UNIVERSIDAD DE AZUAY

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

BIOTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

NOMBRES:

DANIELA ORTIZ

MAYRA PEÑA

DOCENTE:

DR. RODRIGO CAROCA

TEMA:

INACTIVACION DE GLIADINAS PRESENTES EN EL

GLÚTEN MEDIANTE CRISPR-CAS9

CUENCA-ECUADOR
 TEMA: INACTIVACION DE GLIADINAS PRESENTES EN EL

GLÚTEN MEDIANTE CRISPR-CAS9

1. AUTOR(ES) DEL EXAMEN FINAL:

- Mayra Peña
- Daniela Ortiz
2. RESUMEN

Tomando el hecho de que el gluten del trigo es una de los alimentos que causa mayor alergia y
problemas gastrointestinales en la población a nivel mundial, es por eso que este trabajo se
enfoca y propone minimizar la reacción alérgica de este alimento, por ello se plantea la técnica
de CRISPR/Cas9, para la inactivación de las gliadinas. En la etapa en donde observaremos si
funciona o no la inactivación de esta enzima utilizaremos técnicas como la secuenciación de
Illumina o mediante el análisis de Acid-PAGE de CRISPR/Ca9. Y finalmente para la comprobación
de alergenicidad de el gluten modificado, se realizarán ensayos con ratones de laboratorio
hipersensible a esta proteína, para así poder comprobar la disminuimos la este parte alérgica del
trigo y así tener un producto en el cual personas celiacas podrían consumirlo.

3. MARCO TEÓRICO

El trigo es una planta gramínea que contiene espigas. Esto significa que es un tipo de hierba. Su
altura puede variar desde los treinta centímetros hasta un metro y medio de largo. El tallo,
recto, cilíndrico, tienen hojas largas y delgadas que terminan en forma de lanza, por lo que se les
denomina lanceoladas. Esta planta crece en climas subtropicales, templados o moderadamente
fríos. Las plantas requieren una cantidad moderada de agua, entre 229 y 762 milímetros de
precipitaciones. Los trigos de invierno se cultivan en regiones templadas. La temperatura
mínima para que crezca bien es de 13ºC. (Frías, 2012)

Los alérgenos son antígenos que provocan reacciones alérgicas. Aunque cualquier proteína que
se encuentre en los alimentos puede sensibilizar el sistema inmunológico en teoría, la mayoría
de los alérgenos que reaccionan con inmunoglobulinas IgE e IgG son proteínas o glicoproteínas
relativamente resistentes a la digestión y a la cocción. Los alérgenos alimentarios se incluyen en
un número limitado de familias de proteínas, cada una con diferentes propiedades moleculares,
lo que que da lugar a diferentes vías de sensibilización según la familia de alérgenos. (De la Cruz,
González, García, & Martín, 2018)
 La alergia al trigo acontece cuando el cuerpo produce anticuerpos contra las proteínas del trigo.
En la enfermedad celíaca, una proteína de trigo específica, el gluten, provoca otro tipo de
respuesta anormal del sistema inmunitario. El gluten del trigo contiene aproximadamente un 80
% de proteínas, 5 a 10 % de grasas, almidón residual, carbohidratos y proteínas insolubles en
agua que se retienen en la masa. Se compone de dos clases principales de proteínas: gliadina
(una prolamina) y glutenina (una glutelina). (Grima, 2019)

La enfermedad celiaca o enteropatía sensible al gluten es una enfermedad caracterizada por una
alteración de la absorción intestinal provocada por una inflamación crónica y atrofia de la
mucosa del intestino delgado debido a la exposición al gluten en la dieta, que afecta a personas
con predisposición genética. Por definición, existen dos situaciones predominantes para la
aparición de la enfermedad: la predisposición genética y la exposición a antígenos (gluten y
proteínas relacionadas). (Remes-Troche, y otros, 2018)

CRISPR

El sistema CRISPR/Cas incluye un complejo enzimático dirigido por secuencias de ácido

ribonucleico (ARN), que forma parte del mecanismo de defensa (inmunidad) que utilizan las
bacterias y las arqueas para evitar la entrada de ácido desoxirribonucleico (ADN). Sería algo
parecido a unas tijeras capaces de cortar cualquier molécula de ADN de forma muy precisa y
totalmente controlada. (Rangel, 2019)

Ilustración 1.. El sistema CRISPR/Cas involucra un crRNA maduro unido a la proteína Cas, lo cual
conforma un complejo que reconoce a los ácidos nucleicos extraños y destruye las secuencias
complementarias gracias a su actividad de corte(flechas rojas).Las secuencia PAM se señala en amarillo.

En general, el sistema CRISPR/Cas opera en tres etapas para inducir una respuesta inmune
adecuada. En la primera, pequeñas porciones de ADN derivados de los virus (bacteriófagos) o
plásmidos invasores se incorporan cerca de una región del genoma bacteriano con una gran
cantidad de secuencias palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR,
por sus siglas en inglés), en la segunda etapa, se transcriben y producen un ARN no codificante
 largo, denominado ARN CRISPR (pre-crRNA, por sus siglas en inglés), que es procesado por unas
proteínas conocidas como Cas (siglas en inglés de sistema asociado a CRISPR) y otros factores
del huésped para generar crRNA cortos y maduros. Finalmente, el crRNA maduro se combina
con las proteínas Cas y forma un complejo que reconoce a los ácidos nucleicos extraños y
destruye las secuencias complementarias de su fragmento asociado mediante la actividad
endonucleolítica (de corte) de las enzimas Cas, protegiendo asi a la célula de futuras intrusiones
del mismo invasor. (Rangel, 2019)

Ilustración 2.Inmunidad propiciada por el sistema CRISPR/Cas en bacterias. El sistema funciona en tres
etapas. En la primera, un ADN derivado de un virus o plásmido invasor se incorpora entre los repetidos
(R), conocidos como CRISPR. En la segunda etapa, se genera un ARN no codificante largo (Pre-crRNA),
que se procesa. Finalmente, se ensambla el crRNA maduro con la proteína Cas, protegiendo así a la
célula del huésped de futuras infecciones.

CRISP-Cas9

Los primeros indicios del sistema CRISPR-Cas9 van desde el 1987 cuando unos científicos
japoneses de la Universidad de Osaka estudiaron el gen de la enzima Ia que participa en la
conversión isoenzimática de la fosfatasa alcalina de la bacteria Escherichia coli. Encontraron la
presencia de secuencias repetidas de 29 nucleótidos ubicadas a la misma distancia entre sí a lo
largo del ADN bacteriano (Fernández, 2019).

El sistema CRISPR tipo II incluye las nucleasas Cas9, la matriz de ARN cr (dirige a las
proteínas CRISPR inmunogénicas, para encontrar destruir secuencias invasoras coincidentes)
 codifican los ARN guía y un ARN cr transactivador que facilita el procesamiento del ARN cr matriz
en unidades discretas. Cada unidad de ARN cr contiene una secuencia líder de 20 nt y una
repetición directa parcial, la primera de las cuales dirige a Cas9 a una diana del ADN de 20 pares
de bases a través de la unión de bases Watson-Crick (Ran, y otros, 2013).

Todas las técnicas NGS (Secuenciación de Nueva Generación) comparten la misma capacidad de
secuenciar una gran cantidad de fragmentos de ADN en paralelo en un corto periodo de tiempo.
Con este fin, siguen un enfoque metodológico similar que se puede resumir en cinco pasos: 1)
dividir el ADN en múltiples fragmentos, 2) marcar el ADN por medio de primers o adaptadores
que indican el punto de partida de la replicación, 3) amplificación de los fragmentos de ADN
marcados con adaptadores por métodos basados en reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
por sus siglas en inglés), 4) la secuenciación o lectura de los fragmentos de ADN y 5) la
secuenciación completa por medio de secuencias de referencia y exportación a ficheros de
almacenamiento de datos. (Rubio, Pacheco-Orozco, Milena Gómez, Perdomo, & García-Robles,
2020)

La secuenciación mediante Illumina se caracteriza por la ejecución de los siguientes procesos: a.

La amplificación de los fragmentos de ADN para la generación del clúster (colonias del mismo
fragmento) se realiza mediante el método de PCR en puente. b. La detección de bases en la
secuenciación se hace a través de etiquetas fluorescentes. (Rubio, Pacheco-Orozco, Milena
Gómez, Perdomo, & García-Robles, 2020)

4. PROBLEMÁTICA Y MOTIVACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

El trigo es un tipo de cereal fuentes de hidratos de carbono complejos y con una buena
proporción de proteínas de origen vegetal, el trigo contiene gluten en este caso como una de las
proteínas principales de este por lo que se trata de un tipo de cereal que los intolerantes al
gluten deben evitar.
Las reacciones alérgicas causadas por el trigo se pueden prevenir evitando estos alimentos, pero
si bien esto sueno simple es difícil en la práctica, evitar este alimento significa perder opciones
de alimentos saludables ya que es un alimento potencialmente nutricional, provee proteínas,
fibra y es una gran fuente de energía. La sociedad con alergias alimentarias puede esforzarse
para no comer estos alimentos, pero es posible la exposición accidental al maní lo que puede
conducir a hospitalización.
5. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN
- ¿Existe la posibilidad de inactivar el gen de la proteína del gluten para poder producir
Triticum aestivum L. que no cause reacciona alérgica por parte del gluten mediante la
técnica de CRISPR/Cas9?
6. OBJETIVO GENERAL
- Investigar la proteína alérgeno del Triticum aestivum L y modificar el genoma del trigo,
inactivando el gen alérgeno, mediante la técnica de CRISPR/Cas9.
7. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Comprobar la ausencia de gliadinas de la parte del gluten del trigo modificado.
- Evaluar la respuesta inmunológica con experimentos de laboratorio en ratones con el gluten
modificado.
- Aumentar las opciones de alimentos para las personas con alergias con la nueva
modificación hecha en el trigo.
8. METODOLOGÍA
CRISPR/Cas9
El sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 desarrollado recientemente tiene el potencial de
modificar de forma simultanea y precisa múltiples epítopos codificados por gliadina y/o eliminar
algunos de los genes, manteniendo potencialmente la calidad tecnológica alimentaria de las
proteínas de la gliadina, la aplicación de CRISPR/Cas9 ha tenido éxito para la mutagénesis
dirigida de genes de copia en los tres loci homólogos en el trigo hexaploide.
En la edición de genes CRISPR/Cas9, un solo ARN guía (sgRNA) dirige la endonucleasa Cas9 a los
sitios de ADN objetivo donde crea una ruptura doble de cadena, durante la reparación, el
mecanismo innato de reparación de ADN de la planta puede generar errores, en el caso de la
gliadina repetidos en el tándem en el trigo, puedo ocurrió roturas simultaneas de doble cadena
en genes consecutivos, lo que puede resultar en la eliminación de grandes fragmentos de ADN
que portan uno o más genes de gliadina. (Jouanin, y otros, 2020)
Ilustración3. Edición y eliminación de genes mediada por CRISPR/Cas9 frente a silenciamiento de genes
de gliadina en trigo mediado por ARNi

A la izquierda de la ilustración 1: CRISPR/CAS9 con gRNA específicos de la gliadina dirigidos a

genes de la gliadina que dan como resultado la perdida de fragmentos genómicos que contiene
genes de la gliadina completos y/o pequeñas deleciones internas en los genes de la gliadina.
A la derecha de la ilustración 1: Una construcción de ARNi dirigida de los genes de gliadina que
se ha insertado en el ADN genómico del trigo produce pequeños ARN de interferencia (siARN),
quien se une al ARNm de la gliadina, El complejo de silenciamiento inducido por RNA vegetal
(RISC), como resultado de la degradación del ARNm y el silenciamiento de la expresión del gen la
gliadina. (Jouanin, y otros, 2020)
Detección de ediciones en genes de gliadina a nivel ADN
El genoma del trigo harinero hexaploide está compuesto por tres subgenomas diploides (2n= 6x
= AABBDD), tiene un tamaño de 17 Gb y contiene una gran cantidad de secuencias repetidas. Se
puede aplicar la secuenciación del amplicón de la región diana o una etapa de reducción de la
complejidad en el ADN genómico que se describe a continuación. (Jouanin, y otros, 2020)

Secuenciación de amplicones
En el estudio de Sanchez- León et al. se seleccionaron 47 líneas T1 y se confirmo la mutación
inducida por CRISPR/Cas9 mediante la amplificación de las regiones objetivo mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida de la secuencia Illumuna MiSeq de los
amplicones mediante lecturas de extremos emparejados 2 x 280 pb. (Jouanin, y otros, 2020)
Enriquecimiento GlutEnSeq
Una metodología de captura de exoma de enriquecimiento de genes fue desarrollada por
Jouanin et al. Para extraer todos los genes del gluten del genoma del trigo, reduciendo así la
complejidad del ADN antes de la secuenciación. Denominado GutEnSeq, este enfoque utiliza
sondas que representan todas las variaciones de las secuencias conocidas presentes en miles de
secuencias de genes de prolamina disponibles de numerosas especies y variedades de Triticum.
(Jouanin, y otros, 2020)
Los genes de gluten extraídos se secuenciaron utilizando lecturas de extremo emparejando
illumina MiSeq 2 x 250 pb y se analizaron con el genoma de referencia Chinese Srping RefSeq
v1.0, el análisis de la secuencia revelo que las secuencias del gen del gluten generalmente se
enq8uiquesian alrededor de 10.000 veces, las líneas mutantes de la gliadina CRISPR/Cas9 de
Fielder revelaron ejemplos de una deleción homocigota de locus y-gliadina Gli-1 en el
cromosoma1b y una deleción heterocigota de locus α-gliadina Gli-2 en el cromosoma 6 A.
Todavía se requiere más análisis bioinformáticos de las lecturas de secuencia para determinar
qué tan efectivo es GlutEnSeq en la detección de pequeñas inserciones/ deleciones en el sitio de
CRISPR/Cas9 en los genes de gliadina y por lo tanto la eficacia en un gran programa de
detección. (Jouanin, y otros, 2020)
Detección de ediciones en genes de gliadina a nivel proteína
Acid-PAGE es una técnica de electroforesis en gel no desnaturalizada confiable y bien conocida
que se utiliza para diferenciar e identificar variedades de trigo en función de su perfil de
proteína gliadina. Acid-PAGE o SDS-PAGE se ha utilizado en todos los estudios de CRISPR/Cas9
de genes de gliadina publicados hasta la fecha. Sim embargo este no brinda información
completa sobre proteínas de gluten ya que las manchas de proteína se superponen, como es
visible en la electroforesis 2D. Por lo tanto, los cambios en los perfiles de electroforesis en un gel
unidimensional deben confirmase mediante técnicas proteómicas. (Jouanin, y otros, 2020)

Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

Sanchez-León et al. Utilizaron cromatografía liquida de alta resolución de fase reversa para
cuantificar glutelinas y gliadinas en semi-semillas de líneas CRISPR/Cas9. (Jouanin, y otros, 2020)
Evaluación de la respuesta inmunológica en ratones de prueba
 Con fin de comprobar que la Triticum aestivum L modificado ya no cause reacción alérgica
producida por las gliadinas, se utilizara ratones de laboratorio los cuales el 50 % se alimentó con
Triticum aestivum L normal y el otro 50% con Triticum aestivum L modificado y por lo cual se
comprobó mediante observación la presencia o ausencia de esta reacción alérgica.
En otro caso se pondrá a prueba la seguridad del pan en ratas y posteriormente se uso en un
desafío alimentario con personas con NCWS (sensibilidad al trigo no celíaca). (Jouanin, y otros,
2020)
9. RESULTADOS ESPERADOS
Con la técnica de CRISPR/Cas9 se inactivo el gen alérgeno del gluten. Una manera de comprobar
es realizando una PCR del tejido modificado.
Después de un tiempo considerable desde la modificación a nuestro trigo, esperamos obtener
las primeras plantas de la nueva generación creada de Triticum aestivum L modificado.
Los ratones de laboratorio con hipersensibilidad al gluten alimentados con Triticum aestivum L
modificado se espera que no presenten la reacción alérgica. Sin embargo, podría existir la
posibilidad de que presenten reacción alérgica otras gliadinas presenten y que tengan reacción
alérgica lo que tendríamos que realizar nuevamente la inactivación de esa nueva parte alérgica
que presento una nueva gliadina mediante la técnica ya mencionada.

BIBLIOGRAFÍA

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