Prácticas de Biología Molecular – Semestre 2023-II

PRÁCTICA
AMPLIFICACIÓN DE DNA MEDIANTE PCR

1. MARCO TEÓRICO

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es una técnica
mediante la cual se pueden producir múltiples copias de un segmento corto específico de
ADN, delimitado por primers o cebadores, a través de “n” ciclos de temperatura, a fin de
obtener un número exponencial (2n) de copias de doble hebra del producto amplificado.

Muchos factores pueden afectar la amplificación, principalmente: calidad del ADN

molde, la composición del buffer, la especificidad y concentración de los cebadores, la
concentración de los dNTPs, el tipo de ADN polimerasa, número de ciclos, condiciones
del ciclo (tanto en temperatura como duración de cada fase).

Componentes de la PCR

Para lograr la reacción de amplificación del ADN, se requieren de algunos componentes

importantes como:
 ADN molde o template
 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
 ADN polimerasa termoestable
 Cebadores (o primers o iniciadores)
 Buffer de PCR
 Catión divalente (Mg++)

La selección de una región en particular a amplificar depende de los primers. Estos

constituyen una secuencia corta de oligonucleótidos de ADN, de aproximadamente 25 –
30 nt, que son utilizados para iniciar la síntesis de ADN. Existen diversos tipos de
cebadores, como los denominados: universales, cebadores específicos, degenerados, con
cola o tailed-primers, entre otros (Tabla 1).

Tabla 1. Lista de algunas secuencias de cebadores empleados para la amplificación

de genes de procariotas y eucariotas.
Tamaño
Gen (marcador) ID Primer Secuencia (5’ - 3’) Referencia
(kb)

27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
~ Lane
ARNr 16S 16S Procaritoas 1.4
(1991)
1492R TACGGTTACCTTGTTACGACTT

Citrocromo LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

COI-5P Eucariotas ~ Folmer et
oxidasa 0.65
(mtDNA) (animales) al. (1994)
subuinidad 1 HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

Ribulosa-1,5- rbcLaF ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC

rbcL Eucariotas ~ CBOL
bisfosfato 0.68
(cpDNA) (vegetales) GTAAAATCAAGTCCACCRCG (2009)
carboxilasa rbcLbR

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Fases de una PCR

La PCR consiste en ciclos de temperaturas asociados a los procesos de: desnaturalización,

annealing o hibridación y extensión (Fig. 1). Así, un ciclo típico de PCR consiste en 3
pasos:

a. Denaturación: necesaria para convertir el dsDNA (ADN doble hebra) en ssDNA

(ADN hebra simple), generalmente son altas temperaturas (94 - 95°C).

b. Hibridación: también denominada annealing, donde ocurre la hibridación de los

cebadores (forward y reverse) en la región complementaria del ssDNA (ADN hebra
simple) molde. Generalmente, las temperaturas a utilizar están entre 45°C – 60 °C
(Ta). La Ta se establece teniendo como referencia la temperatura de melting (Tm)
de los cebadores. Así, si la Ta es muy baja entonces puede conducir a la formación
de productos inespecíficos (dado por el incremento de malos apareamientos)
mientras que a Ta muy altas se tendría un bajo rendimiento de la PCR (dado por la
reducción en la formación de híbridos ssDNA molde – cebador).

c. Extensión: donde ocurre la extensión del ADN por medio de una polimerasa
termoestable, a partir del extremo 3´OH del cebador. Se establece considerando la
temperatura óptima de la enzima a utilizar en la reacción.

Figura 1. Esquema de temperaturas y tiempos involucrados en cada fase de una PCR.

dsDNA = double strand DNA (ADN de doble hebra); ssDNA = single strand DNA(ADN
de hebra simple); P1 P2 = cebadores.

- Temperatura de melting (Tm)

La temperatura de melting o de fusión de los primers, es la temperatura en la cual el

50% de oligonucleótidos se encuentra en dsDNA o hibridizado y el otro 50% en
ssDNA o hebra simple. Se puede calcular utilizando la siguiente fórmula (para
secuencias de corto tamaño):

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Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) °C

Existen diferentes calculadoras online con los que se puede calcular la Tm de los
cebadores, como por ejemplo http://insilico.ehu.es/tm.php

- Número de ciclos

Teóricamente, en cada ciclo de PCR ocurre la duplicación de la cantidad de ADN

molde target, por lo que la tasa de amplificación es 2n, donde n = número de ciclos
de PCR. En esta situación, se estaría obteniendo el máximo Rendimiento de una PCR.
La eficacia de una PCR puede ser medida por su Especificidad, Eficiencia
(rendimiento) y fidelidad.

El rendimiento del producto de una PCR dependerá entonces de la cantidad de ADN

template, la eficiencia y el número de ciclos de amplificación. Una alta fidelidad
dependerá de la cantidad de errores incorporados en el ADN, inducidos por la ADN
polimerasa. La especificidad de una PCR depende fuertemente de la temperatura de
melting.

Variantes de PCR

Existen diferentes tipos de PCR, siendo el más utilizado: PCR punto final (o PCR
convencional), donde el producto amplificado se evalúa al finalizar los ciclos, mediante
electroforesis utilizando una matriz de separación, como por ejemplo geles de agarosa;
por lo que la detección y cuantificación del producto debe ser analizado en un gel o
mediante un analizador de imágenes. Sin embargo, por la necesidad de una cuantificación
robusta, la PCR cuantitativa fue desarrollada.

- PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR)

A diferencia de la PCR punto final, en el método de PCR en tiempo real o PCR

cuantitativa (qPCR) el producto amplificado es medido en cada ciclo durante la fase
exponencial (Fig. 2).

Figura 2. Cinética de la PCR.

En qPCR, la cantidad de producto es medida gracias a la detección de moléculas

fluorescentes específicas, la señal es directamente proporcional a la cantidad de
producto presente. Los reporteros fluorescentes pueden ser moléculas que se unen a
los surcos de dsDNA (por ejemplo, SYBR Green), o moléculas fluorescentes unidas
a los primers, o sondas que hibridan con el producto durante la amplificación (por
ejemplo, sondas TaqMan). El cambio de fluorescencia es medido por un instrumento

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que combina la capacidad de repetir ciclos de temperatura, detectar la fluorescencia

en cada ciclo, y guardar la información, llamado termociclador de PCR en tiempo
real.

Si graficamos la fluorescencia versus el número de ciclos, obtenemos un gráfico de

amplificación que representa la acumulación del producto durante todo el ciclo de
PCR. De la Fig. 3 podemos definir conceptos como:
 Nivel basal (baseline): Nivel de señal donde la fluorescencia es detectada en los
límites por el instrumento.
 Fluorescencia relativa (△Rn): Incremento de la cantidad de fluorescencia en cada
ciclo.
 Umbral (Threshold): Nivel de fluorescencia arbitrario seleccionado tomando en
cuenta el nivel basal. Las señales que sobrepasen dicho umbral serán consideradas
como reales y podrá establecerse un Ct.
 Ct (cycle threshold): Número de ciclo de PCR donde la fluorescencia supera el
umbral establecido.

Figura 3. Gráfico de amplificación en qPCR. Se muestra la fluorescencia relativa en

función del número de ciclo. Las curvas pertenecen a diluciones seriadas de una
muestra de ADN.

Objetivos
 Conocer los principios básicos de una PCR
 Conocer los parámetros a considerar para establecer ciclos y condiciones
adecuadas para una amplificación de una región de ADN por PCR

2. MATERIALES

Materiales que traerán los alumnos por mesa:

- 1 rollo de papel toalla
- 1 botella de alcohol medicinal
- Guantes de latex o nitrilo (1 par de guantes por alumno)
- Extracciones de ADN obtenidos en clase pasada

Materiales de laboratorio
- Microtubos 0.2 mL, 0.6 mL y 1.5 mL
- Racks portatubos
- Micropipetas P10, P200
- Puntas o tips 0.5-10 uL, 20-200uL

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- Kit de PCR
Equipos
- Termociclador
- Minispin
- Vortex

3. PARTE EXPERIMENTAL

Pautas antes de iniciar la parte experimental:

- Realizar todo el trabajo en frío (colocar los tubos sobre hielo o colocarlos
sobre gel packs).
- Reconocer el material y equipos necesarios para realizar la PCR:
o Equipo: Termociclador, vortex, minispin
o Materiales: micropipetas automáticas, racks, tips, microtubos de
diferentes volúmenes.
o Reactivos: kit de PCR

- Limpiar el área a trabajar con etanol y papel toalla.

- Colocarse los guantes, limpiarse las manos con etanol y secarse con papel toalla.
- Siguiendo las indicaciones del profesor, realice el reconocimiento y función de:
micropipetas automáticas (de 0.5-10 uL, 10-100 uL, 20-200 uL), los racks con
puntas (o tips) para las diferentes micropipetas, microtubos (0.6 mL, 0.2 mL).
- Practique el proceso correcto de manipulación de una micropipeta (toma y
expulsión de los tips, pipeteo de volúmenes diferentes) utilizando la micropipeta
de 20-200 uL, tips amarillos y microtubos de 1.5 mL.

3.1. PROCEDIMIENTO 1. Identificación los componentes de la reacción de PCR

Tabla 1. Kit de PCR y región a amplificar

Nombre del kit de PCR
- Tipo de DNA polimerasa
- Mg (concentración)
- Buffer PCR
- dNTPs

Cebadores
- Nombre de cebadores Forward:
Reverse:
- Temperatura de melting Forward:
Reverse:
- Región a amplificar
- Tipo de cebadores
- Tamaño esperado de
amplificado (pb)

Preguntas para el informe:

- Explique qué tipo de DNA polimerasa utilizará, ventajas y desventajas.
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- ¿Cómo se puede conocer el tamaño del amplificado que se obtendría con los
cebadores a utilizar?
- ¿Qué características debe tener un set de primers (F y R) para utilizarlos
juntos en una reacción de PCR?
- ¿Cuáles considera que son los componentes críticos en una PCR, para
establecer las condiciones óptimas de la reacción?

3.2. PROCEDIMIENTO 2. Determinación de condiciones óptimas de la reacción

de PCR

a. Ciclo de PCR

Establezca un ciclo de PCR, considerando

- Kit de PCR asignado
- Región a amplificar
Complete la tabla 2

Tabla 2. Condiciones de PCR considerando la enzima, la región a amplificar

utilizando los cebadores designados
Kit de PCR: …………………………………………………………………………...
Región a amplificar: …………… Tamaño de amplificado: …………
Tm:………
Temperatura óptima de actividad de la DNA Polimerasa: ………………………

ETAPA Número de ciclos T (°C) x tiempo (min o s)

1. 1X ……°C x …..

2. ……°C x …..

3. …… X ……°C x …..

4. ……°C x …..

5. 1X ……°C x …..

b. Preparación del master mix

- Considerando el Kit de PCR asignado, completar la tabla 3 (tener en cuenta las

sugerencias dadas por el fabricante del kit de PCR).

- Realice los cálculos teniendo en cuenta:

CIVI = CFVF

 Incluir, además de las diluciones de extracciones de ADN, un control negativo

(agua para biología molecular, libre de nucleasas NFW).

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 Realizar los cálculos necesarios para determinar los volúmenes a utilizar de los
reactivos para la preparación del master mix para el número de muestras n + 1,
como sigue:

 Número de muestras a amplificar = X

 # Muestras de ADN (X)+ 01 Control negativo = (X + 1) tubos PCR
 (X + 1) Reacciones + 1 (error pipeteo) = X + 2 reacciones

Tabla 3. Componentes para preparar el master mix PCR, utilizando la enzima

ADN Polimerasa del kit asignado.
Concentración Concentración Volumen (µL) Volumen (µL)
Componente
inicial final para 1 rx para n+1 rx

1. H20 NFW -- --
(necesario para vol final 20 uL)

2. Buffer PCR

3. Primer Forward

4. Primer Reverse
5. dNTPs

6. Mg……

7. DNA Polimerasa

8. DNA molde 50 ng/µL

TOTAL 20 µL

Una vez completada la tabla con los valores de volúmenes a pipetear para el master mix:
- Tomar un microtubo (de 1.5 o 0.6 mL), rotulado como MM, y agregar en orden
todos los componentes indicados en la tabla, excepto el ADN molde.
- Mezclar en el vortex y centrifugar por segundos (minispin en modo ‘touch’).
- Dispensar la cantidad necesaria de MM (ver volumen total para 1 rx) en cada tubo
de PCR de 0.2 mL.
- Agregar la cantidad de ADN molde en cada tubo de PCR, según corresponda,
excepto en el tubo control blanco o negativo donde se agrega agua NFW (esta
reacción no debería de amplificar).
- Agitar los tubos en un vortex y centrifugar por segundos (touch).

Luego de tener listos los tubos con la reacción de PCR, se debería de realizar la
amplificación de ADN, para lo cual:
- Colocar los tubos de PCR en el termociclador.
- Seleccionar el programa del ciclo de PCR correspondiente.

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- Una vez terminado el PCR (aproximadamente luego de 2 horas), se evalúan los

resultados inmediatamente mediante electroforesis en geles de agarosa, de lo
contrario se pueden almacenar las muestras a – 20 °C hasta su análisis.

En clase:
- Exponer el criterio utilizado para completar las tablas, según el kit de PCR
asignado a cada mesa: explicar por qué estableció tiempo y temperatura, número
de ciclos de la PCR,

Para el informe:

- ¿Ambos primers presentaron iguales o cercanos valores de Tm? Explique cuáll es la

ventaja y consecuencia de esto sea que los Tm sean: (a) iguales, (b) muy diferentes.
- Justificar por qué estableció esos protocolos (para cada variable en Tabla 2 y 3).
- Discutir las condiciones establecidas en cada mesa de trabajo vs las utilizadas en
clase.
- Explicar las ventajas o desventajas,de la DNA polimerasa utilizada en la
práctica(según literatura)

d. CUESTIONARIO

(desarrollar 3 preguntas que serán asignadas durante la clase)

1. Defina:
a. Especificidad
b. Fidelidad
c. Rendimiento
d. Eficiencia
Y mencione cómo se puede optimizar en una PCR (ciclo y master mix).
Fundamente.

2. Explique el fundamento y las aplicaciones de los diferentes tipos de PCR

(ventajas, desventajas, diferencias, puede tomar ejemplos de aplicación de
artículos científicos):
a. PCR anidada (o también llamada Nested-PCR)
b. Long-PCR
c. Multiplex-PCR
d. PCR cuantitativa
e. RT-PCR (RT = retrotranscriptasa)
f. Touchdown-PCR
g. Alu-PCR
h. ARMS PCR
i. DOP-PCR
j. Asymmetric PCR
k. PCR digital
l. PCR puente
m. Single-cell PCR

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3. Explicar, según referencias que encuentre, cuáles son las aplicaciones en

investigación de la región designada a amplificar
4. Investigue y explique en qué ocasiones (y ventajas) se realizan reacciones de PCR
considerando en la mezcla más de 1 set de primers.
5. ¿Qué se debe tener en cuenta para evitar la contaminación de los productos
amplificados? Explique cada una de las variables involucradas
6. Explique cómo optimiza una PCR en caso tenga ADN molde rico en secuencias
GC.
7. ¿En qué se basan las técnicas de detección molecular del SARS-CoV-2?
(fundamente los métodos de detección, diferencias entre ellos)

4. REFERENCIAS

- Applied Biosystems. Real time PCR Handbook.

https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-
pcr-handbook.pdf
- Fellermann H. , Ben Shirt-Ediss, B., Koryza J., Linsley M., Lendrem D., Howard T.
(2018) The PCR Simulator: an on-line application for teaching Design of
Experiments and the polymerase chain reaction.
bioRxiv 415042; doi: https://doi.org/10.1101/415042
- Palumbi, S. R., Martin, A., Romano, S., McMillan, W. O., Stice, L., and Grabowski,
G. (1991). “The Simple Fool’s Guide to PCR, Version 2.0,” privately published
document compiled by S. Palumbi, Dept. Zoology, Univ. Hawaii, Honolulu, HI
- Puerta C. & Urueña C. Prácticas de biología molecular. Colección Biblioteca del
Profesional. Editorial Pontificia Universidad Javeriana, 100 p.
- Weiner M. Genetic Variation: A Laboratory Manual. CSHL Press, 2007, 472
- https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:13cd58c8:video:1

Material audiovisual:
 PCR animation: https://dnalc.cshl.edu/resources/animations/pcr.html
 Simulador Virtual Bacterial ID: https://www.biointeractive.org/classroom-
resources/bacterial-identification-virtual-lab
 Video de prueba de coronavirus (8 min.)
https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4
 Simulador de PCR virtual: http://virtual-pcr.ico2s.org/