PRACTICA 5

ELECTROFORESIS

INTRODUCCION

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica

controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su
importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K.
Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asignó a la separación de
materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino
se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha
convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso
molecular. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en
un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee
carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).

La electroforesis de DNA y proteínas tiene muchas aplicaciones entre ellas, el comparar

patrones de bandas de diferentes muestras biológicas, comparar muestras de individuo sano
frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de la biodiversidad o
de agentes infecciosos, así como también sirve para los trabajos de hibridaciones,
amplificaciones, secuenciaciones, clonaciones y mejoramiento genético.

OBJETIVO

Determinar analítica y gráficamente el tamaño de algunos fragmentos de DNA separados

con electroforesis de agarosa

METODOLOGIA

Para determinar el tamaño de fragmentos en el gel de agarosa, una regla es colocada en la

fotografía del gel a lo largo de marcador de peso molecular o ladder (fig. 1), o con más
precisión, se trabaja con programas que analizan y procesan imágenes. La distancia del
fondo del gel hasta cada banda revelada fue medida y registrada (tabla 1). Las distancias
obtenidas de cada banda son ploteadas en un papel semilogarítmico y se construye una
línea de tendencia que une la mayoría de los puntos posibles (fig. 2).
Fig. 1. Medida de la distancia de migración de cada banda del ladder de 100 bp

Tabla 2. Distancias de migración de los fragmentos del ladder de 100 bp

Fig. 2. Ploteo de la distancia de cada banda del ladder de 100 bp en un papel semilog.
Cuál es el tamaño del inserto mostrado en el carril 4 del gel de la fig. 1. Determinar el
tamaño del fragmento:

a) Usando un papel semilogarítmico

b) Por regresión lineal usando Microsoft Excel

También, cual es el tamaño del inserto mostrado en los carriles 5, 6 y 7 del gel de la fig. 1.
Se debe trabajar con medidas aproximadas.
RESULTADOS

Se realizo una gráfica de dispersión para realizar el método analítico de regresión lineal con
los datos proporcionados en la tabla 2.

Distancia (cm) Pares de bases

2.3 1500
2.35 1400
2.45 1300
2.55 1200
2.7 1100
2.85 1000
3 900
3.2 800
3.5 700
3.9 600
4.15 500
4.55 400
5.1 300
5.85 200
7 100

6
f(x) = − 0.00310029730675061 x + 6.2249817398103
5
Distancia (cm)

0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Tamaño(pb)
Ecuación del grafico: y=−0.00029(x)+6.0424

Lo adaptaremos a la siguiente ecuación:

y−6.0424
x=
−0.0029

A partir se reemplazará la distancia en y, dando los siguientes resultados:

Distancia (cm) Pares de bases Tamaño de fragmento

aproximado

2.3 1500 1284

2.35 1400 1267
2.45 1300 1232
2.55 1200 1198
2.7 1100 1146
2.85 1000 1094
3 900 1043
3.2 800 974
3.5 700 870
3.9 600 732
4.15 500 646
4.55 400 508
5.1 300 319
5.85 200 60
7 100 -337

* Calcularemos el tamaño del inserto mostrado en los carriles 4, 5, 6 y 7 del gel de la fig. 1.

Distancia (cm) Pares de bases Tamaño de fragmento

aproximado (pb)
646
4.15 500

508
4.55 400

5.4 260 215

6.5 150 -164

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es un marcador o ladder? ¿Por qué éste es considerado un estándar en el

laboratorio?

Un marcador o ladder se refiere básicamente a un marcador de peso molecular, el cual es

utilizado en técnicas como la electroforesis en gel; este marcador es una mezcla de
fragmentos de ADN de tamaños ya conocidos que se utiliza como una alusión para
determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en una muestra experimental. Este se
considera estándar en el laboratorio por varias razones: facilita la estimación del tamaño de
fragmentos en muestras, calibra geles para asignar tamaños específicos, permite la
comparación entre geles y experimentos, y verifica la integridad del gel, asegurando
resultados reproducibles y confiables.

2. ¿Por qué cada grupo de laboratorio necesita correr su propia ladder?

En ingeniería genética y biología molecular, cada grupo de laboratorio corre su propia

ladder o marcador de peso molecular por varias razones. Esto incluye la calibración del
equipo, asegurando que el equipo de electroforesis y sistemas de visualización esté ajustado
a las condiciones específicas del laboratorio; además, se utiliza para el control de calidad
interno al evaluar la integridad del gel y del sistema, garantizando resultados confiables al
correrse con las muestras. La ladder también se emplea para verificar la consistencia en
condiciones experimentales, adaptarse a protocolos específicos y reducir errores
sistemáticos al tener control sobre el marcador, minimizando la variabilidad en los
resultados y evitando depender de marcadores externos.

3. ¿Cómo el tamaño del fragmento de ADN afecta su movimiento o la migración a través

del gel de agarosa durante la electroforesis?

El tamaño del fragmento de ADN afecta su velocidad de migración a través del gel de
agarosa durante la electroforesis. En general, los fragmentos más pequeños se desplazan
más rápidamente que los fragmentos más grandes debido a su menor resistencia en el gel.
Esto se debe a la relación entre la carga negativa del ADN y su tamaño: los fragmentos más
largos tienen más carga y migran más lentamente, mientras que los fragmentos más cortos
se desplazan más rápido a través de los poros del gel. Además, la concentración de agarosa
en el gel y la distancia que los fragmentos deben recorrer también influyen en la velocidad
de migración.

4. Nombre tres compuestos que se encuentran en el tampón de carga de muestra. ¿Cuál es

el propósito de cada uno de estos compuestos?
Los tres compuestos que se encuentran en el tampón de carga de muestra y consideramos
más importantes son los siguientes:

1. Bromuro de xilidio (Bromophenol Blue):

Este compuesto se añade al tampón de carga de muestra como indicador de seguimiento

durante la electroforesis. Cambia de color en función del pH, lo que permite monitorear el
progreso de las muestras a medida que migran a través del gel.

2. Glicerol o Ficoll:

Estos compuestos de alta densidad se incluyen para proporcionar peso y viscosidad a la

muestra, permitiendo que esta permanezca en el pocillo de carga y facilitando su carga en el
gel durante la electroforesis.

3. Buffer de carga (TBE o TAE):

Se agrega un tampón de carga para proporcionar condiciones iónicas adecuadas para la

migración de los ácidos nucleicos a través del gel. Además, ayuda a mantener el pH
constante durante la electroforesis, lo que contribuye a resultados precisos y reproducibles.

5. ¿Por qué se añade tampón 1X TAE a la caja de electroforesis?

El tampón 1X TAE se añade a la caja de electroforesis por las siguiente razones :

principalmente porque el tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA) proporciona condiciones
iónicas estables durante la electroforesis, asegurando una migración consistente de ácidos
nucleicos a través del gel de agarosa. Además, contribuye al mantenimiento de un pH
constante, lo que favorece resultados precisos y reproducibles al minimizar variaciones en
las condiciones ambientales. Asimismo, el tampón TAE facilita la disipación de calor
generado durante la electroforesis, previniendo el sobrecalentamiento del sistema y
preservando la resolución de bandas e integridad de las muestras de ácidos nucleicos.

6. ¿Cómo puede saber que una enzima de digestión de restricción ha cortado

correctamente una secuencia de DNA teniendo un gel de agarosa?

Para verificar si una enzima de restricción ha cortado correctamente una secuencia de ADN
en un gel de agarosa, se sigue el siguiente mecanismo:

 Preparación en gel:

Se realiza la preparación de un gel de agarosa y se carga con las muestras de ADN,

incluyendo una muestra sin digerir (control) y las muestras digeridas con la enzima de
restricción.
  Electroforesis:

Se aplica un campo eléctrico al gel para que las moléculas de ADN se movilicen a través de
la matriz de agarosa, seleccionándolas según su tamaño y carga.

 Visualización de bandas:

Después de la electroforesis, se tiñe el gel con un agente de tinción específico, como

bromuro de etidio, para visualizar las bandas de ADN.

 Interpretación de resultados:

Si la enzima de restricción ha cortado correctamente la secuencia de ADN, se observarán

bandas más pequeñas en comparación con la muestra sin digerir. Por otra parte, la presencia
de bandas más pequeñas indica que la enzima ha reconocido y cortado la secuencia de
ADN en los sitios específicos de restricción.

 Comparación con marcador de peso molecular:

Se puede cargar un marcador de peso molecular conocido en el gel para estimar el tamaño
de las bandas en las muestras y confirmar la eficacia de la digestión.

7. ¿Habrá alguna influencia de separar secuencias de DNA ricas G+C en un gel de agarosa
en comparación a otras secuencias en cantidades variables de G, ¿C, T, A?

Sí existe influencia al separar secuencias de ADN ricas en G+C en un gel de agarosa en

comparación con otras secuencias que tienen cantidades variables de G, C, T y A. Las
secuencias ricas en G+C tienden a migrar más lentamente debido a su mayor estabilidad
estructural, mientras que las secuencias con menor contenido de G+C pueden migrar más
rápidamente. Además, las secuencias ricas en G+C pueden tener una mayor resolución y
separación en el gel debido a su estructura más compacta. Es importante considerar estas
variaciones al interpretar los resultados de la electroforesis en gel de agarosa.

8. ¿Cuál es la diferencia de usar bromuro de etidio y gel red en el teñido del gel de
agarosa?

La principal diferencia entre el uso de bromuro de etidio y gel rojo (GelRed) en el teñido
del gel de agarosa radica en la naturaleza de los colorantes y las características que las
componen:

 Bromuro de Etidio:
- Características: Es un intercalante de ADN clásico que emite fluorescencia cuando
se une al ADN.
- Seguridad: Tiene preocupaciones de seguridad debido a su potencial carcinogénico
y mutagénico.
- Visualización: Requiere la exposición del gel a la luz ultravioleta para visualizar las
bandas de ADN.
 Gel Red (GelRed):
- Características: Es un colorante alternativo que también se une al ADN y emite
fluorescencia.
- Seguridad: Se considera más seguro que el bromuro de etidio y es menos tóxico.
- Visualización: Permite la visualización directa de las bandas de ADN bajo luz
visible sin necesidad de luz ultravioleta.