Introducción A Citometria de Flujo

Machine Translated by Google
Introducción a
Citometría de flujo:
Una guía de aprendizaje
111103203 rev. Un
diciembre de 2002
Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje
Derechos de autor
© 2002 Becton, Dickinson and Company. Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser
reproducida, transmitida, transcrita, almacenada en sistemas de recuperación o traducida a ningún idioma o lenguaje
informático, de ninguna forma o por ningún medio: electrónico, mecánico, magnético, óptico, químico, manual o de otro tipo. sin
el permiso previo por escrito de BD Biosciences, 2350 Qume Drive, San Jose, CA 95131, Estados Unidos de América.
Descargo de responsabilidad
BD Biosciences se reserva el derecho de modificar sus productos y servicios en cualquier momento para incorporar
los últimos avances tecnológicos. Esta guía está sujeta a cambios sin previo aviso. BD Biosciences agradece los comentarios
de los clientes sobre correcciones y sugerencias para mejorar.
Aunque esta guía se ha preparado con todas las precauciones para garantizar la precisión, BD Biosciences no asume
ninguna responsabilidad por errores u omisiones, ni por daños que resulten de la aplicación o el uso de esta información.
Marcas registradas
Apple, el logotipo de Apple, Mac, Macintosh y Power Macintosh son marcas comerciales de Apple Computer, Inc., registradas
en EE. UU. y otros países. Finder es una marca registrada de Apple Computer, Inc.
Modfit LT y QuantiCALC son marcas comerciales de Verity Software House, Inc.
BD Attractors, BD CellQuest, BD FACS, BD FACSCalibur, BD FACSDiVa, BD FACScan, BD FACSort, BD FACSVantage,

BD FACSVantage SE, BD MultiSET son marcas comerciales de Becton, Dickinson and Company.
Tabla de contenido
Prefacio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . en
Para más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . en
Capítulo 1 Descripción general . . ......... ......... ........ ......... ......... .. 1
Preguntas de revisión: descripción general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3

Capítulo 2 Fluidez. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Preguntas de repaso: fluidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Capítulo 3 Generación de dispersión y fluorescencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.1 Dispersión de luz. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Preguntas de repaso: Dispersión de luz . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3.2 Fluorescencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Preguntas de repaso: Fluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Capítulo 4 Sistema óptico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.1 Banco óptico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Preguntas de repaso: Banco óptico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.2 Filtros ópticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Preguntas de repaso: Filtros ópticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21 4.3 Detección de señal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22 Preguntas de repaso: detección de señales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24 4.4 Umbral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Preguntas de repaso: Umbral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Capítulo 5 Análisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

5.1 Recopilación y visualización de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Preguntas de repaso: recopilación y visualización de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28 5.2 Activación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Preguntas de repaso: Interrupción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Análisis de datos para aplicaciones de creación de subconjuntos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 . 30
5.4 Análisis de datos para otras aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Preguntas de repaso: Análisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje iii

Capítulo 6 Clasificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
6.1 Clasificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Preguntas de repaso: clasificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Capítulo 7 Láseres y alineación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
7.1 Cómo funcionan los láseres. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
7.2 Alineación láser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Preguntas de repaso: Láseres y alineación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Clave de respuesta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 . 47
Preguntas de repaso: descripción general en la página 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47 Preguntas de repaso: fluidos en la página 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Preguntas de repaso: Dispersión de luz en la página 12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48 Preguntas de repaso: Fluorescencia en la página 15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49 Preguntas de repaso: Banco óptico en la página 19 . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Preguntas de repaso: Filtros ópticos en la página 21 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Preguntas de repaso: Detección de señales en la página 24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50 Preguntas de repaso: Umbral en la página 25 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Preguntas de repaso: recopilación y visualización de datos en la página 28 . . . . . . . . . . . .
50 Preguntas de repaso: Interrupción en la página 29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50 Preguntas de repaso: Análisis de datos en la página 36 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51 Preguntas de repaso: Clasificación en la página 41 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51 Preguntas de repaso: Láseres y alineación en la página 45 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
IV Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Prefacio
Aprender a operar un citómetro de flujo se logra mejor usando el instrumento.

Sin embargo, comprender los principios que subyacen a esta tecnología facilita enormemente el proceso.
Este documento contiene información básica sobre la citometría de flujo. Las diferencias entre los
citómetros de sobremesa basados en celdas de flujo (citómetros BD FACScan™, BD
FACSort™, BD FACSCalibur™ y BD LSR) y los citómetros de flujo en aire (citómetros BD
FACS Vantage™ y BD FACSVantage™ SE) se describen en las secciones correspondientes. . La
lectura de este material y la respuesta a las preguntas al final de cada sección mejorarán su experiencia
de capacitación práctica durante la Capacitación de operadores en BD Biosciences.
Esta tarea tomará aproximadamente 2.5 horas en completarse. Revíselo antes de asistir a la sesión
de capacitación. Se proporciona una clave de respuesta.
Si tiene alguna pregunta o problema en los EE. UU., llame al 1.877.232.8995, indicaciones 2, 2.
En Europa o Canadá, comuníquese con su especialista local en aplicaciones.
Para más información

Para obtener más información sobre la citometría de flujo general, revise lo siguiente: •
Givan AL. Citometría de flujo: primeros principios. Nueva York, NY: WileyLiss; 2001
(ISBN 0471382248).
• Melamed MR. Citometría de flujo y clasificación. Nueva York, NY: WileyLiss; 1990
(ISBN 0471562351).
• Shapiro H. Citometría de flujo práctica. 3ra ed. Nueva York, Nueva York: Alan R. Liss; 1995 (ISBN
0471303763).
en
nosotros
1
Descripción general
La citometría de flujo es una tecnología que mide simultáneamente y luego analiza múltiples
características físicas de partículas individuales, generalmente células, a medida que fluyen en una corriente
de fluido a través de un haz de luz. Las propiedades medidas incluyen el tamaño relativo de una partícula,
la granularidad relativa o complejidad interna y la intensidad de fluorescencia relativa.
Estas características se determinan utilizando un sistema de acoplamiento óptico a electrónico que registra
cómo la célula o partícula dispersa la luz láser incidente y emite fluorescencia.
Un citómetro de flujo se compone de tres sistemas principales: fluídica, óptica y electrónica.
• El sistema fluídico transporta partículas en una corriente al rayo láser para su interrogación.
• El sistema óptico consta de láseres para iluminar las partículas en el flujo de muestra y filtros ópticos para
dirigir las señales de luz resultantes a los detectores apropiados.
• El sistema electrónico convierte las señales de luz detectadas en señales electrónicas que pueden ser
procesadas por la computadora. Para algunos instrumentos equipados con una función de
clasificación, el sistema electrónico también es capaz de iniciar decisiones de clasificación para cargar y
desviar partículas.
En el citómetro de flujo, las partículas se transportan hasta la intercepción del láser en una corriente de fluido.
Cualquier partícula o célula suspendida de 0,2 a 150 micrómetros de tamaño es adecuada para el análisis.
Las células de tejido sólido deben separarse antes del análisis. La parte de la corriente de fluido donde se
ubican las partículas se denomina núcleo de muestra. Cuando las partículas pasan a través de la
intercepción del láser, dispersan la luz del láser. Cualquier molécula fluorescente presente
1
en la partícula fluorescente. La luz dispersada y fluorescente es recolectada por lentes

colocados apropiadamente. Una combinación de divisores de haz y filtros dirige la luz dispersa y
fluorescente a los detectores apropiados. Los detectores producen señales electrónicas
proporcionales a las señales ópticas que los golpean.
Los datos del modo de lista se recopilan en cada partícula o evento. Las características o
parámetros de cada evento se basan en sus propiedades fluorescentes y de dispersión de luz.
Los datos son recogidos y almacenados en el ordenador. Estos datos se pueden analizar para
proporcionar información sobre las subpoblaciones dentro de la muestra (Figura 11).
núcleo de muestra
láser
pantallas de datos
pulsos electronicos
Figura 11 Señales de luz dispersas y emitidas convertidas en pulsos electrónicos
2
Capítulo: Resumen
Preguntas de revisión: descripción general
1 ¿ Qué propiedades de una célula o partícula se pueden medir con un citómetro de flujo?
2 ¿Qué fuente de luz se utiliza en la mayoría de los citómetros de flujo?
3 ¿Cuáles son los tres sistemas principales en un citómetro de flujo?
4 ¿Qué tipo de muestra biológica es la más adecuada para el análisis de citometría de flujo?
5 ¿ Cuál es el nombre que se le da a la porción de la corriente de fluido donde se encuentran las células?
¿situado?
6 Cuando las células marcadas con moléculas fluorescentes pasan a través del láser enfocado
rayo, ¿qué dos tipos de señales luminosas se generan?
7 La luz emitida por una partícula es recolectada por

_____________________________
8 La señal electrónica producida por los detectores es proporcional a:
9 Todas las mediciones de citometría de flujo se pueden realizar simultáneamente en una sola celda.
TF
10 Las partículas deben estar en suspensión unicelular antes del análisis de citometría de flujo.
TF
3
4
fluídica
El propósito del sistema fluídico es transportar partículas en una corriente de fluido al rayo láser
para su interrogación. Para una iluminación óptima, la corriente que transporta las
partículas debe colocarse en el centro del rayo láser. Además, solo una célula o partícula debe
moverse a través del rayo láser en un momento dado.
Para lograr esto, la muestra se inyecta en una corriente de fluido envolvente dentro de la cámara
de flujo. La cámara de flujo en un citómetro de sobremesa se llama celda de flujo y la cámara de
flujo en un citómetro de flujo en aire se llama punta de boquilla. El diseño de la cámara de flujo
hace que el núcleo de la muestra se centre en el centro del fluido envolvente, donde el rayo láser
interactuará con las partículas.
Basado en los principios relacionados con el flujo laminar, el núcleo de la muestra permanece
separado pero coaxial dentro del fluido envolvente. El flujo del fluido envolvente acelera las
partículas y las restringe al centro del núcleo de la muestra. Este proceso se
conoce como enfoque hidrodinámico. Para ver una ilustración del enfoque hidrodinámico en cada
tipo de celda de flujo, consulte la Figura 21 y la Figura 22.
5
presión de alta presión

muestra rayo laser de rayo laser
baja (12 µL/min) muestra (60 µL/min)
fluido de fluido de fluido de fluido de

vaina vaina vaina vaina
muestra muestra
Figura 21 Enfoque hidrodinámico del núcleo de la muestra a través de una celda de flujo
muestra
vaina vaina vaina vaina
láser láser
presión diferencial baja alta presión diferencial
Figura 22 Enfoque hidrodinámico del núcleo de la muestra a través de la punta de una boquilla
La presión de la muestra y la presión del fluido envolvente son diferentes entre sí. La presión de la
muestra siempre es mayor que la presión del fluido envolvente. El regulador de presión de la muestra
controla el caudal de la muestra cambiando la presión de la muestra en relación con la presión de la
funda.
• En los citómetros de sobremesa BD, el flujo de muestra se presuriza hacia arriba a través de una
región ópticamente transparente de la cubeta o celda de flujo; las partículas pasan a través del
rayo láser mientras todavía están dentro de esta celda de flujo (Figura 21). La mayoría
de los citómetros de sobremesa tienen ajustes de presión de muestra fijos (LO, MED y HI). El
6
Capítulo: Fluidos
El citómetro BD LSR de sobremesa también tiene una perilla de ajuste "fino" para configuraciones
intermedias.
• En los citómetros de flujo en aire, el flujo de muestra pasa a través de un pequeño orificio en la punta de una
boquilla antes de ser interceptado por el haz de luz al aire libre (Figura 22).
Los ajustes de presión de muestra se pueden ajustar dentro de un rango dinámico.
El aumento de la presión de la muestra aumenta el caudal al aumentar el ancho del núcleo de la muestra. Esto,
a su vez, permite que más células ingresen a la secuencia en un momento dado. Con un núcleo de
muestra más ancho, algunas células podrían atravesar el rayo láser fuera del centro e interceptar el rayo
láser en un ángulo menos óptimo. Sin embargo, esto podría ser apropiado para su aplicación.
• Por lo general, se utiliza un caudal más alto para mediciones cualitativas, como
inmunofenotipado. Los datos están menos resueltos, ya que las celdas están menos alineadas en el flujo
principal más amplio, pero se adquieren más rápidamente. • Un caudal
más bajo reduce el ancho del núcleo de la muestra y restringe la posición de las celdas a un área más pequeña.
La mayoría de las células pasa por el centro del rayo láser; por lo tanto, la luz que ilumina las celdas y
emitida por las celdas es más uniforme. Por lo general, se usa una tasa más baja en aplicaciones donde
una mayor resolución es crítica, como el análisis de ADN.
El funcionamiento adecuado de los componentes fluídicos es fundamental para que las partículas intercepten
correctamente el rayo láser. Por lo tanto, el operador siempre debe asegurarse de que el sistema de fluídica
esté libre de burbujas de aire y desechos y esté presurizado adecuadamente en todo momento.
7
Preguntas de repaso: fluidos
1 El propósito del sistema fluídico en un citómetro de flujo es:
2 ¿ Qué dos factores pueden afectar la iluminación de las partículas dentro del rayo láser?
3 ¿ Cuántas células o partículas deben atravesar el rayo láser en un momento dado?

_______________________
4 La suspensión de partículas se inyecta en _________________ dentro de

_________________.
5 El proceso de centrar el núcleo de la muestra dentro del fluido envolvente se conoce como:
6 ¿Qué regulador controla el diámetro del núcleo de la muestra?
7 ¿Cuáles son los tres ajustes de presión posibles para un citómetro de flujo de sobremesa?
8 Aumento de la presión de la muestra ______________ el caudal de la muestra y el del

________________ núcleo de la muestra.
9 Se requiere una buena resolución de datos para los estudios de ADN. ¿Qué
caudal se recomienda?
10 Un núcleo de muestra más ancho reduce la resolución.
TF
11 Se puede utilizar un caudal alto al realizar mediciones cualitativas.
TF
8
Generación de Dispersión y
Fluorescencia
En la última sección, aprendimos cómo se alinean las partículas o las células para pasar
una sola fila a través del núcleo de la muestra. Antes de describir cómo el citómetro de
flujo detecta y procesa las señales, es útil comprender qué le sucede a la luz láser cuando golpea
las partículas de una sola fila.
9
3.1 Dispersión de luz
La dispersión de luz ocurre cuando una partícula desvía la luz láser incidente. La medida en que
esto ocurre depende de las propiedades físicas de una partícula, a saber, su tamaño y complejidad
interna. Los factores que afectan la dispersión de la luz son la membrana celular, el núcleo y
cualquier material granular dentro de la célula. La forma de la celda y la topografía de la superficie
también contribuyen a la dispersión total de la luz.
La luz dispersada hacia adelante (FSC) es proporcional al área o tamaño de la superficie celular.
FSC es una medida de la mayoría de la luz difractada y se detecta justo fuera del eje del rayo láser
incidente en la dirección de avance por un fotodiodo (Figura 31). FSC proporciona un método
adecuado para detectar partículas mayores que un tamaño determinado independientemente de su
fluorescencia y, por lo tanto, a menudo se usa en inmunofenotipado para desencadenar el
procesamiento de señales.
La luz dispersada lateralmente (SSC) es proporcional a la granularidad celular o la complejidad interna.

SSC es una medida de la mayoría de la luz refractada y reflejada que ocurre en cualquier interfaz
dentro de la celda donde hay un cambio en el índice de refracción (Figura 31). La SSC se recoge a
aproximadamente 90 grados del rayo láser mediante una lente de recolección y luego se redirige
mediante un divisor de rayo al detector apropiado.
detector de dispersión lateral
detector de dispersión frontal

fuente de luz
Figura 31 Propiedades de dispersión de luz de una celda
10
Capítulo: Generación de dispersión y fluorescencia
Las mediciones correlacionadas de FSC y SSC pueden permitir la diferenciación de tipos de células
en una población celular heterogénea. Las principales subpoblaciones de leucocitos se pueden
diferenciar utilizando FSC y SSC (Figura 32).
neutrófilos
sangre entera lisada
monocitos
linfocitos
Figura 32 Subpoblaciones de células basadas en FSC vs SSC
11
Preguntas de repaso: Dispersión de luz
1 ¿Cuándo ocurre la dispersión de la luz?
2 ¿Qué componentes celulares clave contribuyen a la dispersión de la luz?
3 La luz dispersada en la misma dirección que el rayo láser se llama:
4 FSC es proporcional a:
___________________________________________
5 La dispersión de luz recogida a 90 grados del rayo láser se denomina:
6 SSC es proporcional a la ___________ o _____________ de la celda
7 Mediciones correlacionadas de ambos _______________ y _____________ poder
permitir la diferenciación de tipos de células en una población celular heterogénea.
12
3.2 Fluorescencia
Un compuesto fluorescente absorbe energía luminosa en un rango de longitudes de onda que
es característico de ese compuesto. Esta absorción de luz hace que un electrón en el compuesto
fluorescente se eleve a un nivel de energía más alto. El electrón excitado decae rápidamente a
su estado fundamental, emitiendo el exceso de energía como un fotón de luz. Esta transición de
energía se llama fluorescencia.
El rango en el que se puede excitar un compuesto fluorescente se denomina espectro de absorción.

Como se consume más energía en las transiciones de absorción que la que se emite en las
transiciones fluorescentes, las longitudes de onda emitidas serán más largas que las absorbidas. El
rango de longitudes de onda emitidas por un compuesto en particular se denomina espectro
de emisión.
El láser de iones de argón se usa comúnmente en citometría de flujo porque la luz de 488 nm que
emite excita más de un fluorocromo. (Consulte el Capítulo 7 para obtener más información
sobre los láseres). Uno de estos fluorocromos es el isotiocianato de fluoresceína (FITC). En el
espectro de absorción de FITC (Figura 33 en la página 14), la línea de 488 nm está cerca del
máximo de absorción de FITC. La excitación con esta longitud de onda dará como resultado una alta
emisión de FITC. Si el fluorocromo fuera excitado por otra longitud de onda dentro de su
espectro de absorción, se produciría una emisión de luz del mismo espectro pero no de la
misma intensidad.
Se puede usar más de un fluorocromo simultáneamente si cada uno se excita a 488 nm y si las
longitudes de onda máximas de emisión no son extremadamente cercanas entre sí. La
combinación de FITC y ficoeritrina (PE) satisface estos criterios. El espectro de emisión de cada
uno de estos fluorocromos se muestra en la Figura 34 en la página 14. Aunque el máximo de
absorción de PE no es de 488 nm, el fluorocromo se excita lo suficiente a esta longitud de onda para
proporcionar una emisión de fluorescencia adecuada para la detección. Más importante aún, la
longitud de onda de emisión máxima es de 520 nm para FITC y de 575 nm para PE.
Estas longitudes de onda de emisión máxima están lo suficientemente separadas como para
que cada señal pueda ser detectada por un detector separado. La cantidad de señal
fluorescente detectada es proporcional al número de moléculas de fluorocromo en la partícula.
13
FITC = isotiocianato de fluoresceína

PE = ficoeritrina
PerCP = proteína clorofila peridinina
APC = aloficocianina
Figura 33 Espectros de absorción de cuatro fluorocromos comunes
Figura 34 Espectros de emisión de los fluorocromos que se muestran en la Figura 33
Cuando un tinte fluorescente se conjuga con un anticuerpo monoclonal, se puede usar para
identificar un tipo de célula en particular según los marcadores antigénicos individuales de la célula
(Figura 35 en la página 15). En una población mixta de células, se pueden usar diferentes fluorocromos
para distinguir subpoblaciones separadas. El patrón de tinción de cada subpoblación,
combinado con los datos de FSC y SSC, se puede utilizar para identificar qué células están presentes
en una muestra y contar sus porcentajes relativos. Las celdas también se pueden ordenar si es
necesario.
14
marcado con fluorocromo marcador

anticuerpos de superficie antigénico
Figura 35 Unión específica de anticuerpos marcados con fluorocromos a antígenos de superficie celular
Preguntas de repaso: fluorescencia
1 Cuando los compuestos fluorescentes absorben la energía de la luz y luego liberan el exceso de energía,
emiten ____________________.
2 Rangos de longitud de onda característicos en los que se pueden excitar los compuestos fluorescentes
son llamados _________________________________________.
3 Las longitudes de onda más largas de la luz emitida por un fluorocromo constituyen su
_______________________.
4 ¿Qué láser se usa más comúnmente en citometría de flujo? _________________
5 Los fluorocromos FITC y PE son excitados por esta longitud de onda de emisión de un láser
de iones de argón:_________________
6 Dos colorantes fluorescentes comúnmente utilizados en citometría de flujo son ___________ y
____________.
7 Los anticuerpos marcados con fluorocromo se utilizan para detectar
______________________.
15
dieciséis
Sistema óptico
El sistema óptico consiste en una óptica de excitación y una óptica de recolección. La óptica de
excitación consiste en el láser y lentes que se utilizan para dar forma y enfocar el rayo láser.
La óptica de colecciones consta de una lente de colección para recoger la luz emitida por la
interacción partícularayo láser y un sistema de espejos y filtros ópticos para enrutar longitudes
de onda específicas de la luz recogida a detectores ópticos designados. El diseño del banco
óptico permite que estas funciones ocurran.
4.1 Banco óptico

El banco óptico en un citómetro de flujo proporciona una superficie estable que sostiene la
fuente de luz y la óptica de excitación y recolección en posiciones fijas. La alineación de un
analizador de sobremesa es muy estable porque la celda de flujo está fija en su alineación con el
rayo láser. Esto asegura que el láser intercepte el flujo de muestra de manera consistente día a
día. El banco óptico para dos citómetros de sobremesa se muestra en la Figura 41 y la Figura
42 en la página 18.
En un citómetro de flujo en aire, el rayo láser se enfoca a través de una lente acromática para
interceptar el flujo de fluido en un ángulo y una posición óptimos después de que el flujo sale
de la boquilla. Debido a las variaciones en el enfoque y en la posición de la corriente, la
alineación de un citómetro de corriente en el aire es menos estable que la de un analizador de
sobremesa y debe optimizarse a diario. La desalineación del rayo láser con la corriente puede
dar como resultado una iluminación desigual de las partículas y una mayor variabilidad en las
señales emitidas. Esto da como resultado una disminución de la precisión. El banco óptico
para un citómetro de flujo en aire se muestra en la Figura 43 en la página 19.
17
Figura 41 Diagrama de banco óptico del citómetro de flujo de sobremesa BD FACSCalibur™
575/25
530/28
SSC
555 LP 488/25
FL1
FL5
FL6
510 LP
380 LP
620 SP 660/13
470 LP
670 LP
510/20 670 LP
FL4
láser de
FL3
488nm lente de colección
de fluorescencia
láser de
633 nm 488 pasa/
633 refleja
láser de
FSC
325 nm celda de flujo
paso ultravioleta/
488 y 633 reflejan lente de enfoque
Figura 42 Diagrama de banco óptico del citómetro de flujo de sobremesa BD LSR
18
Capítulo: Sistema óptico
detector
opción 5 FL3 PMT
(láser #1) (láser n.º 1)
FL1 PMT
(láser n.º 1)
espejo
dicroico
filtrar filtrar
espejo detector
dicroico
opción 1
filtrar espejo
dicroico lente de relé espejo
dicroico
lente filtrar interceptar #2
filtrar Divisor
iris FL4, 5, 6 (opción)
de 3 haces
lente
FL2 PMT iris de
filtrar
(láser n.º 1) la lente detector
espejo opción 2 fotodiodo FSC
dicroico iris
lente
filtrar filtro (488/10)
lente
detector divisor de haz
filtrar detector iris
opción 3 espejo de 45˚
opción 4 barra de oscurecimiento FSC
lente
interceptar #3
FL4, 5, 6 (opción)
lente
filtrar iris
SSC PMT Lente objetivo FL lente
punto de
(láser n.º 1)
láser #3 barra de oscurecimiento FL intercepción
prisma 8
láser #2
lente
acromática
prisma 6
láser #1
prisma 4 cámara de video de
visualización de flujo
prisma 7
prisma 2
prisma 5
prisma 1
prisma 3
Figura 43 Diagrama de banco óptico del citómetro de flujo de flujo en aire BD
FACSVantage SE™
Preguntas de repaso: banco óptico
1 El banco óptico proporciona una superficie estable para la interacción de la luz láser
con el ___________________________.
2 ¿ Qué dos componentes del citómetro de flujo deben estar perfectamente alineados para
iluminar las células de manera uniforme? _____________________________________
3 La alineación de un citómetro de flujo en aire requiere una optimización diaria.
TF
4 En el caso de los citómetros de flujo de sobremesa,_________________ asegura que el

el láser fijo intercepta el _________________ de forma constante todos los días.
19
4.2 Filtros ópticos
Una vez que una célula o partícula pasa a través de la luz láser, las señales SSC y de fluorescencia
emitidas se desvían a los tubos fotomultiplicadores (PMT) y un fotodiodo recoge las señales FSC. Todas
las señales se enrutan a sus detectores a través de un sistema de espejos y filtros ópticos. Los PMT
detectan señales de fluorescencia, que a menudo son débiles. La especificidad de un detector para un
tinte fluorescente en particular se optimiza colocando un filtro frente al PMT, que permite que solo un
rango estrecho de longitudes de onda llegue al detector. Esta banda espectral de luz está cerca del pico
de emisión del tinte fluorescente. Dichos filtros se denominan filtros de paso de banda (BP). Por
ejemplo, el filtro que se usa frente al detector FITC tiene la etiqueta 530/30. Este número da las
características de la banda espectral transmitida: 530 ±15 nm, o longitudes de onda de luz que están
entre 515 nm y 545 nm.
Otros filtros utilizados en el citómetro de flujo son los filtros de paso corto (SP), que transmiten
longitudes de onda de luz iguales o más cortas que una longitud de onda específica, y los filtros de
paso largo (LP), que transmiten longitudes de onda de luz iguales o más largas que una
longitud de onda específica (Figura 44 en la página 21).
Los divisores de haz son dispositivos que dirigen la luz de diferentes longitudes de onda en
diferentes direcciones. Los espejos dicroicos son un tipo de divisor de haz. El espejo dicroico 560 SP
que se muestra en la Figura 41 transmite longitudes de onda de luz de 560 nm o más cortas. Las
longitudes de onda de luz de más de 560 nm se reflejan a 45 grados.
20
Pase largo Pase corto paso de banda
480 520
480 500 520 480 500 520 460 500 540
LP500 SP500 500/50
transmitancia
% transmitancia
% transmitancia
%
400 500 600 400 500 600 450 500 550
longitud de onda (nm) longitud de onda (nm) longitud de onda (nm)
Figura 44 Transmisión de luz a través de filtros de paso largo, paso corto y paso de banda
Preguntas de repaso: filtros ópticos
1 Los filtros ópticos se colocan frente a los detectores para
2 Un filtro de paso de banda 530/30 transmite longitudes de onda de luz entre _________
y ________ Nuevo Méjico.
3A _________________ se utiliza para dividir las señales de luz por longitud de onda y redirigir
las señales luminosas al detector apropiado.
4 _______________ filtros transmiten longitudes de onda iguales o más cortas que un

longitud de onda especificada, mientras ________________ los filtros transmiten longitudes de onda
que es igual o mayor que una longitud de onda especificada.
21
4.3 Detección de señal

Las señales de luz se generan a medida que las partículas pasan a través del rayo láser en una corriente de fluido.
Estas señales de luz se convierten en señales electrónicas (voltajes) mediante fotodetectores y luego se les asigna
un número de canal en un gráfico de datos. Hay dos tipos de fotodetectores en los citómetros de flujo BD: fotodiodos
y tubos fotomultiplicadores (PMT). El fotodiodo es menos sensible a las señales de luz que los PMT y,
por lo tanto, se usa para detectar la señal FSC más fuerte. Los PMT se utilizan para detectar las señales más
débiles generadas por SSC y fluorescencia.
Se crea un pulso de voltaje cuando una partícula ingresa al rayo láser y comienza a dispersar la luz o emitir
fluorescencia. Una vez que las señales de luz, o fotones, golpean un lado del PMT o del fotodiodo, se convierten
en un número proporcional de electrones que se multiplican, creando una corriente eléctrica mayor. La corriente
eléctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje. El punto más alto del pulso ocurre cuando la
partícula está en el centro del haz y se logra la cantidad máxima de dispersión o fluorescencia. A medida que la
partícula abandona el haz, el pulso vuelve a la línea de base (Figura 45).
Voltaje
Láser
Tiempo
Voltaje
Láser
Tiempo
Láser Voltaje
Tiempo
Figura 45 Creación de un pulso de tensión
El tamaño del pulso de voltaje depende de la cantidad de fotones detectados, el voltaje PMT o la ganancia del
preamplificador y la ganancia del amplificador. Las señales se pueden amplificar aplicando un voltaje a los
PMT, creando así una mayor corriente eléctrica, o aumentando la ganancia de amplificación. Los ajustes
del amplificador pueden ser lineales o logarítmicos (Lin
22
o Registro). La amplificación logarítmica se usa a menudo para separar las señales negativas de las positivas
tenues, mientras que la amplificación Lin se usa a menudo para amplificar los parámetros de dispersión y fluorescentes.
El convertidor de analógico a digital (ADC) convierte un pulso de 0 a 10 V en un número digital.

En los sistemas analógicos, como los citómetros BD FACSCalibur, BD LSR y BD FACSVantage SE, al pulso de
voltaje se le asigna un valor digital que representa de 0 a 1000 canales.
El número de canal se transfiere a la computadora a través del cable de entrada/salida de propósito general
(GPIO) (Figura 46). Luego, la señal luminosa se muestra en una posición adecuada en el gráfico de datos.
Figura 46 Pulsos de voltaje convertidos a valores de canal por convertidor ADC
En los sistemas digitales, como el citómetro BD FACSVantage SE equipado con la opción BD FACSVDiVa™,
los ADC digitalizan el voltaje correspondiente a cada señal en uno de los 16 384 niveles posibles 10 millones de
veces por segundo. Las señales se digitalizan continuamente durante el funcionamiento normal, ya sea
que haya un pulso presente o no, y todas las señales digitalizadas se representan como números en la
memoria. Consulte la Figura 47 en la página 24 (la cantidad de líneas solo tiene fines ilustrativos; 16 384
niveles y 1 muestra cada 0,1 µseg). Las señales se transfieren del citómetro a la computadora a través de
cables Ethernet. Los amplificadores de registro no se utilizan en sistemas digitales. En cambio, el logaritmo de
cada punto de datos digitalizado se calcula y se muestra a través del software. Al igual que con los sistemas
analógicos, la señal de luz se muestra en una posición adecuada en el gráfico de datos.
23
digitalización muestreo
Figura 47 Generación y procesamiento de señales
Independientemente de si el sistema es digital o analógico, cuando se utilizan múltiples láseres, los datos
derivados del láser anterior se retrasan para coincidir con los datos del último láser por evento. Esto
garantiza que los datos de un solo evento se procesen juntos.
Preguntas de repaso: detección de señales
1 La luz dispersada hacia adelante es detectada por un _____________________.
2 La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia son detectadas por sensores altamente sensibles
_____________________________________________________________
24
3 Los detectores de luz generan corriente, que viaja a un amplificador. Convierte

la corriente en voltajes que son proporcionales a la intensidad de la luz que los
golpea.
TF
4 ¿Qué hace el ADC?
4.4 Umbral
Se puede utilizar un umbral electrónico para limitar el número de eventos adquiridos por
el citómetro de flujo. Se establece un umbral en un parámetro. Cuando se define un
valor de umbral, solo las señales con una intensidad mayor o igual que el valor del canal de
umbral se procesarán y enviarán a la computadora. Por ejemplo, cuando se ejecutan
muestras de inmunofenotipado, el umbral se puede establecer en FSC para eliminar
eventos como desechos que son más pequeños que el número de canal del umbral. Se
pueden usar otros parámetros para establecer el umbral según la aplicación.
Un segundo parámetro de umbral está disponible en algunos analizadores de sobremesa

equipados con la opción de segundo láser. Si se eligen dos parámetros de umbral, la
partícula debe cumplir los valores de ambos umbrales para ser procesada como un evento.
Preguntas de repaso: Umbral
Se puede usar 1 umbral FSC para eliminar las señales generadas por:
2 Si se eligen dos parámetros de umbral, el evento debe cumplir los valores de uno
u otro parámetro para ser procesado.
TF
25
26
Análisis de los datos
5.1 Recopilación y visualización de datos
Una vez que las señales de luz se han convertido en pulsos electrónicos y luego convertidos en
números de canal por el ADC, los datos deben ser almacenados por el sistema informático.
Los datos de citometría de flujo se almacenan según un formato estándar, el formato estándar
de citometría de flujo (FCS), desarrollado por la Society for Analytical Cytology.* De acuerdo con el
estándar FCS, un archivo de almacenamiento de datos incluye una descripción de la muestra
adquirida, el instrumento en cual se recopilaron los datos, el conjunto de datos y los resultados del
análisis de datos.
Una sola célula analizada para cuatro parámetros (FSC, SSC, FITC y PE fluorescencia) genera
8 bytes de datos. Cuando se multiplica por los aproximadamente 10 000 eventos recopilados
para una sola muestra, un archivo de datos FCS normalmente contiene 80 kB de datos.
Una vez que se ha guardado un archivo de datos, las poblaciones de células se pueden mostrar
en varios formatos diferentes. Un solo parámetro como FSC o FITC (FL1) se puede mostrar como
un histograma de un solo parámetro, donde el eje horizontal representa el valor de la señal del
parámetro en números de canal y el eje vertical representa la cantidad de eventos por número de
canal (Figura 51) . Cada evento se coloca en el canal que corresponde a su señal
*
Estándar de archivo de datos para citometría de flujo. Comité de Estándares de Archivos de Datos de la Sociedad de Citología
Citometría. Analítica. 1990;11(3):323332.
27
valor. Las señales con intensidades idénticas se acumulan en el mismo canal. Las señales más
brillantes se muestran en los canales a la derecha de las señales más tenues.
Se pueden mostrar dos parámetros simultáneamente en un gráfico. Un parámetro se muestra en el eje x y el

otro parámetro se muestra en el eje y. En el software BD CellQuest™ y BD Attractors, también se pueden
ver datos tridimensionales donde los ejes x e y representan parámetros y el eje z muestra la cantidad de
eventos por canal (Figura 51).
Histograma trama 2D gráfico en 3D gráfico en 3D

Software BD CellQuest Software BD Atractores
Figura 51 Representaciones gráficas de datos de citometría de flujo
Preguntas de repaso: recopilación y visualización de datos
1 ¿ Qué representa el eje horizontal en un histograma?
2 Se puede usar un gráfico de puntos para mostrar los parámetros __________.
3 ¿Qué representa el eje z en un gráfico 3D en el software BD CellQuest?
28
Capítulo: Análisis de datos
5.2 Activación
Un subconjunto de datos se puede definir a través de una puerta. Una puerta es un límite
numérico o gráfico que se puede utilizar para definir las características de las partículas para
incluirlas en un análisis posterior. Por ejemplo, en una muestra de sangre que contiene una
población mixta de células, es posible que desee restringir su análisis solo a los linfocitos. Según el
FSC o el tamaño de la célula, se puede establecer una puerta en el gráfico de FSC frente a SSC para
permitir el análisis solo de células del tamaño de los linfocitos. La pantalla resultante reflejaría las
propiedades de fluorescencia solo de los linfocitos (Figura 52).
datos no controlados
datos cerrados
Figura 52 Uso de gating para restringir el análisis a una población
Preguntas de revisión: puertas
1 Se puede usar una puerta para restringir el análisis a una población específica dentro del
muestra.
TF
29
5.3 Análisis de datos para aplicaciones de creación de subconjuntos
El análisis de datos consiste en mostrar los datos de un archivo en modo lista en una gráfica y
luego medir la distribución de los eventos dentro de las gráficas. Como se mencionó anteriormente, se
pueden usar varios tipos de diagramas para presentar los datos. Los datos también se pueden subdividir
seleccionando poblaciones específicas.
Por ejemplo, en el diagrama de puntos que se muestra en la Figura 53, se dibuja una puerta
alrededor de la población de interés, que en este caso son los linfocitos. Una puerta o una región es un
límite trazado alrededor de una subpoblación para aislar eventos para su análisis o clasificación.
Figura 53 Diagrama de puntos con una puerta que abarca la población de linfocitos
Los datos de los eventos dentro de esta puerta se pueden mostrar en gráficos posteriores. En los
ejemplos que siguen, verá diferentes formas de analizar los datos de fluorescencia de los eventos en
esta puerta para determinar los porcentajes de varias subpoblaciones (subconjuntos) presentes.
Puede hacer un gráfico de histograma de un solo parámetro con marcadores de histograma, un

gráfico de puntos de dos parámetros con un marcador de cuadrante, un gráfico de puntos de dos
parámetros con regiones y gráficos tridimensionales. También puede crear estadísticas y exportar los
resultados asociados con estos gráficos a una hoja de cálculo.
30
Un histograma le permite ver un solo parámetro contra el número de eventos. Se utiliza un

control de subclase para determinar dónde se colocarán los marcadores. Los marcadores de
histograma se utilizan para especificar un rango de eventos para un solo parámetro (Figura 54).
En el primer histograma, el marcador M1 se coloca alrededor del pico negativo del control de la subclase.
El marcador M2 se coloca a la derecha de M1 para designar eventos positivos. El segundo
histograma muestra eventos de una muestra de CD3 FITC.
Figura 54 Histogramas de control de subclase (NORM001) y CD3 FITC

(NORM002) con marcadores de histograma M1 y M2
La Figura 55 muestra 619 eventos en M1 y 2272 en M2. Para averiguar los porcentajes
estadísticos de los negativos y los positivos, compare el recuento de eventos con los eventos
controlados. Hay 6000 eventos en el archivo de datos, pero se encontraron 2891 eventos
dentro de la puerta de linfocitos. Queremos el porcentaje de linfocitos que son CD3 positivos,
por lo que buscaríamos el % Gated para M2: 2272/2891 = 78,59 %.
Figura 55 Estadísticas de histograma
31
Un gráfico de puntos proporciona una visualización de datos de dos parámetros. Cada punto representa
uno o más eventos. El primer diagrama de puntos en la Figura 56 es el control de isotipo o subclase.
Se utiliza un control de subclase para determinar dónde se colocarán los marcadores de cuadrante.
Un marcador de cuadrante divide gráficos de dos parámetros en cuatro secciones para distinguir
poblaciones que se consideran negativas, positivas simples o positivas dobles. El cuadrante inferior
izquierdo muestra eventos que son negativos para ambos parámetros. El cuadrante superior
izquierdo contiene eventos que son positivos para el parámetro del eje y (CD19 PE) pero negativos
para el parámetro del eje x (CD3 FITC). El cuadrante inferior derecho contiene eventos que son
positivos para el parámetro del eje x (CD3 FITC) pero negativos para el parámetro del eje y (CD19 PE).
El cuadrante superior derecho contiene eventos que son positivos para ambos parámetros
(CD19+/CD3+) o doblemente positivos.
Figura 56 Gráficos de puntos del control de subclase (NORM001) y CD3 FITC/CD19 PE
(NORM002) con marcadores de cuadrante
Para averiguar los porcentajes de linfocitos CD19+/CD3 , mire el % Gated del cuadrante superior
izquierdo (UL) dividido por eventos (Figura 57): 296/2839 = 10,43%.
Figura 57 Estadísticas de cuadrante
32
Una forma alternativa de obtener estadísticas es crear regiones alrededor de las poblaciones en lugar
de usar un marcador de cuadrante. Puede crear regiones con formas diferentes (Figura 58); luego
use las estadísticas de la región para averiguar los porcentajes de poblaciones específicas.
En la Figura 59, el % Gated de R4 son los linfocitos CD3–/CD4+ : 40/2866 = 1,40 %.
Figura 58 Diagrama de puntos de CD3 FITC/CD4 PE con cuatro regiones
Figura 59 Estadísticas de la región
Hay una desventaja en el uso de estos dos métodos de análisis cuando tiene varios archivos para
analizar de diferentes muestras de donantes. Si dibuja las regiones alrededor de las poblaciones o
crea marcadores de cuadrante a partir de un archivo de datos y luego lee otro archivo, es posible
que las poblaciones queden fuera de las regiones o marcadores debido a la variabilidad de la
muestra. En este caso, deberá reajustar las regiones o marcadores para cada archivo.
Hay un nuevo método de análisis disponible para evitar esta situación. Esta tecnología
innovadora se llama análisis de conglomerados. El software BD MultiSETTM y BD AttractorsTM
utiliza el análisis de conglomerados para analizar los datos. En estos programas de software, las
regiones cambian sus posiciones para abarcar grupos de un archivo de datos al siguiente (Figura 510).
33
Figura 510 Gráfica de dos parámetros en el software BD Attractors con regiones elipsoides antes y
después del análisis
5.4 Análisis de datos para otras aplicaciones

Los métodos de análisis ilustrados hasta ahora se utilizan para estimar porcentajes de poblaciones
discretas. Es por eso que solo usó las estadísticas %Gated y %Total.
Si estuviera analizando una línea celular clonada para determinar si es positiva para una molécula en
particular, lo más probable es que no use porcentajes. Dado que una línea celular clonada consta de
una sola población, en la mayoría de los casos sería 100 % negativa o 100 % positiva. También
es posible que exprese cantidades bajas de la molécula en cuestión. En ese caso, seguiría
siendo positivo pero tenue.
Para estos casos en los que desea comparar intensidades de fluorescencia y medir el grado de
positividad, compararía las medias geométricas o medianas de los datos de control de la subclase
con los datos de muestra. Si la estadística de datos de la muestra es mayor que la de los datos de
control de la subclase por algún límite establecido por el usuario, se consideraría positiva. Cuanto mayor
es la diferencia entre los dos, más moléculas se expresan por célula y más positiva o brillante es la
población.
El diagrama de puntos de la figura 511 muestra una sola población por dispersión. Las
superposiciones de histogramas muestran datos de un control de subclase y tinción con dos anticuerpos diferentes.
La media geométrica de cada histograma es respectivamente 2, 5 y 20 (de izquierda a derecha). En
este ejemplo, el usuario decidiría si los datos de la muestra en el histograma medio eran positivos.
34
Figura 511 Análisis de una línea celular
Además de usarse para medir la positividad, las medias geométricas o medianas pueden usarse
para estimar la cantidad de moléculas (ligandos) expresadas por célula. Los programas de
software especializados, como QuantiCALC™, utilizan la mediana junto con los datos de una
curva estándar para calcular la cantidad de anticuerpos unidos por célula. En la Figura 512 se
muestra un ejemplo; los círculos en el eje y indican información de una curva estándar. Esta
información se puede utilizar para estimar el número de ligandos por célula.
información de una curva estándar
Figura 512 Estimación de QuantiCALC del número de anticuerpos unidos por célula*
*
Datos proporcionados por cortesía del Dr. David Miller, Community Blood Centers of South Florida.
35
Para el análisis del contenido de ADN, se puede utilizar otro programa de

software especializado como ModFit LT™ . Debido a que las poblaciones que representan un
histograma de ADN (G0/G1, S y G2+M) no son discretas (Figura 513), se utilizan algoritmos
especiales. El área bajo la curva está integrada; luego se calculan los porcentajes de cada
población presente.
Figura 513 Histograma de ADN
Preguntas de repaso: análisis de datos
1 ¿ Por qué usaría un diagrama de puntos bidimensional en lugar de un histograma?
2 Haciendo referencia a la Figura 54 y la Figura 55,
¿Qué porcentaje de los linfocitos no es CD3+? __________________
¿Qué porcentaje del total de eventos es CD3+? ________________________
3 La población en el cuadrante LL es la población doblemente positiva.
TF
4 Con referencia a la Figura 56 y la Figura 57, ¿cuál es el porcentaje de linfocitos

que son CD3+/CD19–? _____________________________
36
5 Las regiones solo se pueden dibujar como rectángulos.
TF
6 ¿Cuál es la desventaja de usar regiones para analizar varios archivos?
7 ¿ Qué tipo de análisis de datos evita el problema de cambiar grupos de celdas?

poblaciones?
8 ¿Qué estadísticas se utilizan para medir el grado de positividad y para la cuantificación?

¿estudios?
37
38
6
Clasificación
6.1 Clasificación
En la mayoría de las aplicaciones, después de que una partícula sale del rayo láser, se desecha. La clasificación
nos permite capturar y recopilar células de interés para su posterior análisis. Una vez recolectadas, las células
se pueden analizar microscópicamente, bioquímicamente o funcionalmente. No todos los citómetros de
flujo de sobremesa están equipados con una función de clasificación; sin embargo, se pueden actualizar para
realizar esta función.
Para clasificar partículas o células, el citómetro primero necesita identificar las células de interés y luego separar
las células individuales. Una vez que se ha identificado la población de interés en un gráfico de adquisición de
datos, se dibuja una región alrededor de esa población. Se crea una puerta lógica a partir de las regiones. Luego,
esta puerta se carga en el software del citómetro como la puerta de clasificación. La puerta de clasificación
identifica las celdas de interés para ser clasificadas fuera de la secuencia.
Diferentes citómetros tienen diferentes métodos para capturar una partícula de interés. El sistema BD
FACSCalibur, un analizador de sobremesa, utiliza un dispositivo mecánico llamado tubo colector para
clasificar las células. Este tubo colector está ubicado en la parte superior de la celda de flujo. Entra y sale del flujo
de muestra para recolectar una población de células deseadas a una velocidad de hasta 300 células por segundo.
A medida que una celda pasa a través del rayo láser, la electrónica del sistema BD FACSCalibur, utilizando
las características de la puerta de clasificación, determina rápidamente si la celda es un objetivo. La celda de
destino se captura de acuerdo con el modo de clasificación preseleccionado. Un modo de clasificación es el
criterio de captura de las células objetivo en relación con el recuento o la pureza exactos de las células. porque láser
39
la alineación y la velocidad de la corriente son fijas, el tiempo que tardan las células deseadas en
viajar desde la intercepción del láser hasta el tubo receptor es constante.
Cuando se toma la decisión de capturar la celda objetivo, el sistema electrónico espera un período de
tiempo fijo para permitir que la celda alcance el tubo receptor. A continuación, activa el tubo receptor
para que oscile en el flujo de muestra para capturar la celda. La figura 61 (izquierda) muestra el tubo
receptor en su posición de reposo en la corriente envolvente. La Figura 61 (derecha) muestra el tubo
receptor colocado en el flujo central de la muestra, listo para capturar una celda objetivo.
colección
de
células ordenadas
desperdiciar desperdiciar
receptor
s salud vaina
Figura 61 (Izquierda) tubo colector en corriente envolvente; (derecha) tubo receptor en flujo de muestra
El sistema BD FACSVantage SE, un citómetro de flujo de corriente en aire, aísla una célula de interés
haciendo vibrar toda la corriente. El flujo de muestra vibra a lo largo de su eje y se rompe en gotas. La
distancia entre gotas es fija. Cuando la velocidad de la vaina y la velocidad de vibración de la punta de la
boquilla son constantes, el patrón de formación de gotas es fijo. Con la formación de gotas fijas, el
instrumento BD FACSVantage SE puede calcular la distancia entre las gotas con precisión, lo que permite
el aislamiento de celdas individuales.
El citómetro BD FACSVantage SE aplica una carga de voltaje a las gotas que contienen una celda que
cumple con los criterios de clasificación predefinidos. Hay placas cargadas positiva y negativamente a
cada lado de la corriente vibrante. A medida que las gotas cargadas pasan por el
40
Capítulo: Clasificación
placas cargadas, las gotas se desvían hacia los tubos de recolección, dependiendo de la polaridad de carga
de las gotas (Figura 62).
electrodo de carga
tubo de inyección de muestra
tubo de vaina
tubo de viento
placas deflectoras
coleccion de basura
tubos de recogida
Figura 62 Clasificación de componentes en el citómetro de flujo BD FACSVantage SE
Preguntas de repaso: Clasificación
1 Para separar células individuales, la corriente líquida del citómetro BD FACSVantage SE

_________________________ a lo largo de su eje.
2 ¿ Cuántas celdas contiene cada gota clasificada en el BD FACSVantage SE?

¿instrumento?
3 ¿ Cuál es el nombre del dispositivo utilizado por el instrumento BD FACSCalibur para capturar células
clasificadas?
4 ¿Qué utiliza el sistema BD FACSVantage SE para atraer o repeler

partículas?
41
42
Láseres y Alineación
7.1 Cómo funcionan los láseres
LASER es un acrónimo de amplificación de luz por emisión estimulada de radiación.
La luz se genera de la siguiente manera. Los láseres de gas consisten en cilindros o tubos de plasma
llenos de un gas inerte como el argón. El gas inerte se ioniza mediante un pulso eléctrico de alto
voltaje, de modo que los electrones de los átomos del gas ionizado absorben energía y pasan a un
estado de mayor energía. A medida que los electrones excitados regresan al estado fundamental,
todos a la vez o en varios pasos rápidos, emiten fotones con longitudes de onda específicas
para cada nivel de transición.
Las ópticas en cada extremo del tubo de plasma reflejan los fotones de un lado a otro a través
del tubo. Estos fotones interactúan con otros electrones emitidos, lo que da como resultado la
liberación de más fotones que son idénticos en longitud de onda, fase y dirección. Como cada fotón
es capaz de estimular más fotones, se produce la amplificación de la luz o el láser. Las ventanas
de Brewster sellan cada extremo del tubo de plasma y transmiten la luz en un plano de
polarización.
Un electroimán colocado alrededor del tubo de plasma crea un campo magnético que
comprime los electrones hacia el centro del tubo. Esto evita que los electrones golpeen los lados
del tubo, aumentando la densidad de corriente y provocando una mayor emisión de luz estimulada.
43
Un pequeño porcentaje de esta luz se transmite a través de la óptica en la parte delantera (acoplador
de salida) del tubo. Esta luz transmitida es el rayo láser. La longitud de onda del rayo láser primario
en los citómetros de flujo de sobremesa se fija en 488 nm colocando un filtro delante del acoplador de
salida (Figura 71). Un láser secundario, el láser de diodo rojo, está disponible para el analizador de
sobremesa. Este es un láser de estado sólido que emite una longitud de onda de 635 nm. La
longitud de onda del rayo láser en los citómetros de corriente en el aire se selecciona ajustando la
posición óptica del reflector alto para reflejar solo una de las longitudes de onda refractadas de
la luz que viaja a través del prisma. Solo la longitud de onda seleccionada se reflejará entre el acoplador
de salida y el reflector alto. La salida del láser se controla y mantiene a un nivel constante mediante el
uso de circuitos de retroalimentación.
Figura 71 Generación de luz láser en un láser de gas
7.2 Alineación láser

En el citómetro de flujo, el rayo láser se enfoca en el núcleo de la muestra. Este punto de
intersección debe permanecer constante. Para lograr esto, la cabeza del láser se mantiene en una
posición fija. El haz pasa a través de una óptica que hace que la forma del haz sea elíptica.
Luego, el rayo pasa a través de una lente de enfoque que enfoca el rayo en el punto de intersección
entre el rayo láser y el núcleo de la muestra. En los citómetros de flujo de sobremesa, el láser se fija
en la alineación adecuada dentro del citómetro y no es necesario que el operador lo ajuste.
Los citómetros de flujo de flujo en aire utilizan láseres extraíbles y óptica láser; por lo tanto, el ajuste
del operador es necesario.
44
Capítulo: Láseres y alineación
Preguntas de repaso: Láseres y alineación
1 Un(n) láser _______________emite luz que tiene una longitud de onda de 488 nm.
2 La forma del rayo láser es elíptica después de viajar a través de la óptica de enfoque.
TF
3 ¿Cuál es la longitud de onda del láser de diodo rojo en el analizador de sobremesa?
4 La longitud de onda del láser utilizado en el citómetro de flujo de flujo en aire se puede
seleccionado ajustando la posición óptica ______________ en la parte trasera del láser.
45
46
clave de respuesta
Preguntas de repaso: descripción general en la página 3
1 Tamaño relativo, granularidad relativa o complejidad interna y fluorescencia relativa

intensidad
2 un láser
3 La fluídica, la óptica y la electrónica
4 Una suspensión unicelular
5 Núcleo de muestra
6 Luz dispersa y fluorescencia
7 lentes
8 La cantidad de luz que los incide
9 Verdadero
10 cierto
47
Preguntas de repaso: fluidos en la página 8
1 Para colocar el núcleo de la muestra en el centro del rayo láser
2 El ancho y el posicionamiento de la corriente
3 uno
4 líquido envolvente; cámara de flujo
5 Enfoque hidrodinámico
6 El regulador de presión de muestra
7 BAJO, MEDIO y ALTO
8 aumentos, ancho
9 Un caudal más bajo
10 cierto
11 cierto
Preguntas de repaso: Dispersión de luz en la página 12
1 Cuando una partícula desvía la luz láser incidente
2 La membrana celular, el núcleo y los componentes granulares internos
3 Luz dispersada hacia adelante (FSC)
4 Área de superficie celular o tamaño
5 Luz de dispersión lateral (SSC)
6 Granularidad o complejidad interna
7 FSC y SSC
48
clave de respuesta
Preguntas de repaso: Fluorescencia en la página 15
1 fotones de luz
2 espectros de absorción
3 Espectro de emisión
4 El láser de iones de argón
5 488 nm
6 FITC y PE
7 marcadores antigénicos
Preguntas de repaso: Banco óptico en la página 19
1 La óptica de excitación y captación
2 El rayo láser y el flujo de muestra
3 Verdadero
4 Celda de flujo, flujo de muestra
Preguntas de repaso: Filtros ópticos en la página 21
1 Limite el rango de longitudes de onda que llegan al detector
2 515 y 545
Divisor de 3 haces
4 pase corto, pase largo
49
Preguntas de repaso: Detección de señal en la página 24
1 fotodiodo
2 tubos fotomultiplicadores
3 Verdadero
4 Convierte pulsos de voltaje a números de canal
Preguntas de repaso: Umbral en la página 25
1 Polvo, escombros o ruido electrónico
2 falso
Preguntas de repaso: recopilación y visualización de datos en la página 28
1 El valor de la señal del parámetro en números de canal
2 dos
3 El número de eventos por canal
Preguntas de repaso: Activación en la página 29
1 verdadero
50
clave de respuesta
Preguntas de repaso: Análisis de datos en la página 36
1 Un gráfico de puntos le permite ver una visualización de datos de dos parámetros. Cada evento tiene
una posición en el gráfico de acuerdo con sus valores de canal para ambos parámetros.
Los histogramas solo pueden mostrar datos de un parámetro en relación con el
número de eventos.
2 21,41%
37,87%
3 falso
4 79,57%
5 falso
6 A medida que lee de un archivo de datos al siguiente en el gráfico, si las regiones se crean
estrechamente alrededor de la población, las poblaciones subsiguientes podrían quedar fuera de
las regiones debido a la variabilidad de la muestra.
7 Análisis de conglomerados
8 Media geométrica o mediana
Preguntas de repaso: Clasificación en la página 41
1 vibra
2 uno
3 Tubo colector
4 placas deflectoras
51
Preguntas de repaso: Láseres y alineación en la página 45
1 argón
2 falso
3 635nm
4 Reflector alto
52

Introducción A Citometria de Flujo

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Introducción A Citometria de Flujo

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Machine Translated by Google

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Modfit LT y QuantiCALC son marcas comerciales de Verity Software House, Inc.

BD Attractors, BD CellQuest, BD FACS, BD FACSCalibur, BD FACSDiVa, BD FACScan, BD FACSort, BD FACSVantage,

Preguntas de revisión: descripción general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3

Capítulo 5 Análisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

5.4 Análisis de datos para otras aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje iii

Preguntas de repaso: clasificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

7.2 Alineación láser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Preguntas de repaso: Láseres y alineación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Preguntas de repaso: descripción general en la página 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

IV Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Aprender a operar un citómetro de flujo se logra mejor usando el instrumento.

Para más información

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Un citómetro de flujo se compone de tres sistemas principales: fluídica, óptica y electrónica.

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

en la partícula fluorescente. La luz dispersada y fluorescente es recolectada por lentes

Figura 1­1 Señales de luz dispersas y emitidas convertidas en pulsos electrónicos

Preguntas de revisión: descripción general

2 ¿Qué fuente de luz se utiliza en la mayoría de los citómetros de flujo?

3 ¿Cuáles son los tres sistemas principales en un citómetro de flujo?

7 La luz emitida por una partícula es recolectada por

8 La señal electrónica producida por los detectores es proporcional a:

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

presión de alta presión

fluido de fluido de fluido de fluido de

vaina vaina vaina vaina

presión diferencial baja alta presión diferencial

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Preguntas de repaso: fluidos

1 El propósito del sistema fluídico en un citómetro de flujo es:

3 ¿ Cuántas células o partículas deben atravesar el rayo láser en un momento dado?

4 La suspensión de partículas se inyecta en _________________ dentro de

6 ¿Qué regulador controla el diámetro del núcleo de la muestra?

8 Aumento de la presión de la muestra ______________ el caudal de la muestra y el del

10 Un núcleo de muestra más ancho reduce la resolución.

11 Se puede utilizar un caudal alto al realizar mediciones cualitativas.

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

3.1 Dispersión de luz

La luz dispersada lateralmente (SSC) es proporcional a la granularidad celular o la complejidad interna.

detector de dispersión lateral

detector de dispersión frontal

Figura 3­1 Propiedades de dispersión de luz de una celda

Capítulo: Generación de dispersión y fluorescencia

sangre entera lisada

Figura 3­2 Subpoblaciones de células basadas en FSC vs SSC

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

Preguntas de repaso: Dispersión de luz

1 ¿Cuándo ocurre la dispersión de la luz?

2 ¿Qué componentes celulares clave contribuyen a la dispersión de la luz?

3 La luz dispersada en la misma dirección que el rayo láser se llama:

5 La dispersión de luz recogida a 90 grados del rayo láser se denomina:

6 SSC es proporcional a la ___________ o _____________ de la celda

7 Mediciones correlacionadas de ambos _______________ y _____________ poder

permitir la diferenciación de tipos de células en una población celular heterogénea.

Capítulo: Generación de dispersión y fluorescencia

El rango en el que se puede excitar un compuesto fluorescente se denomina espectro de absorción.

Introducción a la citometría de flujo: una guía de aprendizaje

FITC = isotiocianato de fluoresceína

Figura 3­3 Espectros de absorción de cuatro fluorocromos comunes

Figura 11 Señales de luz dispersas y emitidas convertidas en pulsos electrónicos

Figura 31 Propiedades de dispersión de luz de una celda

Figura 32 Subpoblaciones de células basadas en FSC vs SSC

6 SSC es proporcional a la _ o ___ de la celda

7 Mediciones correlacionadas de ambos ___ y _ poder

Figura 33 Espectros de absorción de cuatro fluorocromos comunes

Figura 45 Creación de un pulso de tensión

Figura 47 Generación y procesamiento de señales

Histograma trama 2D gráfico en 3D gráfico en 3D

Figura 51 Representaciones gráficas de datos de citometría de flujo

Figura 52 Uso de gating para restringir el análisis a una población

Figura 54 Histogramas de control de subclase (NORM001) y CD3 FITC

Figura 55 Estadísticas de histograma

Figura 57 Estadísticas de cuadrante

Figura 58 Diagrama de puntos de CD3 FITC/CD4 PE con cuatro regiones

Figura 59 Estadísticas de la región

Figura 511 Análisis de una línea celular