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Índice

1.6.1.in vitroensayo paralelo de permeabilidad de membrana artificial……………….78

1.7.Conclusiones……………………………………………………………………81

2. Inhibidores de LRRK2 como agentes proneurógenos…………………………………………83

2.1.Introducción……………………………………………………………………83

2.2.Objetivos……………………………………………………………………...84

2.3.Modulación de señalización Wnt……………………………………………………..85

2.3.1. Antecedentes del ensayo empleado…………………………………….85

2.3.2. Resultados y discusión…………………………………………….....86

2.4.Ensayo de proliferación de neuroesferas……………………………………………….....91

2.4.1. Antecedentes del ensayo empleado……………………………….....91

2.4.2. Resultados y discusión…………………………………………….....92

2.5.Ensayo de diferenciación de neuroesferas………………………………………………..96

2.5.1. Antecedentes del ensayo empleado……………………………….....96

2.5.2. Resultados y discusión…………...…………………………………..96

2.6.Conclusiones……………………………………………………………………..100

3. Inhibidores de LRRK2 como agentes antifosfo-tau……………………………………...103

3.1.Introducción…………………………………………………………………..103

3.2.Objetivos…………………………………………………………………….104

3.3.Ensayo de neuroprotección tau……………………………………………………105

3.3.1. Validación del ensayo………………………………………………...105

3.3.2. Ensayo de neuroprotección de tau para inhibidores de triazolopirimidina

y benzotiazol LRRK2………………………………………………...…108

3.4.Ensayo de neuronas derivadas de A152T transfectadas con Ngn2……………………………….110

Índice

3.4.1. Antecedentes del ensayo empleado………………………………...110

3.4.2. Resultados y discusión……………………………………………...112

3.5.Ensayo de diferenciación de 6 semanas A152T…………………………………………...117

3.5.1. Antecedentes del ensayo empleado………………………………...117

3.5.2. Resultados y discusión……………………………………………...118

3.6.En vivoModelos de tauopatías………………………………………………...120

3.6.1. GMR-MAPT. V337MDrosophila melanogastermodelo…………..120

3.6.2. Modelo de roedor de tauopatía………………………………………………124

3.7.Conclusiones……………………………………………………………………..130

4. LRRK2 como diana terapéutica para la retinosis pigmentaria…………………………...131

4.1.Introducción…………………………………………………………………..131

4.1.1. Elrd10modelo de ratón………………………………………………..131

4.2.Fondo…………………………………………………………………...136

4.3.Objetivos…………………………………………………………………….141

4.4.Análisis de la expresión de LRRK2 en retina………………………………141

4.5.Determinación del efecto neuroprotector de la indolinona.23en la capa de

fotorreceptores enrd10ratones…………………………………………….142

4.6.Determinación del efecto antiinflamatorio de la indolinona.23sobre la

microglía activada……………………………………………………………….…………..144

4.7.Conclusiones……………………………………………………………………..146

CONCLUSIONES…………………………………………………………………………147

DIFUSIÓN DE RESULTADOS………………………………………………………….151

SECCION EXPERIMENTAL………………………………………………………….155
 Índice

1. Estudios computacionales………………………………………………………………..157

1.1.Modelos de homología………………………………………………………………157

1.2.Estudios de atraque………………………………………………………………158

1.3.Minimizaciones de la mecánica cuántica………………………………………….158

2. química………………………………………………………………………………...159

2.1.Síntesis de derivados de indolinona…………………………………………..160

2.2.Síntesis de derivados de benzotiazol………………………………………….164

3. Biología……………………………………………………………………………………175

3.1.in vitroexperimentos...…………………………………………………………...175

3.1.1. Actividad enzimatica …………………………………………………175

3.1.2. Penetración del SNC:in vitroensayo de permeabilidad de membrana

artificial paralela…………………………..………………………….…………..…175

3.1.3. Experimentos con células progenitoras neuronales (NPC) ………………………176

3.1.4. Cultivos de neuroesfera…………………………..……………………...177

3.1.5. Cultivos SH-SY5Y…………………………..……………………...181

3.1.6. Ensayo de neuronas derivadas de A152T transfectadas con Ngn2……………………..181

3.1.7. Ensayo de neuronas derivadas de A152T diferenciadas de 6 semanas………………..183

3.2.En vivoexperimentos…………………………………………...………………184

3.2.1. GMR-MAPT. V337MDrosophila melanogastermodelo…………..184

3.2.2.Rd10modelo de ratón…………………………..…………………………..185

REFERENCIAS…………………………………………………………………………..187
LISTA DE ABREVIATURAS
 Lista de abreviaturas

- AcOEt: acetato de etilo

- EA: enfermedad de Alzheimer

- ADME: absorción-distribución-metabolismo-excreción

- ADMET: absorción-distribución-metabolismo-excreción-toxicología

- AGD: enfermedad agirófila del grano

- ELA: esclerosis lateral amiotrófica

- ANK: anquirina
- BRAZO: armadillo
- BBB: barrera hematoencefálica

- BSA: albúmina sérica bovina

- CBD: degeneración cortico basal
- CDK5: quinasa 5 similar a ciclina dependiente

- 13C-RMN:13Resonancia magnética nuclear C

- SNC: sistema nervioso central

- COR: carboxi-terminal de un ras de complejo

- CTE: encefalopatía traumática crónica

- DAPI: 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6-carboxamidina
- DFT: teoría funcional de la densidad.

- DMAP: 4-(dimetilamino)piridina
- DMEM: Dulbecco ś modificado Eagle ś medio
- ADN: ácido desoxirribonucleico

- DVL1: despeinado 1
- Dcx: doble cortina
- EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
- EDCI: N-(3-dimetilaminopropil)-N -́etilcarbodiimida
- EGF: factor de crecimiento epidérmico

- EtOH: etanol
- ESI: ionización por electrospray

- ETA: demencia británica familiar

- FBS: suero fetal bovino

- FCG: genética química avanzada
- FDD: demencia familiar danesa
- FGF: factor de crecimiento de fibroblastos

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Lista de abreviaturas

- FG: genética avanzada

- DFT: demencia frontotemporal
- DLFT: degeneración del lóbulo frontotemporal

- FTDP-17: demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17

- CCG: capa de células ganglionares

- PIB: difosfato de guanosina

- GFAP: proteína ácida fibrilar glial
- GGT: tauopatía glial globular
- GM: glía de Müller
- GSK-3β: glucógeno sintasa quinasa 3β
- GTP: trifosfato de guanosina
- HEK: riñón embrionario humano
- Hex: hexano
- 1RMN H:1Resonancia magnética nuclear H

- HTS: cribado de alto rendimiento

- HOBT: hidroxibenzotriazol
- HPLC: cromatografía líquida de alto rendimiento
- HRMS: espectrometría de masas de alta resolución

- IBA-1: molécula adaptadora de unión al calcio ionizada 1

- INL: capa nuclear interna

- IPL: capa plexiforme interna

- iPSC: células madre pluripotentes inducidas

- JAK2: Janus quinasa 2

- LRP6: proteína 6 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad

- LRR: repeticiones ricas en leucina

- LRRK2: quinasa 2 de repetición rica en leucina

- MAPT: tau asociada a microtúbulos

- MTT: bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
- MS: espectrometría de masas

- NFT: ovillos neurofibrilares

- Ngn2: neurogenina 2

- NOR: reconocimiento de objetos novedosos

- NPC: células progenitoras neurales

4
 Lista de abreviaturas

- NSC: células madre neurales

- OA: ácido okadaico

- ONL: capa nuclear exterior

- OPL: capa plexiforme exterior

- PBS: solución salina tampón fosfato

- EP: enfermedad de Parkinson ś

- PDE6: fosfodiestereasa 6
- PFA: paraformaldehído
- PTM: modificaciones postraduccionales

- PP2A: proteína fosfatasa 2A

- PSP: parálisis supranuclear progresiva

- PyBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio

- q-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

- RCG: genética química inversa

- RD: distrofias de retina
- CGR: células ganglionares de la retina.

- RMSD: desviación cuadrática media

- ARN: ácido ribonucleico
- ROC: ras de complejo
- ROCK: quinasa que contiene bobinas enrolladas asociadas a rho

- ROS: especies reactivas de oxígeno

- RP: retinosis pigmentaria

- EPR: epitelio pigmentario retiniano

- ta: temperatura ambiente

- rt-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

- SAR: relaciones estructura-actividad

- DE: desviación estándar
- SDS: dodecilsulfato sódico
- SEM: error estándar de la media
- SGV: zona subgranular
- SOD1: superóxido dismutasa 1
- SVZ: zona subventricular
- TCF/LEF: factor de células T/factor potenciador linfoide

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Lista de abreviaturas

- THF: tetrahidrofurano
- TIE2: receptor 2 de tirosina proteína quinasa

- TLC: cromatografía en capa fina

- TNFα: factor de necrosis tumoral-α

- WB: transferencia Western

- PESO: tipo salvaje