto por Mattiucchi et al. (2010) se encuentran 2 especies nominales nuevas identificadas mediante COx2: C. gibsoni y C. overstreeti en Pelecanus crispus de Grecia; antes denominadas C. multipapillatum sp. A y C. multipapillatum sp. B por Nascetti et al. (1990). El complejo adems incluye a C. multipapillatum sp. C de P. occidentalis en Colombia y C. multipapillatum sp. D encontrada en P. conspicillatus en Australia y caracterizadas utilizando los ITS1 e ITS2 (Shamsi et al., 2008; Mattiucci et al., 2006 y 2010).
ANTECEDENTES
Los casos de infeccin por larvas L3 de aniskidos mencionados anteriormente, han despertado el inters por continuar investigando otros aspectos relacionados con su sintomatologa, lesiones, diagnstico y prevencin (Kato et al., 1992; Matzuoka, 1994; Angot y Brasseur, 1995; Bouree et al., 1997;
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Noelle, 1998; Del Pozo et al., 1999; Lpez-Penas et al., 2000; Audicana et al., 2002). Moreno-Ancillo, 1997; Moreno et al., 2000 y Prez-Prez et al., 2000 realizaron estudios sobre reacciones alrgicas y caracterizacin de los alrgenos de las larvas de aniskidos. Por su parte, Gutirrez-Ramos et al., 2000 identificaron los anticuerpos anti-Anisakis y posteriormente, Rodero et al., 2001 lograron la purificacin de antgenos de Anisakis. Por otro lado, los estudios relacionados con aspectos inmunolgicos de Contracaecum son muy escasos, Coscia y Oreste (1998) identificaron anticuerpos especficos para protenas de Contracaecum en diferentes
telesteos. En Mxico son escasos los estudios que aborden el tema de la Anisakidosis y no existen casos reportados de esta enfermedad por ninguno de los gneros de la familia. En varios estados de Mxico se ha encontrado al gnero Contracaecum parasitando gran variedad de hospederos, incluyendo diversas especies de peces (Jurez, 1985 y 1986; Jurez-Arroyo y Salgado-Maldonado, 1989; PrezPonce de Len et al., 1992; Mendoza, 1994; Flores, 1995; Melndez y Rosas, 1995; Castillo, 1996; Mendoza et al., 1996; Prez-Ponce de Len et al., 1996; Castillo-Snchez et al., 1998; Salgado-Maldonado et al., 2001); en aves (Caballero, 1935; Caballero y Peregrina,1938; Bravo, 1939; Alencaster, 1948; Caballero, 1948; Caballero, 1951; Caballero-Deloya, 1960; Amaya, 1990;
Ramos, 1994) y mamferos (Caballero y Peregrina, 1938; Vidal-Martnez et al., 1994)
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En el pas, las especies Mugil curema y M. cephalus han sido objeto de estudio en diversos aspectos: su parasitismo (Salgado-Maldonado y Barqunlvarez, 1978; Jurez-Arroyo y Salgado-Maldonado, 1989; Valles-Ros et al., 2000), abundancia y pesqueras (Stuardo y Martnez, 1975; Warbuton, 1979; Rivas, 1985; Rodrguez-Romero et al., 1994; Plomozo-Lugo, 2010), crecimiento y sobrevivencia (Muhlia-Melo y Muhlia-Almazn, 1995) y hbitos alimenticios (Snchez-Rueda, 2002). Debido a la amplia distribucin que presentan las lisas del gnero Mugil, tambin se han abordado los aspectos antes mencionados en otro lugares como Egipto (Moravec y Libosvarsky, 1975), Portugal (Varela et al., 1981), Francia (Hubert, 1989), Italia (De Dominis, 1993), China (Lu Junyi et al., 2001) y Brasil (Ranzani-Paiva y Tavares-Daz, 2002).
JUSTIFICACIN
Aun cuando los registros de Anisakidosis causada por Contracaecum son escasos, surge el inters por saber si en la poblacin de La Paz, B.C.S. que consume pescado que ha sido infectado por el nemtodo, se presentan algunos de los sntomas identificados y relacionados con los de Anisakis, causados en parte por una reaccin alrgica hacia los antgenos del nemtodo. El presente trabajo presenta informacin acerca de la composicin antignica de la larva L3 de Contracaecum multipapillatum sensu lato y evala su capacidad de inducir una respuesta inmune especfica (inmunogenicidad), informacin relevante por 1) los daos producidos por las especies que conforman a la familia Anisakidae en el hombre (Anisakidosis); 2) la incidencia de Contracaecum en las lisas, siendo
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un pez de consumo humano en la localidad; y 3) la posible presencia de anticuerpos contra un variedad de antgenos que pueden ser identificados por mtodos inmunoqumicos con un extracto somatico total, obtenido de las larvas L3 de esta especie. Cabe mencionar que ste es el primero de varios estudios sobre la estructura e inmunogenicidad de los antgenos de la larva L3 de Contracaecum sp. que ayudarn a establecer el nivel de riesgo a la salud pblica que representa este parsito en productos de consumo humano en la comunidad de La Paz, B.C.S.
HIPTESIS
La larva L3 de Contracaecum sp. en M. cephalus, presenta antgenos que pueden ser identificables por tcnicas inmunoqumicas.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar la estructura antignica de la larva (L3) de Contracacecum sp. presente en las lisas Mugil cephalus de la Baha de La Paz.
Objetivos particulares
a) Identificar a nivel especie las larvas (L3) de Contracacecum sp. b) Obtener el perfil antignico de la larva (L3) de Contracacecum sp. (por electroforesis en geles de poliacrilamida) c) Determinar la inmunogenicidad de los diferentes antgenos de la larva (L3) de Contracaecum sp. (mediante la inmunizacin de conejos Nueva Zelandia bajo condiciones controladas).
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d) Estandarizacin de la tcnica de ELISA para la cuantificacin de anticuerpos contra L3 en conejos inmunizados. e) Identificar los anticuerpos que reconocen antgenos de Contracacecum sp mediante electroforesis en geles de poliacrilamida e inmunoblotting.
REA DE ESTUDIO
La Baha de La Paz se localiza en la costa occidental del Golfo de California entre los 24 06y 24 47 latitud norte y 110 18 y 110 74 longitud oeste (Fig. 4). Tiene una extensin de 2,635 km2, una profundidad mxima de 400m y presenta fondos de arena y fragmentos de carbonato de calcio (Contreras, 1985; Rueda, 1995; Cruz-Orozco et al., 1996). La baha tiene una temperatura mnima superficial de 20 y una mxima de 31C (Espinoza y Rodrguez, 1987). Cuenta con una precipitacin media anual menor a 200mm, siendo septiembre el mes ms lluvioso (>100mm) (Robles GilMestre, 1998). Est separada del Golfo de California por una pennsula estrecha y el complejo insular Espritu Santo-La Partida y presenta una ictiofauna diversa debido a su gran extensin, profundidad y heterogeneidad ambiental; con un nmero total de 522 especies nominales conocidas, siendo el Guachinango (Lutjanus peru) es la especie ms importante en cuanto a captura total, con un promedio de 760.84 toneladas anuales (Balart et al., 1995; Obeso-Nieblas et al., 2008; Plomozo-Lugo, 2010).
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Figura 4. rea de Estudio. Baha de La Paz, B. C. S., Mxico.
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MATERIAL Y MTODOS Recolecta de material biolgico Hospederos: Se compraron 40 lisas Mugil cephalus de la Baha de La Paz, directamente de los pescadores de la marina de la ciudad de La Paz, el mismo da de su captura y sin eviscerar. Su identificacin taxonmica se realiz mediante el uso de las claves en la Gua FAO para la Identificacin de Especies para los Fines de la Pesca / Pacfico centro-oriental (Fischer et al., 1995). Nemtodos: Los peces se disecaron en el Laboratorio de Parasitologa de la Universidad Autnoma de Baja California Sur (UABCS) y se realiz una bsqueda de parsitos por rgano, hasta recolectar 110 larvas de nemtodos de Contracacecum sp. Los parmetros ecolgicos de prevalencia e intensidad media de infeccin por hospedero y por rgano, se obtuvieron de acuerdo al criterio establecido por Bush et al. (1997). La prevalencia parasitaria se define como el porcentaje de la poblacin de hospederos parasitados, respecto a la poblacin de hospederos examinados y se calcula con la formula:
Prevalencia = No. de Hospederos infectados No. de Hospederos examinados x 100
La intensidad parasitaria es la cantidad de parsitos encontrados en cada hospedero revisado y se calcula con la frmula:
No. de larvas
Intensidad
. No. de Hospederos infectados
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Animales de laboratorio: Se adquirieron seis conejos de Nueva Zelandia de 3Kg de peso y se les administr un tratamiento para desparasitarlos, posteriormente se sometieron a un periodo de cuarentena y aclimatacin en el bioterio del Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste (CIBNOR).
Identificacin de las larvas Se preservaron 10 de las larvas L3 en etanol 95% y se enviaron al Dr. Robin M. Overstreet de The University of Southern Mississippi - Gulf Coast Research Laboratory, para realizar la secuenciacin de ADN e identificacin taxonmica de las larvas, comparando las secuencias obtenidas con secuencias conocidas de varias especies del gnero Contracaecum.
Obtencin del extracto crudo de larvas Los parsitos se lavaron en solucin amortiguadora salina de fosfatos (PBS) para eliminar los restos de tejido de los hospederos, se homogeneizaron en un homogeneizador de tejidos y se procedi a centrifugar a 6000rpm durante 30 minutos, a una temperatura de 4C. Se determin la concentracin proteica del extracto crudo por el mtodo de Bradford (1976) y se almacen en alcuotas de 200l que se conservaron en congelacin a -20 C hasta su uso.
Obtencin de suero hiperinmune Se utilizaron cuatro conejos, uno como control y tres a los que se inmuniz con el extracto crudo obtenido, en un volumen de 2 ml de antgeno en adyuvante completo de Freund con una concentracin final de 100 g de antgeno por
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mililitro, por va intramuscular cada 14 das hasta cumplir un mes. En el da 16 y 32 se sangraron a los conejos para obtener el suero hiperinmune y el suero control. A los 37 das los conejos se sacrificaron y se obtuvieron los sueros que se congelaron hasta su uso en la prueba de inmunoreconocimiento. Se determin la concentracin de anticuerpos inducidos en conejos, por la inmunizacin con los antgenos de Contracaecum sp. por la tcnica de ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) segn Yang et al. (1991). En una microplaca de plstico fueron inmovilizados 10g (por pozo) de protenas somticas de las larvas, incubndolas toda la noche a 4C; despus de varios lavados con PBS-Tween 0.05%, se bloque con Albmina Srica Bovina al 3% en PBS. Posteriormente se incubaron con los sueros de los conejos inmunizados y el conejo control durante dos horas a 37C, en dilucin seriada y se lavaron nuevamente con PBS-Tween. Se incubaron 90 minutos a 37C con IgG enlazadas a peroxidasa anti-IgG de conejo, desarrolladas en cabra (Sigma Inmuno Chemicals / Anti rabbit IgG -whole molecule- peroxidase conjugate). Despus de varios lavados con PBS-Tween, se revel aadiendo el sustrato y cromgeno (H2O2, orto-fenil-diamina en solucin amortiguadora de citratos pH 5.4) y se incub en oscuridad a 22C durante 30 minutos. Por ltimo, se detuvo la reaccin con H2SO4 1M y se ley la placa en el cromatgrafo de placas a 492nm.
Anlisis electrofortico de los antgenos de larvas de Contracaecum sp. Previo a la realizacin del anlisis, se llev a cabo el aprendizaje y la prctica de la tcnica en el Centro de Investigacin Biomdica de Oriente (CIBIOR) del Instituto Mexicano del Seguro Social, en Metepec, Puebla.
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En el laboratorio de Patologa Microbiana del CIBNOR, en La Paz, B.C.S., se analiz el extracto crudo de las larvas de Contracaecum sp. por medio de electroforesis en geles de Poliacrilamida - Dodecil sulfato de sodio (PAGE - SDS) como describe Laemmli (1970), para ello se us una cmara de electroforesis Protean II (gel grande) y una Mini Protean II (gel chico). Los geles consistieron en gel concentrador al 4% y gel separador al 20%. Se utiliz solucin amortiguadora para electrodos (Tris 25mM, glicina 192mM, SDS 1%, pH 8.3) y solucin amortiguadora para muestras (Tris-HCl 50mM pH 8.6 conteniendo SDS 2% glicerol 20%, 2-mercaptoetanol 2% y azul de bromofenol 0.02%) para disolver las muestras 1:1 (18l-muestra / 18l-solucin
amortiguadora para muestra por pozo en geles chicos y 40l-muestra / 40l solucin amortiguadora para muestra por pozo en geles grandes). Las electroforesis se realizaron a 100 V durante 2 horas. Se corrieron marcadores de pesos moleculares BIO-RAD SDS-PAGE Molecular weight standards de rango amplio (200,000 - 6,500 kDa) y rango bajo (97,400 - 14,400 kDa) (Tabla 1) junto con las muestras.
Tabla 1. Protenas y sus respectivos pesos moleculares del estndar BIO-RAD SDS-PAGE Molecular weight standards (Cat-Num 161-0304)
Protena
Fosforilasa b Albmina Srica Bovina Ovoalbmina Anhidrasa Carbnica Inhibidor de Tripsina de soya Lisozima
Peso molecular (kDa)

97.4 66.2 45 31 21.5 14.4
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Inmunoblotting de los antgenos de larvas de Contracaecum sp. Previo a la realizacin del anlisis, se llev a cabo el aprendizaje y la prctica de la tcnica en el CIBIOR del Instituto Mexicano del Seguro Social. Se realiz un anlisis de inmunoreconocimiento mediante una electrotransferencia de las protenas del extracto crudo previamente separado mediante PAGE-SDS, a membranas de polifloruro de vinilideno (Immobilon - P Millipore) con poros de 0.4 m utilizando para ello una cmara de transferencia semi-seca (Bio-Rad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell) durante 30 minutos a 20V, utilizando una solucin amortiguadora de transferencia (Tris 25mM, glicina 192mM, metanol 20%, pH 8.3). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% a 4C durante toda la noche; posteriormente se lavaron tres veces con solucin de lavado (PBS-BSA 5% Tween20 2%). Se separ una muestra de cada membrana para ser incubada con suero de conejo no inmunizado (control), diluido en PBS 1:60 durante 2 horas con agitacin; el resto de las muestras se incubaron con suero de conejo antiContracaecum diluido en PBS al 1:60 por 2 horas con agitacin a temperatura ambiente. Todas las muestras se lavaron tres veces ms, con solucin de lavado y se incubaron por 1 hora con un anticuerpo anti-IgG de conejo acoplado a peroxidasa desarrollado en cabra, diluido 1:1000 en PBS-Tween20 conteniendo BSA al 1%, a temperatura ambiente. Para visualizar las bandas, se lavaron las membranas con PBS-Tween 20 y se agreg el sustrato (PBS, H2O2 al 0.006% en metanol conteniendo 0.03% de 4-cloro-1-naftol); finalmente se detuvo la reaccin con varios lavados de agua destilada (Fig. 5).
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METODOLOGA
Identificacin taxonmica molecular

Gulf Coast Research Laboratory
Recolecta de Material Biolgico
Compra
Mugil cephalus
Obtencin
Nemtodos
Compra
Preparacin de
Conejos
Cuarentena y aclimatacin
Extracto crudo
Inoculacin Inyeccin intramuscular
Anlisis por
Inmunizacin
Transferencia Sangrado a membrana
Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE
Suero hiperinmune
ELISA Clculo de Pesos moleculares
Inmunoblotting
Antgenos reconocidos por IgGs de conejo
Perfil Proteico (Antgenos)
Figura 5. Diagrama de flujo de los principales pasos de la metodologa realizada.
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RESULTADOS
Se revisaron 40 lisas presentando un 100% de prevalencia parasitaria y se obtuvieron un total de 521 nemtodos en su tercer estadio larvario (Tabla 2). Los rganos en los que se encontraron los parsitos fueron, en orden descendente de abundancia: el hgado, serosa del estmago-intestino, rin, mesenterio de la cavidad celmica (M.C.C) y la musculatura parietal (filete) (Tabla 2).
Tabla 2. Prevalencia e intensidad parasitaria de C. multipapillatum s.l. (L3) por hospedero y en los diferentes rganos de Mugil cephalus.
No. de Larvas Hospederos Hgado Serosa EstmagoIntestino Rin M.C.C. Msculo 521 232 171 103 12 3
Prevalencia 100% 100% 95% 80% 17.5% 5%
Intensidad 13 5.8 4.5 3.2 1.7 1.5
Identificacin taxonmica de hospederos y nemtodos Los peces recolectados fueron identificados como Mugil cephalus (Linnaeus 1758), basndose en su coloracin caracterstica y a la presencia de: un recubrimiento adiposo extendido sobre el iris; el nmero de escamas longitudinales (38 a 42); la segunda aleta dorsal con 9 radios y la aleta anal con 3 espinas y 8 radios.
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Las larvas de nemtodos extradas de M. cephalus corresponden a la fase 3 (L3) del gnero Contracaecum. Dentro de sus caractersticas morfolgicas se observan: tres labios y un diente cuticular; un ventrculo pequeo y esfrico; apndice ventricular dirigido hacia el extremo posterior y un ciego intestinal, ms grande que el apndice ventricular. No fue posible identificar a nivel especifico los especmenes obtenidos, pero el anlisis molecular indica que pertenecen al complejo multiespecfico de Contracaecum multipapillatum, taxn dentro del que se han descrito, hasta el momento, cuatro especies. Los especmenes de este estudio deben ser referidos como Contracaecum multipapillatum sensu lato.
Anlisis electrofortico de los antgenos de larvas de C. multipapillatum s. l. El extracto crudo somtico de las larvas L3 de C. multipapillatum s. l. present una concentracin de 80 g/lprot. En el extracto crudo se identificaron 54 protenas por el mtodo de electroforesis SDS-PAGE (Fig. 6). Las protenas en el extracto se encuentran en un intervalo de pesos moleculares de 1.2417a 90.9431 kDa (Tabla 3).
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Figura 6. Perfiles proteicos del extracto crudo de C. multipapillatum s.l. en geles de electroforesis SDS-PAGE. A1 Marcadores de peso molecular en gel chico. A2 Antgenos de C. multipapillatum s.l. en gel chico. B1 Marcadores de peso molecular en gel grande. B2 Antgenos de C. multipapillatum s.l. en gel grande.
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Tabla 3. Pesos moleculares (kDa) de los 54 antgenos presentes en el extracto crudo de C. multipapillatum s.l. A.- antgeno. PM.- peso molecular. DE.- desviacin estndar
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
PM 90.94 89.30 87.87 87.01 85.72 84.77 82.81 81.65 80.60 79.71 78.96 78.16 77.31 76.69 75.40 74.32 72.40 71.54
DE 0.24 0.12 0.24 0.26 0.15 0.14 0.14 0.11 0.16 0.20 0.15 0.11 0.16 0.17 0.14 0.15 0.13 0.10
A 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
PM 70.57 69.55 67.55 66.42 64.82 62.79 61.16 58.98 57.65 55.82 53.97 52.25 51.63 50.77 49.85 48.52 47.28 46.23
DE 0.10 0.20 0.19 0.11 0.15 0.25 0.11 0.38 0.20 0.24 0.27 0.21 0.08 0.12 0.14 0.18 0.21 0.14
A 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
PM 45.06 43.43 41.90 40.45 37.36 35.81 33.92 32.36 29.42 28.01 23.81 21.18 16.12 14.44 10.77 8.55 3.43 1.24
DE 0.15 0.13 0.24 0.21 0.32 0.32 0.24 0.21 0.21 0.24 0.28 0.26 0.19 0.25 0.16 0.63 0.24 0.09
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Obtencin de suero hiperinmune e inmunoreconocimiento de los antgenos El suero analizado se obtuvo de tres conejos inmunizados con extracto crudo de C. multipapillatum s.l., ya que uno de ellos falleci antes del primer sangrado. La prueba de ELISA practicada, mostr que el suero extrado del sangrado del da 16 despus de la inmunizacin present niveles bajos (no cuantificables) de inmunoglobulinas G (IgG) anti - Contracaecum, mientras que los sueros obtenidos de los sangrados de los das 32 y 37 presentaron 0.6g/l y 0.57g/l respectivamente. En el suero del conejo control existen anticuerpos tipo IgG que reconocen 14 de los 54 antgenos presentes en el extracto crudo de C. multipapillatum s.l. (Tabla 3, columna A). El suero de los conejos inmunizados present anticuerpos capaces de reconocer 33 de esos 54 antgenos (Fig. 7) por lo que estos resultados demuestran que el sistema inmune de los conejos utilizados en este estudio puede producir IgGs capaces de reconocer 19 de los antgenos con aparente especificidad hacia C. multipapillatum s.l. (pesos moleculares entre 90.94 y 8.55 kDa) (Tabla 4, columna B*)
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Figura 7. Antgenos de C. multipapillatum s.l. reconocidos por IgGs presentes en suero de conejo. A. Antgenos reconocidos por suero de conejo control (14). B. Antgenos reconocidos por suero de conejo inmunizado (33)
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Tabla 4. Antgenos de C. multipapillatum s.l. reconocidos por suero de conejo. A. Pesos moleculares (kDa) de los antgenos reconocidos por suero de conejo control (14). B. Pesos moleculares (kDa) de los antgenos reconocidos por suero de conejos inmunizados (33).
*Pesos moleculares de los antgenos con aparente especificidad, reconocidos solo por el suero
de los conejos inmunizados (19).
A 78.96 78.16 71.54 67.55 66.42 62.79 58.98 53.97 46.23 43.43 40.45 35.81 23.81 16.12 -
B 90.94* 87.87* 87.01* 82.81* 81.65* 80.60* 79.71* 78.96 78.16 77.31* 75.40* 72.40* 71.54 69.55* 67.55 69.55 69.55* 62.79 58.98 53.97 52.25* 50.77* 49.85* 46.23 43.43 40.45 35.81 33.92* 32.36* 23.81 16.12 10.77* 8.55*
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DISCUSIN
Identificacin taxonmica. En el rea de la epidemiologa es importante conocer con claridad qu especies son las causantes de afecciones en el humano. Debido a que algunas de las caractersticas diagnsticas utilizadas en la identificacin morfolgica de las especies carecen de valor interespecfico, el uso de herramientas moleculares para una correcta identificacin de los parsitos ha cobrado gran importancia. Se han descrito numerosas especies nuevas de aniskidos en las ltimas dos dcadas, debido a la hallazgo de varias especies hermanas, con pozas genticas aisladas reproductivamente pero con morfologa muy similar. La falta de diferenciacin puede deberse a que estos parsitos se ven afectados por factores de seleccin muy similares, causando la conservacin de las caractersticas morfolgicas, adems de que muchas de estas caractersticas parecen ser altamente homoplsicas o representan estados morfolgicos ancestrales (Mattiucci y Nascetti, 2008). Los anlisis realizados en The University of Southern Mississippi - Gulf Coast Research Laboratory por el Dr. Robin Overstreet a las larvas de nematodo obtenidas de Mugil cephalus, indican que stas pertenecen a una especie genticamente muy cercana a las especies del complejo de Contracaecum multipapillatum, pero no fue posible identificar el nivel especfico al que pertenecen. Es necesario llevar a cabo nuevos anlisis que confirmen si estas larvas pertenecen a una de las 4 especies que estn actualmente dentro del complejo o si es una especie nueva. Por este motivo la manera indicada para referirse a los especmenes encontrados en las lisas de la Baha de La Paz es
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Contracaecum multipapillatum sensu lato, que indica que se trata de una especie dentro del taxn Contracaecum multipapillatum, cuyo volumen es ms amplio que el descrito en este trabajo en particular.
Parasitismo por Contracaecum Ecolgicamente los parsitos son una parte esencial de la comunidad acutica y la mayora de los individuos de las poblaciones de peces, silvestres o en cultivo, estn infectados con uno o ms parsitos (Al-Zubaidy, 2009). Al parecer, los parsitos aniskidos se acumulan durante el tiempo de vida de los peces; la prevalencia e intensidad de infeccin por nemtodos aumenta a lo largo de la ontogenia, conforme crece el pez. De acuerdo con Moravec et al. (1995) para que un parsito se albergue en un hospedero, ste necesita ser abundante en el medio. Las posibilidades de infeccin aumentan debido al periodo de exposicin a las fases infectivas del nemtodo; al aumento en la cantidad de comida que ingiere; a la acumulacin de parsitos a lo largo de la cadena alimenticia, en particular en el caso de endoparsitos y probablemente tambin al cambio de dieta durante su vida (Szalai y Dick, 1990; Aho y Bush, 1993; Bergmann y Motta, 2004; Al-Zubaidy, 2009). En el caso de M. cephalus Valles-Ros et al. (2000) han reconocido una correlacin positiva entre el tamao del pez y la intensidad de infeccin de Contracaecum spp. y otros parsitos. Una de las causas de las infecciones en peces son los cambios de factores biticos o abiticos en el ambiente. Varias condiciones patolgicas como las alergias y reacciones anafilcticas ocurren en personas que se alimentan de peces que habitan en cuerpos de agua contaminados, en los que aumenta la
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concentracin de plancton cuyos organismos pueden actuar como hospederos intermediarios o paratnicos de helmintos, que a su vez, podra incrementar el nmero de infecciones en el siguiente nivel de la cadena trfica (Mattiucci y Nascetti, 2008; Al-Zubaidy, 2009). En el presente estudio se obtuvo una prevalencia parasitaria por Contracaecum multipapillatum (sensu lato) de 100% en M. cephalus obtenidas en los meses de octubre y noviembre, similar a lo encontrado por Gmez del Prado-Rosas et al. (2008) en M. cephalus parasitadas por Contracaecum sp. en tres localidades dentro de la Baha de La Paz (San Juan de la Costa, El Comitn y Punta Prieta) durante el verano de 1995 y Valles Vega et al. (2010) en M. curema de la Baha de La Paz, mientras que la prevalencia de larvas de C. multipapillatum en M. cephalus de Baja California obtenidas por Valles-Ros et al. (2000) fue de 30% y en otros estudios como el de Iannacone y Alvario (2009) en Per, llegan a ser tan bajas como 2.7 %. Esto sugiere que algn factor, probablemente la eutrofizacin, en la Baha de la Paz, conduce a la infeccin de un alto porcentaje de las lisas en el rea. Por muchos aos la Ensenada de La Paz recibi la descarga directa de aguas residuales de la ciudad y varios autores registraron altos niveles de contaminacin en las dcadas de 1970 y 1980 (Martnez Daz y Hernndez Rivas, 2010). En la actualidad, del total de aguas residuales tratadas en lagunas de estabilizacin, aproximadamente un 35% se utiliza en riego agrcola, el resto se vierte en la Ensenada de La Paz, por lo que grandes cantidades de materia orgnica y bacterias son descargadas en la ensenada (Camacho, 1996; Martnez Daz y Hernndez Rivas, 2010).
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Olivero et al. (2006) encontraron diferencias dramticas en las parasitosis por nemtodos en el pez de agua dulce Halopias malabaricus de Colombia, registrando mayores prevalencia e intensidad de parasitismo en los peces que habitan algunos cuerpos de agua que mostraron ms contaminacin. Por otro lado, Al Zubaidy (2009) menciona que, como la diversidad de peces disminuye en ambientes acuticos contaminados, el problema de las infecciones por helmintos en humanos, adquiridas por el consumo de pescado, se acrecienta, ya que solamente pocas especies estn disponibles (Sakanari y McKerrow, 1989). A pesar de que la mayor parte del ao, la Ensenada de La Paz posee las caractersticas adecuadas para uso recreativo y pesca, es importante considerar los efectos naturales como el aumento en la precipitacin pluvial y la insuficiencia de los sistemas de recoleccin de agua del alcantarillado en el Municipio de La Paz, que provocan un aumento en la contaminacin en algunas temporadas del ao como en la poca de huracanes (Martnez Daz y Hernndez Rivas, 2010). Por el contrario, en la Baha de La Paz no se tienen registros de contaminacin por aguas residuales, sin embargo, debido al sistema de circulacin de corrientes de la Ensenada de La Paz, las aguas residuales que se llegan a verter en sta, terminan finalmente en la baha. Adems de la actual tendencia al aumento en la infraestructura turstica proyectada en todo el margen de la ensenada y la parte sur de la Baha de La Paz, que incluye la instalacin de zonas habitacionales, tursticas y recreativas en reas naturales (Martnez Daz y Hernndez Rivas, 2010). Por lo tanto, seran de utilidad estudios que esclarezcan si existe una relacin entre los niveles de contaminacin biolgica en la Ensenada y la Baha
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de La Paz y la presencia de C. multipapillatum s. l. y otros helmintos parsitos en el ecosistema. Es posible que el ciclo de vida de los nemtodos aniskidos est relacionado con la demografa de sus hospederos en un rea particular, debido a que la culminacin de sus ciclos de vida tan complejos requiere estabilidad en la red trfica, ya que interviene en distintos niveles de sta. Varios estudios indican que existen efectos e interacciones significativas entre los niveles de parasitismo y la presencia y concentracion de contaminantes y otros factores de estres en el en el ambiente que pueden causar la disminucin de las poblaciones hospederos por perturbaciones en el ambiente como la sobrepesca, captura incidental, etc., que se manifiestan tambin en la disminucin de las poblaciones de aniskidos endoparsitos (Vidal - Martnez et al., 1994 y 2009; Coscia y Oreste, 1998; Mattiucci et al., 2008; Mattiucci y Nascetti, 2008; Al-Zubaidy, 2009; Martnez Daz y Hernndez Rivas, 2010). Al peligro potencial que representa la alta prevalencia de Contracaecum multipapillatum s.l. y otras posibles especies del gnero en distintos peces de la Baha de La Paz, se suma el hecho de que la temperatura del agua en que se desarrollan los parsitos puede influir en su capacidad de infectar mamferos y por lo tanto al humano (Vidal-Martnez et al., 1994). Ko, (1976, 1977) demostr que una mayor cantidad de infecciones de distintos mamferos con el nemtodo Echinocephalus sinensis obtenido de ostin, se presentaron con especmenes recolectados en ciertos meses con mayores temperaturas y con especmenes aclimatados a 28 y 33 C, temperaturas
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comunes en las localidades donde Contracaecum multipapillatum es abundante, mientras que pocas o ninguna infeccin se presentaron con los nemtodos aclimatados a 5, 15 y 20 - 24 C. Por este motivo tambin resultan de inters estudios que exploren las variaciones en la capacidad infectiva de los parsitos que pueden amenazar la salud pblica en la localidad en distintas temporadas del ao, ya que en la Baha de la Paz existen variaciones significativas en las temperaturas superficiales del agua, las ms altas se registran de julio a octubre (30 - 32 C) y las ms bajas de enero a marzo (20 - 22 C) (Vidal-Martnez et al., 1994; Lpez et al., 2001). Muchos parsitos pueden alterar el funcionamiento de los rganos vitales de los peces de diversas maneras: pueden afectar la actividad del corazn, en el intestino pueden inhibir la actividad digestiva y el metabolismo de vitaminas y azcar, por lo tanto, de manera indirecta afectan el crecimiento; en el hgado afectan el metabolismo del glucgeno, en gnadas y cavidad celmica provocan la reduccin del nmero de huevos o la castracin (Rhode, 1993). En el caso de las lisas capturadas en la Baha de La Paz, su aspecto externo no muestra signos de enfermedad, a pesar de la alta intensidad de la parasitosis en rganos viscerales por larvas del tercer estadio de C. multipapillatum s. l. El nico rgano que, en ocasiones, presenta lesiones evidentes a simple vista, al abrir la cavidad visceral de los peces, es el hgado, por lo que su valor y comercializacin no disminuye. Por esta razn, aumentan los riesgos de infeccin con este parsito o de presentar una reaccin alrgica hacia los antgenos del gusano o los presentes en la carne del pescado que estuvo en contacto con el parsito (Al-Zubaidy, 2009).
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Narciso et al. (2010) encontraron en M. cephalus a la venta dentro del rea metropolitana de Monterrey, Nuevo Len, Mxico, que los sitios con mayor nmero de larvas de Contracaecum sp. son el hgado, seguido por el msculo (filete), pero no encontr ningn nemtodo en el intestino, lo que hace suponer que al ser ms largo el periodo que pasa el pescado sin ser eviscerado al transportarse a zonas del pas lejanas a la costa, se promueve la migracin de las larvas alojadas en intestino y otros rganos hacia la musculatura, como sucede con varios aniskidos. De las 40 lisas recolectadas en el presente trabajo, solamente en dos se encontraron larvas parasitando el msculo, por ello, se recomienda eviscerar el pescado inmediatamente despus de su captura, con el fin de reducir la infeccin en msculo y no consumir pescado que lleve ms de un da sin haber sido eviscerado. Aun as, probablemente no existe una preparacin al momento de cocinar que elimine por completo el riesgo a la salud humana cuando se consume pescado que fue parasitado, en parte, porque ningn mtodo garantiza al consumidor, proteccin contra una posible reaccin alrgica causada por la ingestin de antgenos del parsito; en especial cuando algunos alrgenos de larvas en tercer estadio (Anisakis simplex) han mostrado resistencia a temperaturas elevadas en pruebas in vitro (Buenda E., 2000; Skirnisson, 2006).
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Estructura antignica e inmunogenicidad de Contracaecum multipapillatum s. l. El reconocimiento de antgenos de nemtodos aumenta nuestra capacidad de entendimiento de los mecanismos de defensa desencadenados por el hospedero durante la infeccin, ya que la respuesta inmune es la responsable de muchos de los cambios patolgicos que se presentan. Esto ha dado lugar al desarrollo de mtodos inmunodiagnsticos especficos, de medicamentos y vacunas (Perec y Okulewicz, 2006; MacDonald et al. 2002). En la literatura se menciona que la primera respuesta del sistema inmune hacia antgenos, respuesta primaria, ocurre despus de una primera inoculacin con presencia de inmunoglobulinas IgM principalmente y stas deben alcanzar su concentracin ptima entre los das 10 y 15 despus de la inoculacin. Despus de este periodo, una segunda inoculacin genera la respuesta secundaria en la que, pocos das despus, los linfocitos B producen las inmunoglobulinas IgG. En el presente trabajo, el suero de los conejos inmunizados con protenas somticas de las larvas L3 obtenido del sangrado del da 32, es decir, cuatro das despus de la segunda inmunizacin, fue el que present una mayor concentracin de IgG Anti - C. multipapillatum s. l., sin que existieran diferencias en cuanto a la cantidad y peso molecular de los antgenos que son capaces de reconocer, respecto a los sueros obtenidos el da 37. La metodologa empleada es similar a la registrada por Escalante et al. (2005) y Lpez-Arellano et al. (2005), que estudiaron la inmunogenicidad de los antgenos de nemtodos Ascaris suum (parsito de roedores y humanos) y Haemonchus contortus (parsito de rumiantes), utilizando conejos con un protocolo de inmunizacin con
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intervalos de 7 o 15 das, inoculando protenas somticas junto con adyuvante completo de Freund, los sueros hiperinmunes que utilizaron, se obtuvieron a partir de la respuesta secundaria del sistema inmune de los conejos. Despus de la reinmunizacin, la respuesta secundaria alcanza niveles mayores de anticuerpos IgG, que descienden lentamente en los siguientes dos o tres meses (Caldern-Tinoco, 1984; Tizard, 2002;). Sin embargo, la sensibilidad y exactitud de las pruebas inmunolgicas en modelos animales se ven afectadas cuando existen factores que modifiquen la respuesta inmune del sujeto (Perec y Okulewicz, 2006). De los seis conejos adquiridos que se sometieron al tratamiento de desparasitacin y los periodos de cuarentena y aclimatacin en el bioterio del CIBNOR, sobrevivieron cinco, de los cuales uno sufri una fractura expuesta en el quinto da despus de la primera inoculacin y falleci en el sptimo da sin que se determinara la causa especifica de la muerte. Se realiz una extraccin de sangre de este conejo para obtener suero, con el que se realiz la prueba de ELISA para conocer la concentracin de IgGs Ant - C. multipapillatum s.l. tras los siete das de inoculacin. Debido a que, probablemente, en este conejo se produjo un efecto inmunosupresor tras la fractura y prdida de sangre y falleci solo siete das despus de la primera inoculacin, las concentraciones de IgGs Ant - C.multipapillatum s. l. presentes en su suero no fueron identificadas por el mtodo de ELISA. El reconocimiento de antgenos de helmintos parsitos por parte del sistema inmune, puede verse afectado como consecuencia a que stos se han adaptado a suprimir, contrarrestar o evitar el sistema inmunitario de sus hospederos. A travs de la secrecin de hormonas y enzimas pueden evitar la
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produccin o favorecer la degradacin de inmunoglobulinas, adems, pueden evadir la accin proteoltica de las clulas defensivas con inhibidores de proteasas o antioxidantes (Tizard, 2002). Las larvas del nemtodo Toxocara canis, al ser expuestas in vitro a eosinfilos del hospedero, simplemente se desprenden de la cubierta larvaria junto con las clulas adheridas, evitando su ataque. Sin embargo, en la respuesta inmune de los hospederos naturales de algunos parsitos, se ha observado que a pesar de que no siempre reconocen los antgenos de las superficies corporales de los helmintos, si son capaces de reconocer los antgenos que no estn comnmente en contacto directo con ellos como los productos de secrecin o protenas del tracto digestivo (Tizard, 2002). Por ello, es importante conocer el total de los antgenos somticos de un parsito, capaces de generar una respuesta inmune en mamferos, para el desarrollo de mtodos de diagnstico, frmacos y/o vacunas eficientes. En el extracto crudo somtico total de larvas L3 de C. multipapillatum s. l. se identificaron 54 protenas de las cuales 14 fueron reconocidas por las IgG en el suero del conejo control con pesos moleculares entre los 23.81 y 78.96 kDa, mientras que el suero de los conejos inmunizados reconoci 33 protenas. Esto quiere decir que, los conejos inmunizados produjeron IgGs por la presencia de los antgenos C. multipapillatum s. l. para 19 antgenos. Es decir, produjo 19 IgGs anti - C. multipapillatum s. l. sin que esto quiera decir que son especficas para los antgenos de esta especie, ya que hace falta realizar pruebas que descarten posibles reacciones cruzadas con antgenos de otros nemtodos u otros helmintos.
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En contraste, Perec y Okulewicz (2006) obtuvieron 47 protenas somticas del nemtodo Syphacia obvelata, 11 de stas con pesos moleculares mayores a las protenas somticas de C. multipapilltum s. l. Debido a que uno de los factores que determina la inmunogenicidad de los antgenos es su complejidad y peso molecular, es de suponerse que las protenas somticas de S. obvelata tienen la capacidad de estimular en mayor medida la produccin de anticuerpos. Del total de protenas de S. obvelata 72 % (34) fueron reconocidas por IgGs de ratones de laboratorio de la cepa BALB/c, en contraste, las IgGs de los conejos inmunizados de este estudio slo reconocen un 61% (33). A pesar de que los resultados indican que C. multipapillatum s. l. posee menos protenas inmunognicas que S. obvelata, el hecho de que en el estudio de Perec y Okulewicz (2006) no presentan una comparacin entre la cantidad de antgenos reconocidos por IgGs de ratones infectados y los reconocidos por IgGs de ratones no infectados, no nos permite hacer una comparacin clara de cuntos de los antgenos de cada nemtodo son reconocidas por anticuerpos producidos especficamente por la exposicin al parsito (o su extracto crudo) y cules estn presentes de manera natural, sistema inmune de los sujetos de estudio. Coscia y Oreste (1998) observaron solamente 14 bandas antes de que sea estimulado el
correspondientes a las protenas de Contracaecum osculatum con pesos moleculares entre los 21 y 200 kDa. En pruebas de inmunoreconocimiento encontraron que el pez telesteo Chionodraco hamatus present
inmunoglobulinas que reconocen 21% (3) de estas protenas con pesos moleculares de 47, 63 y 91 kDa. Como se mencion anteriormente los
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hospederos naturales de algunos helmintos no son capaces de reconocer varios de sus antgenos, en consecuencia a la adaptacin de stos al medio que presenta el hospedero y su sistema inmune. Esto podra explicar el bajo porcentaje de protenas reconocidas por los peces, hospederos intermediarios naturales de las larvas de Contracaecum spp. comparado con el porcentaje de protenas reconocidas por el sistema inmune de los conejos del presente trabajo, que no son hospederos naturales de las especies de este gnero. Como parte del presente estudio se tena contemplado la realizacin de pruebas de inmunoreconocimiento de los antgenos de C. multipapillatum s. l. en el suero de sus hospederos intermediarios naturales, M. cephalus, sin embargo, debido a que el procesamiento de las muestras del suero de los peces no se realiz de manera adecuada, no fue posible utilizarlas. Estos anlisis nos pueden dar ms informacin y ser un punto de referencia acerca de qu protenas de las distintas especies del gnero Contracaecum presentan mayor inmunogenicidad. No obstante, para hacer una comparacin apropiada con estudios como el de Coscia y Oreste (1998), es necesaria la homogenizacin de protocolos que permitan una mayor eficacia para la obtencin de antgenos. A pesar de que analizaron protenas de un nemtodo del mismo gnero al estudiado en el presente trabajo, el nmero de protenas obtenidas en cada uno, es muy distinto. Los resultados obtenidos a partir de Contracaecum multipapillatum sensu lato son ms similares a los descritos por Perec y Okulewicz (2006) en Syphacia obvelata, miembro de una familia distinta.
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Futuro de la lnea de investigacin En prximos trabajos se buscar esclarecer si los nemtodos encontrados en M. cephalus corresponden a alguna de las especies ya descritas dentro del complejo de Contracaecum multipapillatum, o si se trata de una nueva especie, para ello ser necesario conocer las caractersticas morfolgicas de los adultos y qu aves actan como hospederos definitivos de esta especie. Esto proveer un mejor conocimiento de su ciclo de vida, que como ya se mencion, tambin puede ayudar a entender los niveles de infeccin de la especie en el rea. Adems, en los estudios que deriven de los resultados presentados en el presente trabajo ser necesario realizar experimentos en bsqueda de anticuerpos con mayor afinidad e inmunogenicidad, en modelos animales mamferos y sus hospederos peces y aves. Ser necesario llevar a cabo un estudio prospectivo para determinar si existen y con qu frecuencia se presentan las infecciones o reacciones alrgicas provocadas por las larvas de
C. multipapillatum s. l., en pacientes con alguno o varios de los sntomas relacionados con la anisakiasis despus de haber consumido pescado de la Baha de La Paz. Para ello tambin es recomendable analizar las posibles reacciones cruzadas de los antgenos aqu mostrados, con antgenos de otros parsitos presentes en los peces de consumo en la localidad, para determinar cules pueden ser utilizados en pruebas diagnsticas ms exactas.
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CONCLUSIONES
Las larvas L3 encontradas en Mugil cephalus de la Baha de La Paz se ubican taxonmicamente dentro del complejo de Contracaecum multipapillatum, que incluye a C. gibsoni, C. overstreeti, C. multipapillatum sp. C y C. multipapillatum sp. D. Pero es necesario determinar si corresponden a alguna de estas cuatro especies o se trata de una especie no descrita an.
Las lisas M. cephalus de la Baha de La Paz, parasitadas por larvas de C. multipapillatum s. l. presentan prevalencias e intensidades inusualmente altas, siendo mayor la infestacin de hgado e intestino y menos comn en la musculatura parietal de peces recin capturados.
La presencia de larvas de C. multipapillatum s. l. con altas prevalencia e intensidad en M. cephalus no afecta la comercializacin de este pez, por lo tanto, el peligro potencial de infeccin o de presentar una reaccin alrgica, est presente en las personas que lo consumen.
En las larvas L3 de C. multipapillatum s. l. es posible identificar 54 protenas con pesos moleculares entre 1.24 y 90.94 kDa por medio de electroforesis SDS en gel de poliacrilamida.
De las protenas de C. multipapillatum s. l., 61% (33) son capaces de inducir la produccin de IgGs en conejos. De estos 33 antgenos, 19 generan la produccin de IgGs anti - C. multipapillatum s. l.
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RECOMENDACIONES
Al estudiar los efectos de una determinada especie parsita en el ecosistema o en la salud pblica es de gran utilidad acceder al tema de manera interdisciplinaria. En primera instancia se debe identificar taxonmicamente de manera concluyente a la o las especies que son el objeto de estudio, para ello, el uso de herramientas de biologa molecular han probado ser de gran utilidad al estudiar helmintos. A su vez, para entender la dinmica de las poblaciones de parsitos dentro de sus hospederos y en el ecosistema, el estudio de las estrategias que desarrollan ambos organismos para coexistir, incluyendo la respuesta inmune del hospedero, podran ser de gran ayuda para explicar el porqu de temas como: la capacidad de los helmintos de invadir nuevos tejidos o nuevos hospederos; la habilidad del hospedero para evitar infestaciones masivas al estar expuesto constantemente a las fases infectivas de determinados helmintos; la proporcin de parsitos adultos y juveniles dentro de un mismo hospedero, as como la presencia o ausencia de diferentes especies de parsitos y otros aspectos de la ecologa y epidemiologa de los helmintos y sus hospederos, incluido el humano. Tambin se debe analizar la posibilidad de utilizar el estudio de la ecologa y variabilidad gentica de las poblaciones de C. multipapillatum s. l. y otros parsitos en el rea, como parmetros del estado de salud del ambiente, debido a la estrecha relacin que existe entre el ciclo de vida de algunos parsitos con organismos en diversos nichos de un ecosistema. Probablemente Contracaecum multipapillatum s. l. puede ser utilizado como indicador de la salud de las poblaciones de peces y dentro de la Baha de La Paz, ya que existen datos que
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indican que la alta prevalencia de infeccin, puede estar influenciada por la eutrofizacin en la Ensenada y Baha de La Paz, debida a las descargas de materia orgnica provenientes del drenaje de la ciudad o provocadas por eventos naturales como huracanes. Respecto a la amenaza que puede representar C. multipapillatum s. l. a la salud pblica de la regin, es recomendable, con el fin de disminuir la probabilidad de ingerir accidentalmente las larvas o que sus antgenos estn presentes en la carne del pescado, evitar el consumo de pescado que no ha sido eviscerado de manera oportuna despus de su captura. Pero se deber exhortar tambin a los comerciantes iniciales, los pescadores, y a los intermediarios, a adoptar medidas de prevencin, eviscerando el pescado que comercializan, lo ms pronto que les sea posible. Por otra parte se debe promover en los grandes establecimientos y empresas con mayores recursos econmicos, la implementacin de medidas como congelar a una temperatura de -20C durante ms de 24 horas todo el pescado que debe comercializarse crudo, actualmente obligatorio en la Comunidad Econmica Europea. Se recomienda alertar a las autoridades sanitarias de las circunstancias en las que se encuentran las lisas de venta en el rea, y el posible peligro al que se exponen sus consumidores, para que tomen medidas precautorias y participen en las investigaciones que determinen la magnitud del riesgo que representa la especie objeto de este trabajo y otras especies del mismo gnero posiblemente presentes en los organismos de los que se obtienen productos de consumo humano.
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TRABAJOS FUTUROS
Actualmente se trabaja en la secuenciacin del ITS-1, ITS-2 (rADN) y el COx2 (mtADN) de las larvas de Contracaecum provenientes de Mugil cephalus y Mugil curema encontrndose hasta el momento, que estos nemtodos presentes en ambas, pertenecen al complejo de Contracaecum multipapillatum. Se busca determinar si se tratan de una nueva especie dentro de este complejo o si pertenecen a una de las cuatro especies ya descritas. Tambin est en proceso el anlisis de las mismas secuencias en adultos obtenidos de Pelecannus occidentalis. Es posible estudiar si la capacidad infectiva de C. multipapillatum s. l. en mamferos y por lo tanto en el hombre, est influenciada por la temperatura en la que se desarrollan sus larvas, como sucede en el nemtodo Echinocephalus sinensis, que presenta mayor capacidad infectiva cuando se desarrolla en temperaturas de 28 y 33 C. Es necesario realizar un estudio que demuestre si existen infecciones por C. multipapillatum s. l. o reacciones alrgicas a sus antgenos, en la gente que consume pescado de la localidad. Tambin es necesario realizar pruebas de reaccin cruzada entre los antgenos de C. multipapillatum s. l. y los encontrados en otros nemtodos y helmintos parsitos de peces, ya que existen estudios que han demostrado que la presencia de nemtodos parsitos, puede provocar, en el hospedero, la produccin de anticuerpos, que reconocen antgenos de otros parsitos. Debido a que algunos de los hospederos naturales de parsitos, reconocen una menor cantidad de antgenos que los que son capaces de
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reconocer hospederos accidentales o experimentales, es posible determinar la produccin de anticuerpos contra el parsito en sus hospederos intermediarios naturales peces, realizando pruebas de inmunoreconocimiento, para entender mejor los procesos de infeccin de la especie y la respuesta de sus hospederos. Adems de pruebas que demuestren si C. multipapillatum s. l. presenta antgenos resistentes a temperaturas altas, como se ha demostrado en otras especies de aniskidos (Anisakis simplex).
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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

REA INTERDICIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MARINA

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA ANTIGNICA DE LA LARVA L3 DE Contracaecum multipapillatum (sensu lato)

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TTULO DE

MARCO ANTONIO SALAZAR BERMDEZ

M en C. MARA DEL CARMEN GMEZ DEL PRADO ROSAS

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, MARZO 2011

Mara Ins y Leonardo

Estudio de la estructura antignica de Contracaecum multipapillatum s. l.

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Figura 1. Mugil cephalus Lisa cabezona de la Baha de La Paz, B. C. S., Mxico.

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Figura 2. Ciclo de vida probable de Contracaecum multipapillatum (sensu lato).

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Ramos, 1994) y mamferos (Caballero y Peregrina, 1938; Vidal-Martnez et al., 1994)

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Figura 4. rea de Estudio. Baha de La Paz, B. C. S., Mxico.

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. No. de Hospederos infectados

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Peso molecular (kDa)

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Identificacin taxonmica molecular

Recolecta de Material Biolgico

Inoculacin Inyeccin intramuscular

Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE

ELISA Clculo de Pesos moleculares

Antgenos reconocidos por IgGs de conejo

Perfil Proteico (Antgenos)

Figura 5. Diagrama de flujo de los principales pasos de la metodologa realizada.

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Prevalencia 100% 100% 95% 80% 17.5% 5%

Intensidad 13 5.8 4.5 3.2 1.7 1.5

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