Aminoácidos, Péptidos y Proteínas

Función y estructura de las proteínas: son las macromoléculas biológicas

más abundantes, variando en tamaño (desde pequeños péptidos a polímeros
enormes) y en función. Están formadas por subunidades monoméricas
simples: veinte aminoácidos unidos de forma covalente en una secuencia
determinada, la que le otorga a cada proteína su variedad estructural y
funcional.

Aminoácidos: Son los monómeros de las proteínas, en las que los residuos
aminoácidos se unen entre sí mediante enlaces covalentes denominados
genéricamente peptídicos. Los aminoácidos son α-aminoácidos, es decir,
tienen un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo carbono
(carbono α), difiriendo entre sí por sus cadenas laterales (o grupos R) que
varían en estructura, tamaño y carga eléctrica, influyendo así en sus repulsiones y atracciones eléctricas, y en la
solubilidad de los aminoácidos en agua.

Estereoisomería
Carbono α es quiral, generando dos estereoisómeros (enantiómeros). Todos los aminoácidos presentes en
organismos vivos son L, es decir, poseen la misma configuración absoluta que el L-gliceraldehído. Su síntesis
selectiva se debe a centros activos asimétricos de las enzimas. La presencia de D-aminoácidos se da en péptidos
bacterianos o antibióticos, ya que cumplen la función de engañar o evitar las defensas proteolíticas. La glicina posee
un protón como R, lo que la vuelve aquiral

Grupos R apolares: alanina (grupo metilo), la valina (isopropilo), leucina

(isobutilo) y la isoleucina, un secbutilo. Estos aminoácidos son apolares y
alifáticos, uniéndose entre sí en las proteínas para estabilizarse por interacciones
hidrofóbicas.
La metionina posee azufre (es un etil metil tioéter), lo que no influye en su
polaridad. Prolina no es un aminoácido, sino un iminoácido, ya que se genera un
ciclo de cinco miembros que incluyen al carbono α y al grupo amino, haciendo a
la estructura más rígida, lo que le da utilidad funcionando como resto aminoácido
de curvatura.

Grupos R aromático: La fenilalanina (metil benceno), la tirosina (p-fenol) y el

triptófano (anillo indólico) otorgan un elevado carácter hidrofóbico, más allá que
no lo sea totalmente. Fenilalanina es el más apolar, mientras que los átomos de
oxígeno y nitrógeno de la tirosina y del triptófano le otorgan mayor
polaridad.

Grupos R polares sin carga: forman puentes de hidrógeno, variando su

solubilidad en agua. La serina (hidroxometil), la treonina (1-hidroxoetil), la
cisteína (sulfhidroxometil), la asparagina y la glutamina (amidas derivadas
del ácido aspártico y del glutámico) forman parte de este grupo, debiendo
su polaridad a átomos de oxígeno, nitrógeno o azufre. La cisteína se
oxida formando un aminoácido dimérico denominado cistina, mediante la
formación de un enlace disulfuro, fuertemente apolar.
Grupos R cargados positivamente (básicos): La lisina (4-aminobutil), la arginina
(guanidino) y la histidina (imidazol), debiendo todos su basicidad a átomos de
nitrógeno.También encontramos como aminoácido básico a la ornitina (3-
aminopropil), presente en proteínas bacterianas.

Grupos R cargados negativamente (ácidos): El ácido aspártico (derivado del ácido etanoico) y
el glutámico (derivado del propanoico), debiendo su carácter ácido al grupo carboxilo. Por otra
parte, estos reaccionan con amoníaco para generar una amida, correspondiente a la
asparagina y la glutamina.

Aminoácidos no usuales
(a) La 4-hidroxiprolina que se encuentra en la pared celular de plantas y en el colágeno.
(b) La 5-hidroxilisina que se encuentra en el colágeno.
(c) La 6-N-metil-lisina que se encuentra en la miosina muscular
(d) El γ-carboxiglutamato, que se encuentra en proteínas calcodependientes
(e) La desmosina que se forma por la unión de cuatro restos aminoácidos de lisina, y se encuentra en la elastina.
(f) La citrulina y la ornitina son intermediarios en la biosíntesis de otros aminoácidos.

Propiedades ácido-base
Un aminoácido en solución se encuentra como ión dipolar, lo que le permite actuar como ácido o base, es decir son
anfolitos. De esta manera, los aminoácidos no cargados son dipróticos. El punto de inflexión notable entre los dos
pKa es el punto isoeléctrico (pI), en el que la carga neta de la proteína es cero. Se puede calcular este punto como la
semisuma de los pKa correspondientes a la primera protonación y la primera desprotonación.

3. Péptidos y proteínas. Generalidades

Serie de AA unidos por unión peptídica, a cada aminoácido de una cadena polipeptídica se le llama residuo. Las
cadenas polipeptídicas son polares, poseen un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal. Por
convención los péptidos se escriben comenzando con el extremo amino terminal y finalizando con el extremo carboxilo
terminal. Los péptidos varían en tamaño desde pequeños oligómeros (di o tripéptidos) hasta grandes moléculas con
miles de ellos. La diferencia entre polipéptido y proteína es convenida en que la proteína más pequeña es la insulina
(52 restos aminoácidos, 6000 dalton). Por otra parte, una proteína puede contener además de una cadena
polipeptídica (apoproteína), otros grupos adicionales denominados “grupos prostéticos” necesarios para su
funcionamiento, y que pueden otorgarle color (hemo, mio).
Un péptido se forma por los enlaces peptídicos (de condensación) entre aminoácidos, previa activación de los grupos
reaccionantes.
Los enlaces peptídicos son planos (C-N adquiere un 40% de carácter doble) y generalmente trans, excepto cuando
interviene la prolina, que obliga a generar un enlace peptídico cis, lo que conjuga consecuencias estructurales. La
presencia de este doble enlace primitivo, permite que haya absorbancia de luz a 210 nm, lo que permite medir la
cantidad de proteínas en solución, pero con el inconveniente, de que muchas sustancias absorben a esta longitud de
onda, y por lo tanto, las interferencias son notables.
Los péptidos pueden ser sintetizados de diferentes maneras: (a) Naturalmente, por organismos vivos, de los cuales
pueden ser extraídos con diversos métodos, (b) Proteolíticamente, mediante la degradación de proteínas con enzimas
proteolíticas específicas y (c) Sintéticamente, fabricados artificialmente. Por ejemplo, el glutatión, es el péptido natural
más abundante, ya que se encuentra en toda célula viva.

Proteínas: Las proteínas pueden estar formadas por una sola cadena peptídica, o por más de una (subunidades
múltiples), unidas entre sí mediante enlaces débiles. Si por lo menos dos de estas subunidades son iguales, la
proteína se denomina oligomérica y las subunidades idénticas, protómeros.
Degradación: se utilizan distintos métodos, siendo el más común, la acción de ácidos (por ejemplo, bromuro de
cianógeno, que corta la cadena peptídica en las metioninas) o la de enzimas proteolíticas. Entre estas encontramos a
las exoproteasas (degradan por el extremo de la cadena, pudiendo ser aminopeptidasas o carboxipeptidasas), o las
endoproteasas, que degradan enlaces peptídicos internos, pueden ser específicas (degradar un enlace preciso en
polipéptidos identificados) o generales (cuando se degrada el enlace peptídico formado por algún tipo de aminoácido,
sin importar en qué polipéptido se encuentre). Dentro de éstas últimas encontramos a la tripsina (degrada enlaces
entre AA básicos), la quimotripsina (degrada enlaces entre AA aromáticos) y la carboxipeptidasa M (degrada enlaces
entre AA ácidos).

Determinación de la cantidad de cadenas polipeptídicas de una proteína: se puede utilizar alguna reacción que
permita determinar la cantidad y la identidad de los aminoácidos que poseen el extremo amino terminal. Para esto, se
hace reaccionar la cadena polipeptídica con 2,4-flúordinitrobenceno (o FDNB), que sólo reacciona con su extremo
amino terminal. Luego, mediante hidrólisis fuertemente ácida, se produce la ruptura de todos los enlaces peptídicos, y
se puede identificar cuál (o cuáles) son los aminoácidos terminales del péptido en cuestión. Luego de realizado esto,
se puede determinar qué aminoácido es el terminal, mediante la comparación mediante espectrofotometría de flujo,
del tiempo de elución del aminoácido derivado del FDNB con los patrones de cada aminoácido, listados en
bibliografía. Es importante notar que los aminoácidos amínicos, como la lisina y la ornitina, reaccionan también con el
FDNB, por lo que podrían generar falsos positivos, aunque son identificables fácilmente, ya que poseen tiempos de
elución propios, diferentes a los de los otros aminoácidos.

Determinación del tipo y cantidad de los aminoácidos: hidrolizarlo mediante catálisis ácida y calor, y mediante
cromatografía de intercambio iónico, medir el tiempo de elución de cada uno.

Secuenciación de péptidos cortos: reacción de Edman. Esta se basa en la reacción del feniloisotio-cianato con el
extremo amino de los péptidos. Mediante una hidrólisis suave (con ácido suave que no degrade los enlaces
peptídicos), a temperatura ambiente y por poco tiempo, se logra la ruptura solo del último enlace, ya que es labilizado
por la acción del grupo reaccionante. De esta manera, se genera un derivado de la feniltío-hidantoína (PTH) que es
soluble en solventes orgánicos, y puede reconocerse mediante cromatografía. La cadena polipeptídica restante puede
ser purificada y volver a ser incorporada al proceso de Edman, aunque el proceso sólo puede repetirse unas ocho
veces sin ser obstaculizado importantemente por las impurezas.

Secuenciación de proteínas
Para realizarlo, se la degrada mediante enzimas proteolíticas en péptidos más pequeños, se secuencia cada uno de
ellos y se los une en el orden correcto. Como no hay forma alguna de saber el orden original a partir de una
secuenciación, ya que no se conoce cuál es el primer trozo de antemano, generalmente se realizan dos proteólisis con
enzimas distintas, para generar un patrón comparativo de ordenamiento. Es importante también el hecho de que
previamente a la proteólisis, se deben romper los enlaces disulfuro que impedirían la función de varias enzimas
proteolíticas al generar una estructura terciaria compleja. Esto se realiza mediante la reacción con ácido perfórmico,
(que oxida los azufres cisteínicos a residuos de ácidos cisteicos) o por ditiotreitol (que los reduce a sulfhidrilos) y
posteriormente los permite reaccionar con ácido yodoacético para generar un enlace tioéter.

Síntesis de péptidos
Síntesis en fase acuosa: Para sintetizar un péptido pequeño (hasta tetrapéptidos), se protegen los grupos funcionales
no reaccionantes para evitar productos innecesarios. Esto se realiza mediante reacciones esterificantes para el
carboxilo terminal, o reacción con Bencil-Cl-carbamato o Anhídrido ftálico para el bloqueo de aminas. Es importante
que estos bloqueadores sean fácilmente eliminables (los carbamatos mediante hidrólisis ácida diluida, y el anhídrido
mediante hidracina), y que no modifiquen la estereoespecificidad del producto. Por otra parte, la reactividad entre los
aminoácidos es nula, por bloqueos termodinámicos de la formación de enlaces peptídicos. Para activarlos, se hace
reaccionar el aminoácido con diciclohexilcarbodiimida (DCCD), la que se une mediante un éster con su grupo
carboxilo. Luego, el carbono α del aminoácido, ataca al del éster recién formado, para generar el enlace peptídico y se
obtiene como subproducto, la diciclohexilurea que puede regenerar el DCCD original mediante deshidratación.

Síntesis en fase sólida: síntesis de péptidos más eficiente, rápida y útil. Union extremo carboxilo del primer aminoácido
a una resina sólida (generalmente poliestirenos) mediante una reacción reversible, pero difícilmente rompible. Luego,
el ataque del siguiente aminoácido protegido y activado, permitirá la unión en el grupo amino del último de la cadena
recién formada, y se efectúan lavados continuos para eliminar las impurezas posibles en el producto recién formado.
Pudiendo separar los péptidos recién formados de la resina, mediante ácido fluorhídrico.

Síntesis mediante biotecnología bacteriana: La biotecnología sobre bacterias permite incorporar genes precisos que
codifiquen a la proteína buscada, en el material genético de la bacteria en cuestión, la que lo traducirá
espontáneamente. De esta manera, se obtienen productos eficientes totalmente, de manera rápida, segura y con
mucho menos costo.

PROTEINAS
Las proteínas pueden clasificarse según su composición en: (a) Simples: solo están compuestas por restos
aminoácidos, (b) Conjugadas: están compuestas por otras moléculas además de aminoácidos. Entre estas últimas
encontramos a: glico y mucoproteínas (unidas a carbohidratos), lipoproteínas, nucleoproteínas, metaloproteínas,
cromoproteínas (unidas a moléculas orgánicas, llamadas así porque son generalmente coloreadas), etc.

Según su solubilidad en agua y soluciones salinas, podemos clasificarlas en: (a) Albúminas: solubles en agua y
soluciones salinas, (b) Pseudoglobulinas: solubles en soluciones salinas, y en menor medida, en agua, (c)
Euglobulinas: solubles en soluciones salinas pero no en agua. El aumento de la fuerza iónica del medio, aumenta la
solubilidad de las proteínas. Sin embargo llega un nivel de fuerza iónica que las hace precipitar, cualquiera sea su tipo.

Según su solubilidad en general, podemos encontrar: (a) Escleroproteínas: insolubles, (b) Prolaminas: solubles en
alcoholes, (c) Glutelinas: solubles en sustancias ácidas o básicas.

Tamaño: muy pequeñas (como la insulina).En general, el tamaño refleja la función de la proteína, ya que
generalmente las proteínas más grandes cumplen funciones más complejas.

Estructura
(a) La estructura tridimensional está dada por la secuencia de restos aminoácidos, (b) La estructura tridimensional es
el origen de la función de una proteína, (c) La estructura tridimensional es única o casi única, (d) Las fuerzas que
generan la estructura tridimensional son interacciones no covalentes, (e) Existen patrones estructurales comunes.

Generalidades estructurales: Las proteínas disponen espacialmente sus átomos en determinadas conformaciones.
Pueden existir más de una, siempre y cuando no se rompan enlaces peptídicos, y solo se generen por giro de los
enlaces covalentes sencillos, pocas conformaciones son representativas, y son las más estables, es decir las que
poseen una energía libre menor, llamándose por esto, nativas.
Estas conformaciones se generan por interacciones débiles entre los grupos laterales de los restos aminoácidos, o, en
muchos casos, por uniones covalentes fuertes, como los puentes disulfuro. Las uniones que mantienen la estructura
terciaria son principalmente no covalentes
La estabilidad de una conformación está dada por varios factores termodinámicos: (a) El ordenamiento de los átomos
en una conformación disminuye la entropía, (b) La agrupación de los grupos laterales hidrofóbicos en el interior de una
proteína, está favorecido entrópicamente por desestructurar el agua de solvatación, (c) La polaridad de los grupos
laterales superficiales, permite formar la mayor cantidad posible de puentes de hidrógeno con el agua,
desestructurándola y aumentando la entropía del sistema total. De este modo, la termodinámica de la conformación es
favorable, lo que permite la existencia de la misma en el agua. Un aminoácido hidrofóbico superficial, o uno polar en el
interior de la conformación (y sin su respectivo par) son tan desestabilizantes que no permitirían una funcionalidad
total de la proteína casi en ningún caso.

Multímeros, oligómeros y protómeros

Una proteína que solo posee una repetición de una subunidad se denomina multímero, aunque puede poseer una
gran cantidad de subunidades o solo un pequeño número de ellas, en este caso se denomina oligómero.
Cuando una proteína se forma por unidades distintas, puede obtener una estructura general complicada y asimétrica,
sin embargo, generalmente se genera por la repetición de grupos de subunidades distintas denominados protómeros.

Estructura primaria
La estructura primaria está dada por la secuencia ordenada de restos aminoácidos unidos por enlaces covalentes
entre sí (incluyendo los puentes disulfuro). El giro se da sobre los enlaces Cα-N y Cα-Cβ, por lo que podemos
imaginar a una cadena polipeptídica como la unión de planos rectangulares sobre el vértice que representaría al Cα.
Se representa con φ al ángulo de giro Cα-N, y con ψ al ángulo de giro Cα-Cβ. No todos los pares (φ;ψ) están
permitidos por las interacciones electrostáticas entre los grupos.
Estructura secundaria
La estructura secundaria de una proteína es la conformación local de algunas partes del polipéptido, debida a los
enlaces débiles (principalmente puentes de hidrógeno) generados entre los átomos de los enlaces peptídicos.

Hélices α
Son estructuras plegadas helicoidales y dextrógiras. La rigidez de los enlaces peptídicos genera hélices α fácilmente,
enrollando compactamente la cadena alrededor de un eje imaginario longitudinal, quedando los grupos R hacia fuera,
y existiendo en su interior, un hueco tan pequeño, que no puede acomodar siquiera moléculas de agua.
La hélice hace un giro cada 5,4 Å, incluyendo 3,6 residuos aminoácidos por giro. Esto permite que los grupos R de
dos residuos superpuestos en la hélice, no estén completamente en contacto, sino que se separen lo suficiente para
minimizar sus interacciones. Están muy beneficiadas termodinámicamente, ya que aprovecha muy bien los puentes de
hidrógeno intercuatenarios paralelos al eje longitudinal, que se generan entre los oxígenos cetónicos y los hidrógenos
amínicos de restos aminoácidos separados por otros dos.

Relación entre hélices α y estructura primaria: las interacciones que pueden producirse entre las cadenas laterales de
los restos aminoácidos pueden estabilizar o desestabilizar las estructuras secundarias. Los grupos R cargados o
voluminosos que no se ubican a cuatro restos de distancia entre sí, de esta manera evitan una repulsión (o atracción
significativa). Por otra parte, los residuos aminoacídicos de prolina y glicina también son desestabilizantes de las
hélices α, la primera por sus ángulos de enlace fijos (aminoácido bisagra), y su configuración cis, que rompe la
estructura necesaria para generar una hélice, sin contar que no puede generar un puente de hidrógeno ya que su
protón amínico es inexistente. Contrariamente la glicina es demasiado flexible para participar de las hélices α, ya que
se deforma muy fácil, adquiriendo un enrollamiento mucho más compacto.
Por último, se observa que los restos aminoácidos de los extremos de las hélices, son cargados, con el fin de
estabilizar el dipolo innato generado por éstas. Como todos los puentes de hidrógeno están polarizados, un extremo
(el amino terminal) adquiere una carga parcial positiva que se contrarresta con la presencia de aminoácidos cargados
negativamente al finalizar la hélice α, y viceversa.

Láminas β
Esta estructura repetitiva, se genera por una disposición en zigzag de las cadenas polipeptídicas, ubicándose
paralelamente, y generando enlaces de hidrógeno entre ellas, los que las estabilizan. Los grupos R, salen hacia arriba
y abajo, interaccionando más entre ellos que en una hélice α, por lo que es más probable que los restos aminoácidos
cargados o voluminosos se ubiquen en éstas últimas, antes que en una lámina β.

Es importante notar que las dos (o más) cadenas polipeptídicas que forman una lámina β, pueden ser la misma, ya
sea luego de un plegado inmediato, o con la existencia de un segmento de cadena extenso entre ellas, o
directamente, pertenecer a dos dominios distintos. No obstante, la disposición relativa entre ellas puede ser:

(a) Paralela: poseyendo la misma orientación amino-carboxilo. Por otra parte, en este caso, los puentes de hidrógeno
poseen cierta torsión, lo que los desestabiliza, disminuyendo (aunque en baja proporción) la estabilidad comparada
con la de la disposición antiparalela.

(b) Antiparalela: poseyendo la orientación inversa amino-carboxilo.

Relación entre láminas β y estructura primaria: Las láminas β pueden ubicar menos grupos cargados y voluminosos
que las hélices α, las cadenas polipeptídicas que formarán esta estructura, son ricas en los aminoácidos más
pequeños: glicina y alanina.

Estructura Supersecundaria
Las estructuras supersecundarias se generan por combinaciones particulares de hélices α y hojas β. Estas
disposiciones particulares son especialmente estables, y son el origen de la unión relativamente duradera de varias
cadenas polipeptídicas separadas, para generar una proteína multilobular, ya que cada “lóbulo” (o dominio) puede
poseer una función distinta y requiere una unión estable con los otros.

Estructura Terciaria
Las estructuras terciarias se basan en interacciones a largo alcance en la secuencia de aminoácidos, ya sea por
enlaces débiles (puentes de hidrógeno, puentes salinos, interacciones hidrofóbicas) o covalentes (puentes disulfuro).
La estructura tridimensional está afectada por los AA quedan lugar a curvas: Pro, Thr, Ser, and Gly.La estructura
terciaria está íntimamente relacionada con la estructura y la función de las proteínas. El ejemplo más claro en este
sentido está dado por la clasificación proteica en dos grupos: las proteínas globulares y las fibrosas.

Proteínas Fibrosas: Entre ellas encontramos a la α-queratina, la β-queratina y el colágeno. Todas comparten sus
funciones de conferir fuerza y/o elasticidad, y algunas características fisicoquímicas como su insolubilidad (por la gran
cantidad de aminoácidos hidrofóbicos superficiales). La estructura secundaria más presente es, obviamente, la hélice
α y también hojas β; podemos encontrarlas dando soporte, forma y protección

α-Queratina: Son proteínas que resisten esfuerzos mecánicos, por lo que se encuentran en cabellos, uñas, garras,
cuernos, piel, citoesqueleto celular, etc. Es una hélice α dextrógira que se superenrolla con otra orientada en paralelo.
El enrollamiento es levógiro y las uniones que se dan entre ambas cadenas, son generalmente permitidas por
atracciones hidrofóbicas, con un ordenamiento y un entrecruzamiento regular entre los grupos R de los aminoácidos
hidrofóbicos. Esta es la base de la ondulación permanente en cabellos y la causa de la gran cantidad de cisteínas en
la estructura primaria proteica.

β-Queratina: también llamada fibroína de la seda, es una proteína formada predominantemente por hojas β, siendo,
por lo tanto, rica en alaninas y glicinas. En ésta, los grupos hidrofóbicos permiten las interacciones de Van der Waals
entre las hojas, estabilizando su estructura, e impidiendo su estiramiento, aunque permitiendo su flexibilidad.

Colágeno: proporciona fuerza, fundamentalmente en el tejido conjuntivo, tendones, huesos, etc. Las hebras de
colágeno están formadas por hélices de colágeno, con un triple enrollamiento entre ellas, lo que le otorga su
característica representativa de resistencia y fortaleza. Ésta se genera por la repetición de muchos restos de prolina,
lo que altera los ángulos de enlace en la cadena polipeptídica, generando una hélice mucho más abierta que las
hélices α. En estas, los puentes de hidrógenos, no estabilizan a la hélice en sí (ya estabilizada por la rigidez
estructural de la prolina), sino que permite el interenrollamiento de tres hélices (tropocolágeno), que interaccionan por
puentes de hidrógeno entre ellas. El colágeno se sintetiza como procolágeno, con prolinas en su estructura, que
luego (para generar colágeno), deben unir un grupo alcohol y transformarse en hidroxiprolinas, que le permiten
generar más puentes de hidrógeno.

Proteínas Globulares: La compactación de las proteínas globulares se debe al plegamiento de varios segmentos de
la cadena polipeptídica unos sobre otros, proporcionando además una amplia variedad de funciones biológicas, como
catálisis, transporte, movilidad, regulación, etc. En general, las hélices α se encuentran en el interior, ya que se
estabilizan con interacciones hidrófóbicas, y permiten el movimiento sectorial de la cadena, para favorecer a las
relaciones estructurales y funcionales. Las hojas β, sin embargo, sirven para interconectar varias cadenas
polipeptídicas, permitiendo el surgimiento de nuevas estructuras moleculares y la unión entre varias cadenas
polipeptídicas separadas.

Estructuras Cuaternarias
Muchas proteínas presenta múltiples subunidades polipeptídicas asociadas para generar una estructura compacta y
única, cuya función depende notablemente de esta agrupación. La agrupación puede generar nuevas funciones en las
proteínas, aumentar (o disminuir) su actividad específica, llevar a cabo funciones relacionadas más rápidamente, etc.

Desnaturalización
La estructura nativa (o funcional) de una proteína en cuestión depende fundamentalmente del entorno celular en el
que está inmersa. Cambios en el entorno generarán, por lo tanto, la pérdida total o parcial de la estructura proteica, e
indefectiblemente la pérdida de su función, en un proceso denominado desnaturalización. Cabe destacar que un modo
desnaturalizado de la proteína no es necesariamente el desplegado, sino todo aquel que no es el funcional.
Factores desnaturalizantes
(a) Calor: afecta a las interacciones débiles de una proteína, lo que provocará la desnaturalización completa. Cabe
notar que el proceso se da en un estrecho rango de temperaturas, lo que sugiere la cooperatividad del proceso, es
decir, la pérdida de estructura en una región proteica, provoca la rápida pérdida en todo el resto de la proteína.

(b) pH. Genera modificaciones en la carga total de la proteína, haciendo nacer interacciones electrostáticas
desestabilizantes.

(c) Solvente

(d) Solutos caotrópicos, como la urea, el cloruro de guanidinio, o detergentes. Éstos desestabilizan el core hidrofóbico
de las proteínas.

Patrones estructurales comunes

Motivos: arreglos estable de distintos elementos de estructura secundaria y sus conexiones (B-A-B LOOP, A-A
CORNET)
Dominios: unidades globulares presentes en la estructura de muchas proteínas asociados a una determinada función.
(Troponin C)

Relación estructura-función en las proteínas

La mayoría de las interacciones son transitorias. Las moléculas que se unen reversiblemente a una proteína se
denominan ligandos y uniéndose a un lugar de la proteína llamado sitio de unión que es complementario a él en
tamaño, forma, carga y carácter (hidrofílico o hidrofóbico). Esta interacción es notablemente específica y crucial para
mantener el alto grado de orden.
Las proteínas, son flexibles, pudiendo cambiar de conformación, siendo estos cambios los responsables en gran
medida de cumplir su función de manera útil. Este hecho también afecta a los sitios de unión, generalmente creados
luego de un cambio de conformación (encaje inducido) y a la preferencia evolutiva de las estructuras cuaternarias, ya
que un pequeño cambio en una subunidad puede inducir a grandes cambios en las demás. También se observa
cooperatividad, es decir, los cambios inducidos por un ligando, puede generar mayor o menor afinidad por la adhesión
de otros.

Globinas: grupo de proteínas y apoproteínas globulares con una estructura primaria similar, pero no necesariamente
igual. Cada secuencia específica de aminoácidos genera un tipo distinto de globina nombradas con letras griegas. Así
encontramos globinas α, β, γ, δ, ε y ξ, presentes en la mayoría de los vertebrados, y variando según su desarrollo
evolutivo y embrionario. Las globinas se asocian entre sí generando proteínas con una estructura cuaternaria
determinada, tal como la mioglobina (en músculos) y la hemoglobina (en sangre).

Las cadenas de las globinas en general, forman estructuras complejas, y son útiles para observar las diferencias
entre las cuatro estructuras proteicas: (I) Su estructura primaria es consistente con su forma, todas tienden a plegarla
globularmente y con el mismo patrón hidrofílico/hidrofóbico necesario para cumplir sus funciones. (II) Su estructura
secundaria está fundamentalmente representada por un gran porcentaje de hélices α dispuestas en distintas
direcciones y unidas por cadenas al azar, dándole mayor compactación e hidrofilicidad en su interior. (III) Su
estructura terciaria permite generar el sitio de unión a grupos prostéticos tales como el hemo, para cumplir sus
funciones, entre ellas, el transporte de oxígeno. (IV) Su estructura cuaternaria genera polímeros de diferente
naturaleza: tetrámeros, dímeros, etc.

Mioglobina: proteína fijadora de oxígeno pequeña que se encuentra en las células musculares, ayudando al
transporte de una mayor cantidad de oxígeno a éstas durante la contracción. Es un monómero con un solo grupo
hemo como grupo prostético, idéntico al utilizado en otras globinas. En su interior no se encuentra demasiado espacio
libre, ya que la mayoría está cubierto por los grupos R, básicamente hidrofóbicos lo que promueve la compactación
proteica (característica típica de las proteínas globulares). En contraposición, todos los grupos hidrofílicos (y dos
hidrofóbicos) se encuentran hacia el exterior, con el fin de hidratarse y permitir la solubilidad de la proteína.
El grupo hemo

Derivado porfírico plano, ubicado en una hendidura de las moléculas de globina.

En su centro, posee un átomo de hierro en estado de oxidación +2, que posee
cuatro enlaces de coordinación con nitrógenos de la molécula de hemo, y dos
enlaces de coordinación libres que se unirán, uno a un resto de histidina de la
posición 93 en la cadena polipeptídica de la globina, y el otro a un átomo de
oxígeno, ya sea de O2, CO, NO, etc. (lo que explica la toxicidad de estos gases, al
disminuir el transporte de oxígeno).
La accesibilidad del grupo hemo al solvente está muy restringida ya que al
contacto con éste el hierro(II) puede oxidarse a hierro(III), estado de oxidación
incapaz de unir oxígeno. Es importante notar, que cuando se extrae el hemo de la mioglobina, su estructura terciaria
casi no cambia, pero sí su estructura secundaria, disminuyendo el porcentaje de hélices α, lo que demuestra que el
hemo ayuda a reforzar las interacciones hidrofóbicas, estructurando así a la apoproteína. La conjugación que presenta
es la responsable de su coloración.

Unión del oxígeno: El oxígeno molecular no es soluble en agua, y su transporte a los tejidos por difusión es
extremadamente lento, comparado con las necesidades metabólicas de éstos. Por lo tanto, la evolución dependió del
surgimiento de proteínas transportadoras de O2, fundamentalmente por la acción redox de algunos cationes metálicos
como el hierro(II) o el cobre(II).

Unión a ligandos y estereoespecificidad

La unión a ligandos se ve afectada notablemente por la estructura
proteica y suele acompañarse con cambios conformacionales.

El hierro del hemo, cuando se encuentra en el surco globínico, está

unido a la histidina proximal (F8) y también a la histidina distal (E7).
Tal es así, que la fuerza de unión de la Hys proximal es tan superior a Unión del Fe(II) con la Hys distal y la Hys proximal
la de la Hys distal que el átomo de hierro se escapa del plano
molecular del hemo, hacia el sentido de la Hys proximal. Cuando el
hierro se une a oxígeno, la geometría molecular sp2 de los átomos de oxígeno provocan que el ángulo Fe-O-O sea de
aproximadamente 109º, lo que impide que haya interacciones estéricas con la histidina distal, ahora libre (ya que la
que queda formando la unión con el hierro, es obviamente, la proximal). Sin embargo, al unirse CO, su hibridación
sp3, provoca un ángulo Fe-C-O de 180º, lo que genera interacciones estéricas desestabilizantes con la histidina distal,
disminuyendo la afinidad del hemo con el CO.

Hemoglobina
Se encuentra fundamentalmente en el tejido sanguíneo, más particularmente dentro de los glóbulos rojos (de ahí su
coloración característica), o eritrocitos, que son células vestigiales incompletas, provenientes de los hemocitoblastos
(sus células madre asociadas), de los cuales maduran perdiendo la mayoría de sus organelas, con el fin de aumentar
la concentración de hemoglobina intracelular.

Estructura: tetrámero de globinas similares a la mioglobina en estructura y conformación. Está formada por dos
protómeros compuestos cada uno por una subunidad de globina α y una β. Cada una de las cuatro subunidades
posee unido un grupo hemo responsable de la unión y el transporte de oxígeno molecular. La subunidad α de la
hemoglobina carece de la hélice corta D.
Al estudiar la estructura terciaria de la hemoglobina, se notan dos estados conformacionales distintos: el R y el T. El
primero está estabilizado cuando el hemo está unido al oxígeno, mientras que el segundo es más estable cuando la
hemoglobina no está oxigenada. El estado R (o relajado) posee muchos menos enlaces por pares iónicos como el T
(o tenso), que tienden a unir más fuertemente la interfase αnβm. El cambio T-R se desencadena porque la unión del
oxígeno al hierro del hemo modifica la posición relativa del hierro en posición al plano de la molécula, trayendo hacia
sí a la histidina proximal. Este pequeño cambio induce a muchos restos aminoácidos cercanos a la unión hierro-Hys a
moverse, lo que en definitiva, produce cambios muy notables en la conformación total de las subunidades, haciendo
que los pares iónicos característicos del estado T desaparezcan, y las subunidades se deslicen una sobre otra.
Cooperatividad
¿Es más conveniente que la hemoglobina tenga alta afinidad al oxígeno o baja? Si fuera alta, se saturaría de oxígeno
en los pulmones correctamente, pero al llegar a los tejidos, no podría liberarlo de manera suficiente. Sin embargo, si
tuviera baja afinidad, liberaría rápidamente el oxígeno en los tejidos, pero sería difícil que éste vuelva a unirse en los
pulmones. Este inconveniente es el visto en la mioglobina, pero no en la hemoglobina.

La razón de esta diferencia recae en que le mioglobina posee un solo sitio de unión a oxígeno, por lo que debe
poseer o alta afinidad o baja afinidad, con las consecuencias que esto genera. Sin embargo, la hemoglobina posee
cuatro sitios de unión, lo que le permite utilizar la cooperatividad. Es decir, la desoxihemoglobina (en estado T) posee
una muy baja afinidad por el oxígeno, y es de este modo como la hemoglobina se encuentra al llegar a los pulmones.
Sin embargo, cuando la primera molécula de O2 se une a un grupo hemo de los cuatro, se producen cambios
conformacionales que aumentan la afinidad de los otros tres (disminuyendo el estado T), y lo mismo sucede en la
unión del segundo y el tercer oxígeno, siendo la trioxihemoglobina muy afín a la unión de oxígeno, ya que se
encuentra en un estado muy cercano al R.

Esta transición entre un estado de alta afinidad y uno de baja afinidad, genera un gráfico θ-p sigmoideo, que le
permite a la hemoglobina poseer una elevada afinidad por el oxígeno en los pulmones, y una muy baja en los tejidos,
pudiendo ceder una gran cantidad de oxígeno a éstos. Las proteínas que poseen esta capacidad se denominan
alostéricas, ya que un cambio de conformación inducido por un ligando (conocido como modulador), es el que
aumenta la afinidad por otros ligandos (ya sean moduladores o ligandos propiamente dichos). El oxígeno es
homotrópico (porque es ligando y modulador) y activador (ya que la incorporación de ligando induce a la incorporación
de más ligando).

Transporte de H+ y CO2
La hemoglobina no solo transporta oxígeno, sino que también sirve como transportadora de protones y dióxido de
carbono. El inconveniente es que el dióxido de carbono no puede existir como tal en la sangre, ya que es poco soluble
y formaría burbujas de aire mortales para el individuo. De ahí, que la carbónico anhidrasa funcione hidratando todas
las moléculas de dióxido de carbono en sangre, para generar bicarbonatos y protones. Sin embargo, esto acidifica la
sangre, lo que también es peligroso, y es aquí donde entra en juego el papel de la hemoglobina. La protonación de
algunos grupos funcionales acídicos permite la formación de más interacciones salinas, propias del estado T, lo que
induce a la liberación del oxígeno. Cuando la hemoglobina llega a los pulmones, el pH aumenta, los grupos se
deprotonan, y los carbamatos vuelven a transformarse en dióxido de carbono que se libera, regenerando el estado R,
y por lo tanto, induciendo a la unión de oxígeno.

La separación proteica
Para separar y purificar proteínas se usan diversos métodos dependiendo de algunos criterios de distinción entre las
proteínas, tales como su solubilidad, su tamaño, su carga y su afinidad con ciertos sustratos.

Separaciones por solubilidad

Fraccionamiento salino: A baja concentración, las sales incrementan bruscamente la solubilidad fenómeno que
recibe el nombre de solubilización por salado o salting-in. Por otra parte, a medida que la fuerza iónica aumenta, la
solubilidad de la proteína comienza a disminuir. A una concentración salina lo suficientemente alta, una proteína
puede ser casi completamente precipitada de su solución, efecto denominado insolubilización por salado o salting-out.
La concentración elevada de la sal puede eliminar el H2O de hidratación de la molécula de proteína (ya que los iones
son mas “solvatables” que la proteína) reduciendo de esta forma su solubilidad. Las proteínas precipitadas por salado
retienen su conformación nativa y pueden disolverse nuevamente sin experimentar desnaturalización.

El salting-out puede utilizarse en un método de separación denominado fraccionamiento salino, usado normalmente
para separar euglobulinas de pseudoglobulinas, o dos proteínas cuya insolubilización se de a concentraciones salinas
lo suficientemente distintas para no generar interferencia mutua. En general, se utiliza el sulfato de amonio, que
presenta precipitación de proteínas a partir de una concentración de 1M hasta su saturación a 4 M, de ahí que se
realicen cortes al x%, siendo x% el porcentaje de solución saturada que se necesita al realizar una dilución
determinada útil para fraccionar. El fraccionamiento salino se utiliza como primer método de separación, útil para
eliminar otras biomoléculas que no se insolubilizan por la fuerza iónica, como los hidratos de carbono, lípidos, etc.

Fraccionamiento con solventes orgánicos: Para esto, se agregan cantidades crecientes de solventes orgánicos
precipitantes como acetona o alcoholes, hasta lograr la precipitación selectiva de la o las proteínas en estudio. El
principal inconveniente recaía en el hecho de que la mayoría de los solventes orgánicos, además de precipitantes son
desnaturalizantes, introduciendo errores al producto que podrían ser de importancia.

Separación por tamaño

Diálisis: paso selectivo de ciertas moléculas a través de una membrana porosa. Las moléculas pequeñas, como
iones, sacáridos pequeños y péptidos pueden atravesar la membrana, mientras que las proteínas no. Este método
puede utilizarse con dos fines: (a) Separación: ya que si se regula el poro de la membrana pueden separarse las
biomoléculas de un tamaño mayor al poro de las que poseen un tamaño menor, (b) Purificador: ya que si ponemos en
contacto la solución original con otra hipertónica, se podrá deshidratar, y por lo tanto concentrar y purificar el producto.

Ultrafiltración: La ultrafiltración obliga a una solución a pasar a través de una membrana porosa, cuyos poros poseen
un diámetro regulado, que permite el paso diferencial de ciertos solutos pequeños, y no el de otros solutos más
grandes, como proteínas. La ultrafiltración se efectúa en una doble cubeta, poseyendo la interna una membrana
porosa en su base, y es la que se llena de la solución a separar. Cuando se aplica una fuerza centrífuga suficiente, la
solución pasa por la membrana, reteniéndose las moléculas de soluto grandes. Otros métodos similares, son la
ultrafiltración por vacío, donde se aplica vacío en el extremo opuesto a la membrana porosa para inducir el paso de la
solución por ella, y la ultrafiltración por presión, en la que se aplica presión a la solución para obligarla a pasar por la
membrana.

Cromatografía de Exclusión Molecular: La cromatografía de exclusión molecular se basa en el tiempo de elución de

una solución a través de una base porosa (como el Sephadex). Las moléculas de alto peso molecular, no pueden
ingresar en los poros y caen por los espacios interparticulares (ya que generalmente las bases usadas vienen en
forma de esferitas) rápidamente. A medida que el peso molecular y el tamaño del soluto disminuye, pueden ingresar
por más y más poros, lo que lentece su escurrimiento. De esta manera, separando las eluciones a partir del tiempo de
escurrimiento, se pueden separar los solutos de acuerdo a su tamaño. Sin embargo, las moléculas alargadas pueden
generar inconvenientes, ya que pueden meterse en poros y no salir, al atascarse en su interior, lo que disminuye la
calidad del método. Se puede utilizar para determinar PM graficando PM vs abs.

Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC): eluyente líquido arrastra a los solutos según su afinidad a través de
un medio sólido útil, con la diferencia de que el eluyente líquido se usa a altas presiones, para facilitar el paso de
solutos muy difícilmente móviles. La ventaja de este método recae en que la separación es casi perfecta ya que
aumenta la cantidad de platos teóricos de separación.

Cromatografía Líquida de Media Presión (FPLC): sigue básicamente el mismo concepto que la HPLC con la diferencia
que se utilizan presiones mucho menores (200 atm en las HPLC, 10 atm en las FPLC). Esto permite utilizar material
menos complejo (como columnas de vidrio, menos contaminables) y conseguir resultados más satisfactorios que en
una LC común.

Cromatografía en Fase Reversa: separación de biomoléculas por su afinidad con el agua, se utiliza una base de
elución hidrofóbica, generalmente núcleos de polímeros con cadenas hidrocarbonadas laterales de tamaño variable.
De esta manera, las moléculas hidrofílicas son las que más rápido se moverán por la columna, mientras que las más
hidrofóbicas serán las mayormente unidas. Una ventaja de este método es que permite el uso de presiones elevadas,
sin deformación del polímero.

Electroforesis en SDS: (dodecilsulfato de sodio) es un agente desnaturalizante y cargado negativamente, que al

saturar una solución proteica con él, carga a las proteínas de manera homogénea, independizando su movilidad
electroforética de la carga, y haciéndola solo dependiente de su tamaño. De esta manera, al colocar las proteínas
tratadas previamente con SDS en una campo eléctrico, éstas migrarán hacia el ánodo (polo positivo), siendo su
relación de frente (Rf) sólo dependiente de su tamaño, ya que poseen la misma carga. Este Rf está relacionado con el
peso molecular de la proteína ya que ln PM = a.Rf + b. Variando la concentración de poliacrilamida se puede obtener
distinto grado de separación. Para ácidos nucleicos se utilizan geles de agarosa.

Centrifugación en gradiente de densidad: Ciertas sustancias permiten generar un gradiente de densidad en

solución acuosa, tales como la sacarosa o el cloruro de cesio. En el caso de la sacarosa, puede generarse mediante
el contacto de una solución saturada y otra diluida de la misma, que luego de unos días difunden lo suficiente para
generar un gradiente de concentración (y por lo tanto de densidad) útil. Si se centrifuga una solución de biomoléculas
en contacto con estos gradientes, éstas difundirán hasta el sector del gradiente que posea una densidad igual a la de
la solución de la proteína en cuestión, observándose platos notables de separación. Luego, mediante la succión y el
análisis espectrofotométrico de cada capa, se pueden determinar e incluso purificar cada una de las secciones
proteicas.

MALDI-TOF: utiliza el mismo principio de separación y análisis que la espectroscopia de masas. Un láser de alta
energía es enfocado hacia la muestra proteica para ionizarla, e inducirla a entrar a un campo magnético que le asigne
una velocidad uniforme, y luego genera una caída libre hasta chocar con una placa fotográfica que indica su
separación según su tamaño y peso molecular.

Separación por carga

Cromatografías Líquidas: cromatografía líquida común y las de alta presión separan fundamentalmente por la carga
de la biomolécula, de acuerdo a su movimiento relativo con eluyentes de polaridad controlada. CROMATOGRAFIA DE
INTERCAMBIO INONICO.

Electroforesis: separa a las proteínas según su relación carga/masa, ya que no solo es importante su carga total para
determinar su movimiento hacia uno y otro polo, sino también su tamaño, íntimamente relacionado con su rozamiento
y dificultad de movimiento. Para eso, se utilizan geles preparados en los que se puede regular el entrecruzamiento
polimérico para evitar una corrida muy rápida (con entrecruzamiento muy lábil) o casi nula (con entrecruzamiento
denso). El más utilizado es el gel de acrilamida/disacrilamida.

Isoelectroenfocado: se basa en el punto isoeléctrico de las proteínas para separarlas entre sí. Para hacerlo, se
depositan en un soporte en el que se generó un gradiente de pH. Las proteínas migrarán hasta encontrar su punto
isoeléctrico. Este método es muy útil, ya que el poder separativo que posee es muy grande, además de representar un
método muy sencillo para la medición del punto isoeléctrico de las proteínas. Igualmente, la separación tan
exhaustiva, muchas veces puede representar un inconveniente, ya que las diferencias apreciables en el corrimiento
pueden deberse a cambios muy importantes en la estructura proteica, como a cambios en un solo aminoácido muy
poco influyente en la función proteica.

Separación por Afinidad

Cromatografías de Afinidad Específica. En estas, el sólido base utilizado para la elución tiene una afinidad específica
con a biomolécula a separar. Por ejemplo, pueden ser enzimas o antígenos, que sirvan para separar reguladores
alostéricos, anticuerpos o biomoléculas con estructura similar a éstos.

Proceso de separación y purificación

La preparación de la muestra: las primeras separaciones (las más burdas), se realizan mediante el fraccionamiento
salino, la diálisis o las ultrafiltraciones. Luego, se aplican técnicas más finas como las cromatografías líquidas y las
electroforesis, y luego, si es posible, otras más específicas aún como los isoelectroenfocados o las cromatografías de
afinidad específica.

Criterios de pureza
Técnicas de purificación
Ciertas técnicas utilizadas en la separación de proteínas permiten obtener muestras casi puras de las mismas. Las
electroforesis son algunas de ellas, fundamentalmente la electroforesis con SDS. No obstante, el SDS separa las
subunidades proteicas, lo que es un gran impedimento del uso de esta técnica con proteínas que poseen una
estructura cuaternaria determinada (la gran mayoría de ellas). Por otra parte, las electroforesis sin SDS también son
útiles como métodos de separación y purificación, pero sus productos son menos puros que los que se obtendrían al
usar SDS, más allá que no produce la destrucción de la estructura cuaternaria. Las cromatografías líquidas de alta
presión (HPLC) también son muy buenas en este sentido, ya que poseen un gran poder separativo.

Determinación del porcentaje de pureza

En el caso de que haya una cantidad considerable de muestra, la técnica más comúnmente utilizada se basa en la
solubilización diferencial de la proteína con sus impurezas (generalmente más solubles). Por lo tanto, graficando la
concentración total de proteínas en función de la masa de muestra agregada, se obtendrá un gráfico lineal con una
pendiente α determinada, que cambia bruscamente a otra recta de pendiente β, mucho menor que α. Esto se debe a
que la primera recta muestra la solubilidad continua de todas las proteínas presentes en la muestra, es decir, la de
interés y las impurezas. Cuando la proteína de interés no se disuelve más, la recta siguiente se debe a la

solubilización de las impurezas. Por lo tanto, . Por otra parte, este método es útil para
purificar proteínas de sus impurezas solubles, ya que el precipitado que se formará al saturar la solución de la proteína
de interés, será solo de ésta, ya que las impurezas solubles se mantendrán en el seno de la solución.

Dosaje de proteínas
Se denomina dosaje de proteínas a los métodos que permiten cuantificar la concentración de una o más proteínas en
una muestra determinada.

Métodos puramente espectrofotométricos

Por absorción en el UV lejano: midiendo la absorbancia de una muestra de proteína a dicha longitud de onda, se
puede obtener una aproximación de la concentración de la proteína, ya que es directamente proporcional a la
concentración de enlaces peptídicos de la muestra. La gran desventaja de este método tan sensible, es su
especificidad, ya que cualquier proteína de la muestra, incluso las impurezas, absorberán a esta longitud de onda, lo
que modificaría (a veces considerablemente) el resultado obtenido.

Por absorción en el ultravioleta: permite cuantificar la concentración de éstos aminoácidos en solución. Vemos que la
especificidad del método aumenta considerablemente, pero, no es útil en proteínas desconocidas, en que no sabemos
la cantidad de aminoácidos aromáticos que hay en cada proteína, es decir disminuye notablemente la sensibilidad.

Métodos Químicos
Método de Kjeldahl: Se basa en la destrucción de los enlaces peptídicos, y la posterior oxidación de los átomos de
nitrógeno en amoníaco, que entrará en equilibrio con su forma protonada, el amonio, que puede cuantificarse
mediante reactivos específicos como el de Nessler. Sabiendo que los átomos de nitrógeno representan
aproximadamente un 16% de la proteína, se puede aproximar su concentración total. No se pueden tener en cuenta
con certeza los nitrógenos no amídicos de la proteína, como los que se encuentran en los grupos laterales de algunos
aminoácidos.

Método de Gornall: reactivo utilizado (Reactivo del Biuret) utiliza sulfato cúprico y un acomplejante (tartrato de sodio o
EDTA) en medio básico en presencia de yoduro de potasio, lo que le confiere un color celeste característico, que
variará en absorbancia proporcionalmente a la concentración de proteína utilizada. (Cuando se calienta la urea a
180C se descompone transformándose en un compuesto llamado “Biuret”, el cual en presencia de Cu2+ en solución
alcalina forma un complejo violáceo. La unión peptídica también reacciona con el Cu2+ en medio alcalino dando
coloración violácea). Se requieren al menos dos enlaces peptídicos para dar positiva esta reacción. El máximo de
absorción del complejo proteína - Biuret se produce a 545 nm. La técnica implica la elaboración de una curva de
calibración con una solución proteica de concentración conocida (por ejemplo, albúmina sérica bovina), llamada
testigo o patrón.
Método de BCA (o Método de Fujimoto): El ácido bicinconínico (BCA), como sal sódica, es un compuesto capaz de
formar un complejo púrpura intenso con iones Cu+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método
analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu++ en medio alcalino
(reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de
proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros
métodos, tales como detergentes y agentes caotrópicos.

Métodos Físicos
Método del Salting Out: se trata la muestra con una sal inerte, generalmente cloruro de sodio o potasio, hasta lograr
su precipitación completa. En este momento, la solución se verá turbia, pudiendo cuantificarse turbidimétricamente su
nivel de turbidez. Éste, a su vez, está relacionado directamente con la concentración de la proteína agregada al primer
momento.

Métodos de Unión a Colorante

Método de Bradford: Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína
desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína standard. El complejo
colorante - proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm. En este caso, se observa una coloración
notablemente azul a pH > 5 (notable absorción en el rojo), mientras que posee una coloración mas amarronada a pH <
5 (notable absorción en el verde azulado). Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones
básicas.

Determinación del peso molecular

Peso molecular mínimo
Muchos métodos de determinación del peso molecular, se basan en la determinación de la proporción de algún
aminoácido específico. Esto es así ya que, si se conoce la concentración de un aminoácido en la muestra, y el peso
molecular de este, se puede estimar la concentración proteica en la misma, siempre y cuando, consideremos que la
proteína posee un solo aminoácido de ese tipo en la estructura. Si tuviera dos, la concentración se reduciría a la
mitad, etc. Al peso molecular obtenido por este método se lo denomina peso molecular mínimo (PMm), y representa el
peso molecular de la proteína en estudio si tuviera solo un aminoácido medido. Como la cantidad de éstos en una
proteína es un número natural, podemos decir que PM = n . PMm, donde n es un número natural igual a la cantidad
de restos aminoácidos cuantificables por proteína. Esta aseveración se cumple para n pequeños, ya que si aumenta
demasiado, son más factibles los errores debido a que las diferencias de peso molecular generadas por aumentar o
disminuir n son menos pronunciadas.

Métodos de determinación del peso molecular

Electroforesis con SDS: se puede correr la muestra incógnita junto con muestras de comparación con pesos
moleculares conocidos, y de ahí, se pueden comparar para aproximar cada vez mejor, el peso molecular de la
muestra incógnita. SDS destruye la estructura cuaternaria de la proteína, por lo que sirve para medir el peso molecular
de cada subunidad y no de la proteína total.

Cromatografía de Exclusión Molecular: se corren en dos columnas separadas la muestra incógnita y muestras
coloreadas de peso molecular conocido. A partir de la comparación entre los Rf, se puede aproximar con la exactitud
deseada, el peso molecular de la proteína.

Ultracentrifugación: Se define al coeficiente de sedimentación (S) como (donde , siendo x el eje de

desplazamiento de la partícula boca-fondo). Nótese que S no depende de la centrífuga en que se efectúa la medición.
Este S, en conjunto con el coeficiente de difusión de la proteína (D), puede dar una buena aproximación de su peso
molecular. No obstante, se cumple ésta para proteínas esféricas, ya que al cambiar la forma de éstas, el resultado se
altera.
Equilibrio de Sedimentación: se utiliza una velocidad angular lo suficientemente pequeña como para que el rango de la
fuerza de sedimentación se asimile al de la fuerza de difusión. Por lo tanto, se llegará a un x en que ambas se igualen
y la proteína se mantenga estable. Realizando esta medición con dos proteínas de peso molecular conocido, y
comparando sus desplazamientos relativos, se puede aproximar el peso molecular de la proteína incógnita.

Tema 6: Enzimología I: Introducción

Generalidades de las enzimas
Las enzimas (“en levadura”) son catalizadores biológicos, es decir, aumentan la velocidad de una reacción bioquímica
sin alterar su realidad termodinámica, sólo disminuyendo su energía de activación por diversos mecanismos, y sin
modificarse en el proceso, su acción permite conservar eficazmente la energía implicada en los procesos
metabólicos, mediante la regulación del medio que pueden sufrir. Por otra parte, permiten el acoplamiento de
reacciones de manera eficaz, utilizado generalmente para obtener energía para una reacción endergónica, mediante
el acoplamiento con otra reacción exergónica.

Propiedades: Las enzimas son casi todas proteínas (existen también las ribozimas, o enzimas ribonucleotídicas,
hebras de RNA). Su intervención en la catálisis las hace elevar de 105 a 1017 la velocidad de las reacciones
bioquímicas que catalizan, esto sucede fundamentalmente por el hecho de que poseen una región en su estructura
terciaria denominada sitio activo, pequeño, en el cual, sus aminoácidos (generalmente de distintas ubicaciones en la
cadena polipeptídica, y en una cantidad no mayor a doce) se acomodan de manera tal que elevan la reactividad de los
reactivos implicados. Es importante destacar que solo dos o tres de los restos aminoácidos presentes en el sitio activo
son los responsables de la catálisis, uniendo reversiblemente al sustrato..

Especificidad
La presencia del sitio activo, otorga además la especificidad característica de las enzimas. Fischer o del molde, que
asegura que el sustrato se une al sitio activo como un sistema llave/cerradura, mientras que la segunda, de Koshland
o del ajuste inducido, afirma que la unión enzima-sustrato genera un cambio conformacional enzimático que favorece
la unión y la estabiliza, por lo que el sitio activo debe ser una disposición espacial precisa de grupos R no
necesariamente ordenada de manera constante. Por otra parte, todos los demás aminoácidos juegan un papel
fundamental, ya que mantienen no solo la estructura ternaria adecuada necesaria para el funcionamiento enzimático,
sino también, modifican el medio interno de la enzima, haciendo variar notablemente algunas características
enzimáticas, peptídicas y aminoacídicas, tales como el pH, o la hidrofobicidad.

Inalteración: Las enzimas no se ven modificadas luego de completar su catálisis bioquímica. Esto permite el concepto
de ciclo catalítico, es decir, la reutilización de la enzima luego de completar la catálisis de una reacción, para catalizar
otra igual. También se denominan ciclos de recambio o de turn over. Para cuantificarlos, se crean los números de
recambio, que son la cantidad de ciclos que cataliza una enzima por unidad de tiempo.

Nomenclatura
Las enzimas generalmente se nombran por nombres comunes, que especifican su sustrato o la reacción que cataliza,
más la terminación –asa. Sin embargo, la mayoría de las enzimas proteolíticas (su sustrato son otras proteínas), se
nombran mediante la terminación –ína, y una raíz de fantasía o que indique su origen. Las enzimas están
acompañadas en muchos casos, por otras especies colaboradoras que son imprescindibles para que realice su
función. Entre ellas encontramos: cofactores (generalmente iones metálicos), coenzimas (compuestos orgánicos de
unión débil) y grupos prostéticos (de unión fuerte). Se denomina apoenzima a la enzima sin éstos, mientras que
cuando se une a ellos, se la llama holoenzima.

Clasificación: la IUPAC propone un sistema de nomenclatura, generalmente llamado “sistema EC”, donde cada una
de ellas tiene asignado un nombre del tipo “EC a.b.c.d”, donde a, b, c y d, son números.
El número a: “de clase”, y puede ser un número natural de 1 a 6. Este corresponde a cada uno de los seis tipos
enzimáticos generales previamente conocidos.

a Grupo Ejemplos
1 Oxidoreductasas Oxigenasas, deshidrogenasas, reductasas, etc.
2 Transferasas Fosfotransferasas, metiltransferasas, etc.
3 Hidrolasas Fosfatasas, peptidasas, etc.
4 Liasas (sobre enlaces múltiples) Decarboxilasas, etc.
5 Isomerasas Epimerasas, racemasas, etc.
6 Ligasas Sintetasas, ligasas, etc.

Los otros números: El número b indica la subclase, generalmente, relacionada con el grupo donante en la reacción
catalizada. El número c indica la subsubclase, relacionada con la especie receptora del grupo.

Cinética Enzimática
Es la rama de la enzimología que trata los factores que afectan a la velocidad de las reacciones catalizadas
enzimáticamente. Entre ellos encontramos: concentración de la enzima y el sustrato, presencia de inhibidores,
activadores y productos, pH, fuerza iónica, temperatura, etc. Mediante su estudio, se pueden obtener datos
importantes sobre la actividad enzimática, fundamentalmente el mecanismo cinético de la reacción, la forma de
regulación in vivo, el estudio de la conformación y las características del sitio activo, etc.

Relación termodinámica-cinética
Podemos definir a la velocidad de una reacción bioquímica como la variación de la concentración de sustrato o de
producto en un período infinitesimal de tiempo.

. Suponiendo que las reacciones son de orden uno, donde k es una constante de
velocidad, dependiente de la reacción analizada y la temperatura. . Llamando k1 a la constante de
velocidad que rige la reacción directa, y k-1 a la que rige la inversa, podemos asegurar que cuando la reacción alcance

el equilibrio, .

Las enzimas, actúan modificando las constantes de velocidad pero sin modificar su constante de equilibrio, es decir,
aumentando ambas constantes de equilibrio, sin modificar su cociente relativo. De esta manera, las reacciones cursan
más rápidamente, sin alterar su posición de equilibrio.

Dependencia de la velocidad con la concentración de sustrato

Si graficamos la concentración de producto en función del tiempo, podemos observar una gráfica del tipo hiperbólico,
en el que a tiempos bajos, la pendiente es muy elevada, y va disminuyendo a medida que sube. A medida que
aumentamos la concentración de enzima en el medio, la concentración máxima de producto es la misma, pero se
alcanza más rápidamente. Ahora, si mantenemos la cantidad de sustrato constante, la velocidad de la reacción no
variará. Sin embargo, si la aumentamos, la velocidad también aumentará, hasta alcanzar un máximo, llamado
genéricamente Vmax. El problema, es que las velocidades varían en el tiempo, por lo que se debe fijar un momento en
el proceso para poder calcular Vmáx. Aprovechando que a medida que el tiempo tiende a cero, la relación [P] vs t se
hace lineal, se utilizan siempre velocidades iniciales para aplicar los conceptos de cinética enzimática. La utilización
de las velocidades iniciales, además, elimina los factores interferentes en el proceso de catálisis. Por ejemplo, la baja
cantidad de producto hace casi nula la influencia de las reacciones inversas. No hace falta decir, que las mediciones
se realizan a pH y temperatura constantes, para eliminar su influencia en la cinética.

Métodos de medición de la actividad enzimática

Para medir la actividad enzimática, debemos obtener la concentración de producto (o sustrato) reaccionante en
función del tiempo. Para hacerlo, podemos contar con métodos continuos o discontinuos, de medición.

Procesos continuos de medición de velocidad

Se basan en características del sistema basados en el nivel molecular, y que varían de manera continua a medida que
la reacción transcurre, pudiendo medirse de manera eficaz mientras sucede. Entre ellos:
(a) Espectrofotometría: algunos pares típicos producto-sustrato (como el NAD+/NADH, o el malato/fumarato) poseen
características espectrofotométricas opuestas, es decir, a una determina longitud de onda, uno absorbe radiación y el
otro no. De este modo, el aumento (o disminución) de la absorbancia se puede relacionar directamente (y
continuamente) con la variación de concentración.
(b) Fluorometría
(c) Manometría: si alguno de los productos o sustratos, es un gas.
(d) Potenciometría: si la reacción genera o consume protones, el pH del medio puede utilizarse para seguirla
continuamente.
(e) Polarografía: si el producto o el sustrato modifica la rotación específica del plano de la luz polarizada, midiéndolo,
podemos seguir la reacción.

Procesos discontinuos de medición de velocidad

Se basan en la medición fisicoquímica de ciertas características del medio de reacción al cortarla en un momento
determinado. Puede realizarse de dos maneras: iniciando varias reacciones al mismo tiempo, y deteniendo cada una
en un momento determinado, o, iniciando solo una, y retirando alícuotas en los tiempos de interés.

Otros procesos de medición

También se pueden utilizar ensayos acoplados, es decir, reacciones específicas que pueden seguirse mediante
métodos generalmente continuos, y que usan como sustrato al producto de la reacción en estudio. Para que puedan
utilizarse, las reacciones implicadas deben ser irreversibles, y la enzima que genera el producto medible, debe estar
en exceso, con toda coenzima necesaria para que funcione, también en exceso, y a su temperatura y pH óptimo (por
lo que deben ser iguales a los de la enzima en estudio).

Cinética de un sustrato
La reacción más sencilla catalizada enzimáticamente implica que un único sustrato dé lugar a un único producto (Uni-
Uni). Podemos representar este mecanismo como , donde ES y EP son denominados
complejos centrales. Para el trabajo teórico, se utilizan dos aproximaciones que se cumplen (o pueden hacerse
cumplir) en la mayoría de los casos, la eliminación del complejo central EP, y el trabajo con velocidades iniciales (se
consume menos del 5% del sustrato inicial) para hacer a la reacción inversa insignificante. De acuerdo a esto, la

reacción se resume a .

Concentración de enzima
Normalmente, la velocidad de la reacción aumenta proporcionalmente a la concentración de enzima en el medio. No
obstante, existen variaciones al respecto.En algunos casos, se observa una velocidad más baja de lo normal, a bajas
concentraciones de enzima, que lentamente se igualan a las esperadas. Esto puede deberse a la presencia de
activadores en el medio, agregados a medida que crece la concentración de enzima. De este modo, la velocidad
enzimática específica aumenta. Otra causa probable, es la autoactivación enzimática por polimerización, es decir, a
medida que aumenta la concentración de enzima en el medio, polimeriza con otras subunidades, aumentando así la
actividad específica del grupo. En otros casos, se observa una velocidad que disminuye a altas concentraciones de
enzima. Esto se puede deber a limitaciones del método de medida como a la fuerza iónica en el medio que generan
las propias enzimas pudiendo afectarlos. Otras causas, pueden ser la medición de velocidades no iniciales (lo que
permitiría la acción de inhibidores), el agregado de inhibidores al medio o una disminución de la actividad catalítica de
polímeros enzimáticos en comparación con sus subunidades.

Concentración de sustrato
Si observamos el comportamiento de la velocidad en función de la concentración de sustrato, observaremos una
hipérbola creciente, cuya asíntota horizontal es la ya nombrada Vmax. Esto muestra la saturación de la enzima, es
decir, a medida que se aumenta la concentración de sustrato, la velocidad alcanzada por el sistema se mantiene casi
constante, ya que toda enzima tiene su sitio activo ocupado. Una enzima será mas activa cuanto mayor sea su Vmáx y
cuanto más rápidamente la alcance. Para deducir la ecuación de velocidad, se pueden utilizar dos desarrollos: el de
equilibrio rápido (que asegura que la formación de ES a partir de E y S se dan más rápidamente de lo que ES puede
comenzar a formar producto) o el del estado estacionario (que asegura que la cantidad de ES en el medio se
mantiene constante en el tiempo, es decir, la velocidad de formación a partir de E y S es igual a la de consumición
para formar P y S nuevamente).

Ecuación de velocidad por equilibrio rápido

Como el único equilibrio que se considera es el que relaciona E y S con ES, podemos asegurar que la velocidad de
formación del complejo es igual a la de disociación, cuando se alcanza el equilibrio, así,

. Si toda la enzima forma complejo ES, la

velocidad de catálisis será máxima, por lo que . Además, podemos asimilar a

como una constante de equilibrio, particularmente, la de disociación del complejo ES; nombrándola ,

podemos llega a que , conocida como ecuación de Henri-Michaelis-Menten.

El equilibrio rápido no es un estado imposible. In Vitro puede lograrse simplemente elevando considerablemente la
concentración de sustrato por encima de la de enzima, lo que generará una rápida formación del complejo ES,
comparada con la de producto. Sin embargo, in vivo, esto puede reemplazarse por una constante reposición del
sustrato utilizado en las reacciones bioquímicas continuas.

Ecuación de velocidad para el estado estacionario

En este caso, la disociación del complejo ES también se debe a la formación de producto. Así,

Definiendo , obtenemos que , análoga a la obtenida para equilibrio rápido, solo

con modificación de las constantes de velocidad. Nótese que . La constante de Michaelis (Km) es una
constante dinámica (o de pseudoequilibrio), ya que expresa la relación entre las concentraciones reales del estado

estacionario .

Determinación de los parámetros cinéticos

Supongamos que , reemplazando en cualquiera de las ecuaciones anteriores, vemos que , es

decir, podemos imaginar a la Km como la concentración de sustrato a la que la velocidad de la reacción es igual a la
mitad de la velocidad máxima. Por lo tanto, mientras más pequeña sea, más afín es la enzima por el sustrato, ya que
se necesita menos sustrato en el medio para llegar a la mitad de la Vmax. Por otra parte, la Km también establece un
valor aproximado del nivel intracelular del sustrato. Es poco probable que éste sea mayor o menor, ya que si es
menor, pequeños cambios en [S] generarían cambios marcados pero la velocidad total sería demasiado baja,
comparada con la potencial. Si es mayor, se desperdiciaría sustrato, ya que variaciones muy grandes de su
concentración generarían pequeñas variaciones de la velocidad, y, además, se pierde capacidad de regulación, ya
que la velocidad requeriría grandes cambios en S para variar.

Gráfica v vs [S]
Si graficamos la velocidad en función de la velocidad de sustrato, vemos que efectivamente, la ley sigue una relación

hiperbólica. Cuando [S] tiende a cero, , es decir se acerca linealmente a origen, por lo tanto, sigue una

cinética de primer orden. Cuando [S] tiende a infinito, , es decir, se acerca asintóticamente a Vmax, siguiendo
una cinética de orden cero.

La constante de recambio
La constante de velocidad kp se denomina constante de recambio o constante catalítica, y expresa la cantidad de
sustrato formado por unidad de tiempo por la cantidad de sitios activos de la enzima presentes. Si hacemos la inversa
de ésta, obtendremos el tiempo de recambio, es decir, el tiempo que tarda un ciclo catalítico.

Métodos de representación de los datos de cinéticas enzimáticas

Como v vs [S] es una hipérbola, es difícil determinar los parámetros cinéticos a partir de ella, y obtenerla
estadísticamente a partir de los datos proporcionados por mediciones directas. Por esto, para facilitar la determinación
de los parámetros cinéticos y para obtener de manera más fiel el grado de error generado por la dispersión, se busca
linealizarla mediante transformaciones matemáticas. El inconveniente recae en la propagación de errores que
acarrean algunas operaciones, como por ejemplo, la búsqueda de inversas.
3.1. Representación de Lineweaver-Burk
La gráfica de Lineweaver-Burk o de la doble recíproca, reestructura la ecuación de Henri-Michaelis-Menten por

inversión. De este modo, obtenemos , por lo que obtendremos Vmax de la ordenada al origen y Km
de la pendiente (positiva) o de la abscisa al origen. No obstante, es el método menos confiable, ya que al invertir las
velocidades, el error se propaga rápidamente. Para evitarlo, se usan valores cercanos al Km. Si los valores son muy
grandes, la recta será prácticamente horizontal, mientras que si son muy pequeños, será casi vertical.

3.2. Representación de Hanes-Woolf

La gráfica de Hanes-Woolf se obtiene multiplicando por [S] a la de Lineweaver-Burk, obteniendo así

. De aquí que podamos graficar en función de , para obtener una recta de pendiente
y abscisa al origen igual a – Km. Posee las mismas dificultades que Lineweaver-Burk.

3.3. Representación de Woolf-Augustinsson-Hofstee

Se basa en la reestructuración de la ecuación de Michaelis-Menten para obtener una relación en función de .

Así, llegamos a , expresión que posee dos ventajas: la velocidad se encuentra en ambas
variables, por lo que los errores son disminuidos notablemente, y, además, los valores de los parámetros cinéticos se
obtienen directamente de la pendiente y la ordenada al origen, por lo que los coeficientes de error estadístico, pueden
relacionarse directamente con ellos.

Ecuación Integrada de Henri-Michaelis-Menten

En este caso, se puede recurrir a la Ecuación Integrada de Henri-Michaelis-Menten, que permite calcular Vmax y Km
simplemente midiendo la cantidad de sustrato o producto reaccionante.

Como

Inhibición enzimática
Se denomina inhibidor a cualquier sustancia que reduzca la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente. Es
uno de los mecanismos de regulación más importantes de las células, fundamentalmente en el caso de la
retroinhibición, es decir, cuando los productos de una vía metabólica inhiben a alguna enzima participante de ésta.

Clasificación
El primero se relaciona con su reversibilidad, es decir, si la unión entre la enzima y el inhibidor es eterna o no. En el
caso de que sí lo sea, llamaremos a la inhibición irreversible, mientras que si no lo es, reversible. Las inhibiciones
reversibles, a su vez, pueden subdividirse de acuerdo a la capacidad de los complejos enzimáticos unidos a inhibidor,
para dar producto. Si son capaces de formarlo, se denominan parciales, mientras que si no, totales. Las inhibiciones
más comunes, son las reversibles totales, ya que son las más fácilmente modelizables, y las que ofrecen resultados
matemáticos más sencillos.

Inhibiciones reversibles totales comunes

Inhibición competitiva: Un inhibidor competitivo es una sustancia que se combina con la enzima libre de forma que
impide la unión al sustrato, es decir, ambos se excluyen mutuamente.Existen varias causas moleculares que explican
la inhibición competitiva. Entre ellas podemos nombrar: La competencia por el mismo sitio activo, El inhibidor genera
impedimento estérico para el sustrato, más allá que no compartan el sitio activo, Competencia por un grupo de unión
común, más allá que no sea el único sitio de unión ni del sustrato ni del inhibidor a la enzima, Solapamiento de sitios
de unión diferentes, Cambio conformacional del sitio activo del sustrato por unión del inhibidor.

Nótese que es un inhibición reversible (el complejo EI puede separarse) y total (el complejo EI

no genera producto). Las constantes de disociación involucradas son y

La concentración analítica de enzima en la solución, será

Como .

A se lo denomina Km aparente, y a medida que la concentración de inhibidor en el medio sea mayor,

es más grande que Km, es decir, parecería que se disminuye la afinidad de la enzima por su sustrato ya que una parte
de la enzima está formando el complejo EI, sin embargo, esto no es cierto, sino que el factor de transformación de la
Km solo es un factor estadístico, que se relaciona con la repartición de la enzima para formar tanto el complejo ES
como el EI. Por otra parte, la velocidad alcanzada por el sistema, puede igualarse a la que tendría este en ausencia
del inhibidor, simplemente aumentando la concentración de sustrato, para igualar la concentración del complejo ES
que, al fin de cuentas, es el responsable de la velocidad de la catálisis enzimática. Por lo tanto, Vmax no se modifica.

Representaciones de los parámetros enzimáticos

Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

, por la que podremos obtener el Vmax y la Km-ap como las recíprocas de la ordenada al origen y
la abscisa al origen respectivamente. Estas rectas se acercarán más al origen a medida que aumentemos la
concentración de inhibidor. Esto sucede porque la pendiente de las rectas depende de ella (formando parte de la Km-
ap). Por eso, realizando gráficos secundarios, podemos obtener otros parámetros cinéticos útiles, como por ejemplo, la

Ki.

(a) Si graficásemos la pendiente de las rectas antes nombradas en función de la concentración de inhibidor,

obtendríamos la ley , donde Ki es el opuesto de la abscisa al origen.

(b) Por otra parte, si graficásemos la Km-ap en función de la concentración de inhibidor, obtendríamos la recta

, donde nuevamente la Ki será la abscisa al origen.

(c) Dixon propone la representación de 1/v en función de [I]. Esta se obtiene reemplazando la Kmap en la
representación inversa, por su definición, y agrupando los grupos que dependen de [I]. De esta manera, se consigue

, por la cual, se graficará un haz de rectas que se intersecan en un punto del

segundo cuadrante, representado como (-Ki;Vmax-1).

Inhibición no competitiva
Un inhibidor no competitivo no tiene efectos sobre la unión al sustrato, es decir, se puede unir independientemente a E
o ES, y S se puede unir a E o EI. No obstante, el complejo ESI resultante, no tiene actividad catalítica. Se cree que I
impide la conformación adecuada del centro catalítico.

De éste, vemos que por más que aumentemos la cantidad de sustrato, siempre una parte de
la enzima quedará en forma de ESI, por lo tanto, no tendrá actividad catalítica, y disminuirá
la velocidad de la reacción, y la Vmax. No obstante, la afinidad de la enzima por el sustrato no
varía, ya sea estando en forma de E o de EI, por lo que la Km no sufrirá modificaciones.

Las constantes de disociación involucradas son y . La

concentración analítica de enzima en la solución, será

Como

A se lo denomina Vmax aparente, y a medida que la concentración de inhibidor en el medio sea

mayor, es más pequeña que Vmax.
Representaciones de los parámetros enzimáticos
Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

, por la que podremos obtener el Vmax-ap y la Km como las recíprocas de la

ordenada al origen y la abscisa al origen respectivamente. Estas rectas se alejarán más al origen (disminuirán su
ordenada al origen) a medida que aumentemos la concentración de inhibidor. Esto sucede porque la pendiente de las
rectas depende de ella (formando parte de la Vmax-ap). Por otra parte, la abscisa al origen se mantiene constante (-1/Km)
Por eso, realizando gráficos secundarios, podemos obtener otros parámetros cinéticos útiles, como por ejemplo, la Ki.

(a) Si graficásemos la pendiente de las rectas antes nombradas en función de la concentración de inhibidor,

obtendríamos la ley , donde Ki es el opuesto de la abscisa al origen.

(b) Por otra parte, Dixon propone la representación de 1/v en función de [I]. De esta manera, se consigue

, por la cual, se graficará un haz de rectas que se intersecan en un punto del eje
1/[S], correspondiente a –Ki.

Inhibición acompetitiva
Un inhibidor acompetitivo es un compuesto que se une reversiblemente al complejo ES, dando un complejo ESI
inactivo catalíticamente. No se une a la enzima libre. Es un mecanismo corriente en sistemas multireactivos, donde
probablemente el inhibidor pueda unirse solo después de que lo haga el sustrato.
De éste, vemos que para cualquier concentración de inhibidor, por más grande que sea la
concentración de sustrato, una parte del complejo ES se inactivará como ESI. Por lo tanto, la
Vmax disminuirá con respecto al equilibrio sin inhibidor. Por otra parte, el equilibrio entre ES y
ESI, consume ES, lo que hace tender al equilibrio entre E y ES hacia productos, por lo que
podemos suponer que la afinidad enzimática se ve aumentada, y Km también disminuirá. Las

constantes de disociación involucradas son y .

La concentración analítica de enzima en la solución, será

. Como
Nótese que en este caso, la Km aparente es menor que la Km, a diferencia de la de los inhibidores competitivos.

Representaciones de los parámetros enzimáticos

Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

, por la que podremos obtener el Vmax-ap y la Km como las recíprocas de la ordenada al

origen y la abscisa al origen respectivamente. Estas rectas serán paralelas, ya que la pendiente de la misma no
depende de [I]. No obstante, a altas [I], las rectas se alejan del origen. Por eso, realizando gráficos secundarios,
podemos obtener otros parámetros cinéticos útiles, como por ejemplo, la Ki.

(a) Si graficásemos la ordenada al origen de las rectas antes nombradas en función de la concentración de inhibidor,

obtendríamos la ley , donde Ki es el opuesto de la abscisa al origen.

(b) Por otra parte, Dixon propone la representación de 1/v en función de [I]. De esta manera, se consigue

, por la cual, se graficará un haz de rectas paralelas que se intersecan en 1/Vmax-ap

con el eje de las ordenadas, y con -1/Ki en el de las abscisas.

Inhibición mixta
Un inhibidor mixto se puede unir tanto a la enzima libre como al complejo ES pero con distinta afinidad. Por lo tanto,
podemos considerar a la Ki de la unión entre el inhibidor y el complejo ES como α.Ki, siendo ésta la correspondiente a
la unión entre I y E. Por lo tanto, para mantener la Keq total constante, la KS de unión entre el complejo EI y S, también
deberá multiplicarse por α. α puede tomar valores mayores o menores que 1. Si fuese 1, estaríamos en un caso de
inhibición no competitiva.

Las constantes de disociación involucradas son , ,

y .
La concentración analítica de enzima en la solución, será

Representaciones de los parámetros enzimáticos

Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

, por lo que si graficamos las rectas generadas, obtendremos un haz

intersectante en el segundo o tercer cuadrante dependiendo de si α es mayor o menor a uno respectivamente. A
pesar de ello, las coordenadas de este punto, siempre serán (-1/αKm;β/Vmax), donde β = (α-1)/α. Por eso, realizando
gráficos secundarios, podemos obtener otros parámetros cinéticos útiles, como por ejemplo, la Ki.

(a) Si graficásemos la pendiente de las rectas antes nombradas en función de la concentración de inhibidor,

obtendríamos la ley , donde Ki es el opuesto de la abscisa al origen.

Inhibición irreversible
Un inhibidor irreversible se une a la enzima mediante un enlace covalente, modificándola y haciéndola perder
actividad. La Vmax disminuye, ya que parte de la enzima se elimina del sistema.

Activadores
Un activador es un compuesto que aumenta la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente, ya que elevan
la actividad enzimática. Se clasifican en esenciales y no esenciales, dependiendo de si su ausencia bloquea la
reacción o simplemente, disminuye la velocidad.

Activadores esenciales de unión a enzima: Este tipo de activador se une a la enzima para generar la reacción. De
este modo, sigue el siguiente mecanismo: .
Las constantes de disociación involucradas son y . La concentración analítica de
enzima en la solución, será

Como

A se la denomina Km aparente.

Representaciones de los parámetros enzimáticos

Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

, generando rectas cuya abscisa al origen será -1/Km-ap. Por eso, realizando gráficos
secundarios, podemos obtener otros parámetros cinéticos útiles, como por ejemplo, la KA.

(a) Si graficásemos la pendiente de las rectas antes nombradas en función de la inversa de la concentración de

inhibidor, obtendríamos la ley , donde KA es el opuesto de la abscisa al origen.

Activadores esenciales de unión a complejo ES

Este tipo de activador se une al complejo enzima-sustrato para generar la reacción. De este modo, sigue el siguiente
mecanismo: . Las constantes de disociación

involucradas son y . Luego del desarrollo analítico, obtenemos

. De aquí vemos que tanto Vmax como Km son modificadas.

Si graficamos la velocidad de la reacción en función de la

concentración de activador, vemos que sigue un comportamiento
parabólico, con una velocidad máxima a una determinada
concentración de activador, siendo que a mayores concentraciones que
esta, actúa como inhibidor.

Activadores esenciales de unión a la enzima y al complejo ES

Este tipo de activador se une al complejo enzima-sustrato y a la enzima para generar la reacción. De este modo, sigue
el siguiente mecanismo:

Las constantes de disociación involucradas son , , y .

La concentración analítica de enzima en la solución, será

Realizando la linealización de Lineweaver-Burk, obtendremos haces de rectas que se intersectaran en el segundo o

tercer cuadrante (según α sea menor o mayor que uno respectivamente), cuyas coordenadas serán (-1/Km;(1-α)/Vmax).

Activadores de sustrato
Un activador de sustrato es un activador que se une al sustrato para volverlo activo, y no sobre la enzima o el
complejo enzima-sustrato.

Las constantes de disociación involucradas son , .

La concentración analítica de enzima en la solución, será

Llamando a como Km aparente, podemos obtenerla como el opuesto de la abscisa al origen de la

linealización de Lineweaver-Burk.

Efecto del pH
El pH afecta notablemente la capacidad catalítica de las enzimas, ya que los sitios activos de éstas se componen de
grupos ionizables que deben encontrarse en la forma iónica adecuada para mantener la conformación útil de unión a
sustratos, o para los mecanismos de catálisis ácido-base. Por otro lado, en algunas ocasiones los sustratos también
son ionizables, por lo que necesitan un pH en el medio capaz de generar la forma iónica útil para la acción catalítica.
 Estabilidad vs ionización.
Toda enzima posee un pH óptimo, en el que la velocidad de catálisis es máxima; sin embargo, a pH mayor o menor, la
velocidad disminuye. La causa mas común de esta disminución es la formación de una forma iónica incorrecta de la
enzima, del sustrato o de ambos. Aunque, a pH muy altos o bajos, la enzima es inestable, es decir, se desnaturaliza
irreversible. Para comparar los efectos de la estabilidad con los de la deformación iónica, se realiza un ensayo de
estabilidad, es decir, se preincuba a la enzima por un tiempo mayor o igual al de reacción, a distintos pH. Luego, se la
vuelve a llevar a su pH óptimo y se mide su actividad. Si graficamos ésta en función del pH de preincubación,
obtendremos un gráfico con una zona aproximadamente constante en un rango de pH determinado. Podemos
asegurar, que en este, la enzima es estable, mientras que fuera de éste, sufre desnaturalización por pH. Luego,
graficando actividad de la enzima (sin preincubación) en función del pH, y observando el gráfico en forma de campana
obtenido, podremos discriminar los rangos de pH en que la disminución de actividad se deben a la desnaturalización
enzimática, de los que se deben a un cambio conformacional y/o iónico.

Ionización enzimática inespecífica

Supongamos una enzima E activa en su forma protonada EH, pero con la posibilidad de diprotonarse (EH2+) o de
deprotonarse (E-), no poseyendo actividad en ninguno de estos dos casos.

, , , y .

La concentración analítica de enzima en la solución, será

Ionización enzimática
Si la única especie capaz de protonarse es la enzima (y no el complejo enzima sustrato), la expresión anterior se

simplifica, ya que no existirán ni KeS1 ni KeS2. De este modo, .

La Vmax no variará de acuerdo al pH, pero sí lo hará la Km aparente. Graficando ésta en función del pH obtendremos
una gráfica aproximadamente parabólica de coeficiente principal positivo.
Como

Por

lo tanto, resolviendo el sistema de ecuaciones, ambos se igualarán cuando . Graficando pKm-ap en

función del pH, observaremos una zona lineal de pendiente positiva (e igual a 1) para pH bajo, y otra de pendiente
negativa (e igual a -1) para pH alto, que llegarán a un máximo casi constante al pH óptimo antes calculado.

Ionización del complejo enzima-sustrato

Si sólo se puede ionizar el complejo enzima-sustrato (y no la enzima libre), no existirán los equilibrios regidos por Ke1 y

por Ke2. De este modo, . De aquí vemos que tanto la Vmax como la Km se modifican
por el pH.

Si graficamos la Vmax-ap en función del pH, obtendremos una

log Vmax- gráfica en forma de pico, centrada en el pH óptimo, que decrece
ap hacia los extremos de pH en forma hiperbólica. Podemos obtener
pKeS1 y pKeS2 como las abscisas de las intersecciones entre la
log Vmax gráfica con Vmax/2, donde Vmax es la ordenada del pH óptimo, es
decir, el máximo de la función.

Por otra parte, podemos graficar el log Vmax-ap (o log Km-ap) en

función del pH, que siguiendo el mismo pensamiento que en el
caso 1.4., dará dos rectas, una creciente, y otra decreciente, que
generarán un pico máximo en el pH óptimo (nótese que se usa el
logaritmo y no la función p, ya que la variación surge en el
pKeS1pH opt pKeS2 pH denominador, lo que haría surgir un factor -1 en el logaritmo). De
esta gráfica podemos obtener pKeS1 y pKeS2 como la abscisa de la
intersección entre la proyección de estas rectas sobre una constante en log Vmax.

Efecto de la Temperatura
Muchas reacciones químicas transcurren a una velocidad mayor si la temperatura aumenta, ya que ésta otorga más
energía cinética a las moléculas de reactivo dando más colisiones eficaces en el tiempo. La cinética enzimática sigue
el mismo principio hasta que la temperatura interfiera con la estructura proteica, rompiendo los débiles enlaces que la
mantienen y desnaturalizándose, para perder completamente la actividad catalítica. De este modo, si graficamos la
velocidad de catálisis en función de la temperatura obtendríamos nuevamente una gráfica en forma de pico,
correspondiente éste a una “temperatura óptima”. Para la aplicación, se siguen los mismos pasos que para determinar
el pH óptimo, es decir, realizar un ensayo de estabilidad preincubando a la enzima un tiempo determinado (mayor o
igual al de la duración del ensayo) a distintas temperaturas, para después regresarla a su temperatura óptima y
observar si existe o no desnaturalización. Las enzimas son estables generalmente a temperaturas bajas, por lo que
los gráficos de estabilidad no son en forma de “meseta”, sino que a temperaturas bajas no se observan caídas de
velocidad.

Ecuación de Arrhenius

La ecuación de Arrhenius relaciona la constante de velocidad de una reacción y su energía de activación. .

A es una constante dependiente de cada reacción, lo que dificulta la utilización directa de esta expresión.

Para solucionarlo, se aplica logaritmos a ambos lados de la ecuación, en dos pares k-T distintos y obtendremos

, es decir, si representamos ln k en función de 1/T, conseguiremos una recta de pendiente

negativa. En cinética enzimática, la utilización de esta linealización no siempre es posible, ya que todas las constantes
de velocidad utilizadas (kp, Km, etc.), varían con la temperatura de manera aleatoria, lo que impide obtener
linealizaciones buenas. No obstante, en intervalos cortos de temperatura, sí se observarán linealizaciones útiles, e
incluso, algunos casos representativos: (a) Si la representación presenta un pico agudo entre dos rectas, existe un
cambio de proceso enzimático limitante, ya que la Vmax depende de dos kp distintas, (b) Si la representación disminuye
bruscamente a 1/T bajas (T altas), existe desnaturalización proteica.

2.2. El factor Q10

Se denomina factor Q10 al factor en que aumenta la velocidad al incrementarse 10º C (o 10 K) la temperatura de
reacción. Si partimos de la ecuación de Arrhenius integrada,

Tema 10: Enzimología V: Cinética Enzimática de 2 sustratos

Sistemas Bi-Bi
La mayoría de las enzimas catalizan reacciones entre dos o más sustratos, generando dos o más productos. No
obstante, se puede estudiar su acción como un sistema unisustrato transformando la Km real en una Km aparente que
varíe al variar las concentraciones de cosustrato. Para conocer las verdaderas Km y Vmax de un reactivo participante de
un sistema de más de un reactivo, debemos saturar a los otros. Lo mismo sucede al estudiar la inhibición.

Clasificación
Supongamos un sistema típico Bi-Bi que catalice la reacción . La catálisis enzimática de éste, puede
seguir dos mecanismos: secuencial y ping pong.
Los mecanismos secuenciales aseguran que primero se une a la enzima uno de los sustratos, luego el otro, y el
complejo EAB formado será capaz de producir P y Q. Podemos clasificarlos a su vez en al azar (cualquiera de los dos
sustratos puede entrar primero) u ordenados (un sustrato determinado entra primero).
Lo mecanismos ping pong aseguran que la unión de uno de los sustratos genera un cambio conformacional en la
enzima que permite la producción de uno de los productos y la unión del otro sustrato, que vuelve a la enzima a su
forma primitiva, generando Q, y pudiendo nuevamente unir al primero.

Cinética de los mecanismos Bi-Bi

Mecanismo secuencial al azar
Las constantes de disociación involucradas son , , y .

La concentración analítica de enzima en la solución, será

Representaciones de los parámetros enzimáticos

Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

. Si elegimos a A como el sustrato sobre el que aplicar la

linealización, . Vemos que en las rectas obtenidas, tanto su

ordenada al origen como su pendiente varían con la concentración del otro sustrato. No obstante, generan un haz de
rectas que se cortan en un punto del segundo o tercer cuadrante (según α sea menor o mayor a uno), cuyas

coordenadas son .

Para obtener KB recurrimos a los gráficos secundarios:

(a) Si graficamos la ordenada al origen en función de 1/[B], , por lo que podemos obtener αKB
como el opuesto del inverso de la abscisa al origen.

(b) Si graficamos la pendiente en función de 1/[B], , por lo que podemos obtener αKb
nuevamente como el opuesto del inverso de la abscisa al origen.
Mecanismo secuencial ordenado

Las constantes de disociación involucradas son y .

La concentración analítica de enzima en la solución, será

Como

Representaciones de los parámetros enzimáticos

Si realizamos la linealización de Lineweaver-Burk (o de la doble recíproca), obtendremos la siguiente ley

(I) Si elegimos a A como el sustrato sobre el que aplicar la linealización,

. Vemos que en las rectas obtenidas, tanto su ordenada al origen como

su pendiente varían con la concentración del otro sustrato.

No obstante, generan un haz de rectas que se cortan en un punto del segundo o tercer cuadrante (según α sea
menor o mayor a uno) y del cual podemos obtener Vmax como la ordenada al origen cuando B esté saturante.

(II) Si elegimos a B como el sustrato para aplicar la linealización, .

Vemos que las rectas obtenidas se cortan sobre el eje de las ordenadas en 1/Vmax, y de sus gráficos secundarios,
podrán obtenerse KA y KB.

Cabe destacar que el desarrollo para obtener estas ecuaciones puede darse tanto en estado estacionario como en
equilibrio rápido, por lo que no se puede saber cuál es el que ocurre guiándonos por este parámetro.
Mecanismo ping-pong

Analizándolo mediante el estado estacionario, .

Planteando la doble recíproca, vemos que , lo que nos da una idea, que las rectas
obtenidas, ya sea tomando a A o B como sustrato de referencia, tendrán la misma estructura.

Se pueden obtener también datos útiles, de los gráficos secundarios.

Determinación del mecanismo de catálisis Bi-Bi

Cuando se reconoce que una catálisis es Bi-Bi, se pretende determinar qué mecanismo sigue. Para esto, hay distintas
técnicas de identificación.

Retroinhibición
La retroinhibición es el estudio de la inhibición de una reacción generada por su producto. Los distintos mecanismos
antes vistos, presentan diferencias a la hora de retroinhibirse, dependiendo del producto elegido, del sustrato a inhibir
o de la concentración del otro. Por ejemplo, si a un mecanismo secuencial al azar, se le agrega un producto, se verá
inhibición competitiva con cualquiera de los dos sustratos, excepto en el caso, en que el otro sustrato esté saturante,
lo que impedirá la unión a la enzima tanto del sustrato estudiado como del producto inhibidor. Por otro lado, en el caso
del secuencial ordenado, sólo se verá inhibición competitiva entre el producto P y el sustrato A, ya que son las únicas
dos especies que se unen a E, sin importar la saturación del otro. No obstante, en el caso de mecanismos ping-pong,
se verá inhibición competitiva entre P y A, y entre Q y B, ya que son los pares de especies que se unen a la misma
forma de la enzima, ya sea E o F.

Para resumir el comportamiento, se crean las tablas de retroinhibición, que se presentan a continuación:
(a) Mecanismo Secuencial al Azar

A B
B subsaturante B saturante A subsaturante A saturante
P Competitiva Competitiva
Q Competitiva Competitiva

(b) Mecanismo Secuencial Ordenado

A B
B subsaturante B saturante A subsaturante A saturante
P Competitiva Competitiva Mixta
Q Acompetitiva Mixta Mixta Mixta

(c) Mecanismo Ping-Pong

A B
B subsaturante B saturante A subsaturante A saturante
 P Mixta Competitiva Competitiva
Q Competitiva Competitiva Mixta

4.2. Inhibición por análogos de sustrato

Un análogo de sustrato es una sustancia, generalmente similar a los sustratos en estructura, que puede unirse a los
sitios activos de las enzimas pero no generan producto. Por esto, presentarán inhibición cuando se encuentren junto al
sustrato original de la enzima. Llamando A’ al análogo de sustrato de A, podemos obtener las distintas tablas de
inhibición:

(a) Mecanismo Secuencial al Azar

A B
A’ Competitiva Competitiva
B’ Competitiva Competitiva
(b) Mecanismo Secuencial Ordenado

A B
A
Competitiva No Competitiva
’
B No Competitiva
Competitiva
’
(c) Mecanismo Ping-Pong

A B
A
Competitiva No Competitiva
’
B No Competitiva Competitiva
’

Tema 11: Enzimología VI: Cinéticas no michaelianas

Cooperatividad
La mayoría de las enzimas son oligómeros, de monómeros posiblemente idénticos e independientes. En este caso,
veremos una curva de unión de sustratos hiperbólica, lo que indicaría que n moléculas de un enzima con un sitio se
comportan de la misma manera que una molécula de la enzima de n sitios. Existen casos en los que los monómeros
no son funcionales por separado, pero al unirse para formar el oligómero, sufren pequeñas perturbaciones en sus
estructuras terciarias que les permiten tener actividad catalítica, sin dependencia entre ellos. Si la presencia de un
sustrato en uno de los sitios influye sobre la unión en otros o sobre la velocidad de formación del producto, estamos
frente a un fenómeno de cooperatividad.

Efecto homotrópico y heterotrópico

La cooperatividad puede estar generada por el mismo sustrato, o por otras sustancias distintas. Si existe
cooperatividad por el mismo sustrato, decimos que este tiene un efecto homotrópico sobre la enzima, lo cual se
observa comúnmente en la regulación de vías metabólicas in vivo. Sin embargo, la presencia de inhibidores o
activadores ajenos al comportamiento usual de la enzima, genera un efecto heterotrópico, lo cual se observa por lo
general, en regulaciones más generales en los organismos, como por ejemplo, en la regulación hormonal.

Cooperatividad positiva y negativa

La cooperatividad puede aumentar o disminuir la actividad enzimática. Si la aumenta, estamos frente a cooperatividad
positiva, en la que vemos un aumento de afinidad del complejo enzimático por su sustrato. Si graficásemos la
velocidad en función de la concentración de sustrato, veríamos una curva sigmoidea que tiende a la misma velocidad
máxima que la reacción no cooperativa relacionada. Linealizando mediante Lineweaver-Burk, obtenemos una curva,
que se aleja positivamente de la recta esperada sin cooperatividad, al aumentar en el eje 1/[S].
Si la cooperatividad disminuye la actividad enzimática, estamos frente a cooperatividad negativa, en la que vemos un
descenso de afinidad del complejo enzimático por su sustrato. Si graficásemos la velocidad en función de la
concentración de sustrato, veríamos una curva sigmoidea de pendiente inicial muy grande que tiende a la misma
velocidad máxima que la reacción no cooperativa relacionada. Linealizando mediante Lineweaver-Burk, obtenemos
una curva, que se aleja negativamente de la recta esperada sin cooperatividad, al aumentar en el eje 1/[S].

Alosterismo
Cuando la unión de una molécula de sustrato provoca cambios electrónicos o estructurales que dan por resultado que
las afinidades por los sitios vacantes se alteren, la curva de velocidad no se ajustará a la cinética de Michaelis-
Menten, lo que genera una enzima alostérica. Esto se da en la mayoría de los casos en que los múltiples sitios de
unión al sustrato se encuentran sobre diferentes subunidades, obteniendo curvas de velocidad sigmoideas.
La ventaja del alosterismo se basa en el hecho de que más allá que a bajas concentraciones de sustrato, el cambio de
velocidad hiperbólico es notable, las velocidades sigmoideas crecen más lentamente y en intervalos de concentración
de sustrato más regulados. Por otra parte, para producir un aumento de velocidad determinado, en un sistema de
regulación hiperbólica, se debe aumentar la concentración de sustrato en un gran número, mientras que en una
regulación sigmoidea es mucho menor. En resumen, la respuesta sigmoidea en velocidades intermedias proporciona
un control sensible de la velocidad de reacción por variación de concentración de sustrato. Se han propuesto dos
modelos principales para el alosterismo: el de interacción secuencial de Koshland y el de simetría de Monod.

Modelo de interacción secuencial de Koshland

Este modelo se basa en la teoría del ajuste inducido de Koshland, suponiendo que los cambios significativos en la
conformación de una enzima pueden deberse a la unión de un sustrato u otro ligando, dando como resultado
afinidades alteradas en los sitios vacantes.
Suponiendo una enzima alostérica de dos sitios activos.

De aquí vemos que cuando un sitio es ocupado, la constante de disociación

del sitio vacante cambia a αKS, donde α < 1 para cooperatividad positiva.

La velocidad de la reacción será igual a

, ya que el
complejo unido a dos sustratos puede producir dos moléculas de producto.

La enzima total en el medio será , y las constantes de disociación implicadas,

y .

De este modo,
2.1. Ecuación de Hill

Si aplicamos el mismo razonamiento para tres sitios activos, obtenemos que .

Mientras que si lo deducimos para cuatro sitios activos, .

Si una enzima posee n sitios equivalentes de unión al sustrato con una cooperatividad muy marcada, los factores β,
γ, δ y demás serán muy pequeños, lo que hará que los complejos que poseen menos de n sustratos unidos sean
insignificantes, y podemos simplificar la expresión como

donde .

En general, donde , y n se denomina número de sitios de unión o

número de Hill, ya que la ecuación antes demostrada es la ecuación de Hill.

Cabe destacar que la ecuación de Hill también se utiliza en casos en que:

(a) La cooperatividad es negativa, en los que n es el inverso de los sitios de unión.

(b) La cooperatividad no es fuerte, en los que no se puede asegurar que n es la cantidad de sitios de unión, sino son
los sitios útiles, y el menor número natural mayor al obtenido es el mínimo que puede existir en la enzima.

2.2. Gráfico de Hill

La ecuación de Hill produce una nueva herramienta de estudio gráfico del comportamiento enzimático.

Como

De este modo, graficando en función de se obtendrá una recta de pendiente n.

Modelo de simetría de Monod

El modelo de Monod se basa en enzimas proteicas alostéricas poliméricas que contienen unidades mínimas idénticas
y simétricas denominadas protómeros, con un sitio de unión cada uno. La enzima puede presentarse en dos estados
generadas por el reordenamiento de la estructura cuaternaria o terciaria de los protómeros, pasando de un estado
general tenso (T) a uno relajado (R). La afinidad del ligando a la enzima depende del estado, pudiendo ser mayor en
el estado tenso o en el relajado. Ahora, cuando un ligando se une en un estado determinado, desplaza el equilibrio
hacia esa conformación.

Diferencias y similitudes entre los modelos

Ambos modelos poseen fuertes similitudes, como por ejemplo, que ambos dependen del medio de reacción o que el
ligando tiene libertad de unión. El modelo de Monod requiere dos estados de conformación que pueden no estar en el
de Koshland. Por otra parte, no hay formas intermedias en el modelo de Monod (se conserva la simetría), mientras
que si los hay en el de Koshland. Otra diferencia notable recae en el hecho de que el complejo que genera productos
en el modelo de Monod es solo uno, mientras que en el de Koshland son tres. En otro aspecto, en el de Monod la
unión a ligando produce un desplazamiento termodinámico del equilibrio que no sucede en el de Koshland.

Tema 12: Enzimología VII: Regulación Enzimática

Mecanismos generales de regulación enzimática
En el metabolismo celular las enzimas funcionan en grupos, en rutas secuenciales para realizar un proceso
metabólico determinado, por lo que el producto de la reacción de la primera enzima se convierte en sustrato de la
siguiente. Esto se denomina genéricamente vía metabólica y es la forma casi única en el que los procesos
biocatalizados del metabolismo ocurren.
Generalmente, existen vías metabólicas en contrasentido, es decir, existen vías de degradación de A a B, y también
vías de síntesis de A a partir de B. Termodinámicamente es lógico pensar que una de ellas es endergónica y la otra
exergónica, pero siempre el gasto energético de la biosíntesis es mayor a la ganancia energética del catabolismo. De
este modo, deben existir modos de regulación de las vías metabólicas que utilicen de manera eficiente la energía
celular para evitar despilfarrarla en procesos cíclicos sin sentido y perjudiciales para el organismo.
En cada vía metabólica hay al menos una enzima que fija la velocidad de la secuencia global ya que cataliza la
reacción más lenta. Estas se denominan enzimas reguladoras, y en una gran mayoría de casos, ajustan su velocidad
a señales químicas y/o hormonales del entorno con respecto a la energía y las moléculas requeridas durante el ciclo
celular.

Clasificación
Los mecanismos de control enzimático se clasifican en dos grandes grupos: (a) De control fino, (b) De control grueso.

Mecanismos de control fino: Los mecanismos de control fino son rápidos, requieren poca energía y regulan la
actividad enzimática de acuerdo a variaciones temporales y reversibles en el medio interno de la célula. Están dados
por cambios específicos, por ejemplo, de temperatura (en procesos de hibernación), de acidez (en la proteólisis
estomacal), de concentración de sustrato, cofactores, inhibidores o activadores, o de estado oligomérico (polímeros de
actividad diferente a los monómeros que lo conforman).

Entre los mecanismos de control fino que existen, encontramos a:

(a) Alosterismo: unión reversible de moduladores alostéricos específicos en un sitio de unión distinto al sitio activo de
la enzima. Esto modifica los parámetros cinéticos de las enzimas. Generalmente las regulaciones alostéricas son
retroinhibiciones en las que un producto de la vía metabólica inhibe alostéricamente la primera reacción enzimática
(por ejemplo, la inhibición de la hexoquinasa por hexosas-6-P).

(b) Modificación covalente (c) Reducción de puentes disulfuro

(d) Adenilación y uridilación (e) Metilación

(f) ADP-Ribosilación

Mecanismos de control grueso: Los mecanismos de control grueso son más lentos, duraderos, energéticos y
generalmente regulan la biosíntesis por el control de la cantidad de enzima activa disponible en la célula. Se basan en
mecanismos de regulación de la expresión génica.

Entre ellos encontramos:

(a) Regulación transcripcional (b) Regulación post-transcripcional

(c) Regulación traduccional (d) Regulación post-traduccional

Control fino
Modificación covalente
Se denomina así a la modulación de la actividad enzimática por modificación covalente de la molécula enzimática.
Aunque el término puede hacer referencia a unión de fosforilos, adenililos, uridililos, ADP-ribosilos, metilos, etc., en
general se denomina modificación covalente a la regulación por fosforilación. Muchas enzimas se fosforilan, ya sea en
un solo residuo como en varios. La unión de fosforilos está catalizada por proteínas quinasa, y generalmente se da a
residuos de serina, histidina, treonina y tirosina. Su eliminación posterior se da por proteínas fosfatasas.
El fosforilo es un grupo voluminoso, muy cargado, y con una gran cantidad de electrones libres. Esto permite la
formación de enlaces hidrógeno (con enlaces amida, argininas, etc.), el alejamiento de grupos cargados
negativamente, etc. Vemos que la ubicación del fosforilo puede causar cambios de conformación importantes de las
enzimas y, por tanto, cambios en la catálisis enzimática. Un ejemplo es la regulación de la actividad fosforilasa de la
glucógeno fosforilasa por una cascada de fosforilación.
La fosforilación puede afectar a la catálisis enzimática de otras maneras: mediante la modificación de la afinidad de
fijación del sustrato (por cambios importantes en el sitio activo) o por la polimerización o despolimerización de
complejos multienzimáticos.
Las proteín-quinasas generalmente son susceptibles a la regulación por calcio (mediante calmodulinas).

Fosforilación múltiple
Algunas proteínas permiten fosforilaciones múltiples, mediante la acción de quinasas específicas. Algunas prefieren
fosforilar residuos con vecinos básicos, otros cercanos a prolinas, otros organizados en una estructura tridimensional
específica, otros cercanos a grupos ya fosforilados, etc. Esto genera una regulación muy sutil, sumando a esto, el
hecho de que la fosforilación es reversible.

Reducción de puentes disulfuro

Ciertas enzimas con potencial redox mediante la formación de puentes disulfuro catalíticos intracatenarios pueden ser
reguladas mediante el estado reductor del medio, encontrándose en forma reducida (en general más activo) u
oxidado, utilizando para esto a las tioredoxinas.

Otros mecanismos
Otras modificaciones covalentes válidas y útiles son:
(a) La adenilación y la uridilación, que es la transferencia de un grupo AMP o UMP de un ATP o UTP respectivamente,
a la enzima para volverla más activa. Se unen a residuos de tirosina.
(b) La metilación no es común y se da fundamentalmente en histonas, por lo que es esencial para la regulación
génica. El agente metilante es la S-adenosilmetionina que metila glutámicos.
(c) La ADP-ribosilación es la transferencia de ADP-ribosa desde una molécula de NAD a residuos de arginina,
glutamina o cisteína.

Control grueso
El control grueso se basa fundamentalmente en la regulación génica. La síntesis de macromoléculas de información
es tan cara para una célula que se han desarrollado mecanismos complicados para regular este proceso, los cuales
pueden implicar una inversión considerable de energía química.
Regulación transcripcional
La transcripción está regulada por factores de transcripción que inhiben y promueven la unión del complejo enzimático
biosintético. La RNA polimerasa se une al DNA e inicia la transcripción en sitios denominados promotores cercanos al
inicio de la síntesis de RNA. Las secuencias de nucleótidos de los promotores varían considerablemente influyendo en
la afinidad de unión del complejo, y por tanto, en la frecuencia de transcripción del gen. Esto es lo que permite la
síntesis del nivel apropiado de productos génicos constitutivos.

Activación y represión
Existen proteínas reguladoras que potencian o interfieren en la interacción del complejo enzimático y el promotor. Son
de tres tipos: (a) Factores de especificidad (que modifican la especificidad del complejo enzimático por el promotor),
(b) Represores y (c) Activadores.

Los represores se unen a sitios específicos del DNA denominados operadores cercanos al promotor. Esto impide la
unión y/o el movimiento del complejo enzimático a lo largo del DNA. Su actividad se da por una señal molecular (o
efector) que se une al represor y provoca un cambio conformacional que une a la proteína al operador o lo separa.

Los activadores se unen al DNA y potencian la actividad de los complejos enzimáticos al facilitar la unión de la
polimerasa. También se regulan por efectores.

Operones
Las bacterias coordinan la regulación de los genes que codifican productos implicados en una serie de procesos
relacionados agrupándolos en el cromosoma para transcribirlos juntos, es decir, genera mRNA policistrónico, ya que
hay múltiples genes en un único transcrito, y el único promotor que inicia la transcripción es el sitio de regulación para
la expresión de todos los genes en el grupo. El grupo de genes y el promotor, al igual que las secuencias adicionales
intermedias, se denominan operones.

El operón lac
El operón lac en procariotas incluye al gen codificante para β-galactosidasa (hidroliza lactosa en glucosa y galactosa)
y para galactósido permeasa (transporta lactosa al interior de la célula).
En ausencia de lactosa, los genes están reprimidos debido a la expresión de un gen que da origen a una proteína
denominada represor Lac que se une contiguamente al sitio de inicio de la transcripción.
Cuando se agrega lactosa, se induce el operón lac debido a que una molécula inductora se une en el represor Lac y
cambia su conformación provocando su disociación del represor. Este inductor es la alolactosa, un producto de la β-
galactosidasa en bajas concentraciones al transformar lactosa. Esto permite la producción de más β-galactosidasa.

Otro factor afecta a la expresión de los genes lac como ser la disponibilidad de glucosa. Esta regula mediante un
mecanismo llamado represión por catabolito que está facilitado por cAMP y la proteína receptora de cAMP (CRP). La
CRP es un activador de transcripción del operón lac sensible a glucosa. La CRP tiene un sitio de unión al cAMP y se
une al DNA cuando las concentraciones de cAMP son altas. La síntesis de éste está inhibida por la glucosa, por lo que
la activación del operón lac se da si hay lactosa (para desinhibir el proceso) y no hay glucosa (para activarlo, al
aumentar las concentraciones de cAMP). Si no hay lactosa, el inhibidor se encuentra funcionando y no habrá
transcripción. Si hay mucha glucosa, baja la concentración de cAMP y la transcripción no se activa.

Regulación de empaquetamiento de cromosomas

En eucariotas los efectos de la estructura cromosómica sobre la regulación génica es notable. La transcripción de un
gen está muy reprimida cuando su DNA está condensado en la cromatina. Ésta se prepara para la transcripción
eliminando barreras estructurales potenciales, como histonas (acetilación), nucleosomas (migración y ordenamiento),
etc.

Regulación hormonal
Las hormonas son moduladoras de proteínas reguladoras eucarióticas mediante la interacción directa con señales
moleculares. Las hormonas esteroideas por ejemplo, difunden por la membrana plasmática (son pequeñas e
hidrofóbicas) y se unen a receptores intracelulares citosólicos que cambian de conformación y pueden potenciar o
suprimir la expresión de genes adyacentes. Otras, pueden generar efectos por unión a receptores de membrana,
como por ejemplo la adrenalina o el glucagón.

Regulación post-transcripcional
Gran parte de las moléculas de RNA de las bacterias y todas las de los eucariotas son modificadas en cierta medida
después de su síntesis mediante ribozimas.
Entre estas modificaciones encontramos la adición de un casquete en 5’ de un residuo de 7-metilguanosina y la
adición de una cola de poli(A) de entre 80 y 250 residuos de adenilato al extremo 3’. La función del casquete es
fundamentalmente la unión al ribosoma para iniciar la traducción. La cola de poli(A) sirve de sitio de unión para
proteínas específicas y probablemente dirija la vida útil del transcrito primario, ya que controla la velocidad de
degradación del mismo en el citosol.
El splicing elimina las secuencias no codificantes del gen, aunque también ha evolucionado, por ejemplo, al splicing
alternativo que favorece la producción de proteínas alternativas dependiendo de la ubicación y la magnitud del splicing
realizado. Está regulado por señales internas.
Los snRNA son reguladores post-transcripcionales ya que se transcriben en el núcleo e hibridizan con el mARN del
citosol, activando la degradación de éste, disminuyendo la concentración efectiva de enzimas.

Regulación traduccional
Algunos mecanismos de regulación traduccional son:

(a) Los snRNA que se unen al mRNA impidiendo temporalmente la unión del tRNA, o activando su degradación.

(b) La existencia de UTR en los extremos 5’ y 3’ que favorecen o desfavorecen la traducción de acuerdo a su
composición. Por ejemplo, la UTR 5’ con secuencias TOP (compuesta por una gran cadena de pirimidinas) activa la
traducción en un alto nivel.

(c) Fosforilación de proteínas ribosomales que alteran su afinidad por el rRNA y por lo tanto, la estabilidad del
ribosoma en el citosol.

Regulación post-traduccional
Algunos mecanismos de regulación post-traduccional son:

(a) Zimógenos: son cadenas polipeptídicas inactivas, que se activan por la eliminación de un sector de su cadena. Son
generalmente peligrosas para su existencia intracelular, y se activan mediante enzimas externas, por ejemplo,
proteasas digestivas.

(b) Proteínas de unión a proteasas que inhiben su funcionamiento

(c) Degradación proteica: se da en proteínas notablemente poco útiles o deformes, ya que posee menos gasto
energético que la inhibición constante. El método más utilizado es la ubiquitinación, que es el marcaje de las proteínas
con ubiquitina, lo que permite la unión de complejos proteolíticos que las degradan.

Tema 13: Enzimología VIII: Mecanismos de catálisis y estudio del sitio activo
Mecanismos de catálisis
Todas las reacciones químicas deben superar una barrera de energía potencial para que los reactivos se transformen
en productos. En seres vivos, esto no puede hacerse por elevación de la temperatura, ya que la termorregulación es
tan extrema que un mínimo cambio de temperatura corporal podría ser fatal para el individuo en cuestión.
Las enzimas, catalizadoras, cambian la cinética del sistema sin afectar su termodinámica, modificando el camino para
alcanzar el estado final, pudiendo generar intermedios metaestables muy afines al sitio activo de la enzima lo que
favorece la transformación en este.
La acción enzimática puede explicarse por cuatro procesos: catálisis ácido-base, tensión sobre el sustrato, catálisis
covalente y efectos entrópicos.
Catálisis ácido-base
En la mayoría de las reacciones enzimáticas no se encuentran protones y oxhidrilos libres, sino que los que cumplen
estas funciones son las cadenas laterales de algunos aminoácidos como histidinas (de comportamiento ácido), tioles
de cisteínas, hidroxilos de tirosinas y aminos de lisinas, además de los carboxilos de glutamatos y aspartatos.

Un ejemplo de este método es el de la ribonucleasa que rompe la cadena de RNA en el enlace fosfodiéster. En el
mecanismo están implicadas dos histidinas (llamadas genéricamente A y B). La histidina A protona el fosfodiester
mientras que la B forma un alcóxido en el oxhidrilo 3’ de la ribosa. Éste ataca al fósforo del fosfodiester, produciendo
un fosfato cíclico con los carbonos 3’ y 4’. La histidina B (ahora protonada) ataca al oxígeno del carbono 3’ y permite la
ruptura del fosfato cíclico que tomará un hidroxilo de un agua, quedándose con el protón restante la histidina A para
reiniciar el ciclo.

Deformación del sustrato

La fijación del sustrato a un centro preformado de la enzima puede inducir tensión y el nivel energético del sustrato
aumenta, ya que los ángulos y la longitud de los enlaces de éste son más parecidos a los que se encuentran en el
estado de transición.

Catálisis covalente
El ataque de un grupo nucleófilo (generalmente negativo) o electrófilo (generalmente positivo) del centro activo de la
enzima sobre el sustrato conduce a la unión covalente del sustrato a la enzima como intermedio en la secuencia de
reacción. El sustrato unido a la enzima (o a veces a la coenzima, como NADH o FADH2) es más lábil y por lo tanto
deprime el perfil energético.
Un ejemplo claro es el del complejo de Michaelis, presente en muchas enzimas pero notablemente funcional en la
quimotripsina. Está compuesto por un aspártico (-COO-), una histidina (-NH y =N-) y una serina (-OH) ubicados de
manera tal que uno de los nitrógenos de la histidina (el =N-) ataque al protón de las serina generando un alcóxido
reactivo, lo que permita el ataque nucleófilo sobre centros electrófilos (como por ejemplo, el carbono peptídico de
proteínas), generando la ruptura de éstos y regenerándose por su unión al protón de un agua, que cede su oxhidrilo al
centro electrófilo para liberarlo.

Efectos entrópicos
Las posibilidades de que dos reactivos se unan con la orientación geométrica correcta y con suficiente energía para
reaccionar es pequeña a la temperatura corporal y en soluciones diluidas como es el citosol. Sin embargo, si una
enzima con dos centros de fijación de alta afinidad para ambos se introduce en la solución diluida, se unirán con la
orientación correcta, se fijarán con la estequiometría correcta y la concentración efectiva se incrementará sobre la
superficie enzimática lo que incrementará la velocidad de reacción. De este modo, los sustratos pueden ser
tensionados hacia el estado de transición, estando preparados para la catálisis ácido-base o covalente. Este “efecto
de proximidad” aumenta entre 103 y 105 veces la velocidad de reacción.

Estudio del sitio activo

Las enzimas son los catalizadores más específicos que se conocen. Esto reside en el centro de fijación del sustrato
que se encuentra en la superficie de la enzima, generado por la estructura tridimensional de la enzima poseyendo las
dimensiones moleculares correctas, la topología adecuada y el alineamiento óptimo de grupos contraiónicos y/o
hidrofóbicos adecuados.

Modificación química
Se basa en el incubado de la enzima con reactivos modificadores que reaccionen con restos aminoácidos particulares,
midiendo luego la actividad enzimática. Si hubo cambios en esta, puede deberse a que existieron cambios particulares
en el sitio activo que impidieron su funcionamiento o a que existen cambios conformacionales suficientes para cambiar
su funcionamiento.Para diferenciar entre estas dos opciones, se une previamente la enzima a su sustrato. Si se vuelve
a notar cambio de actividad, se sabrá que se debe a cambios tridimensionales externos, y no del sitio activo. Se podrá
saber cuál es la posición del resto aminoácido afectado, mediante unión al modificador, y secuenciación tanto de la
cadena modificada como la no modificada.
Biología molecular
Es la comparación del gen codificante de la enzima con otras isoenzimas (generadas por distintos genes pero que
catalizan la misma reacción, poseyendo distintos parámetros cinéticos y regulación) buscando secuencias o dominios
conservados, los que probablemente sean pertenecientes al sitio activo.

Mutagénesis dirigida
Si se conoce el gen codificante de la enzima en estudio, y más aún, del dominio que posee el sitio activo, se puede
cambiar artificialmente la secuencia para reemplazar de a un aminoácido por vez con el fin de observar si tienen
incidencia en la actividad enzimática o no.

Tema 14: Enzimología IX: Coenzimas

Coenzimas
Las coenzimas son moléculas orgánicas pequeñas que funcionan en conjunción con la enzima en el proceso
catalítico. Frecuentemente poseen una afinidad por la enzima similar a la del sustrato, por lo que puede ser
considerado como un segundo sustrato. En otros casos, se liga de forma covalente a la apoenzima (enzima
propiamente dicha) y, funciona en el centro activo o cerca de él.
La mayoría derivan de vitaminas y se clasifican según su función en la reacción catalizada en: (a) Coenzimas de alta
capacidad de transferencia de grupos (como el ATP, UTP, etc.), (b) Coenzimas que modifican estructuralmente al
sustrato (como el TPP, PPL, etc), (c) Coenzimas con actividad redox (como el NADH, FADH2, etc.).
Podemos encontrar otra clasificación de las coenzimas dependiendo de su unión con la apoenzima. Si la interacción
es débil y existe un equilibrio, hablamos de una coenzima propiamente dicha. Si se unen fuertemente, los llamamos
grupos prostéticos.
No obstante, toda coenzima es reciclable, es decir, existen enzimas que transforman a la coenzima en una dirección y
otras que la regresan a su estado inicial. En el caso puntual de los grupos prostéticos, esta enzima transformante es la
apoenzima de unión.

Adenosina trifosfato
El ATP suele llamarse la “moneda de energía” celular, que enlaza el catabolismo y el anabolismo. Las células
heterotróficas obtienen energía libre en forma química a través del catabolismo produciendo ATP, y éste cede parte de
su energía a procesos endergónicos (como la biosíntesis). La participación del ATP depende sus transformaciones
covalentes, desde ATP a ADP o AMP, las que generan (y requieren) una gran cantidad de energía libre por lo que son
más que una simple hidrólisis, sino que por lo general son transferencias de grupo.

Adenosina trifosfato a pH fisiológico

Hidrólisis del ATP
El ATP está formado por una ribosa unida a una base adenina y a tres fosfatos inorgánicos ligados entre sí por
uniones fosfoanhídrido. Éstos están cargados negativamente, por lo que existe una elevada repulsión entre ellos, lo
que hace más estables a los productos de las reacciones de hidrólisis comparándolos con el ATP de origen. Existen
otras situaciones acopladas que favorecen la hidrólisis, como ser la facilidad de protonación del (o de los) fosfatos
salientes (incluso a pH relativamente alto) o la baja concentración de productos de hidrólisis en el medio.
De este modo, la hidrólisis es muy exergónica (ΔGº = -30,5 kJ/mol) pero cinéticamente desfavorable, lo que hace
necesaria la acción enzimática para que suceda. Sin embargo, en las condiciones de la célula, la energía libre no es la
estándar, ya que hay distintas concentraciones de ATP, ADP, AMP y fosfato, y, además, porque se encuentra
acomplejado con cationes divalentes como el Mg2+. De este modo, se calcula una ΔG’º entre -50 y -65 kJ/mol llamada
potencial de fosforilación.
Se puede decir que en las reacciones de hidrólisis (tanto del ATP como de otros grupos de transferencia energética),
la estabilidad diferencial de los reactivos se debe a: (a) La tensión de enlace en los reactivos, debida a la repulsión
electrostática, (b) Estabilización de los productos por ionización, (c) Estabilización de los productos por isomerización,
(d) Estabilización de los productos por resonancia (el ATP tiene 5 formas resonantes, el AMP y ADP, más).

Transferencia de energía por transferencia de grupo

La hidrólisis del ATP no consigue nada excepto la liberación de calor. En general, existe una transferencia de grupo
(fosfato, pirofosfato, ADP o AMP) entre el ATP con uno de los reactivos o un grupo lateral de un aminoácido de la
enzima para elevar su contenido energético. En un segundo paso, se desplaza la porción que contiene el grupo
transferido, produciendo la reacción. Por lo tanto la acción del ATP es covalente.
Cabe aclarar que cuando uno se refiere a la ruptura de un “enlace rico en energía” del ATP, llamando como tal a los
enlaces P-O del fosfoanhídrido, no se refiere a que exista una liberación de energía, ya que como en toda ruptura se
requiere un aporte energético. La liberación de energía proviene de la modificación de los parámetros termodinámicos
(entálpicos y entrópicos) del sistema al producirse la ruptura.
La utilización del ATP en el metabolismo celular se debe a que su potencial de fosforilación es intermedio, por lo que
puede ser generado por compuestos más energéticos que él, y utilizado por otros menos energéticos que él. De este
modo, algunos compuestos como el fosfoenolpiruvato, la fosfocreatina o el 1,3-bifosfoglicerato son de los más
energéticos en la célula, pero utilizan su energía para fosforilar ATP en vez de cederla directamente a la reacción
enzimática.

Mecanismos de transferencia
Las reacciones del ATP son generalmente SN2, siendo el oxígeno generalmente oxígenos o nitrógenos. Los tres
fosfatos son susceptibles al ataque y cada posición de ataque conduce a un tipo diferente de producto.Existen cuatro
formas de ruptura del ATP, dependiendo del enlace roto.

La ruptura tipo I es la más frecuente. Se da una trasferencia de un grupo fosforilo (-PO32-). Dentro de esta también se
incluye la hidrólisis del ATP. La ruptura puede darse por varios mecanismos:

(a) Catálisis enzimática indirecta:

(b) Catálisis enzimática directa:

(c) Acción directa:

La ruptura tipo II es poco frecuente, liberando un grupo pirofosforilo (-PO2-O-PO33-) y uniendo el adenililo sobrante.
Se da por ataque nucleofílico directo.

La ruptura tipo III es un poco más frecuente que la II. Es la disociación del ATP en AMP y pirofosfato (PPi). Éste
puede a su vez, disociarse enzimáticamente (pirofosfato inorgánico hidrolasa) en dos fosfatos, liberando una gran
cantidad de energía.

La ruptura tipo IV es poco frecuente y análoga a la de tipo II, con la diferencia que en vez de liberar un pirofosforilo,
se libera un trifosfato que se hidrolizará en pirofosfato y fosfato.

La transferencia de pirofosfatos está más beneficiada termodinámicamente, porque no solo se libera más energía al
romper el enlace β-γ, sino que la hidrólisis del pirofosfato generado aporta otro empujón energético adicional. Estas
reacciones de adenililación (ya que el grupo transferido es el adenililo) sirven para activar sustancias inertes de otra
manera.

Transfosforilaciones y polifosfatos
Es lógico pensar que no solo el ATP pueda ser usado como coenzima, siendo que la adenina no participa en su
función. Efectivamente, el CTP, GTP y UTP son equivalentes al ATP energéticamente, siendo distinta su función
debido a la diferente especificidad enzimática sobre la base nitrogenada.
No obstante, la nucleósido bifosfato quinasa cataliza la transferencia de fosforilos entre el ATP y cualquier otro NTP (o
dNTP si poseen una desoxirribosa) sin pérdidas de energía. Por otra parte, si se acumula NDP en la célula, existen
adenilato quinasas que utiliza uno de ellos para fosforilar al otro, generando NMP y NTP.

Nicotinamida dinucleótido
Todas las enzimas que catalizan oxidaciones celulares canalizan los electrones desde los sustratos a solo unos
cuantos tupos de transportadores de electrones. La reducción de estos permite el ingreso de los electrones a
procesos de conservación de la energía. Entre estos transportadores, encontramos a la nicotinamida dinucleótido o
NAD+ con su variante fosfatada (NADP+). Están compuestos por dos nucleótidos unidos a través de sus grupos fosfato
por un enlace fosfoanhídrido. La porción de ácido nicotínico es aportado por la vitamina niacina y es la porción que se
reduce y le otorga su funcionalidad.
Una molécula de NAD+ (o NADP+) acepta un ión hidruro proveniente de una deshidrogenación, generando su forma
reducida (NADH o NADPH). El segundo protón eliminado de ésta reacción redox se libera al medio. El anillo
bencenoide nicotínico se transforma en quinonoide, ya que no posee carga en el nitrógeno.

La principal diferencia biológica entre el NAD+ y el NADP+ es la diferencia de proporciones. El NAD+ está más
presente en las células en la forma oxidada, favoreciendo así las reacciones de oxidación (catabolismo). El NADPH
está mas presente en forma reducida, aunque en diez veces menor cantidad que el NAD+, por lo que es utilizado en
las reducciones, es decir, en las biosíntesis. De esta manera, generalmente las enzimas poseen preferencias sobre
uno y otro. Una notable ventaja del NAD+ es su absorción dependiente de su estado de oxidación. Tanto el NAD+
como el NADH absorben a 260 nm (adenina), pero solo el NADH lo hace a 340 nm (nicotinamida reducida), por lo que
puede utilizarse la espectrofotometría para seguir reacciones que utilicen o produzcan NADH.

Reducción de la parte nicotínica del NAD+

Flavoproteínas
Las flavoproteínas son enzimas que catalizan reacciones redox utilizando o mononucleótidos de flavina (FMN) o
dinucléotido de flavina-adenina (FAD). Ambos derivan de la vitamina riboflavina.

Riboflavina Dinucleótido de flavina-adenina (FAD)

 Flavina mononucleótidos y sus sucesivas reducciones
En las flavoproteínas pueden participar transferencias tanto de uno como de dos electrones, por lo que participan en
una mayor variedad de reacciones. Las flavoproteínas oxidadas tienen generalmente un máximo de absorción cerca
de 570 nm, cuando se reducen, el máximo se desplaza a 450 nm.

La unión de los nucleótidos de flavina a las flavoproteínas es fuerte e incluso covalente, por lo que se trata de un
grupo prostético. No transfieren electrones difundiendo desde una enzima a otra sino que proporcionan un medio por
el que la flavoproteína puede retener electrones mientras cataliza la transferencia desde un sustrato a otro. Su
potencial de reducción estándar es variable, ya que cambia notablemente entre el FAD libre y el FAD unido a la
flavoproteína, por lo que es propio de cada enzima.

Se cree que el mecanismo de reacción seguido por las flavoproteínas para reducirse puede ser de tres tipos:

(a) Por ataque no sincronizado de los hidrógenos (H.). Es decir, el primer hidruro ataca al nitrógeno del anillo central, y
el segundo (hidrógeno atrasado) al nitrógeno del tercer anillo.

(b) Por la formación de un carbanión.

(c) Por métodos radicalarios.

Tiamina pirofosfato
La tiamina pirofosfato (TPP) es una coenzima que proviene de la vitamina B1.Juega un papel importantísimo en la
rotura de enlaces adyacentes a grupos carbonilos como en la decarboxilación de α-cetoácidos, y en reordenamientos
químicos en los que hay transferencia de grupos aldehídos activados. Su parte funcional es el “anillo de tiazolio”, ya
que su protón es ácido, lo que genera un carbanión activo adicionable a grupos carbonilo.

Tiamina Pirofosfato (TPP)

 Mecanismo de reacción de la TPP

Coenzima A
La coenzima A posee pantotenato y un grupo tiol reactivo, actuando como transportador de grupos acilo. Éstos
se unen formando tioésteres que poseen un elevado potencial de transferencia de grupos acilo ya que tienen una
elevada energía libre estándar de hidrólisis.

Coenzima A

Biotina
La biotina es una vitamina que actúa como grupo prostético, participando en reacciones de carboxilación. Es un
transportador especializado de grupos de un carbono en su forma más oxidada, es decir, como dióxido de carbono.
Éstos son activados en una reacción que descompone ATP y una el dióxido de carbono a la coenzima para luego ser
transferido al aceptor. Posee un “brazo” móvil que permite el transporte de los grupos carboxilo de un centro activo a
otro. Está notablemente inhibida por la avidina, una proteína que se encuentra en la clara de huevo.

Mecanismo de reacción de la biotina

Otros cofactores de transferencia de grupos carbonados
Ya se dijo que la biotina transportaba unidades de carbono en su estado más oxidado. Otras coenzimas participan con
unidades monocarbonadas en estado de oxidación intermedios (tetrahidrofolato) y reducidos (S-adeninosilmetionina).

9.1. Tetrahidrofolato
Consta de tres partes: una 6-metil-pterina, un para-amino-benzoato y glutamato. Es
utilizado por bacterias para mover metilos, metilenos y aldehidos que se unen al nitrógeno 5
y/o 10.

9.2. S-adenosilmetionina
Es el cofactor preferido para la transferencia de grupos metilo debido a su elevado potencial
de transferencia. Se sintetiza a partir de la metionina adenosil transferasa, que transfiere la Tetrahidrofolato
ribosa y la adenina de un ATP al azufre de la metionina mediante un ataque nucleofílico de este sobre el carbono 5’ de
la ribosa.

Piridoxal fosfato
El piridoxal fosfato (PLP) es un grupo prostético presente en todas las aminotransferasas
unido mediante una base de Schiff a un residuo de lisina, siendo un derivado de la
piridoxina (vitamina B6). Es un transportador intermedio de grupos amino ya que pasa de
su forma aldehído (PLP) a un forma aminada (piridoxamina fosfato) para poder dar su
amino.
Debido a esto, se utiliza en la transaminación de aminoácidos, en la decarboxilación de Piridoxal fosfato (PLP)
cadenas laterales y en racemización de aminoácidos.

Vitamina B12
Es el cofactor predilecto en enzimas mutasas que intercambian de posición un protón y un grupo X cualquiera unidos
a carbonos adyacentes. Esto se debe a la vitamina B12 que contiene cobalto (cobalamina). Está formada por un
sistema anular similar al porfírico del hemo estando las otras dos uniones de coordinación del cobalto ocupadas por
una 5’-desoxi-adenosina (5dA) y un ribonucleótido de dimetil-benzimidazol. La unión entre la 5dA y el cobalto es
fácilmente rompible mediante una disociación homolítica que genera un radical 5dA muy activo. Este, toma el protón
del sustrato para compensar su radical libre, generando un radical en el carbono del sustrato que se ocupará por el
grupo del carbono adyacente. Este nuevo radical, puede tomar el protón de la 5dA para volver a dejarla como radical
libre, y ésta podrá volver a unirse al cobalto para regenerar la cobalamina.

Tema 26: Lípidos

Lípidos de almacenamiento
Las grasas y los aceites almacenamiento de energía en los organismo. Derivan de los ácidos grasos. su oxidación
completa sea muy exergónicas.

Ácidos grasos
Son ácidos carboxílicos con cadenas hidrocarbonadas de 4 a 36 carbonos, completamente saturadas o con alguna
insaturación, lineales, ramificados o incluso con algunos anillos. Los ácidos grasos más abundantes tienen números
pares de carbonos (consecuencia de la síntesis de los mismo que utilizan condensación sucesiva de unidades de
acetati de dos carbonos), en una cadena sin ramificar de entre 12 y 24 carbonos. La posición de los dobles enlaces
también suele ser regular, generalmente entre el carbono 9 y 10, entre el 12 y 13, y entre el 15 y 16. Es raro encontrar
dobles enlaces conjugados, y la mayoría en posición cis. Los trans se forman durante la fermentación en el rumen de
los animales productores de lacteos y carne.
Ácidos grasos poliinsaturados PUFA con doble enlace en el tercer y cuarto carbono desde el extremo metilo de la
cadena. El carbono del grupo metilo es decir el carbono mas alejado del grupo carboxílico se denomina omega y se le
da el numero 1. Los PUFA con doble enlace en C3 Y C4 son omega 3, y los C6 y C7 omega6. Los humanos no tienen
la capacidad de sintetizar omega3 acido alfa-linolenico por lo que deben obtenerlo de la dieta.

Propiedades fisicoquímicas
La longitud y la insaturación de los ácidos grasos controlan sus propiedades fisicoquímicas. Son notablemente
apolares, lo que explica su poca solubilidad en agua, la que disminuye al aumentar la longitud de la cadena. Los
puntos de fusión aumentan a medida que aumenta la saturación de la cadena, ya que adquieren una típica
conformación extendida que les permite agruparse y estabilizarse por fuerzas de Van der Waals (rotación C-C la
conformación mas estable es la extendida en la que empedimientos estéricos son mínimos). Las instauraciones
generan “quiebres” (por conformación cis) en la disposición lineal de la cadena, por lo que no pueden empaquetarse
tan juntamente y su punto de fusión disminuye. Los ácidos saturados son solidos a temperatura ambiente y los
insaturados son líquidos.
En vertebrados los ácidos grasos libres (no esterificados, con grupo carboxilato libre) circulan por la sangre unidos de
forma no covalente a una proteína portadora, la albumina serina. También suelen unirse a glicerol y otros compuestos
carbonados pequeños y reactivos.

Triacilgliceroles
Los lípidos más sencillos obtenidos a partir de ácidos grasos son los triacilgliceroles o grasas. Son un triéster de
ácidos grasos y un glicerol. Pueden ser simples o mixtos, de acuerdo a la igualdad entre los ácidos grasos unidos.
Son apolares, hidrofóbicos e insolubles en agua, aunque su densidad es menor que la del agua, por lo que flotan.
En las células se encuentran en forma de gotitas microscópicas en el citosol acuoso. No obstante, existen células
especializadas (adipocitos) que almacenan grasas en gran cantidad, y poseen una gran cantidad de lipasas que los
hidrolizan cuando son necesarios como combustible.
Sus ventajas como combustibles recaen en que están más reducidos que los azúcares (aportan más del doble de
energía por gramo) y no se unen a agua de hidratación. También funcionan como aislantes térmicos, y como
protectores mecánicos.

El enranciamiento de alimentos ricos en grasas proviene de la rotura oxidativa de dobles enlaces que produce
aldehídos y ácidos carboxílicos de cadena mas corta y de mayor volatilidad. Con el fin de aumentar su estabilidad a
altas temperaturas son sometidos a hidrogenación parcial, el cual convierte dobles enlaces cis en enlaces sencillos lo
que aumenta la temperatura de fusión de los mismo. Un efecto indeseable es que algunos enlaces cis se pueden
convertir en trans. Los ácidos grasos trans aumentan la cc de triacilgliceroles y de colesterol ligado a LDL malo en la
en sangre, al mismo tiempo que disminuye colesterol ligado a HDL bueno.

Ceras
Una cera es un éster de ácido graso de cadena larga y saturación variable con alcoholes de cadena larga. Sus puntos
de fusión son más elevados que los de los triglicéridos. Pueden servir como combustibles (para plancton), o como
cubiertas impermeables (ya que son hidrofóbicos y consistentes). El pelo de los animales, las plumas de las aves y las
hojas de ciertas plantas serían blanco fácil para la deshidratación y los parásitos. Es ahí donde las ceras funcionan.

3. Lípidos estructurales

La principal función estructural de los lípidos es la de formar membranas biológicas: capas dobles de lípidos, que
sirven de barrera selectiva. Para esto, es necesario obtener lípidos anfipáticos, con un extremo hidrofóbico y uno
hidrofílico, por lo que los primeros quedan en el interior y los segundos hacia las regiones superficiales.

Hay tres tipos esenciales de lípidos de membrana: glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles.

3.1. Glicerofosfolípidos

Son lípidos de membrana en los que dos ácidos grasos están unidos por enlaces éster al primer y segundo carbono
del glicerol, y un grupo de cabeza muy polar o cargado está unido por enlace fosfodiéster al tercer carbono. Su
nombre deriva fundamentalmente del grupo polar unido al tercer carbono, el que puede estar cargado (positiva o
negativamente) o no.

Los grupos más comunes de unión al carbono 3 son:

Grupo Nombre
Ninguno
Ácido Fosfatídico
(protón)
Etanolamina Fosfatidiletanolamina
Colina Fosfatidilcolina
Serina Fosfatidilserina
Glicerol Fosfatidilglicerol
Fosfatidilglicerol Cardiolipina
Azúcar Fosfatidilglicérido
3.1.1. Plasmalógenos

Ciertos glicerofosfolípidos tienen unida una cadena lateral por enlace éter, en vez de enlace éster. Si entre los
carbonos uno y dos existe un doble enlace, estamos frente a un plasmalógeno. El tejido cardíaco es rico en estos
compuestos, al igual que las membranas bacterianas y de ciertos microorganismos, ya que son resistentes a las
fosfolipasas.

Otro compuesto importante con enlace éter es el factor activador plaquetario, una señal molecular que estimula la
agregación de plaquetas, y participa en la reacción inflamatoria y alérgica.

3.2. Esfingolípidos

3.2.1. Estructura

Los esfingolípidos poseen una cabeza polar y dos colas, pero no unidas a glicerol sino a un aminoalcohol de cadena
larga llamado esfingosina que ya posee una cadena larga de 14 carbonos y permite la unión de un ácido graso por
enlace amida. La unidad fundamental de un esfingolípido es la ceramida en la que no hay ningún grupo polar unido al
carbono 3 de la esfingosina.

Esfingolípido

Dependiendo de los grupos polares, se encuentran tres tipos de esfingolípidos.

Nombre Grupo polar Características

Fosfocolina o Similares a las fosfatidilcolinas, presentes en membranas
Esfingomielinas
fosfoetanolamina plasmáticas y en la vaina de mielina nuronal.
Glucoesfingolípidos Azúcares Se encuentran en la cara externa de la membrana plasmática.
Oligosacáridos con ácido
Gangliósidos Son negativos.
siálico terminal
Si un glucoesfingolípido posee un solo azúcar unido a la ceramida, se denomina cerebrósido, comunes en el tejido
nervioso (galactosa) y en algunos no nerviosos (glucosa). Los globósidos son glucoesfingolípidos con más de un
azúcar unido a la ceramida, pero siempre con carga neutra.

3.2.2. Función y degradación

Su función era tan enigmática, que fueron bautizados así en honor a la esfinge. La principal función descubierta fue la
del reconocimiento celular, lo que afecta no solo al individuo desarrollado sino también al desarrollo embrionario y al
desarrollo tumoral.

Tanto los fosfolípidos como los esfingolípidos se degradan en los lisosomas, mediante enzimas específicas
denominadas fosfolipasas. Existen enzimas específicas que degradan a las moléculas en distintos sitios.

Fosfolipasa Sitio de corte

A1 Enlace éster en el carbono 1
A2 Enlace éster en el carbono 2
C Enlace fosfoéster más cercano al glicerol
D Enlace fosfoéster más alejado del glicerol
Los esfingolípidos se degradan por gangliosidasas, muy específicas y cuyas alteraciones generan enfermedades
mortales (Tay-Sachs, Fabry, Gaucher, etc.)

3.3. Esteroles

Los esteroles son lípidos estructurales que se encuentran notablemente extendidos. Posee un núcleo esteroideo que
consiste en cuatro anillos fusionados, tres de ellos con seis carbonos y uno con cinco. Este núcleo es casi plano y
rígido, lo que impide el giro sobre los enlaces sigma.

El colesterol es el principal esterol anfipático, ya que posee una cabeza polar (grupo hidroxilo en el anillo A) y un
cuerpo apolar (con una cadena apolar de ocho carbonos en el anillo D). Las bacterias no pueden sintetizar esteroles.

Todos los esteroles se obtienen a partir de subunidades de isopreno de cinco carbonos, y constituyen las membranas
plasmáticas. Otras funciones específicas pueden ser la señalización biológica (hormonas esteroideas), detergentes
(sales biliares), etc.

4. Membranas biológicas

La primera célula apareció cuando se formó una membrana que

encerraba un pequeño volumen de solución acuosa y lo separaba del
resto del universo. Las membranas definen los límites externos de las
células y regulan el tráfico molecular a través de éstos. No solo dividen el
espacio, sino que organizan secuencias de reacciones, además de
participar en la conservación de la energía y la comunicación celular.
Colesterol
Toda esta funcionalidad deriva de ciertas características básicas:

(a) Flexibilidad: se correlaciona con los cambios de forma de las células en el crecimiento, movilidad y desarrollo
celular.

(b) Autosellado: permite la fusión y la fisión sin pérdida de superficie celular.

(c) Permeabilidad selectiva: controla el flujo metabólico de la célula.

En su composición se incluyen proteínas especializadas en promover o catalizar procesos celulares.

4.1. Constituyentes moleculares y arquitectura supramolecular

Cada tipo de membrana posee una composición de proteínas y lípidos característica. La composición de los lípidos
de membrana es característica de cada reino, especie, tejido y orgánulo. La composición proteica varía más, ya que
es puramente funcional. Muchas proteínas de membrana se unen específicamente a glúcidos, los que juegan papeles
específicos en la unión celular y el reconocimiento.
 El modelo más actual y aceptado de la estructura de la membrana plasmática es el del mosaico fluido, en la que los
fosfolípidos y los esteroles forman una bicapa lipídica con las regiones apolares encaradas una con otra en el centro
de la bicapa, y sus grupos de cabeza polares encarados hacia el exterior. Las proteínas están incrustadas a intervalos
regulares y se mantienen mediante interacciones hidrofóbicas entre los lípidos de las membranas y los dominios
hidrofóbicos de las proteínas. Como estas interacciones no son covalentes, existe un constante movimiento lateral de
los lípidos y las proteínas.

Tema 15: Glúcidos y glucobiología

Disacáridos
Los disacáridos están formados por dos monosacáridos unidos covalentemente por un enlace O-glucosídico, formado
cuando un grupo hidroxilo de un azúcar reacciona con el carbono anomérico del otro, generando un acetal que elimina
el poder reductor del (o de los) monosacáridos que se unen.

Carbono
Monosacárido 1 Configuración Carbono 2 Monosacárido 2 Poder reductor
1
Maltosa Glucosa 1 Α 1 Glucosa Si
Lactosa Galactosa 1 Β 4 Glucosa Si
Sacarosa Glucosa 1 Α 2 (β) Fructosa No
Trehalos
Glucosa 1 Α 1 (α) Glucosa No
a

Tema 16: Glicólisis

Metabolismo
El metabolismo es el conjunto de reacciones que realiza la célula con el fin de obtener energía para su supervivencia,
como también para la síntesis de compuestos de interés tanto propio como, en algunos casos, de otras células o
grupos de células.Todos los procesos metabólicos pueden clasificarse en: (a) Catabólicos: son aquellos que degradan
biomoléculas para obtener energía en forma de ATP; generalmente son reacciones de oxidación que almacenan el
potencial electrónico generado en transportadores universales tales como el NADH, (b) Anabólicos: son aquellos que
generan biomoléculas a partir de compuestos más simples; por lo general son procesos reductivos cuyo poder
reductor proviene de los transportadores universales antes citados, (c) Anfibólicos: son aquellos con subprocesos
anabólicos y subprocesos catabólicos.

Rutas metabólicas
Las rutas metabólicas son secuencias de reacciones catalizadas enzimáticamente, tal que el producto de una enzima
sea el sustrato de la siguiente. La mayoría de los procesos metabólicos siguen rutas metabólicas precisas de distinta
longitud.

Clasificación: Las rutas pueden clasificarse según su dirección. La mayoría de las rutas metabólicas son lineales, es
decir, existe un sustrato inicial que se transforma en un producto final luego de un número preciso de pasos. Otras
rutas son ramificadas, ya que una reacción enzimática intermedia genera dos productos que siguen rutas metabólicas
propias y separadas. También encontramos rutas cíclicas, en las que el “producto final” de la ruta es el sustrato inicial,
siendo una bifurcación la que permite obtener productos netos.

Regulación: Las rutas metabólicas están reguladas por distintos métodos. El más común es el alosterismo, es decir,
ciertas sustancias se unen a un sitio distinto al activo y controlan la velocidad enzimática por modificación de su
estructura terciaria. En un gran número de casos, el regulador alostérico es un producto de la vía, lo que genera un
caso de retroinhibición. Otra manera de regularlas es la modificación covalente, fundamentalmente por fosforilación
generada por acción hormonal. En casos de regulación más potente, se utiliza el control grueso y la regulación de la
concentración de enzimas por diferencias en su síntesis. Es común que la regulación de las vías metabólicas se de
sobre los primeros pasos de las mismas, ya que de esta manera se evita el gasto de energía innecesario que
representa una vía inhibida al final, por lo que puede transcurrir hasta casi el final. Otros sitios comunes de regulación
son los pasos previos a bifurcaciones, los que generalmente están regulados por productos de ambas vías. Sin
embargo, los sitios de regulación más extendidos son las enzimas irreversibles (ΔG<<0), ya que son las que dirigen el
flujo desde sustratos a productos de la vía en general

Procesos fútiles: Dos procesos son fútiles si el producto final de uno es el sustrato inicial del otro y viceversa, y,
pueden ocurrir ambos al mismo tiempo sin ningún tipo de regulación. Todo proceso fútil gasta energía, por lo que las
células lo evitan utilizando las mismas enzimas reversibles para la gran mayoría de los pasos de la ruta, mientras que
existen enzimas distintas e irreversibles que dirigen el proceso hacia un lado o hacia el otro. Otra manera de
contrarrestar sus efectos es la compartamentalización, es decir, la reclusión de un tipo determinado de enzima en
determinada región celular especializada en esa función, lo que impide el contacto con otros ciclos opuestos que
pueden darse en otros compartimentos.

Glicólisis y glucólisis
En la glicólisis, los monosacáridos son oxidados parcialmente a dos moléculas de tres carbonos denominada
piruvato. Si la glicólisis utiliza como reactivo a la glucosa, es llamada glucólisis y es la vía central, a la cual se acoplan
las vías catabólicas de los otros monosacáridos al ingresar como intermedios de la misma.

Glucólisis:parte de la energía liberada en la oxidación de la glucosa se conserva en forma de ATP y NADH. En ciertos
tejidos, la glucosa es la única fuente de energía metabólica, mientras que algunas células la utilizan como única vía de
obtención de energía, tanto por adaptación al medio (algunos vegetales), como por imposibilidad de realizar otro tipo
de proceso (organismos anaeróbicos). Se denomina fermentación a la degradación anaeróbica de glucosa y otros
nutrientes orgánicos para obtener energía. Se basa fundamentalmente en la glucólisis, y es probablemente el primer
mecanismo para obtener energía, lo que explica la conservación de las enzimas glucolíticas en toda la evolución.
La glucosa se rompe en dos moléculas de tres carbonos (piruvato) siguiendo una vía que consta de diez pasos. Los
primeros cinco constituyen la fase preparatoria o de inversión de la energía. En estas reacciones la glucosa es
fosforilada y transformada hasta formar un compuesto simétrico. Esto se consigue mediante ATP, lo que le concede
su nombre.
Los productos finales de la fase preparatoria son dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato, que poseen una elevada
densidad de carga, y se obtienen gracias a la utilización de 2 moléculas de ATP. El retorno energético tiene lugar en la
fase de beneficios, en la que cada molécula de gliceraldehído-3-fosfato es oxidada y fosforilada por fosfato inorgánico
para generar productos de alta energía capaces de fosforilar a ADP, lo que producirá 4 moléculas de ATP por
molécula de glucosa introducida a la vía y las dos, ya mencionadas, moléculas de piruvato.También se producirá
NADH que podría utilizar su poder reductor para generar más energía mediante fosforilación oxidativa. De esta
manera, la ecuación neta del proceso será:

La degradación de la glucosa es un proceso

espontáneo en condiciones intracelulares, por lo
que es acoplada a la fosforilación del ADP
(notablemente poco espontáneo) para que pueda
suceder. En definitiva, la reacción total es
irreversible y se almacena un 60% de energía en
forma de ATP.

Destinos del piruvato: El piruvato formado puede seguir tres rutas catabólicas distintas luego de sintetizado por
glucólisis: (a) Continuación de su degradación aeróbica a dióxido de carbono, mediante el ciclo del ácido cítrico, (b)
Fermentación a lactato en hipoxia, que permite la regeneración del NAD+, (c) Fermentación a etanol por enzimas
específicas de ciertas especies (levaduras).

Funciones de la fosforilación en la glucólisis

La fosforilación es el primer paso de la glucólisis y no se revierte en ningún momento. Esto nos sugiere que su función
es imprescindible para la vía, ya que además es una causa de que el rendimiento energético del proceso disminuya.
Parece tener tres funciones:
(a) Otorgan una carga neta negativa a los intermedios de la glucólisis, lo que impide el escape de estas moléculas de
la célula sin gasto de energía.
(b) Los enlaces fosfoanhídrido que se generan en las enzimas, conservan parte de la energía del ATP (entre otros).
Esto activa a muchos compuestos, aumentando su reactividad.
(c) La fijación a los centros activos proporciona energía de fijación que contribuye a reducir la energía de activación y
a aumentar la especificidad.

3. Fase preparatoria de la glucólisis

 1) En el primer paso de la glucólisis, la glucosa es activada para
posteriores reacciones mediante la fosforilación en el carbono 6 por
ATP, dando glucosa-6-fosfato. Esta reacción es irreversible y está
catalizada por la hexoquinasa (inespecífica para monosacáridos) la
que necesita Mg2+ para funcionar. En el hígado encontramos a la
glucoquinasa, una isoenzima específica para glucosa.

2) La glucosa-6-fosfato es transformada en fructosa-6-fosfato por la

fosfohexosa isomerasa, que cataliza una isomerización reversible
aldosa-cetosa. También requiere Mg2+ para su funcionamiento.

3) La fructosa-6-fosfato se fosforila (con ATP) a fructosa-1,6-bifosfato

mediante la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). La reacción es
irreversible. Es el sitio más activo de regulación de la vía. Existen
isoenzimas que generan Fru-2,6-bifosfato, o que utilizan pirofosfato
en vez de ATP (en plantas y protistas.

4) La fructosa-1,6-bifosfato se rompe en gliceraldehído-3-fosfato

(G3P) y dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) mediante la enzima
aldolasa. En condiciones intracelulares no debería ser espontánea,
pero la utilización de los productos por los pasos siguientes de la vía,
la desplazan hacia productos.

5) Solo el G3P puede ser utilizado en los pasos siguientes de la ruta,

por lo que la DHAP se convierte en él mediante la triosa fosfato
isomerasa.

4. Fase de beneficios

El gliceraldehído-3-fosfato (G3P) obtenido en la fase de inversión es transformado a 1,3-bifosfoglicerato mediante la

gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. El grupo aldehído es oxidado a un anhídrido de ácido con ácido fosfórico
(un acil fosfato), llevándose los electrones generados, el cofactor NAD+. La enzima que actúa en este caso, se une
covalentemente al G3P mediante un enlace tioacetal con una cisteína, la que induce a la oxidación. El yodoacetato
también se une covalentemente a esta, inhibiendo su actividad. La fosfoglicerato quinasa transfiere el fosfato del
carbono 1 del 1,3-BPG a un ADP, para formar ATP y 3-fosfoglicerato (3PG). Este proceso es una fosforilación a nivel
de sustrato y se da por la alta energía libre del 1,3-BPG que le otorga un alto potencial de fosforilación.
El 3PG es mutado a 2-fosfoglicerato (2PG) mediante la fosfoglicerato mutasa. La enzima es una fosfoenzima, ya
que puede fosforilar una de sus histidinas. Esto sucede por una molécula de 2,3-BPG previamente existente. El 3PG
reacciona con esta, desfosforilando a la enzima y generando 2,3-BPG. Este puede volver a fosforilar a la enzima para
reiniciar su actividad, pero lo hace con el fosforilo en posición 3, por lo que se obtiene 2PG. Este 2PG es deshidratado
mediante la enolasa, generando fosfoenolpiruvato (PEP) un compuesto de altísima energía con un doble enlace.
Por último, el PEP es desfosforilado mediante la piruvato quinasa, obteniendo piruvato y ATP. Es otra fosforilación a
nivel de sustrato, que necesita magnesio (o manganeso) y potasio para suceder. Es irreversible y un importante punto
de regulación.

Destinos del piruvato

En condiciones aeróbicas, el piruvato se oxida a acetato, el cual entra en el ciclo del ácido cítrico para terminar su
oxidación, regenerando el NAD+ utilizado en el proceso mediante la cadena de transporte de electrones mitocondrial.
En hipoxia, el NADH generado en la glucólisis no puede ser reoxidado por el oxígeno, lo que detendría la glucólisis por
acumulación y produciría rápidamente la muerte celular. Para solventar este problema, las células primitivas (que
vivían en condiciones anaerobias) encontraron mecanismos alternativos que se basan en la re transferencia de los
electrones del NADH al piruvato sin utilizar ATP en el proceso.

Fermentación láctica
Cuando a los tejidos animales no se les puede suministrar oxígeno suficiente, el NAD+ se genera por la reducción del
piruvato a L-lactato mediante la lactato deshidrogenasa.

Este lactato puede reciclarse: se transporta por la sangre al hígado donde se convierte en glucosa. A este ciclo, se lo
denomina ciclo de Cori. Sin embargo, sobre todo en músculo, si la actividad es muy intensa, el lactato se acumula y
acidifica el medio lo que produce dolor.

Fermentación alcohólica
La levadura y otros microorganismos fermentan la glucosa a etanol y dióxido de carbono, mediante un proceso de dos
pasos denominado “fermentación alcohólica”.

En el primer paso, el piruvato se descarboxila mediante la piruvato decarboxilasa que utiliza TPP para su accionar.
En el segundo, el acetaldehído así formado se reduce a etanol mediante acción del NADH y la alcohol
deshidrogenasa. Esta reacción es utilizada en la panificación y en la producción de bebidas alcohólicas (entre otras),
y es la primera actividad biotecnológica realizada por el hombre. El ser humano no posee la piruvato decarboxilasa,
pero sí la alcohol deshidrogenasa, que es utilizada para oxidar el etanol a acetaldehído con producción de NADH. Por
otra parte, también tenemos la posibilidad de oxidar el acetaldehído a acetato, lo que genera más NADH y genera
acidosis.
Rutas alimentadoras de la glucólisis
Un gran número de glúcidos pueden ingresar en la ruta glucolítica al ser transformados en intermedios de la ruta de
inversión de ésta (ya que si fueran de la ruta de beneficios, disminuiría su efectividad energética).

Glucógeno y almidón: Ambos polisacáridos entran a la ruta mediante degradación enzimática, que genera unidades
de glucosa simple.

Fructosa: La fructosa puede entrar al ciclo por dos vías:

(a) La hexoquinasa puede fosforilarla (mediante el consumo de ATP) a fructosa-6-fosfato.
(b) En hígado, la fructoquinasa fosforila a la fructosa en el carbono 1, generando fructosa-1-fosfato, mediante ATP.
Esta puede romperse por la acción de la fructosa-1-fosfato aldolasa en dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y
gliceraldehído. Éste último se fosforila mediante la triosa quinasa con consumo de ATP, generando gliceraldehído-3-
fosfato (G3P).

Galactosa: La entrada de la galactosa a la glucólisis ocurre mediante nucleótidos azúcares o nucleósidos

difosfoazúcares. La galactosa es fosforilada en el carbono 1 mediante la galactoquinasa. Ésta será la que reaccione
con UDP-glucosa, mediante la UDP-glucosa galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, para generar glucosa-1-fosfato y
UDP-galactosa. La Glc-1-P puede mutarse (mediante una mutasa) en Glc-6-P, mientras que la UDP-galactosa, puede
generar UDP-glucosa por la UDP-glucosa 4-epimerasa. La galactosemia es una enfermedad generada por la
disfuncionalidad de alguna de las enzimas de la vía.

Manosa: La manosa puede fosforilarse mediante la hexoquinasa en manosa-6-fosfato (y ATP). Ésta, a su vez, puede
isomerizarse mediante la fosfomanosa isomerasa en fructosa-6-fosfato.

Disacáridos: El almidón y el glucógeno son degradados a disacáridos en todo el proceso digestivo, comenzando con
la α-amilasa de la saliva, y siguiendo por jugos pancreáticos. Recién en el intestino delgado, ciertas enzimas
específicas degradarán estos compuestos en monosacáridos para ser absorbidos. La lactasa es una enzima
participante en este proceso, y su carencia genera una intolerancia a la lactosa que puede resultar grave.

Glicerol: El glicerol se obtiene a partir de la degradación de lípidos. Es fosforilado mediante la glicerol quinasa (y
ATP) para formar glicerol-3-fosfato que puede ser oxidado por la glicerol fosfato deshidrogenasa a dihidroxiacetona
fosfato, reduciendo una molécula de NADH.

7. Regulación
El catabolismo de glúcidos proporciona ATP y precursores de diversos procesos biosintéticos, por lo que es de suma
importancia regularlo para mantener los niveles de ATP en un nivel constante, independientemente del tipo de
combustible utilizado para producirlo y de la velocidad de consumo. La regulación en la glucólisis se da en las tres
enzimas irreversibles, es decir, en las tres quinasas.

Las enzimas reguladoras como válvulas metabólicas

Los organismos adultos se encuentran en estados estacionarios, lo que permite su composición constante. Cuando
éste se perturba por algún cambio, los flujos a través de rutas metabólicas individuales ponen en marcha mecanismos
reguladores (homeostasis), fundamentalmente orientados al equilibrio de las concentraciones de ATP en el medio. El
flujo depende de las enzimas que pertenecen a la vía. La regulación que sufren éstas puede ser de distintas índoles:
(a) Limitada por el sustrato: la concentración instantánea del sustrato determina la actividad enzimática.
(b) Limitada por la enzima: la constante de equilibrio de la reacción es tan pequeña que la misma no puede suceder
en el medio celular. Esto genera una acumulación de sustrato, que se transforman en producto dependiendo
únicamente de la actividad enzimática. De ahí que se llame al modelo “de válvula”. Estos pasos son los pasos
limitantes de velocidad y son diana de la regulación metabólica.
Tipos de regulación: El más rápido es el alosterismo, ya que es local y generado por una respuesta directa a cambios
de composición del medio. Uno más lento es el hormonal, que afecta a tejidos enteros, permitiendo la coordinación de
las actividades metabólicas. El más lento sin embargo es el control grueso de las tasas de síntesis y degradación de
enzimas reguladoras.

Regulación hormonal de los hidratos de carbono

Además de la degradación de glucosa por la glucólisis, otros procesos generan glucosa, como la gluconeogénesis (a
partir de precursores sencillos tales como el piruvato o el lactato) o la glucógenolisis (a partir de glucógeno). Sin
embargo, el nivel de glucosa en sangre debe mantenerse constante excepto en casos de necesidad, como stress. La
regulación de esta situación está a cargo de ciertas hormonas, que afectan fundamentalmente al hígado, ya que éste
es el órgano responsable de la glucorregulación sanguínea. El páncreas sintetiza dos hormonas peptídicas: la insulina
y el glucagón, que controlan los niveles de glucosa en sangre luego de variaciones debidas a la dieta. Es decir,
disminuyen la concentración de glucosa luego de la ingesta (insulina) o la aumentan luego del ayuno prolongado
(glucagón). Por otra parte, la corteza adrenal genera una hormona esteroidea que también disminuye la cantidad de
glucosa en sangre (como la insulina) pero debido a la mayor absorción de la misma en músculo. Esta hormona es la
adrenalina (o epinefrina) que regula la disponibilidad de glucosa para realizar contracción muscular. No es ilógico
pensar entonces, que las situaciones de stress aumenten el nivel de adrenalina, lo que prepara al músculo para un
ejercicio repentino.

Regulación sobre hexoquinasa

La hexoquinasa es la primera enzima de la glucólisis. La hexoquinasa muscular es inhibida alostéricamente por su
producto (retroinhibición) la glucosa-6-fosfato. En el hígado, sin embargo, existe la glucoquinasa, una isozima de la
hexoquinasa, pero que trabaja a concentraciones de glucosa mayores. De esta manera, puede ser regulada por el
nivel directo de glucosa en sangre, ya que posee un sistema de transporte muy efectivo. Por otra parte, la
glucoquinasa no es inhibida por la Glc-6-fosfato sino por Fru-6-fosfato, lo que abre nuevas rutas de regulación. Cabe
destacar que también está retroinhibida alostéricamente por ATP.

Regulación sobre la fosfofructoquinasa-1

La glucosa-6-fosfato es un intermediario de varias rutas metabólicas paralelas. La reacción irreversible catalizada por
la PFK-1 es, por lo tanto, un sitio de regulación activa.El ATP es un inhibidor alostérico de la PFK-1, ya que es tanto
un sustrato directo de su accionar como el producto final de la ruta. De esta manera, un aumento en su concentración
indica una sobreproducción innecesaria del mismo, lo que permite una inhibición coherente de la glucólisis. Lo
opuesto sucede con el ADP y el AMP que activan su funcionamiento.
El citrato es un intermedio del ciclo del ácido cítrico, y también regula alostéricamente a la PFK-1, aunque no
directamente, sino amplificando el efecto inhibitorio del ATP.
Sin embargo, el regulador alostérico más importante es el activador fructosa-2,6-bifosfato. Ésta se genera por la
fosforilación de la fructosa-6-fosfato (F6P) por la fosfofructoquinasa II, y se desfosforila por la fructosa-2,6-
bifosfatasa. Ambas actividades enzimáticas están en la misma cadena polipeptídica, pero se intercambian mediante
la fosforilación de su extremo amino. Esta fosforilación proviene de una señal hormonal: cuando la concentración de
glucosa en sangre baja, el páncreas libera glucagón que se une a un receptor de membrana en cada una de las
células afectadas. Este provoca la liberación de cAMP (AMP cíclico), que activa una proteínquinasa específica. Ésta
fosforila la proteína de función doble, activando la acción fosfatasa, por lo que se degrada la Fru-2,6-bifosfato, y se
inhibe la acción de la PFK-1, lo que detiene la glicólisis y por lo tanto, aumenta el nivel de glucosa en sangre.

Regulación sobre la piruvato quinasa

En los vertebrados hay al menos tres isozimas de la piruvato quinasa que difieren en su distribución y regulación. El
ATP inhibe alostéricamente su actividad al disminuir su afinidad por el PEP.
Es también inhibida por acetil-CoA y por ácidos grasos de cadena larga, ambos combustibles del ciclo del ácido
cítrico. En el hígado, existe otra isozima de piruvato quinasa que se fosforila mediante otra proteínquinasa, lo que la
inhibe. Esto está producido por una cadena de fosforilación generada por el glucagón.
Tema 17: Ciclo de Krebs

El destino aeróbico del piruvato

En la mayor parte de células eucariotas y muchas bacterias que viven en condiciones aeróbicas y oxidan sus
nutrientes a dióxido de carbono y agua, la glucólisis no es más que la primera etapa de la oxidación completa de la
glucosa, ya que el piruvato sufre una oxidación mayor: se produce la respiración.
Ésta tiene tres fases principales: la generación de compuestos de dos carbono (en forma de grupos acetilos), la
oxidación enzimática de los mismos en dos moléculas de dióxido de carbono y la oxidación de coenzimas energéticas
con propiedades redox (como el NADH).
El ciclo de Krebs está presente en la segunda de las etapas de la respiración, y no solo es importante como vía
energética, sino también como generador de precursores de muchas vías biosintéticas relacionadas que reponen y
utilizan intermedios del mismo, lo que nos da la idea de una importante regulación y coordinación sobre él.

Producción de acetato
Para entrar al ácido cítrico, los esqueletos carbonados de azúcares y ácidos grasos deben ser degradados a un grupo
acetilo que se une a una coenzima (la coenzima A), para evitar la pérdida de energía. El piruvato se oxida a acetil-CoA
mediante el complejo de la piruvato deshidrogenasa por pérdida de una molécula de dióxido de carbono. Este
complejo se compone de tres enzimas y se localiza en las mitocondrias, unido a la membrana interna y necesita cinco
cofactores para su funcionamiento. Por último, está regulado por una combinación de factores y es muy similar en
funcionamiento a muchas otras enzimas mitocondriales.

1.2. La piruvato deshidrogenasa

La piruvato deshidrogenasa cataliza irreversiblemente una descarboxilación oxidativa en el que el grupo carboxilo del
piruvato se pierde como dióxido de carbono mientras que los otros dos carbonos son transferidos a la coenzima A
covalentemente, y mediante la formación de una molécula de NADH.

El complejo está formado por copias múltiples de las mismas enzimas: piruvato deshidrogenasa (E1), dihidrolipoil
transacetilasa (E2) y dihidrolipoil deshidrogenasa (E3), en número variable dependiendo del organismo. La E2
constituye el núcleo del conjunto al que se unen las demás, con la adición de dos proteínas reguladoras (una proteín
quinasa y una fosfoproteína fosfatasa).

1.2.1. Mecanismo de reacción

La E1 posee unido un TPP que ataca al carbonilo del piruvato, lo que provoca la liberación del carboxilo como dióxido
de carbono, y la reducción del carbonilo a alcohol. La E2 oxida el alcohol a ácido carboxílico, utilizando los dos
electrones liberados en el proceso para reducir el enlace disulfuro del lipoato unido a ella. De este modo, el acetato se
puede tioesterificar con uno de los tioles. La coenzima A es la encargada de liberar el acetato del lipoato, generando
acetil-CoA que se libera, y dejando al lipoato reducido. La E3 está unida a un FAD oxidado en todo el proceso, que
será el encargado de reoxidar y formar nuevamente el enlace disulfuro del lipoato, quedando como FADH2, y pudiendo
ceder su poder reductor a un NAD+ del medio (esto no es común, se da en este caso simplemente debido al medio
proteico que rodea al FAD). De esta manera, se regenera el sustrato de partida y se produce dióxido de carbono,
acetil-CoA y NADH.

2. El Ciclo de Krebs
 El Ciclo de Krebs es una vía metabólica cíclica aeróbica cuyo sustrato es el acetil-CoA y genera dióxido de carbono,
ATP y NADH. Cabe destacar que el único sustrato de la vía es el antes dicho, ya que los demás son regenerados al
suceder.

Su ecuación general neta es:

Se compone de ocho pasos, de los cuales la mayoría son oxidaciones que conservan eficientemente la energía
liberada. Por otra parte, sus intermediarios son comunes a muchas otras vías biosintéticas.

El Ciclo de Krebs se da en la mitocondria, donde se da la oxidación de ácidos grasos y donde ingresa también el
piruvato luego de la glicólisis.

2.1. Pasos del ciclo

La primera reacción condensa el acetil-CoA con oxalacetato (OAA) para dar citrato, un ácido tricarboxílico, mediante
la citrato sintasa. El carbono metílico del grupo acetilo se une al carbonílico del OAA, para luego liberar la coenzima
A. Es una reacción irreversible, lo que permite que efectivamente suceda la reacción, debido a que el OAA en el
interior mitocondrial se encuentra en concentraciones muy bajas. El OAA genera un cambio conformacional
importante al unirse a la enzima, que permite la unión del acetil-CoA y la formación del intermedio reactivo.

La segunda reacción del ciclo es la transformación de citrato en isocitrato, otro ácido tricarboxílico que posee una
disposición espacial distinta. Esto se da mediante la enzima aconitasa que deshidrata al citrato, generando el cis-
aconitato (con un doble enlace) que luego es rehidratado para generar el isocitrato. La aconitasa posee un centro
hierro-azufre (Fe-S) en su estructura, que puede ser rápidamente inhibido por fluoruros.

Por otra parte, la aconitasa posee un mecanismo raro en el que intervienen tres sitios de unión para el citrato. Esto
asegura que se una a ellos por el lado del carbono proveniente del Acetil-CoA, lo que da estereoespecificidad a la
reacción, más allá que el citrato es aquiral.

La tercera etapa del ciclo es la descarboxilación oxidativa del isocitrato mediante la isocitrato deshidrogenasa, para
formar α-cetoglutarato mediante la síntesis de NADH o NADPH (dependiendo de la isozima).
 La cuarta etapa del ciclo es la decarboxilación oxidativa del α-cetoglutarato por la α-cetoglutarato deshidrogenasa
para formar succinil-CoA, generando NADH y utilizando Coenzima A del medio. La α-cetoglutarato deshidrogenasa es
casi idéntica al complejo de la piruvato deshidrogenasa comentado anteriormente.

La quinta etapa del ciclo es el reemplazo del tioéster formado con la Coenzima-A por un oxhidrilo, liberando suficiente
energía como para fosforilar un GDP por la succinil-CoA sintetasa. De esta manera, se obtiene succinato y GTP.
Éste último puede donar su grupo fosfato para formar ATP mediante la catálisis de la nucleósido difosfato quinasa, sin
requerimientos energético extra.

La sexta etapa del ciclo es la oxidación del succinato a fumarato mediante la succinato deshidrogenasa, una
enzima unida a la membrana mitocondrial interna (en eucariotas) que participa en la cadena de electrones, y posee
FAD y un corazón de Fe-S. Por otra parte, es inhibida por el malonato, estructuralmente similar al succinato, pero
incapaz de llevar a cabo la reacción enzimática.

La séptima etapa del ciclo es la hidratación del fumarato, para generar L-malato, por la fumarasa, la que utiliza el
trans-fumarato estereoespecíficamente.

La octava y última etapa del ciclo es la oxidación del L-malato en oxaloacetato mediante la L-malato
deshidrogenasa ligada a NAD+. La reacción está muy desplazada hacia reactivos, pero en la célula esto se
compensa por el consumo de OAA por la citrato sintasa, con el fin de recomenzar el ciclo.

3. Cuestiones energéticas

3.1. Balance Energético

 La oxidación de los dos carbonos que ingresan al ciclo en forma de Acetil-CoA genera una gran cantidad de energía
que se almacena en GTP, NADH y FADH2. Sin embargo, los dos carbonos que se liberan como dióxido de carbono no
son los que provienen del acetil-CoA sino que se necesitarán varias vueltas para conseguir que esto suceda.

El Ciclo de Krebs genera más de 30 moléculas de ATP por vuelta, no solo por la fosforilación a sustrato que se da en
la Succinil-Coa sintetasa sino también por la energía almacenada en las coenzimas reducidas.

3.2. Transporte de NADH

El NAD+ y el NADH del citosol no pueden atravesar las membranas mitocondriales, por lo que no puede haber
intercambio directo entre estos dos compartimentos. Por otra parte, no existe algún tipo de transportador de
membrana específico para ellos tampoco.

Esto sucede, porque una forma de regulación de los procesos catabólicos mitocondriales es la actividad de ciertas
lanzaderas sensibles a cambios del medio, que permiten el transporte de los electrones del NADH citosólico al NAD+
mitocondrial. Existen dos lanzaderas: la de glicerol-fosfato y la de malato-aspartato.

3.2.1. Lanzadera de malato-aspartato

La lanzadera de malato-aspartato está compuesta por dos proteínas transmembrana, una que transporta hacia el
interior de la mitocondria malato mediante transporte inverso de α-cetoglutarato, y otra que transporta hacia el exterior
de la mitocondria aspartato, mediante el transporte inverso de glutamato.

Este aspartato citosólico es rápidamente transaminado a oxalacetato por una transaminasa (dependiente de PLP),
mediante la transaminación simultánea de α-cetoglutarato a glutamato. El oxaloacetato puede transformarse en
malato mediante la malato deshidrogenasa citosólica, utilizando NADH. El malato es transportado al interior celular.

Este malato de la matriz puede reconvertirse a oxaloacetato, generando NADH. El oxaloacetato a su vez, puede
transaminarse a aspartato, mediante la misma transaminasa que transforma a su vez glutamato en α-cetoglutarato.

Esta lanzadera funciona si la concentración de NADH citosólica es alta, y la de

la mitocondria, baja.

3.2.2. Lanzadera del glicerol-fosfato

Funciona en otros tejidos, fundamentalmente en músculo esquelético y cerebro.

Esta, cede los equivalentes de reducción desde el NADH al FAD de una enzima
de membrana mitocondrial (la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa mitoncondrial) que los dirige hacia el pool de
ubiquinonas para que ingresen a la cadena de electrones directamente, lo que disminuye su capacidad energética con
respecto a los electrones que ingresan por malato-aspartato.

4. Regulación

La regulación de las enzima clave del ciclo asegura la producción de intermedios y productos a la velocidad requerida
para mantener a la célula en estado estacionario estable y evitar la sobreproducción o carencia. Los dos niveles
principales de regulación son: la generación de Acetil-CoA (por la piruvato deshidrogenasa) y su consumo (por la
citrato sintasa). También hay regulación sobre la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa.

4.1. Sobre la piruvato deshidrogenasa

Está fuertemente inhibida por el ATP, el acetil-CoA y el NADH, es decir, sus productos, así como también por los
ácidos grasos de cadena larga. Por otra parte, es activada por el AMP, la Coenzima A libre, el calcio y el NAD+.

Un segundo nivel de regulación lo da la modificación covalente, ya que es inhibido cuando se fosforila

(reversiblemente) un residuo específico de serina de la E1 por la proteín quinasa propia del complejo. Esta quinasa es
activada alostéricamente por ATP.

4.2. Sobre sus pasos exergónicos

Cada uno de los tres pasos altamente exergónicos del ciclo pueden llegar a ser pasos limitantes de la velocidad en
determinadas circunstancias, ya que pueden variar con el estado metabólico de la célula (citrato sintasa), o su reserva
energética (deshidrogenasas).

La acumulación de productos inhibe los tres pasos limitantes del ciclo: el succinil CoA a la α-cetoglutarato
deshidrogenasa y a la citrato sintasa, el citrato a la citrato sintasa y el ATP a la citrato sintasa y la isocitrato
deshidrogenasa. El ADP y el AMP pueden servir como activadores débiles de la citrato sintasa y la isocitrato
deshidrogenasa.

El calcio activa las deshidrogenasas en músculo, ya que es la principal respuesta intercelular a la regulación
hormonal.

Cabe aclarar que el Ciclo de Krebs está regulado coordinadamente con la glucólisis para mantener flujos constantes.
Un ejemplo de esto, es la inhibición de la fosfofructoquinasa-1 por el citrato.