Coeficiente de absortividad

Ácido acuoso 245 nm (A11 = 688a)

Álcali acuoso 257 nm (A11 = 715a)
Componentes esenciales del espectrofotómetro
Fuentes de luz
Una fuente debe satisfacer tres requisitos importantes para ser adecuada en un
método analítico de absorción. Primero debe proporciona el intervalo de longitud
de onda de energía radiante deseado para el estudio o la determinación de la
substancia de interés. Segundo, la radiación proporcionada ha de tener intensidad
suficiente para que, en combinación con la muestra y el detector, las mediciones
den resultados analíticos de la precisión y exactitud deseadas. Tercero, la fuente
ha de proporcionar energía radiante de intensidad constante, porque en su
mayoría las determinaciones analíticas requieren más de una medición.
Fuente visible:
 La fuente de luz de tungsteno de un espectrofotómetro es una lámpara que
contiene un filamento de metal de tungsteno que se calienta al pasar una
corriente eléctrica. Su función es generar luz visible y cercana al infrarrojo,
que se usa para iluminar la muestra química o biológica que se quiere
analizar.
Las longitudes de onda de la luz de tungsteno dependen de la temperatura
del filamento, pero en general se encuentran en el rango del espectro
visible y el infrarrojo cercano, es decir, entre 360 y 950 nm.
Fuentes infrarrojas:
 Globar: consiste en una varilla de carburo de silicio. La radiación se emite
cuando se calienta hasta aproximadamente a 1500° Celsius.
 Lámpara de Nernst: es un cilindro de circonio y óxidos de itrio, se calienta
eléctricamente a 1500-2000° Celsius.
Fuentes ultravioleta:
 Lámparas de vapor de mercurio y los arcos de xenón. Estas fuentes dan
energía radiante particularmente intensa a las longitudes de onda de los
espectros de emisión de mercurio y xenón, respectivamente, aunque se
produce también considerable radiación policromática.  La lámpara de
vapor de mercurio de alta presión emite un espectro discontinuo con líneas
espectrales en el rango de 200 a 600 nm. La lámpara de vapor de mercurio
de baja presión produce un espectro más simple con cuatro líneas
principales en 254, 313, 365 y 436 nm. La lámpara de arco de xenón emite
líneas espectrales en el rango de 200 a 780 nm.
  Lámparas de deuterio e hidrógeno, la de deuterio está formada por un tubo
cilíndrico que contiene deuterio a baja presión con una ventana de cuarzo a
través de la cual sale la radiación.  La lámpara de deuterio produce un
espectro continuo entre 180 y 370 nm.
Selector de longitud de onda.
Sirve para eliminar o rechazar todos los fotones otros que los de la longitud de
onda deseada.
Un sistema monocromador puede ser evaluado a base de 3 cantidades:
 Anchura de banda efectiva
 Longitud de onda central
 Porcentaje máximo (pico) de transmitancia
Hay 3 tipos principales:
 Filtro: es simplemente un objeto físico que absorbe radiación
electromagnética de ciertas longitudes de onda en mayor grado que de
otras y transmite preferentemente fotones de las longitudes de onda que
son menos absorbidas por él.
 Prisma: Un prisma es un elemento óptico que dispersa la luz blanca en sus
componentes de diferentes longitudes de onda, formando el espectro
visible. El prisma se usa como selector de longitud de onda en algunos
espectrofotómetros, colocándolo entre una rendija de entrada y una rendija
de salida. La luz que entra por la rendija de entrada se refracta al pasar por
el prisma y se separa en sus colores. La rendija de salida selecciona la
longitud de onda deseada y la dirige hacia la muestra y el detector.
 Rejilla: Una rejilla de difracción es un elemento óptico que tiene muchas
ranuras paralelas espaciadas uniformemente. Cuando la luz blanca incide
sobre la rejilla, se difracta y se dispersa en sus componentes de diferentes
longitudes de onda, formando el espectro visible. La rejilla de difracción se
usa como selector de longitud de onda en algunos espectrofotómetros,
colocándola entre una fuente de luz y una rendija de entrada. La luz que
sale por la rendija de entrada tiene una longitud de onda determinada por el
ángulo de incidencia y el espaciamiento de las ranuras.
Celda
El vidrio ordinario transmite suficiente en el intervalo de longitudes de onda de 300
a 2500 nm aproximadamente. (visible)
El vidrio corex y el cuarzo tienen límites inferiores de la longitud de onda de 210
nm, son útiles en particular en la región U.V. del espectro. La sílice fundida tiene
un valor límite algo más bajo.
Detector
 Fototubo: consta de un fotocátodo semicilíndrico y de un ánodo de
alambre sellado dentro de una cubierta al vacío de vidrio transparente o de
un cuarzo. La superficie cóncava del cátodo sostiene una capa de material
fotoemisivo, como un metal alcalino o un óxido metálico que emite
electrones cuando se irradia con luz de energía apropiada.
Cuando se aplica un voltaje aprox. 90 V o más, todos los fotoelectrones son
recolectados en el ánodo para producir una fotocorriente que también es
proporcional a la energía radiante del rayo.
 Tubo fotomultiplicador: se construye similar al anterior, pero es mucho
más sensible. El fotocatodo es similar al del fototubo, los electrones se
emiten con la exposición de la radiación, el TFM tiene una serie de
electrodos llamados dínodos. Los electrones emitidos desde el cátodo se
aceleran hacia el primer dínodo que se mantiene de 90-100 V positivos con
respecto al cátodo.
 Celda fotovoltaica: constan de una película delgada de un material
semiconductor, como sulfuro de plomo, telururo de cadmio y mercurio, o
antimonio de indio, depositado comúnmente en una superficie de vidrio no
conductora y sellada dentro de una cubierta al vacío. La absorción de
radiación por estos materiales promueve los electrones de valencia no
conductores a un nivel energético mayor, lo cual disminuye la resistencia
eléctrica del semiconductor.
 Fotodiodos de silicio: el silicio cristalino es un semiconductor. A
temperatura ambiente, ocurre suficiente agitación térmica en esta estructura
para liberar un electrón ocasional de su estado enlazado, dejándolo libre
para moverse a través del cristal.
La excitación térmica de un electrones deja atrás una región cargada
positivamente denominada hueco.
El mecanismo de movimiento del huevo es secuencial, el electrón enlazado
de un átomo de silicio vecino salta a la región deficiente en electrones (el
hueco) y entonces crea otro huecos positivo a su paso. El movimiento de
electrones y huecos en direcciones opuestas en los semiconductores es la
fuente de conductividad de estos dispositivos.
Lectores
Convierte las cantidades no eléctricas, como la intensidad de luz, pH, masa y
temperatura, en señales eléctricas que pueden ser amplificadas posteriormente,
manipuladas, y, por último, convertidas en números proporcionales a la magnitud
de la cantidad original.
Hay 2 tipos generales: un tipo responde a fotones; el otro, a calor. Los fotones
están basados en la interacción de la radiación con una superficie reactiva ya sea
para la fotoemisión o la fotoconducción. Los térmicos convierten el fenómeno
físico de la temperatura en una señal eléctrica normalizada.

Espectrofotómetro de un haz
El Spectronic 20 es un espectrofotómetro sencillo y económico, que está diseñado
para la región visible del espectro. Este instrumento apareció en el mercado por
primera vez a mediados de la década de 1950, y la versión modificada que se
muestra en la figura todavía se fabrica y se vende. Estos instrumentos son los más
utilizados a lo largo del mundo, más que cualquier otro modelo de
espectrofotómetro de un solo haz.
El Spectronic 20 puede leer la transmitancia o la absorbancia y desplegarla en una
pantalla de cristal líquido (LCD, por sus siglas en inglés); los instrumentos
análogos más antiguos proporcionaban las lecturas de transmitancia en un
medidor. El instrumento está equipado con un oclusor, que consiste en una veleta
que se interpone de manera automática entre el haz o rayo y el detector cada vez
que la celda cilíndrica se remueve de su soporte. El dispositivo de control de luz
consiste en una apertura en forma de “V” que se mueve dentro y fuera del haz
para controlar la cantidad de luz que alcanza la apertura de salida. Para obtener
una lectura del porcentaje de transmitancia, el indicador digital de lectura de salida
se coloca en cero con el compartimento de la muestra vacío de tal manera que el
oclusor bloquea el haz, lo que impide que llegue radiación al detector. Este
proceso se llama calibración o ajuste a 0% T. Una celda que contiene el blanco
(comúnmente el disolvente) se inserta entonces en el contenedor de la celda, y el
puntero se lleva a la marca de 100% T ajustando la posición de la apertura de
control de la luz y, por lo tanto, la cantidad de luz que llega al detector. Este ajuste
se denomina calibración o ajuste a 100% T. Por último, la muestra se coloca en el
compartimento de la celda, y el porcentaje de transmitancia o absorbancia se lee
directamente en la pantalla de cristal líquido. El intervalo espectral del Spectronic
20 es de 400 a 900 nm. Otras especificaciones incluyen un paso de banda
espectral de 20 nm, una exactitud de longitud de onda de 62.5 nm y una exactitud
fotométrica de 64% T. Una opción permite que el instrumento se conecte en
interfaz a una computadora para el almacenamiento y análisis de datos.
Ilustración: Imagen del espectrofotómetro Spectronic 20

Los instrumentos de un solo haz del tipo recién descrito son muy apropiados para
mediciones de absorción cuantitativa a una sola longitud de onda. Con estos
instrumentos, la simplicidad de instrumentación, el bajo costo y la facilidad de
mantenimiento ofrecen distintas ventajas.

Ilustración: Diagrama óptico del espectrofotómetro. La radiación proveniente de una lámpara de tungsteno
pasa a través de una apertura de entrada hacia el monocromador. Una rejilla de reflexión difracta la
radiación y la banda de la longitud de onda seleccionada pasa a través de la apertura de salida hacia
la cámara de la muestra. Un detector de estado sólido convierte la intensidad de luz en una señal
eléctrica relacionada que es amplificada y mostrada en un lector digital.
Espectrofotómetro de doble haz.

Ilustración: Diagrama de instrumento de doble haz en el espacio.

Esta imagen ilustra un instrumento de doble haz en el espacio en el cual se

forman dos haces en un espejo en forma de “V” llamado divisor de rayos. Un rayo
pasa a través de la disolución de referencia hacia un fotodetector, y el segundo
pasa simultáneamente a través de la muestra a un segundo fotodetector igualado.
Las dos señales de salida se amplifican y su relación, o el logaritmo de su
relación, se obtiene electrónicamente o se calcula y se despliega en el dispositivo
de salida.

Ilustración: Diagrama de espectrofotómetro de doble haz en el tiempo.

Esta imagen ilustra el espectrofotómetro de doble haz en el tiempo. En este

diseño, los haces se separan en el tiempo por un espejo de sectores rotatorios
que dirige el haz completo a través de la celda de referencia y posteriormente a
través de la celda de muestra. Los pulsos de radiación se recombinan por acción
de otro espejo que transmite el haz de referencia y refleja el haz de muestra al
detector. El método de doble haz en el tiempo se prefiere sobre el de doble haz en
el espacio debido a la dificultad de igualar los dos detectores. Los instrumentos de
doble haz ofrecen la ventaja de que compensan para todas las fluctuaciones en la
radiación de salida de la fuente, a excepción de las más rápidas. También
compensan para variaciones amplias en la intensidad de la fuente con la longitud
de onda. Más aún, el diseño de doble haz es útil para el registro continuo de
espectros de absorción.
Espectrofotómetro con arreglo de fotodiodos.

Los arreglos de fotodiodos y los dispositivos de transferencia de carga son la base

de los instrumentos multicanal para absorción de radiación UV/visible. Estos
instrumentos suelen tener el diseño de un solo haz.
Con los sistemas multicanal, el sistema dispersivo es un espectrógrafo de rejilla
colocado después de la celda de muestra o de la celda de referencia. El arreglo de
fotodiodos o arreglo CCD se coloca en el plano focal del espectrógrafo. Estos
detectores permiten la medición de un espectro entero en menos de 1 s. Se
requiere una computadora para obtener los espectros. Con los diseños de un solo
haz, la corriente de oscuridad del arreglo se adquiere y se almacena en la
memoria de la computadora; posteriormente, el espectro de la fuente se obtiene y
se almacena en la memoria después de extraer la corriente de oscuridad. Por
último, el espectro de baja calidad de la muestra se obtiene y, después de sustraer
la corriente de oscuridad, los valores de la muestra se dividen entre los valores de
la fuente a cada longitud de onda para producir el espectro de absorción. Los
instrumentos multicanal también pueden configurarse como los
espectrofotómetros de doble haz en el tiempo.

Ilustración: Diagrama de un espectrómetro multicanal basado en el espectrógrafo de rejilla con un arreglo de fotodiodo
como detector.

Factores que afectan la lectura.

Algunos factores que pueden afectar la lectura en un espectrofotómetro:

 La fuente luminosa, que debe emitir radiación monocromática y brillante.

 El color o la longitud de onda de la radiación que se emite o se absorbe por
la muestra, que debe ser adecuada para el tipo de análisis que se realiza.
 La intensidad de la radiación que pasa a través de la muestra, que debe ser
suficiente para producir una señal detectable.
 La concentración de soluto en la disolución que se analiza, que debe estar
dentro del rango lineal de la ley de Beer-Lambert.
 El tipo y tamaño de los tubos o cubetas que se usan para contener la
muestra, que deben ser transparentes y homogéneos.
 El pH, la temperatura, el tiempo y la presencia de interferentes, que pueden
afectar la reacción entre el analito y el cromógeno.

hay otros factores que pueden afectar la lectura en un espectrofotómetro, como:

  El ruido, la estabilidad, la linealidad, la variación de la longitud de onda,
la repetibilidad fotométrica y la luz difusa del equipo, que deben ser
verificados y calibrados con materiales de referencia certificados.
 La concentración de sal y el disolvente de la muestra, que pueden alterar la
carga de las moléculas y provocar desplazamientos de los espectros UV.

Error fotométrico.

El error fotométrico es el grado de discordancia entre la absorbancia real y la

absorbancia medida por el instrumento. Puede ocurrir cuando la señal que llega al
fotodetector es muy alta o muy baja, y se satura o no se detecta. El error
fotométrico depende de la relación logarítmica entre la transmitancia y la
concentración. Para evitarlo, se debe calibrar el equipo y usar muestras dentro del
rango lineal de la ley de Beer-Lambert.

Puede calcularse el error fotométrico usando diferentes métodos, como:

 El error relativo a la concentración, que se obtiene con la ecuación:

donde c es la concentración calculada y c0 es la concentración real.

 La desviación estándar relativa de la concentración, que se obtiene con la

ecuación:

donde Sc es la desviación estándar de la concentración, ST es la

desviación estándar de la transmitancia, T es la transmitancia media y A es
la absorbancia media.

 El método de la primera derivada, que se basa en encontrar el punto de

inflexión de la curva de transmitancia vs concentración, donde el error
fotométrico es mínimo.

Bibliografía

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