ENZIMOINMUNOENSAYO PARA LA CUANTIFICACIN DE IgG

1.- INTRODUCCIN El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un mtodo empleado habitualmente para la deteccin y/o cuantificacin de sustancias, generalmente protenas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El mtodo combina la especificidad de unin de los anticuerpos con la amplificacin de "seal" que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la prctica clnica es la tcnica inmunolgica ms empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antgenos microbianos y para la determinacin cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algn antgeno en particular. En esta prctica se determinar la cantidad de IgG total en varias muestras problema. La cantidad de IgG que contienen estas muestras es similar a la que podramos esperar en LCR, lquido sinovial o en el sobrenadante de un cultivo de linfocitos, es decir, muy inferior a la del suero. La determinacin se llevar a cabo mediante un enzimoinmunoensayo en fase slida de tipo "sandwich". Para ello se inmovilizan anticuerpos de cabra anti IgG humana (anticuerpo de captura) a un soporte slido y se aade la muestra problema, dejando que la IgG presente sea "capturada" especficamente por los anticuerpos inmovilizados. Despus de lavar se aadirn anticuerpos de oveja anti IgG humana conjugados a la enzima peroxidasa (anticuerpo de deteccin). Despus de incubar y lavar, se aadir el sustrato de la enzima. Al formarse el producto, un cromgeno que se aade junto al sustrato y que est acoplado a la reaccin, dar lugar a una sustancia coloreada, que puede ser medida con ayuda de un espectrofotmetro. La cantidad de sustancia coloreada formada estar en relacin directa con la cantidad de IgG presente en la muestra problema. Para conocer su concentracin exacta se comparar la absorbancia del problema con la absorbancia de blancos y patrones de referencia que contienen concentraciones de IgG conocidas y que se han procesado en paralelo. 2.- OBJETIVOS Al finalizar la prctica el alumno debe ser capaz de: Disear un ELISA cualitativo y cuantitativo para cualquier protena Inmovilizar protenas (Ag/Ac) a un soporte plstico Llevar a cabo todas las fases de un enzimoinmunoensayo Determinar el tramo de la curva obtenida en el que se pueden estimar concentraciones

3.- EQUIPAMIENTO -

Mdulos MaxiSorp (Nunc) de 16 pocillos de fondo plano y marcos. Tubos de ensayo para preparar diluciones y gradillas Micropipetas y puntas de 5-200 (amarillas) y 200-1000 l (azules) Matraces Erlenmeyer Parafilm Papel secante Agitador horizontal Bomba de vaco Espectrofotmetro Titertek Multiskan

4.-REACTIVOS
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PBS pH 7.2 Para 1L: NaCl H2KPO4 HNa2PO4 KCl 8.00g 0.20g 1.15g 0.20g

Ajustar a pH 7.2

Tampn bicarbonato 0.05M, pH 9.6 Para 1L: HNaCO3 Na2CO3 2.93g 1.59g Ajustar a pH 9.6.

Tampn citrato pH 5.5 Para 1L: Citrato trisdico dihidrato 29.4 g Ajustar a pH 5.5 con cido ctrico 1M.

BSA (fraccin V de albmina bovina, Sigma, St. Luis, MO) Antisuero de cabra (purificado por cromatografa de afinidad) frente a IgG humana (Beckman, Sa Jose, CA). Concentracin: 0.1 mg/ml Suero humano de concentracin de IgG conocida. Preparar previamente las siguientes diluciones: 104 ng/ml, 2*103 ng/ml, 4*102 ng/ml, 80 ng/ml y 16 ng/ml, usando como diluyente PBS- 1% BSA. Antisuero anti IgG humana obtenido en oveja, purificado por cromatografa de afinidad y conjugados con peroxidasa (perxido de hidrgeno oxidorreductasa, EC 1.11.1.7) (Serotec, Oxford, Gran Bretaa) OPD (1,2 fenilendiamina, Merck, Darmstadt, Alemania) H2O2 3% (Foret, Barcelona) H2SO4 1N (Panreac, Barcelona) Muestras problema proporcionadas por el profesor

5.- PROCEDEMIENTO (por parejas) 5.1- [Primer da] Inmovilizacin de anticuerpos de captura al soporte slido. 1) Ajustar una tira de 16 pocillos MaxiSorp a un marco. 2) Preparar 1.7 ml de una dilucin de Ac de cabra anti IgG humana a 1g/ml en tampn bicarbonato. 3) Pipetear 100 l/pocillo. 4) Incubar a 4C de 12 a 48h 5.2- [Segundo da] Lavado (eliminacin del exceso). 1) Aspirar el contenido de los pocillos con bomba de vaco. 2) Pipetear 300l de PBS/pocillo. 3) Repetir la aspiracin, el pipeteo de PBS y de nuevo la aspiracin. 4) Invertir los pocillos y golpear varias veces sobre secante para no dejar gotas.

5.3- Patrones de referencia, muestras problema y blancos. 1) Pipetear, por duplicado, 100 l/pocillo de cada uno de los patrones de referencia (ver figura siguiente). 2) Pipetear de igual manera las muestras problema y el blanco (PBS- 1% BSA). A B C D E F G H 1 10 ng/ml 2*103 ng/ml 4*102 ng/ml 80 ng/ml 16 ng/ml Problema 1 Problema 2 Blanco
4

2 = = = = = = = =

3) Incubar 20 minutos a temperatura ambiente en agitacin. 4) Eliminar el exceso lavando como en el paso 5.2. 5.4- Anticuerpo de deteccin. 1) Una pareja preparar, para todo el grupo, 20 ml de Ac de oveja anti IgG humana conjugado con peroxidasa a dilucin 1/20 000 (v/v) en PBS-1% BSA. 2) Pipetear 100l en todos los pocillos. 3) Incubar 20 minutos a temperatura ambiente con agitacin. 4) Lavar como en el paso 5.2. 5.6- Sustrato y cromgeno. 1) Preparar (una pareja para todo el grupo) 20 ml de la mezcla: OPD 0.5 mg/ml, H2O2 0.05% (v/v) disuelto todo en tampn citrato. 2) Pipetear 100l en todos los pocillos. 3) Incubar 5-15 minutos en oscuridad hasta que se observe color. 4) Detener la reaccin con 50 l/pocillo de H2SO4 1N aadindolo en el mismo orden en que se pipete la mezcla sustrato-cromgeno. 5.7-Lectura y representacin grfica. 1) Determinar la absorbancia a 492 nm en un lector de placas, restando a cada pocillo la lectura de los blancos. 2) Trazar la grfica patrn, log Concentracin de IgG vs ABS492. 3) En el tramo recto interpolar los valores de ABS492 de las muestras problema. Muestra Problema 1 Problema 2 Concentracin Media del obtenida grupo Concentracin terica

1E 5 IgG (ng/ml) 1E 4 1E 3 1E 2 1E 1 1E 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 A S (492 n ) B m 1 1.2