225 Análisis Cinético de Las Reacciones de Activación de Zimógenos

Matilde Esther Fuentes Ortega
ANLISIS CINTICO DE LAS REACCIONES

DE ACTIVACIN DE ZIMGENOS:
APLICACIN A SISTEMAS ENZIMTICOS
DE INTERS FISIOLGICO

I.S.B.N. Ediciones de la UCLM
978-84-8427-503-9

Cuenca, 2007

UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA
Departamento de Quimica-Fisica

"ANALISIS CINTICO D LAS RACCIONS D
ACTIVACION D ZIMOCNOS: APLICACION A
SISTMAS NZIMATICOS D INTRS IISIOLOCICO"

Memoria presentada para aspirar al grado de Doctor
por la Universidad de Castilla-La Mancha

MutiIde Esther Fuentes Ortegu

Z00

D. 1ose Albaladejo Prez, Catedratico de Quimica-Fisica y Director del
Departamento de Quimica-Fisica de la Universidad de Castilla-La Mancha.

CERTIFICA:

Que la presente Tesis Doctoral titulada: ~Anlisis cintico de las reacciones de
activacin de zimgenos: aplicacin a sistemas enzimticos de inters fisiolgico,
constituye la memoria que presenta D Matilde Esther Fuentes Ortega, para aspirar al titulo
de Doctor en Ciencias Quimicas por la Universidad de Castilla-La Mancha, y ha sido
realizado en el Departamento de Quimica Fisica bajo la direccion del Dr. Ramn Varn
Castellanos y la Dra. Edelmira Valero Ruiz.

Y para que conste a los eIectos oportunos, Iirma el presente CERTIFICADO en
Ciudad Real, a dieciseis de Junio de dos mil seis.

D. Ramn Varn Castellanos, Catedratico de Quimica-Fisica de la Universidad de
Castilla-La Mancha y D Edelmira Valero Ruiz, Catedratica de Escuela Universitaria de
Quimica-Fisica de la Universidad de Castilla-La Mancha,

AUTORIZAN:

La presentacion de la Tesis Doctoral titulada: ~Anlisis cintico de las reacciones de
activacin de zimgenos: aplicacin a sistemas enzimticos de inters fisiolgico,
realizada por D Matilde Esther Fuentes Ortega, bajo nuestra inmediata direccion y
supervision, en los laboratorios del Departamento de Quimica-Fisica en la Escuela Politecnica
Superior de Albacete, y que presenta para la obtencion del grado de Doctor en Ciencias
Quimicas por la Universidad de Castilla-La Mancha.

A nuestro juicio reune las condiciones necesarias para ser presentada en la Facultad de
Ciencias Quimicas, y juzgada por el Tribunal correspondiente.

En Albacete, a 15 de Junio de 2006

Fdo. Ramon Varon Castellanos Fdo. Edelmira Valero Ruiz

Los trabajos de investigacion recogidos en la presente Memoria han sido Iinanciados
por los siguientes proyectos:
- 'Analisis cinetico de las reacciones de activacion de :imogenos. Aplicacion a
sistemas en:imaticos de interes fisiologico` (Proyecto n BQU2002-01960),
Iinanciado por la Direccion General de Investigacion (MCyT, Espaa).
- 'Grupo de Modeli:acion en Bioquimica '(Proyecto n GC-02-032), Iinanciado por la
Consejeria de Ciencia y Tecnologia de la Junta de Comunidades de Castilla-La
Mancha.
- 'Analisis cinetico de diversos mecanismos biologicos de amplificacion de la respuesta
frente a una seal` (Proyecto n PAI-05-036), Iinanciado por la Consejeria de
Educacion y Ciencia de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha.

La Iirmante de esta Memoria disIruto en los comienzos de su realizacion de una beca
Predoctoral de Formacion de Personal Investigador, de la Consejeria de Ciencia y Tecnologia,
Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha (J.C.C.M.), del 13 de mayo al 1 de julio de
2003 y posteriormente de una beca del Programa de Becas Predoctorales de Formacion de
Personal Investigador (MCyT, Espaa), asociada al Proyecto BQU2002-01960, coIinanciada
por el Fondo Social Europeo. Asi mismo, ha disIrutado de una 'Ayuda para Estancias
Breves del Ministerio de Educacion y Ciencia, realizando una estancia en el Departamento
de Bioquimica y Biologia Molecular A de la Universidad de Murcia, bajo la direccion del
ProI. Dr. Francisco Garcia Canovas.

Albacete, 15 de Junio de 2006

Fdo. Matilde Esther Fuentes Ortega

Las siguientes publicaciones recogen los resultados obtenidos en la presente Tesis
Doctoral:
M.E. Fuentes, R. Varon, M. Garcia-Moreno y E. Valero (2005) Kinetics oI intra- and
intermolecular zymogen activation with Iormation oI an enzyme-zymogen complex.
The FEBS Journal, 272:85-96.
M.E. Fuentes, R. Varon, M. Garcia-Moreno y E. Valero (2005) Kinetics oI
autocatalytic zymogen activation measured by a coupled reaction: pepsinogen
autoactivation. Biological Chemistrv, 386:689-698.
R. Varon, M.E. Fuentes, M. Garcia-Moreno, F. Garcia-Sevilla, E. Arias, E. Valero y
E. Arribas (2006) Contribution oI the intra- and intermolecular routes in autocatalytic
zymogen activation: application to pepsinogen activation. Acta Biochimica Polonica.
(En prensa).
M.E. Fuentes, E. Valero, M. Garcia-Moreno, E. Vique y R. Varon (2006) Kinetic
analysis oI the mechanism oI plasminogen activation by streptokinase. Journal of
Mathematical Chemistrv. (En prensa).

Son muchas las personas que han contribuido de alguna manera a la reali:acion de esta Tesis Doctoral
v a quienes deseo expresar mi gratitud.

En primer lugar, a los Dres. D. Ramn Jarn Castellanos v D. Edelmira Jalero Ruiz, directores de
este Trabafo, por su direccion, orientacion, continuo apovo v por la confian:a depositada en mi a lo largo de la
reali:acion del mismo.

A la Dra. Manuela Carcia Moreno, por su constante avuda cada ve: que me surgia cualquier duda de
trabafo. Y funto con ella a las Dras. Maria Llanos Amo Saus, Milagros Molina Alarcn v Maria 1os Carcia
Meseguer, por su amistad, estimulo, apovo constante v por sus atenciones v en general por los momentos tan
agradables que hemos disfrutado funtas.

Al Dr. 1os Albaladejo Prez, que tras la entrevista que realice en la Facultad de Quimicas de Ciudad
Real le facilito mis datos a mi directora como aspirante a la beca que hov estov disfrutando.
A Daniel Jalera Ruiprez por su avuda en el laboratorio.
A Pedro Carrin Lozoya por la orientacion que me proporciono a la hora de preparar la Memoria del
DEA.
A Esperanza Monedero Jillalba v Andrs Carzn Ruiz, doctorandos del Departamento de Quimica-
Fisica, por su compaerismo v sus atenciones en mis viafes a Ciudad Real para reali:ar los cursos de
doctorado.
A Maria Elena Maeso Carbayo por la informacion que, de manera tan amable, me proporciono para
la documentacion tanto de esta Memoria como para la del DEA.
A Alicia Rivas Moreno por toda la avuda prestada siempre que me surgia algun problema con el
ordenador.

A la Universidad de Castilla-La Mancha v especialmente a la Direccin de la Escuela Politcnica
Superior de Albacete por las facilidades que siempre me han brindado.

Al Dr. Francisco Carcia Canovas, por acogerme en el Departamento de Bioquimica v Biologia
Molecular A de la Universidad de Murcia para la reali:acion de una Estancia Breve v por todas las atenciones
dispensadas. Igualmente a todos los miembros de su grupo de investigacion, por su amabilidad v avuda, pero
muv especialmente a mis compaeros Francisco Carcia Molina v 1ose Luis Muoz Muoz, que hicieron que
mi estancia en Murcia fuese tan agradable.

A D. Carmen Lpez Molina, mi profesora de Fisica v Quimica en el Instituto, que desperto en mi el
interes por la Quimica gracias a la calidad de su ensean:a.

A la familia Roldan-Gon:ale:, Loli, Lorenzo, Amparo, Maria 1os v 1eresa, por acogerme en su casa
como una hifa mas. Por sus constantes atenciones v amistad.

A mis compaeros de piso en Albacete, Eli, Aacho v Janesa por llenar la convivencia diaria de tantos
buenos momentos v por su amistad.

A Loli por avudarme en la busqueda v eleccion de pisos en Albacete v en Murcia.

A mi amiga Mari Paz que a pesar de los kilometros que nos separen siempre siento que esta cerca, por
ser como una hermana para mi v por lo bien que lo pasamos funtas.

A mis amigas de Almeria, Loli, Maria Dolores v Charo por los momentos tan divertidos que hemos
vivido funtas durante la carrera v desde entonces hasta ahora.

A mis amigos de Huercal-Overa, especialmente a mis compaeras de piso durante la carrera, Lola,
Aavio, Ana Isabel v Pilar, por tantos momentos inolvidables.

A Denis porque conocerlo es lo mefor que me ha pasado en Albacete, por su paciencia sobre todo en
estos ultimos meses v por ser tan especial.

A mis hermanos por estar siempre disponibles cada ve: que los necesito.

A mis padres, por procurarnos a mis hermanos v a mi siempre todo lo mefor. Porque con su efemplo
me han dado la mefor ensean:a que podria recibir. Por las facilidades v la libertad que siempre me han dado
para hacer las cosas que me gustan. Sin su apovo, sus animos v sus consefos esta Memoria no habria salido
adelante.

Asi mismo, al resto de mi familia especialmente a mis tias Ana v Mari Carmen.

A mis padres, Diego y Catina

A mis hermanos, Pedro y Martin

A Denis

Indice General

Matilde Esther Fuentes Ortega - i -

INDICE GENERAL

Indice General

Matilde Esther Fuentes Ortega - ii -

INDICE GENERAL

CAPITULO 1. INTRODUCCIN.......................................................................................................................... 1
1.1 REACCIONES ENZIMATICAS.......................................................................................................................... 2
1.1.1 Concepto de fase de transicion, estado estacionario v equilibrio rapido........................................... 2
1.1.2 Estudio cinetico ................................................................................................................................ 10
1.1.3 El complefo En:ima-Sustrato (ES) ................................................................................................... 13
1.2 PROTEASAS ............................................................................................................................................... 16
1.2.1 Clasificacion..................................................................................................................................... 18
1.2.2 Transformacion proteolitica v regulacion fisiologica ...................................................................... 21
1.3 ZIMOGENOS............................................................................................................................................... 24
1.3.1 Reacciones de activacion.................................................................................................................. 24
1.3.2 Procesos autocataliticos................................................................................................................... 27
1.3.3 Efemplos fisiologicos........................................................................................................................ 29
1.4 SISTEMA ENZIMATICO PEPSINOGENO-PEPSINA........................................................................................... 37
1.5 SISTEMA ENZIMATICO PLASMINOGENO-PLASMINA.................................................................................... 41
CAPITULO 2. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA .......................................................... 43
CAPITULO 3. OB1ETIVOS ................................................................................................................................. 48
CAPITULO 4. MATERIALES Y MTODOS.................................................................................................... 51
4.1 MATERIALES ............................................................................................................................................. 52
4.2 METODOS.................................................................................................................................................. 53
4.2.1 Ensavos espectrofotometricos .......................................................................................................... 53
4.2.2 Determinacion de la concentracion de pepsinogeno........................................................................ 56
4.2.3 Afuste de los datos experimentales ................................................................................................... 56
4.2.4 Integracion numerica ....................................................................................................................... 56
4.2.5 Trasnformada de Laplace................................................................................................................. 57
CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSIN.................................................................................................. 58
5.1 'KINETICS OF INTRA- AND INTERMOLECULAR ZYMOGEN ACTIVATION WITH FORMATION OF AN ENZYME-
ZYMOGEN COMPLEX ............................................................................................................................................ 59
5.2 'KINETICS OF AUTOCATALYTIC ZYMOGEN ACTIVATION MEASURED BY A COUPLED REACTION:
PEPSINOGEN AUTOACTIVATION ........................................................................................................................... 73
5.3 'CONTRIBUTION OF THE INTRA- AND INTERMOLECULAR ROUTES IN AUTOCATALYTIC ZYMOGEN
ACTIVATION: APPLICATION TO PEPSINOGEN ACTIVATION .................................................................................... 85
5.4 'KINETIC ANALYSIS OF THE MECHANISM OF PLASMINOGEN ACTIVATION BY STREPTOKINASE .............. 103
CAPITULO 6. CONCLUSIONES...................................................................................................................... 129
CAPITULO 7. BIBLIOGRAFIA........................................................................................................................ 133

Indice de Esquemas, Tablas y Figuras

Matilde Esther Fuentes Ortega - iii -

INDICE DE ESQUEMAS, TABLAS Y FIGURAS


Matilde Esther Fuentes Ortega - iv -

INDICE DE ESQUEMAS, TABLAS Y FIGURAS

CAPITULO 1.

Esquemu 1,1................................................................................................................................................... 7
Esquemu 1,Z................................................................................................................................................... 9
Esquemu 1,3, Meconismo generoI propuesfo poro Io oufoocfivocion de ;imogenos que incIuye
uno efopo infromoIecuIor (rufo (o)) y ofro infermoIecuIor (rufo (b)).......................................... 28
Esquemu 1,4, Meconismo generoI propuesfo poro Io oufoocfivocion de ;imogenos
incIuyendo Ios efopos infromoIecuIor (rufo (o)) e infermoIecuIor (rufo (b)), y Io
hidroIisis de un susfrofo de Io en;imo ocfivo (rufo (c))............................................................ 28
Esquemu 1,, Meconismo de ocfivocion de pIosminogeno o pIosmino por esfrepfoquinoso
(8oxrud y coI., Z004, 8oxrud ond 8ock., Z004)............................................................................... 34

TubIu 1,1, CIoses y fomiIios de profeosos (Drenfh y coI., I97I, Meurofh, I984, Iosfko,
I98b), ...................................................................................................................................................... 18
TubIu 1,Z, Focfores que porficipon en Io cooguIocion songuneo..................................................... 31
TubIu 1,3, EjempIos de ;imogenos fisioIogicos y fenomenos concrefos ofecfodos (AviIes y
coI., I994)................................................................................................................................................. 36

Figuru 1,1, Pepresenfocion esquemofico de Io voriocion de Io concenfrocion de producfo de
uno reoccion en;imofico con eI fiempo. ............................................................................................... 3
Figuru 1,Z, Curvos de progreso de reocciones en;imoficos. .............................................................. 5
Figuru 1,3, Formocion deI compIejo en;imo-susfrofo. ...................................................................... 14
Figuru 1,4, Pofuro profeoIfico de un enIoce pepfdico..................................................................... 22
Figuru 1,, Acfivocion de quimofripsinogeno. ..................................................................................... 25
Figuru 1,, Pepresenfocion esquemofico de uno reoccion de ocfivocion de ;imogenos en
coscodo. .................................................................................................................................................... 26
Figuru 1,7, Esquemo simpIificodo de Io ocfivocion de ;imogenos en eI duodeno. ........................ 30
Figuru 1,, Peocciones de ocfivocion de ;imogenos en coscodo que se presenfon en Io
cooguIocion de Io songre ....................................................................................................................... 32
Figuru 1,9, Esquemo simpIificodo de Io fibrinoIisis............................................................................ 33
Figuru 1,10, Esfrucfuro fridimensionoI deI pepsinogeno A humono. .............................................. 39
Figuru 1,11, Esfrucfuro de Io pepsino humono.................................................................................... 39

CAPITULO 4.

Figuru 4,1, Esquemo generoI deI experimenfo........................................54

Matilde Esther Fuentes Ortega - v -

CAPITULO 5.

,1, "kINETICS OF INTRA- AND INTERMOLECULAR ZYMOSEN ACTIVATION WITH
FORMATION OF AN ENZYME-ZYMOSEN COMPLEX",

Esquemu 1, Meconismo de oufoocfivocion de pepsinogeno o pepsino propuesfo por AI-Jonoby y
coI. (I97Z)....................................................................................................................................62 (86 art.)
Esquemu Z, Meconismo sugerido por Iogo y Hoyoshi (I97o).,,,,,,,,,,,,,,,..62 (86 art.)
Esquemu 3, Meconismo generoI propuesfo poro Io oufoocfivocion de ;imogenos que incIuye uno
efopo infromoIecuIor (rufo (o)) y ofro infermoIecuIor (rufo (b)),.........................62 (86 art.)
Esquemu 4, Meconismo mosfrodo en eI Esquemo 3 bojo condiciones de equiIibrio ropido enfre
E, Z y EZ,.....................................62 (86 art.)
Esquemu ,Meconismo generoI simpIificodo poro Io oufoocfivocion de ;imogenos.........62 (86 art.)

TubIu 1 VoIores de [Z] obfenidos o porfir de Ios curvos simuIodos ([Z]
sim
) comporodos con Ios
obfenidos o porfir de Io ecuocion (ZI) ([Z]
Eqn ZI
) y con Ios de Io ecuocion (8I) deI Apendice 8
(AI-Jonobi y coI., I97Z) ([Z]
Eqn 8I
).........................66 (90 art.)

Figuru 1,A} Curvos de progreso simuIodos correspondienfes o Ios especies que infervienen en
eI meconismo de reoccion mosfrodo en eI Esquemo 3............................................66 (90 art.)
Figuru 1,} Curvos de progreso correspondienfes oI consumo de Z..........66 (90 art.)
Figuru Z, Pepresenfocion de Z
0
/ vs Z
0
de ocuerdo con Io ecuocion (40) poro fres voIores
diferenfes de k
3
...............................69 (93 art.)
Figuru 3,A} Curvos de progreso deI consumo de pepsinogeno o diferenfes concenfrociones
inicioIes de esfe,.................................69 (93 art.)
Figuru 3,} 0rofico secundorio de Ios dofos onferiores......................69 (93 art.)

,Z, "kINETICS OF AUTOCATALYTIC ZYMOSEN ACTIVATION MEASURED Y A
COUPLED REACTION: PEPSINOSEN AUTOACTIVATION,"

TubIu 1, VoIores de [S] y [Z] obfenidos o porfir de Ios curvos simuIodos ([S]
t,sim
y [Z]
t,sim
)
comporodos con Ios obfenidos o porfir de Ios ecuociones (3Z) y (33) ([S]
t,Eq
y [Z]
t,Eq
)
respecfivomenfe...................................80 (694 art.)

Figuru 1, Meconismo generoI propuesfo poro Io oufoocfivocion de ;imogenos incIuyendo Ios
efopos infromoIecuIor (rufo A) e infermoIecuIor (rufo 8), y Io hidroIisis de un susfrofo de Io
en;imo ocfivo (rufo C)...............................76 (690 art.)
Figuru Z,A} Curvos de progreso correspondienfes oI consumo de susfrofo o diferenfes voIores
inicioIes de S
0
.................................................79 (693 art.)
Figuru Z,} Curvos de progreso correspondienfes o Io especies que infervienen en eI
meconismo de Io Figuro I........................................................................................................79 (693 art.)

Matilde Esther Fuentes Ortega - vi -

Figuru 3, Curvos de progreso experimenfoIes correspondienfes o Io hidroIisis deI susfrofo
pepfdico.....................................................................................................................................80 (694 art.)
Figuru 4,A} Pepresenfocion de Ios voIores de I/ obfenidos o porfir deI ojusfe por regresion
no IineoI de Ios curvos de progreso experimenfoIes o Io ecuocion (3Z) o diferenfes
concenfrociones inicioIes de ;imogeno vs S
0
..........................................81 (695 art.)
Figuru 4,} 0rofico secundorio de Ios ordenodos en eI origen obfenidos en Io Figuro 4.A) vs.
I/Z
0
....................................81 (695 art.)
Figuru 4,C} 0rofico Secundorio de Ios pendienfes obfenidos en Io Figuro 4.A) vs.
I/Z
0
.............................................................................................................................................81 (695 art.)
Figuru ,A) Pepresenfocion grofico de Ios voIores de r obfenidos o porfir de Io ecuocion (4Z)
o diferenfes voIores de t vs Z
0
........................82 (696 art.)

,3, "CONTRIUTION OF THE INTRA- AND INTERMOLECULAR ROUTES IN
AUTOCATALYTIC ZYMOSEN ACTIVATION: APPLICATION TO PEPSINOSEN
ACTIVATION",

Esquemu 1,..................................88 (408 art.)
Esquemu Z,..................................88 (408 art.)
Esquemu 3,..................................88 (408 art.)

TubIu 1, VoIores de 0, t
=
y P
u,=
correspondienfes o codo uno de Ios curvos de progreso de Io
Figuro Z...................................93 (413 art.)
TubIu Z, VoIores de k
I
y k
Z
obfenidos o diferenfes pH por AI-Jonobi y coI., (I97Z) poro Io
ocfivocion de pepsinogeno o pepsino........................95 (415 art.)
TubIu 3, VoIores de 0, t
=
y P
u,=
correspondienfes o codo curvos de progreso de P
u
en Io Figuro
3...................................................................................................................................................96 (416 art.)
TubIu 4, VoIores de k
Z
y k
-Z
, 0, t
=
y P
u,=
correspondienfes o codo curvo de Io Figuro
4.......................................97 (417 art.)
TubIu , VoIores de o, b, c obfenidos deI ojusfe de Ios dofos de Io Figuro 4 o Io ecuocion
(bb).....................................98 (418 art.)

Figuru 1, Curvos de progreso simuIodos de [Z], [E], [EZ], [E
T
]
u
y [E
T
]
o
obfenidos por
infegrocion numerico deI conjunfo de ecuociones diferencioIes (Ib)-(I7)......91 (411 art.)
Figuru Z, Curvos de progreso de P
u
correspondienfes oI Esquemo Z obfenidos o porfir de Ios
curvos de progreso simuIodos de [E
T
]
u
y [E
T
]
o
poro Ios mismos voIores de Ios consfonfes de
veIocidod de Io Figuro I............................91 (411 art.)
Figuru 3, Curvos de progreso de P
u
poro Io ocfivocion de pepsinogeno o cuofro diferenfes
pHs y dos concenfrociones diferenfes....................95 (415 art.)
Figuru 4, Diferenfes curvos de progreso de P
u
correspondienfes o I
m
~ I.b x I0
-7
M y o uno
concenfrocion de pepsinogeno inicioI fijo [Z]
0
pero diferenfe voIor de
k
Z
..................................................................................................................................................96 (416 art.)
Figuru , Pepresenfocion de t
=
vs. Ink
Z
de Io TobIo b poro codo concenfrocion de pepsinogeno
correspondienfe................................96 (416 art.)


Matilde Esther Fuentes Ortega - vii -

,4, "kINETIC ANALYSIS OF THE MECHANISM OF PLASMINOSEN ACTIVATION Y
STREPTOkINASE",

Esquemu 1,....................................107 (3 art.)

TubIu 1, Cosos porficuIores deI Esquemo I...................108-110 (4-6 art.)

Figuru 1, Curvos de progreso correspondienfes o Io ocumuIocion de [E]/Z
0
, [P]/S
0
y [P],
obfenidos por infegrocion numerico (Ineos confinuos) y curvo de progres de [P] obfenido de
Io Eq. (30) (Ineo de punfos)...........................115 (11 art.)
Figuru Z, Curvos de progreso correspondienfes o Io ocumuIocion de Z..........................116 (12 art.)
Figuru 3, Curvos de progreso correspondienfes o Io ocumuIocion de [P], obfenidos por
infegrocion numerico (curvo i, Ineo confinuo), de Io Eq. (30) (curvo ii, Ineo de punfos) y de
Io Eq. (40) (curvo iii, Ineo disconfinuo)......................118 (14 art.)
Figuru 4, Curvo de ocumuIocion deI producfo...................119 (15 art.)
Figuru , Curvo de progreso correspondienfe o Io ocumuIocion de Z obfenido por infegrocion
numerico (Ineo confinuo), o porfir de Io Eq. (4I) (Ineo de punfos) y de Io ecuocion propuesfo
por 8oxrud y coI.,(Z004) (Eq. (8Z), Apendice 8) (Ineo disconfinuo).......122 (18 art.)

Introduccion

Matilde Esther Fuentes Ortega - 1 -

CAPITULO 1. INTRODUCCIN

Introduccion


1.1 REACCIONES ENZIMTICAS
Las enzimas son proteinas que catalizan la mayoria de las reacciones quimicas que
tienen lugar en los organismos vivos. Algunas enzimas, como ocurre con las enzimas
proteoliticas del tracto digestivo, son secretadas y actuan Iuera de la celula. Sin embargo, la
mayoria de las enzimas catalizan distintos pasos del metabolismo celular, que abarca
numerosas reacciones quimicas relacionadas entre si, constituyendo secuencias diIerentes de
reacciones consecutivas con intermedios comunes, de Iorma que el producto de una reaccion
actua como sustrato de la siguiente.
El proIundo conocimiento del mecanismo de una reaccion enzimatica es Iundamental
e imprescindible para optimizar su control en procesos bioquimicos de interes Iisiologico,
Iarmacologico, industrial, etc. El estudio cinetico de una reaccion enzimatica abarca la
identiIicacion del numero y secuencia de las especies enzimaticas intermedias, asi como la
determinacion de las constantes de velocidad de sus etapas de interconversion. La
caracterizacion cinetica de una reaccion enzimatica permite la descripcion cualitativa y
cuantitativa de la aIinidad y la rapidez de actuacion de la enzima sobre los sustratos, en base a
la deduccion de ecuaciones analiticas explicitas que relacionan las concentraciones de cada
especie quimica reaccionante con el tiempo de ensayo, bajo determinadas condiciones
experimentales, tales como las concentraciones iniciales de reactivos, el pH y la temperatura.

1.1.1 Concepto de fase de transicin, estado estacionario y equilibrio
rpido
A nivel experimental, es Irecuente la utilizacion de concentraciones de sustrato y de
otros ligandos mucho mayores que la de enzima, asi como que el consumo de ligandos sea
despreciable durante todo el tiempo de ensayo de la reaccion. En esas condiciones, la reaccion
comienza con una Iase de transicion preestacionaria, caracterizada por una acumulacion de
producto no lineal Irente al tiempo (Figura 1.1, curva I). A continuacion, tiene lugar una
Iormacion lineal de producto con el tiempo, correspondiente a la Iase de estado estacionario
Introduccion


(Figura 1.1, curva II). Por ultimo, la reaccion entra en la Iase Iinal, desde que el consumo de
sustrato comienza a ser signiIicativo hasta su total agotamiento (Figura 1.1, curva III).

Figuru 1,1, Representucin esquemticu de Iu vuriucin de Iu concentrucin de
producto de unu reuccin enzimticu con eI tiempo, I) Fose de fronsicion, II) Esfodo
esfocionorio y III) Fose finoI (AhIer, I98Z).

Para conocer la variacion con el tiempo de la concentracion de las distintas especies
implicadas en una reaccion, es necesario plantear el sistema de ecuaciones diIerenciales
correspondiente a la evolucion de los reactivos, productos e intermedios. Este sistema de
ecuaciones diIerenciales no esta, en general, en Iorma lineal, por lo que no es posible obtener
soluciones analiticas aplicables a las tres Iases de la reaccion. La solucion analitica tiene
caracter general y es mas adecuada para el analisis de los datos cineticos experimentales,
puesto que es aplicable a diversos conjuntos de condiciones iniciales y conduce a la
determinacion de las constantes cineticas que caracterizan el mecanismo de la reaccion en
estudio. Sin embargo, cada solucion numerica tiene caracter particular y exige la asignacion
previa de valores a las constantes cineticas que se desean determinar y es aplicable a un solo
tiempo
[
p
r
o
d
u
c
t
o
]
I
II
III
0
0
Introduccion


conjunto de condiciones iniciales. La condicion mas Irecuente que permite linealizar el
sistema de ecuaciones diIerenciales correspondiente a una reaccion enzimatica es la de utilizar
una concentracion inicial de sustrato mucho mayor que la de enzima, aunque a veces tambien
se utiliza la condicion inversa (Varon y col., 1988).
Fase de transicin
La Iase de la reaccion comprendida desde el inicio de la misma, es decir, desde t 0
hasta la consecucion del estado estacionario, se denomina Iase de transicion preestacionaria y
su duracion varia con el tipo de reaccion y las condiciones experimentales en las que esta se
realice. En aquellos casos en los que hay una reaccion quimica acoplada a una enzimatica, hay
que distinguir entre la Iase de transicion de la reaccion enzimatica y la de la reaccion quimica
acoplada.
En aquellas condiciones iniciales en que cada una de las etapas del mecanismo de una
reaccion enzimatica pueda considerarse de primer o pseudoprimer orden, el sistema de
ecuaciones diIerenciales que describe la evolucion de las especies quimicas que participan en
la reaccion es lineal y su solucion analitica conduce, para la mayoria de las reacciones
enzimaticas y para cualquiera de los productos, X, a una expresion del tipo (Maguire, 1974;
Darvey, 1977; Galvez y Varon, 1981):
[ ] [ ] ( )
=
+ + =
u
h
h h
t t X X
1
0
exp (1.1)
donde |X|
0
es el valor de |X| a t 0, los parametros cineticos , o, y
h
,
h
(h 1, 2,., u)
dependen de las constantes de velocidad, de las concentraciones iniciales de los ligandos que
se adicionan a alguna especie enzimatica del mecanismo y, excepto las
h
(h 1, 2,., u), de
la concentracion inicial de la enzima libre. Las
h
(h 1, 2,., u) son negativas o complejas
con la parte real negativa. En el sumatorio, u es un numero entero siempre menor que el
numero de especies enzimaticas involucradas en el mecanismo de reaccion. La ecuacion (1.1)
es valida tanto para la Iase de transicion como para el estado estacionario.
En la Iase de transicion de una reaccion enzimatica se puede observar un 'burst (salto
rapido al principio de la reaccion) o un 'lag (periodo de retardo) dependiendo del signo del
parametro cinetico . Cuando ~ 0, aparece un 'burst en la curva de acumulacion del
producto (Figura 1.2, curva A); cuando 0, se observa un periodo de retardo en la
Introduccion


Iormacion del producto (Figura 1.2, curva C). En el caso en que 0, el producto se
acumulara linealmente desde el primer instante de la reaccion (Figura 1.2, curva B),
alcanzandose directamente la Iase de estado estacionario, ya que cuando |P| 0 a t 0, se
cumple que L y
h
- .
tiempo
0
[
p
r
o
d
u
c
t
o
]
0

x

A
B C

Figuru 1,Z, Curvus de progreso de reucciones enzimticus, A) 0, 8) ~ 0 y C)
0. y : represenfon Ios corfes con eI eje de ordenodos y obscisos respecfivomenfe,
de Io proIongocion de Io porcion IineoI de Io curvo de progreso.

El analisis cinetico de las reacciones enzimaticas se potencia con aproximaciones que
Iacilitan la obtencion de soluciones analiticas. La aproximacion del estado estacionario hace
posible la transIormacion del sistema lineal de ecuaciones diIerenciales en un sistema lineal
de ecuaciones algebraicas. La aproximacion del equilibrio rapido permite considerar grupos
de especies enzimaticas como una sola. A continuacion se describen con mas detalle estas dos
aproximaciones:
Introduccion


Aproximacin de estado estacionario
La aproximacion del estado estacionario se basa en la hipotesis de que la
concentracion de las especies enzimaticas intermedias no cambia durante el curso de la
reaccion; es decir, que las especies enzimaticas se Iorman a la misma velocidad a la que se
transIorman. Si |X| es la concentracion de una especie enzimatica, dicha aproximacion supone
hacer:
[ ]
0 =
dt
X d
(1.2)
Esto permite simpliIicar considerablemente el sistema de ecuaciones diIerenciales,
transIormandolo en un nuevo sistema lineal de ecuaciones algebraicas. En todo caso, una de
estas ecuaciones puede ser sustituida por el balance de materia de las especies enzimaticas.
Muchos autores (Laidler, 1955; Hommes, 1962; Walter y Morales, 1964; Walter, 1966;
Wong, 1965; Wong, 1975) han discutido la validez de la aproximacion del estado
estacionario.
En general, como ocurre en las reacciones de activacion de zimogenos, que seran
objeto de estudio en la presente Memoria, bajo determinadas condiciones experimentales
(Varon y col., 1987,1988, 1990a; Havsteen y Varon, 1990), las concentraciones de algunas
especies enzimaticas pueden alcanzar un valor constante, mientras que otras pueden variar
lineal, parabolica o exponencialmente con el tiempo. En estos casos pueden existir estados
estacionarios restringidos a determinadas especies y no un estado estacionario de la reaccion
global. Una deIinicion alternativa de estado estacionario ya ha sido implicitamente utilizada
por varios autores (Darvey, 1968, 1977; Maguire, 1974; Wohl y col., 1980; Havsteen y
Varon, 1990), para situaciones en que la variacion de la concentracion de las especies
implicadas en la reaccion se ajusta a una ecuacion que contiene uno o mas terminos
exponenciales, cuyo valor disminuye al aumentar el tiempo. En estos casos el estado
estacionario de la reaccion puede deIinirse como el estado correspondiente a valores altos de
tiempo, es decir, a t , situacion en la que los terminos exponenciales son despreciables
Irente a los demas. Asi, la ecuacion (1.1) se simpliIica a:
[ ] [ ] t X X + =
0
(1.3)
Introduccion


que es la ecuacion que expresa la acumulacion del producto X una vez que se ha alcanzado el
estado estacionario, siendo o la velocidad de la reaccion en dicho estado.
Consideremos, a modo de ejemplo, una reaccion enzimatica que siga el conocido
mecanismo de Michaelis-Menten (Esquema 1.1):

Esquemu 1,1

Las ecuaciones que describen el comportamiento cinetico son:
[ ]
[ ] [ ] ( )[ ] ES k k S E k
dt
E d
2 1 1 + +
+ + = (1.4)
[ ]
[ ] [ ] [ ] ES k S E k
dt
S d
1 1 +
+ = (1.5)
[ ]
[ ] [ ] ( ) [ ] ES k k S E k
dt
ES d
2 1 1 + +
+ = (1.6)
[ ]
[ ] ES k
dt
P d
2 +
= (1.7)
[ ] [ ] [ ] ES E E + =
0
(1.8)
[ ] [ ] [ ] [ ] P ES S S + + =
0
(1.9)

Este sistema de ecuaciones diIerenciales (1.4)-(1.7) es no lineal y por lo tanto, no tiene
solucion analitica.
E S ES E P ES
k
1

k
-1

k
2

Introduccion


En condiciones iniciales de concentracion inicial de sustrato, |S|
0
, mucho mayor que la
inicial de la enzima libre, |E|
0
, la ecuacion de acumulacion del producto para el ejemplo
anterior, suponiendo |P|
0
0, es:
[ ] ( ) t t P exp + + = (1.10)
donde:
[ ] [ ]
[ ]
2 1 0 1
0 0 2 1
+ + +
+ +
+ +
=
k k S k
E S k k
(1.11)
[ ]
2 1 0 1 + +
+ +
=
k k S k

(1.12)
= (1.13)
[ ] ( )
2 1 0 1 + +
+ + = k k S k (1.14)

En el estado estacionario, es decir, cuando t , la ecuacion (1.10) se transIorma en:
[ ] t P + = (1.15)
que indica que el producto se acumula linealmente con el tiempo en dicho estado.
Aproximacin de equilibrio rpido
Por otra parte, existen muchas etapas reversibles de enlace de ligandos a enzimas que
alcanzan rapidamente su equilibrio, antes de que tenga lugar una transIormacion apreciable de
ligando. Esta situacion cinetica se denomina equilibrio rapido y puede aparecer en reacciones
enzimaticas con un comportamiento cinetico global de Iase de transicion o bien de estado
estacionario.
La aproximacion del equilibrio rapido permite tratar grupos de especies enzimaticas
como si Iuesen una sola (Cha, 1968; Huang, 1979; Cornish-Bowden, 1989). Esto tiene un
doble eIecto: en primer lugar Iacilita la obtencion de las ecuaciones cineticas y, en segundo
Introduccion


lugar, estas ecuaciones y las expresiones de los parametros cineticos que contienen resultan
considerablemente simpliIicadas.
Como ejemplo ilustrativo de la aproximacion de equilibrio rapido consideremos el
mismo Esquema 1.1 de reaccion en el que la unica etapa reversible estuviese en equilibrio
rapido. En estas condiciones el mecanismo se escribiria:

Esquemu 1,Z
donde K
1
es la constante de disociacion del complejo ES, es decir, K
1
k
-1
/k
1
.
La ecuacion de acumulacion de producto resulta ser:
[ ]
[ ] [ ]
[ ]
t
S K
E S k
P
0 1
0 0 2
+
=
+
(1.16)
ecuacion de la que se deduce que el producto se acumula linealmente con el tiempo desde el
instante inicial.
La aproximacion de equilibrio rapido (ecuacion (1.16)), supone un caso particular de
ecuaciones mas generales (ecuaciones (1.1) y (1.3)), que en ocasiones no permite discernir
entre dos posibles mecanismos de reaccion. El uso de esta aproximacion debe justiIicarse
adecuadamente.
Se han publicado una serie de trabajos en los que las ecuaciones correspondientes a la
Iase de transicion, cuando se dan las condiciones de equilibrio rapido, se obtienen como casos
particulares de las ecuaciones cineticas generales obtenidas, suponiendo que en estas las
constantes de velocidad de primer o pseudo primer orden involucradas en las etapas
reversibles sean mucho mayores que las demas y no muy diIerentes entre si (Garcia-Canovas
y col., 1987; Garcia-Moreno y col., 1987; Varon y col., 1988, 1989; Manjabacas y col., 1996).
La aproximacion de equilibrio rapido se puede aplicar en la deduccion de las
ecuaciones cineticas, tanto de la Iase de transicion como del estado estacionario. En la
E S ES E P ES
K
1
k
2

Introduccion


practica, el comportamiento cinetico de las reacciones enzimaticas abarca la posible
superposicion en el tiempo de etapas en Iase de transicion, estado estacionario y equilibrio
rapido.

1.1.2 Estudio cintico
La inIormacion cinetica correspondiente a las situaciones de Iase de transicion y de
estado estacionario se obtiene a partir de los respectivos parametros cineticos. Estos
parametros estan relacionados con magnitudes controlables experimentalmente, como las
concentraciones iniciales de enzima y de ligandos, el pH, etc.
La eIicacia del control de un sistema enzimatico se basa en el conocimiento de los
aspectos estructurales y cineticos de su mecanismo de reaccion. Los estudios cineticos
permiten detectar el numero y secuencia de los intermedios del mecanismo, la existencia de
complejos y de cambios conIormacionales, y la participacion de grupos acidos y basicos
(Laidler y Busting, 1973; Segel, 1975; Dixon y col., 1979). Por otra parte, estos estudios
conducen a la determinacion de las constantes de velocidad del mecanismo, parametros que
describen cuantitativamente las propiedades de aIinidad y de reactividad caracteristicas del
sistema enzimatico considerado. Ademas, las constantes de velocidad tambien son utiles para
comparar diIerentes sistemas enzimaticos.
Para conocer la variacion con el tiempo de las distintas especies implicadas en una
reaccion debe resolverse un sistema de ecuaciones diIerenciales, que generalmente no esta en
Iorma lineal, por lo que en estas condiciones no es posible obtener soluciones analiticas
rigurosas. En consecuencia, o se recurre a utilizar metodos de resolucion numerica, o bien, en
el caso de que deseemos disponer de expresiones analiticas, debemos utilizar metodos
aproximados que, en esencia, consisten en linealizar el sistema de ecuaciones diIerenciales
que describe el esquema de reaccion. Ambas Iormas de abordar la resolucion del sistema de
ecuaciones tienen sus ventajas e inconvenientes que, basicamente podemos resumir asi:
Soluciones numricas
La integracion numerica por ordenador puede utilizar diIerentes metodos, ya sea
mediante simulacion analogica (Higgins, 1961) o digital (Hayashi y Sakamoto 1986). En los
Introduccion


ultimos aos, los metodos de simulacion digital estan desplazando a los analogicos en el
analisis cinetico de las reacciones enzimaticas.
En la simulacion digital, el principal problema consiste en elegir el metodo adecuado
de integracion numerica. Cada metodo posee sus propias ventajas e inconvenientes y la
eleccion de uno u otro viene generalmente determinada por el problema a estudiar (Gordon y
Alldridge, 1971). La mayoria de los programas de integracion utilizan el metodo de Runge-
Kutta-Gill para la resolucion de ecuaciones diIerenciales. Este metodo a menudo presenta
numerosas diIicultades al aplicarlo a sistemas de reacciones enzimaticas. Se han propuesto
numerosos metodos de resolucion (GarIinkel y col., 1977), siendo el metodo de Gear el mas
ampliamente utilizado (Gear, 1971).
Garrido del Solo y col. (1992) realizaron un programa de ordenador para MS DOS
escrito en TURBO PASCAL para simular el comportamiento cinetico de reacciones
enzimaticas de hasta 20 especies. Dadas las concentraciones iniciales de cada especie, el
programa resuelve el sistema de ecuaciones diIerenciales mediante un algoritmo basado en el
metodo de Adams-BashIorth de cuarto orden como predictor y una iteracion del metodo de
Adams-Moulton (Burden y Faires, 1985; Michavilla y Gavete, 1985; Gerald y Wheatley,
1989) como corrector despues de calcular los tres valores siguientes a los valores iniciales
mediante el metodo Runge-Kutta de cuarto orden.
Este programa Iue posteriormente mejorado por Garcia-Sevilla y col. (2000) al
implementar un programa de ordenador especiIico para MS Windows 95/98/NT/XP, escrito
en C , que puede ser utilizado para mecanismos de reaccion que contengan hasta 32
especies. El tiempo de computacion es corto, la entrada de los datos es Iacil y los resultados se
obtienen como imagenes graIicas de las curvas de progreso y como tablas ASCII. El
programa utiliza el metodo de Runge-Kutta de cuarto orden, pero aplicando un control
adaptativo del paso de integracion inventado por Fehlberg (Fehlberg, 1970; Mathews y Fink,
1999).
Soluciones analiticas
Por otro lado, la aproximacion generalmente mas utilizada para la obtencion de
soluciones analiticas consiste en considerar que hay un exceso de concentracion inicial de las
Introduccion


especies ligando que reaccionan con algun intermedio, con respecto a la de enzima inicial, lo
que permite linealizar el sistema, que de esta Iorma se hace integrable analiticamente.
Los primeros trabajos teoricos para la obtencion de soluciones analiticas validas para
la Iase de transicion Iueron publicados por Roughton (1954) para un mecanismo con un solo
intermedio. Posteriormente Ouellet y colaboradores (Ouellet y Laidler 1956; Ouellet y
Stewart, 1959) extendieron este tratamiento al caso de un mecanismo con dos intermedios. En
estos trabajos se supone que la concentracion de sustrato es mucho mayor que la de las
especies enzimaticas. Por su parte, Kasserra y Laidler (1970) han ampliado este estudio al
caso en el que la enzima esta en exceso respecto al sustrato, lo que permite obtener una
inIormacion que no proporciona el caso inverso. Posteriormente, Darvey (1977) publico un
trabajo en el que permite que las concentraciones iniciales sean cualesquiera. Se han
propuesto diversos metodos (Galvez y Varon, 1981; Galvez y col., 1982, 1983) para calcular
las constantes individuales de velocidad de diversos mecanismos, a partir del analisis cinetico
de las curvas de progreso de los productos de reaccion.
Un procedimiento utilizado a menudo para la obtencion de las soluciones analiticas de
un mecanismo en concreto es particularizar a el las ecuaciones cineticas en Iase de transicion
obtenidas en la literatura para un modelo general de reaccion enzimatica (Darvey, 1968, 1977;
Galvez y Varon, 1981; Chou, 1989). Otro procedimiento (Varon y col., 1990b) consiste en
obtener las ecuaciones cineticas en Iase de transicion correspondientes a un mecanismo
determinado a partir de las ya conocidas de un mecanismo mas complejo (mecanismo
primitivo), del que el primero (mecanismo derivado) puede considerarse, real o Iormalmente,
un caso particular. Este procedimiento es analogo al ya existente para la obtencion de
ecuaciones en estado estacionario (Varon y col., 1989).
Se han desarrollado programas de ordenador (Cornish-Bowden, 1977; Fromm, 1979;
Canela, 1983; Herries, 1984; Ishikawa y col., 1988) que Iacilitan la deduccion de la ecuacion
de velocidad en el estado estacionario. Se ha publicado tambien un trabajo (Zhang y col.,
1989) que describe un programa de ordenador para obtener y representar las ecuaciones
cineticas de la Iase de transicion, a partir de valores numericos de las constantes de velocidad
y de las concentraciones iniciales de los reactivos.
Asi mismo, se han desarrollado programas de ordenador que permiten obtener las
ecuaciones cineticas de la Iase de transicion y del estado estacionario de una reaccion
Introduccion


enzimatica en Iuncion de las constantes de velocidad y de las concentraciones iniciales de los
reactivos, cuando la unica especie enzimatica presente al comienzo de la reaccion es la
enzima libre en una unica Iorma conIormacional (Varon y col., 1990c) o bien cuando hay mas
de una Iorma enzimatica al comienzo de la reaccion (Varon y col., 1990d). En ellos se
obtienen las ecuaciones para condiciones estrictas, es decir, sin ninguna etapa reversible en
equilibrio rapido. Posteriormente se han desarrollado dos programas de ordenador (Varon y
col., 1997, 1999) que ademas de presentar una mejor entrada y salida de los datos en pantalla,
Iacilitando asi la interaccion con el usuario, contempla casos en los que una o mas de las
etapas reversibles involucradas en el mecanismo puedan estar en equilibrio rapido.

1.1.3 El complejo Enzima-Sustrato (ES)
Una reaccion S P catalizada enzimaticamente puede escribirse como:

S P
Pero se vio en seguida que la enzima y el sustrato debian combinarse de alguna Iorma
durante la reaccion. La secuencia de la reaccion total puede escribirse como:
Aunque la enzima participa en la secuencia de reaccion, no se consume. Asi, solo unas
pocas moleculas de E pueden catalizar la conversion de miles de moleculas de S en P cada
segundo. La existencia de un complejo enzima sustrato, ES, se dedujo a partir de (Segel,
1975):
El alto grado de especiIicidad que presentan los enzimas (Fischer, 1894).
La Iorma de la curva de velocidad Irente a la concentracion de sustrato (Brown, 1902;
Henri, 1902).
E
S E E P ES
Introduccion


El hecho de que Irecuentemente los sustratos protegen a las enzimas de la inactivacion
(O`Sullivan y Tompson, 1890).
La especiIicidad de las enzimas esta relacionada con la estructura tridimensional de la
molecula enzimatica. En una reaccion catalizada enzimaticamente, la enzima se combina
temporalmente con el reactivo, el sustrato (S) de la enzima, Iormando un complejo enzima-
sustrato (ES). Entonces, a medida que la reaccion procede, el producto (P) se libera y la
enzima (E) vuelve a su estado original:
La enzima es generalmente mas grande que el sustrato(s) y la combinacion de la
enzima y el sustrato(s) depende normalmente de Iuerzas debiles, tales como puentes de
hidrogeno, Iuerzas de van der Waals e interacciones hidroIobas para unir la enzima con el
sustrato. La pequea parte de la enzima a la que se une el sustrato se conoce como el sitio
activo de la enzima.
La union del sustrato a la enzima produce el complejo enzima-sustrato. Ello sirve
para alinear los grupos reactivos, tensionando enlaces especiIicos del sustrato. El resultado del
complejo enzima-sustrato es la reduccion de la energia de activacion para que proceda la
reaccion, con la consiguiente conversion del sustrato en producto(s).
En la siguiente Iigura se ilustra la Iormacion del complejo enzima-sustrato.

Figuru 1,3, Formucin deI compIego enzimu-sustruto,

Introduccion


Sin embargo aunque la Iormacion del complejo enzima-sustrato ha sido deducida y
demostrada por los experimentos de O`Sullivan y Tompson (1890), Fischer (1894) Brown
(1902), Henri (1902) y posteriormente por Michaelis y Menten (1913), en la actualizad no
suele ser incluido en los mecanismos de reaccion propuestos para ciertos enzimas, debido a la
complejidad matematica que este hecho implica.

Introduccion


1.2 PROTEASAS
La vida de los seres depende en buena parte de la accion de las proteinas, sus
biomoleculas mas versatiles. Las proteinas, y entre ellas las enzimas, se Iorman a partir de
veinte aminoacidos distintos. La combinacion de estos en largas cadenas, con centenares de
unidades cada una, posibilita la Iormacion de millares de proteinas diIerentes, adaptadas a los
distintos procesos biologicos.
Los organismos necesitan controlar la actividad de esta multitud de proteinas para sus
propias Iunciones. Los mecanismos de control de la actividad proteica han ido
perIeccionandose a lo largo de la evolucion. En ese camino han adoptado diversas Iormas:
control genetico de la cantidad de proteina sintetizada, control directo de su actividad
mediante sustancias como sustratos o inhibidores que se unen a sus centros activos (que son
las regiones de la molecula donde se lleva a cabo su accion biologica), o control indirecto de
su actividad por union de sustancias Iuera de su centro activo (regulacion alosterica). Asi, los
organismos vivos disponen de diIerentes sistemas de ampliIicacion biologica que les ayudan a
alcanzar una rapida respuesta Irente a un estimulo dado, cuya cinetica ha sido ampliamente
estudiada por nuestro grupo de investigacion, tales como los denominados ciclos de substrato
(Newsholme y col., 1984; Valero y col., 1995, 1997, 2000, 2004, 2006), cascadas enzimaticas
(Chock y col., 1980; Varon y col., 1994a,b, 2005a,b,c) y reacciones de proteolisis limitada
(Neurath y Walsh, 1976; Butenas y Mann, 2002; Dobrovolsky y Titaeva, 2002; Nesheim,
2003; Varon y col., 1991; Manjabacas y col., 1995, 1996; Fuentes y col., 2005a,b).
Los ciclos de sustrato y las cascadas de modiIicacion covalente de enzimas son
procesos ciclicos reversibles, en los que un sustrato o una enzima, respectivamente, suIren
modiIicacion y desmodiIicacion por dos enzimas diIerentes. En cambio las reacciones de
proteolisis limitada constituyen un mecanismo de control irreversible, ya que se produce una
degradacion parcial de una proteina, catalizada por unas enzimas denominadas proteasas. Los
mecanismos de control irreversible estan dedicados generalmente a proteinas que poseen una
accion biologica muy potente o de especial riesgo para su entorno (enzimas degradadoras,
neuropeptidos, hormonas y otras), para las que es necesario un control muy estricto de su
actividad hasta alcanzar el lugar de destino y en el momento apropiado. Estas proteinas se
Introduccion


sintetizan, por lo comun, en Iorma de precursores inactivos con una extension peptidica que
bloquea su Iuncionalidad.
Otras veces, la degradacion limitada de proteinas tiene relacion con los procesos
encargados de dirigir las proteinas recien sintetizadas hacia su deIinitiva ubicacion
intracelular o extracelular. Este es el caso de los segmentos 'pre, secuencias aminoterminales
adicionales con las que se sintetizan las proteinas que deben ser secretadas Iuera de la celula o
que tienen su destino en membranas o en organulos celulares. Los segmentos en cuestion
conducen a la proteina hasta su asiento Iinal, cumplido lo cual se eliminan por proteolisis
limitada. Ademas de la degradacion limitada debemos considerar la degradacion total que
suIren todas las proteinas al Iinal de su vida. Gracias a este mecanismo de control irreversible
se ajusta la concentracion de proteinas en tejidos y Iluidos biologicos mediante el equilibrio
entre degradacion y sintesis. Ello permite, ademas, su renovacion constante, eliminando las
aIectadas por procesos de envejecimiento.
La moleculas responsables de los mecanismos de control de la actividad proteica por
degradacion irreversible son las proteasas, enzimas de gran rendimiento catalitico capaces de
catalizar a gran velocidad reacciones hidroliticas en las cadenas polipeptidicas de las proteinas
sustrato. La accion proteolitica de estas enzimas se halla controlada, a su vez, por inhibidores,
cuyo eIecto es el de impedir que su accion degradativa se lleve a cabo o se extienda. Y, al ser
las proteasas moleculas peligrosas para su entorno, se suelen sintetizar en Iorma de
precursores inactivos, las preproteasas o zimogenos.
El estudio de las proteasas y de sus precursores esta Iacilitando una mejor
comprension de los procesos de regulacion por proteolisis limitada, asi como de los
mecanismos de inhibicion y activacion de los precursores inactivos en general. Se conoce
bastante bien la bioquimica de las proteasas, su estructura tridimensional y mecanismo de
actuacion, contandose entre las primeras enzimas que se cristalizaron.
Las proteasas son tambien una herramienta muy util en el analisis de la secuenciacion
de aminoacidos y en la identiIicacion y aislamiento de cadenas de proteinas multiIuncionales
mas complejas (Walsh, 1986). Por otro lado, el aislamiento de proteinas de tejidos biologicos
requiere una inactivacion selectiva de las proteasas que interIieren mediante inhibidores
especiIicos. Esta medida, que parece tan simple conceptualmente, puede ser una tarea
laboriosa si la naturaleza, estabilidad y especiIicidad de las proteasas contaminantes no es
Introduccion


conocida. Con ayuda de la biologia molecular se ha descubierto una nueva dimension en el
estudio de las proteasas a partir de sus correspondientes ADN. Esta inIormacion ha
contribuido de Iorma signiIicativa a nuestro conocimiento de la organizacion, Iunciones y
evolucion de proteasas reguladoras mas complejas.

1.2.1 Clasificacin
Originalmente, las proteasas se clasiIicaron de acuerdo con su masa molecular, carga o
especiIicidad de sustrato. Un sistema mas racional se basa en la comparacion de sitios activos,
mecanismos de reaccion y estructura tridimensional. La Union Internacional de Bioquimica
reconoce cuatro clases. Cada Iamilia posee un conjunto caracteristico de residuos de
aminoacidos dispuestos en una conIiguracion particular para Iormar el sitio activo. En la
tabla 1.1 se muestran estas clases y Iamilias.

TubIu 1,1, CIuses y fumiIius de proteusus {Drenth y coI, 1971; Neuruth 194; kostku
19}

CLASE
PROTEASA
REPRESENTATIVA
RESIDUOS
CARACTERSTICOS DEL
SITIO ACTIVO
Quimofripsino Asp I0Z, Ser I9b, His b7
Serinoprofeosos
SubfiIisino Asp 3Z, Ser ZZI, His o4
Cisfenoprofeosos Popono Cys Zb, His Ib9, Asp Ib8
Asporficoprofeosos Pepsino Asp 3Z, Asp ZIb
Corboxipepfidoso A
8ovino
Zn, 0Iu Z70, Try Z48
MefoIoprofeosos
TermoIisino Zn, 0Iu I43, His Z3I
Introduccion


Dentro de cada Iamilia se cree que sus miembros proceden de una proteasa comun y
que a partir de ahi tuvo lugar una evolucion divergente.
1. Familia de las serinaproteasas
Es la Iamilia de proteasas mejor caracterizada y Iisiologicamente mas versatil (Kraut,
1977). Incluye enzimas intimamente relacionadas que contienen un residuo reactivo de serina
en el sitio activo. El grupo de las serinaproteasas es muy amplio y puede ser dividido en otras
subIamilias, de cada una de las cuales se puede tomar un miembro representativo. El grupo de
la quimotripsina contiene proteasas como tripsina, elastasa, acrosina, calicreina, catepsinas
(A, G y R), Iactores de coagulacion (VII, IX, X, XI), activador del plaminogeno, trombina,
proteina C y Iactores del sistema del complemento. Todas ellas se caracterizan por constar en
su estructura de dos barriles beta entre los que se encuentra el centro activo, donde hay un
aminoacido serina indispensable para su accion catalitica. Los barriles beta deben su nombre a
que la cadena polipeptidica adopta una estructura extendida y ondulada (estructura beta) que
se repliega en segmentos antiparalelos que adoptan la Iorma de un barril. Si bien poseen unas
estructuras y unos mecanismos de reaccion similares, presentan distintas especiIicidades de
sustrato. El mecanismo de reaccion de la quimotripsina ha sido estudiado exhaustivamente
durante cuarenta aos y es tipico de las serinaproteasas, pudiendo extrapolase a otras
reacciones catalizadas enzimaticamente
Las serinaproteasas intervienen en la coagulacion sanguinea, deIensa inmunitaria y
Iecundacion, entre otras Iunciones.
Otra subIamilia es la representada por subtilisina, una serina proteasa bacteriana
producida por Bacillus subtilis, cuya estructura y conIormacion se diIerencia marcadamente
de las serinaproteasas de vertebrados. Existe una analogia entre la quimotripsina y la
subtilisina, que se considera un ejemplo de una evolucion convergente, Ienomeno por el que
proteinas de especies no relacionadas han desarrollado una Iuncion y un mecanismo de
reaccion comun para un proceso dado.
Otros grupos interesantes son las prolil oligopeptidasas y las serina carboxipeptidasas.

Introduccion


2. Familia de las asparticoproteasas
Esta Iamilia esta representada por la pepsina gastrica, proteina que consta de dos
regiones globulares o dominios similares, Iormados esencialmente por cadenas beta, y
asociados en Iorma de 'croissant, entre los cuales discurre un amplio surco que contiene el
centro activo. Los residuos caracteristicos del sitio activo son los aminoacidos Asp-32 y 215
(numeracion de la pepsina porcina) (Beynon y Bond, 1989). En este mismo grupo de
proteasas se inscribe la quimosina, responsable de la coagulacion gastrica de la leche en
mamiIeros neonatos, y la renina, enzima que circula por el torrente sanguineo y activa la
angiotensina, hormona que controla la presion arterial y el balance de electrolitos, asi como
ciertas proteasas de origen bacteriano. Un inhibidor muy potente de las proteasas asparticas es
la pepstatina.
3. Familia de las cisteinaproteasas
Esta Iamilia encuentra en la papaina uno de los miembros mas representativos. La
estructura de la papaina contiene dos dominios abrazados, lo que le sirve de proteccion contra
la autolisis, con un aminoacido cisteina no oxidado en su centro activo (Cys-25) (Beynon y
Bond, 1989). Diversas catepsinas (L, S, H, B, etc), mayoritarias en los lisosomas (organulos
celulares en donde se degradan proteinas), son cisteinaproteasas. Se ha observado la
participacion de cisteinaproteasas en la replicacion y accion de parasitos y virus, asi como en
procesos patologicos, tales como distroIia muscular, osteoporosis e invasividad tumoral.
4. Familia de las metaloproteasas
Los componentes de la heterogenea Iamilia de las metaloproteasas poseen un metal,
cinc por lo comun, en su centro activo. Sus cadenas polipeptidicas presentan plegamientos
tridimensionales muy diversos. En las estructuras conocidas de enzimas de este grupo se ha
observado que el atomo metalico presenta tres ligandos con la cadena polipeptidica y el cuarto
ligando es una molecula de agua que se activa cuando se inicia el ataque nucleoIilico sobre el
enlace a hidrolizar. Se conocen hasta 25 Iamilias de metaloproteasas que incluyen subIamilias
de endopeptidasas como la de la termolisina, la colagenasa y astacina, y de exopeptidasas
como las carboxipeptidasas y las aminopeptidasas. En vertebrados, la carboxipeptidasa A es
secretada por el pancreas en Iorma de zimogeno al intestino delgado. Tras su activacion, esta
proteasa participa en la digestion de las proteinas. Las colagenasas, ejemplo de
Introduccion


metaloendopeptidasas, intervienen en la degradacion del tejido conjuntivo y revisten interes
en patologias reumatoides y en invasion tumoral.
Otras peptidasas
Hay otras peptidasas que no estan representadas en ninguna de las cuatro Iamilias.
Entre ellas se encuentra la Iamilia N-terminal hidrolasas nucleoIilicas que incluyen el
proteosoma 20S de levadura, penicilina G amidasa (PGA), glutamina PRPP
amidotransIerasas, glicosilasparaginasas y penicilina V amidasa (PVA). Este diverso grupo
muestra rasgos en comun como un unico plegamiento y el hecho de que todas necesitan ser
activadas para exhibir sus propiedades como hidrolasa. Estas hidrolasas se caracterizan por el
hecho de que el nucleoIilo del sitio activo es Thr, Cys o Ser, esta localizado en la posicion del
extremo N-terminal y debe ser destapado por la activacion para llegar a ser activo.
Otra Iamilia incluye la proteasa de la germinacion (GPR) responsable de la
degradacion de proteinas que protegen el ADN antes de la germinacion de esporas (Lazure,
2002).
Los estudios cristalograIicos de rayos-X han contribuido signiIicativamente al
entendimiento de la activacion de peptidasas, han suministrado mecanismos y estructuras
noveles y continuaran siendo una herramienta principal en el analisis del Iuncionamiento de
las peptidasas. Sin embargo, en pocos aos, debido al conocimiento total del genoma, existen
numerosas Iamilias y miembros emergentes que obviamente no tienen homologo
cristalograIico. Algunos ejemplos son: las caspasas, que son proteasas intracelulares que
actuan como reguladores de la muerte celular y son los eIectores de la apoptosis, y las matrix
metaloproteasas (MMPs), que son sintetizadas como zimogenos.

1.2.2 Transformacin proteoltica y regulacin fisiolgica
La transIormacion proteolitica es la etapa Iinal en la expresion de la actividad de una
gran variedad de proteinas, operando cambios en la estructura tridimensional y en la
Iuncionalidad de las proteinas. La proteolisis esta dirigida y limitada a la rotura de enlaces
peptidicos especiIicos situados en determinadas regiones de la proteina (Figura 1.4). Estas
regiones presentan un plegamiento espacial laxo para Iacilitar la accion proteolitica y, a veces,
Introduccion


una secuencia de aminoacidos que ha de ser reconocida por la proteasa activante. Cuando los
peptidos escindidos del zimogeno pertenecen a una zona interna, la proteina activa queda, de
ordinario, separada en dos o mas Iragmentos o cadenas polipeptidicas, que no se sueltan del
todo, sino que permanecen unidas a traves de puentes disulIuro.

Figuru 1,4, Roturu proteoIticu de un enIuce peptdico,

La proteolisis limitada interviene en muchos Ienomenos conocidos, como el desarrollo
celular, la Iecundacion, la transmision de seales hormonales y nerviosas y en los mecanismos
de deIensa inmunitaria. Asi pues, el repertorio de procesos Iisiologicos regulados por
proteasas es amplio y variado e implica una gran variedad de estas.
El estudio de la estructura y Iuncion de las proteasas y de los sistemas proteicos
regulados por proteolisis limitada ha sido y continua siendo uno de los campos de
investigacion principal en bioquimica. Mientras que en el pasado han recibido mayor atencion
N
H
C
C
H
R
2
R
1

H
C
O
O

H
2
O
C
H
H
3
N
O
C
O
R
1

C
H
H
3
N
O
C
O
R
2

C
O
H
3
N
Enlace peptidico
Proteasa
Introduccion


las proteasas de vertebrados del tracto digestivo, Iundamentalmente las de secreciones
pancreaticas y gastricas, y, por lo tanto, estan entre las mejor caracterizadas estructural y
Iuncionalmente, las proteasas reguladoras mas complejas son de mayor importancia a causa
de la gran variedad de procesos Iisiologicos en los que toman parte. Estos abarcan desde la
transIormacion y asociacion molecular de las crecientes cadenas polipeptidicas hasta la
transIormacion de precursores de hormonas proteicas, receptores y Iactores de crecimiento, y
la activacion de proteasas reguladoras implicadas en la coagulacion sanguinea, Iibrinolisis y
en el sistema del complemento. Igualmente importantes, aunque menos caracterizadas, son las
proteasas celulares encontradas en una gran variedad de tejidos.
Asi pues, estas proteinas constituyen uno de los modelos mas utilizados para la
aplicacion de metodologias de manipulacion y transIormacion geneticas y de ingenieria de
proteinas, gracias a su variedad de Iormas, al proIundo conocimiento que se tiene de ellas y a
la potencialidad de sus aplicaciones biotecnologicas y biomedicas. Con la introduccion de
metodos mas soIisticados de aislamiento y caracterizacion de proteinas y la aplicacion de
metodos de biologia molecular, las proteasas se han convertido en un campo muy importante
dentro de la investigacion aplicada (Craik, y col., 1895; Gardell y col., 1985; Bryan y col.,
1986; Neurath, 1986; Neurath, 1999; Chang y Yang, 2000; Dunn y col., 2002; DeClerck y
col., 2004).

Introduccion


1.3 ZIMGENOS
1.3.1 Reacciones de activacin
Una importante cantidad de proteinas se sintetizan como precursores inactivos, que se
activan en un tiempo y lugar apropiados Iisiologicamente, para proteger la celula que los
produce. Estos precursores se denominan proenzimas o zimogenos, y deben suIrir un proceso
de activacion para convertirse en enzimas activas.
Este es un Ienomeno de gran importancia para entender el comportamiento de muchos
procesos Iisiologicos Iundamentales, tales como la digestion (Chen y col., 2003), la muerte
celular (Boatright y Salvesen, 2003; Shi, 2004), la diIerenciacion (Pearton y col., 2001), la
respuesta inmune (Kanost y col., 2004), la coagulacion sanguinea (Spronk y col., 2003), la
Iibrinolisis (Varon y col., 1986; Marin y col., 2003) y la respuesta a una lesion (Lluis y col.,
2001). Otros ejemplos son la evolucion de los virus, oncogenes y celulas metastaticas
(McKay, 2003).
La reaccion de activacion de zimogenos requiere la rotura catalitica de uno o mas
enlaces peptidicos por proteolisis limitada. Este proceso es una reaccion exergonica en
condiciones Iisiologicas normales y tiene caracter irreversible, no existiendo reacciones
opuestas que regeneren el mismo enlace peptidico hidrolizado o que reinserten el peptido
liberado correspondiente. En este sentido, la activacion de zimogenos es un mecanismo de
control del organismo que diIiere, esencialmente, de las transiciones alostericas y de las
modiIicaciones covalentes reversibles (Stadtman, 1970). En la Iigura 1.5 se muestra, como
ejemplo, la activacion de quimotripsinogeno a u-quimotripsina.
Los zimogenos pierden uno o varios peptidos en la proteolisis. La naturaleza tiende a
ahorrar la perdida de grandes regiones proteicas que son de sintesis costosa. En alguna
ocasion, sin embargo, los peptidos o Iragmentos de activacion eliminados pueden superar, en
tamao, a la propia proteina activa. Un ejemplo de este proceso es la activacion del
plasminogeno, proteina sanguinea que pierde 560 aminoacidos de sus 791 iniciales.
En algunos casos, el proceso de activacion de zimogenos consta de una sola reaccion,
mientras que en otros, el proceso implica una serie de reacciones consecutivas o cascada, que
Introduccion


sirve para ampliIicar un estimulo y obtener una mayor respuesta Iisiologica (Neurath, 1975).
En virtud de una cascada de activacion, Ienomeno caracteristico de los sistemas regulados por
proteolisis limitada, varios precursores inactivos de proteasas se activan consecutivamente de
Iorma especiIica, multiplicando asi la accion inicial de unas pocas moleculas.

Figuru 1,, Activucin de quimotripsingeno, Lo formocion de Io esfrucfuro finoI de Io
quimofripsino ocurre en vorios efopos. En Io primero, Io fripsino rompe eI enIoce enfre
Ios residuos de orginino Ib y de isoIeucino Io, resuIfondo uno formo ocfivo de Io
quimofripsino IIomodo -quimofripsino. A confinuocion, unos rofuros profeoIficos
oufocofoIi;odos por Io quimofripsino conducen o Io formocion de Io -quimofripsino, que
sufre cierfos combios conformocionoIes sucesivos, resuIfondo en primer Iugor k-
1 122 136 201 245
16 122 136 201 245 1 15
Cys Cys S-S Cys Cys S-S
Cys Cys S-S
Tripsina
Cys Cys S-S
Quimotripsinogeno
H-quimotripsina
14 15 147 148
Ser Arg Thr Asn
1 13 16 122 136 146 149 201 245
Tyr Ala Leu Ile
S-S S-S
o-quimotripsina
Cambio conIormacional
k-quimotripsina
Cambio conIormacional
u-quimotripsina
Introduccion


quimofripsino y en segundo fermino o-quimofripsino, formo ocfivo finoI de Io en;imo
(Pown, I989).

En la Figura 1.6 se esquematiza un proceso de activacion de zimogenos en cascada. En
la cascada de activacion, el producto de una reaccion se convierte en el catalizador de la
siguiente. La secuencia de los acontecimientos viene determinada por la especiIicidad de cada
enzima, por la posible presencia de inhibidores y el grado de ampliIicacion del estimulo
inicial debido a la eIicacia de cada proceso de activacion.

Zimgeno 1 Enzima 2

Zimgeno 2 Enzima 3

Zimgeno 3 Enzima 4
.
.
.
.
.

Zimgeno n Enzima (n+1)

Figuru 1,, Representucin esquemticu de unu reuccin de uctivucin de zimgenos
en cuscudu, Lo conversion deI ;imogeno I en Io en;imo Z fiene Iugor medionfe Io en;imo
I, o su ve;, Io en;imo Z fronsformo eI ;imogeno Z en Io en;imo 3, esfo Ifimo fronsformo
eI ;imogeno 3 en Io en;imo 4 y os sucesivomenfe.
Enzima 1
Enzima 2
Enzima n
Enzima 3
Introduccion


1.3.2 Procesos autocatalticos
La activacion de zimogenos por rotura proteolitica de uno o varios enlaces peptidicos
es un proceso enzimatico que requiere la presencia de una enzima activante. Generalmente, la
enzima activante es distinta a la enzima activa resultante de la activacion, dando lugar a un
proceso de activacion intermolecular sobre el precursor o zimogeno. Se pueden dar casos de
activacion reciproca, como ocurre cuando calicreina activa el Iactor XII acoplado a la
activacion de precalicreina por el Iactor XIIa (Smith y col., 2002).
En aquellos casos en los que la enzima activante coincide con la activada el proceso de
activacion de zimogenos es autocatalitico. Ejemplos Iisiologicos incluyen la activacion de
tripsinogeno a tripsina (Brunger y col., 1987; Manjabacas y col., 1995; Liu y Wang, 2004), la
conversion de pepsinogeno a pepsina (Al-Janabi y col., 1972; Auer y Glick, 1984; Kageyama
y Takahashi, 1987; Kageyama, 1988; Kageyama y col., 1989; Nielsen y Foltmann, 1993;
Richter y col., 1998), y de precalicreina a calicreina (Tans y col., 1987; Magklara y col., 2003;
Shariat-Madar y col., 2004). Por ejemplo:
Tripsinogeno Tripsina 2 Tripsina Peptido
En estas reacciones, la propia enzima activa puede actuar en una reaccion de
autocatalisis sobre su precursor o zimogeno (Hadorn, 1974). En otros casos sin embargo, los
zimogenos muestran bajos niveles de capacidad proteolitica que puede contribuir a la
activacion de otras moleculas distintas del propio zimogeno (Gertler y col., 1974; Kerr y col.,
1975). El proceso de autoactivacion que acabamos de describir tiene caracter intermolecular
(Silverberg y col., 1980). Aunque la eIicacia catalitica de la autoactivacion es baja, la
naturaleza exponencial de la autocatalisis Iavorece que pueda llegar a representar un Iactor
importante en el proceso global de activacion de zimogenos. Algunos zimogenos, como el
pepsinogeno, suIren autoactivacion intermolecular e intramolecular (Al-Janabi y col., 1972;
Karlson, 1988):
Pepsinogeno Pepsina Peptido
Pepsinogeno Pepsina 2Pepsina Peptido
Introduccion


En este caso, la activacion del pepsinogeno sucede de Iorma espontanea a pH inIerior
a 5. La etapa clave concretamente en el pepsinogeno porcino es la rotura del enlace peptidico
entre los aminoacidos Leu 16 e Ile 17 (James y Sielecki, 1986).
En esta memoria se va a estudiar un Modelo general de autoactivacion de :imogenos
de proteasas asparticas en el que el zimogeno suIre activacion intramolecular e
intermolecular. Se realizara un seguimiento experimental del modelo general propuesto en
discontinuo (Esquema 1.3) y en continuo (Esquema 1.4).

Esquemu 1,3, Mecunismo generuI propuesto puru Iu uutouctivucin de zimgenos que
incIuye unu etupu intrumoIecuIur {rutu {u}} y otru intermoIecuIur {rutu {b}}, Z es eI ;imogeno,
E es fonfo Io profeoso ocfivonfe como Io en;imo ocfivodo, EZ es eI compIejo en;imo-susfrofo
infermedio de Io reoccion, y W es uno o mos pepfidos Iiberodos de Z duronfe Io formocion de E.

Esquemu 1,4, Mecunismo generuI propuesto puru Iu uutouctivucin de zimgenos
incIuyendo Ius etupus intrumoIecuIur {rutu {u}} e intermoIecuIur {rutu {b}} y Iu hidrIisis
de un sustruto de Iu enzimu uctivu {rutu {c}}, Z es eI ;imogeno, E es fonfo Io profeoso
ocfivonfe como Io en;imo ocfivodo, EZ es eI compIejo infermedio en;imo ocfivo-;imogeno, W es
E W
E Z
Z
EZ 2 E W (b)
(a)
k
1
k
2
k
-2
k
3
E S
ES E P
(c)
k
4
k
-4
k
5
E W
E Z
Z
EZ 2 E W (b)
(a)
k
1
k
2
k
-2
k
3
Introduccion


uno o mos pepfidos Iiberodos de Z duronfe Io formocion de E, S es un susfrofo cromogenico de Io
en;imo ocfivo, ES es un compIejo infermedio en;imo-susfrofo y P es eI producfo de Io hidroIisis
deI susfrofo S.

El Esquema 1.3 es una modiIicacion del mecanismo previamente propuesto para este
tipo de procesos (Koga y Hayashi, 1976), el cual se trato unicamente por integracion
numerica. La principal innovacion de este trabajo es que el comportamiento cinetico del
sistema se ha analizado por ambas vias, analitica y numerica, mostrando asi la bondad del
analisis. Hasta ahora el analisis analitico no se habia llevado a cabo por la complejidad
matematica que incluye la Iormacion de un intermedio enzima-sustrato en la etapa
intrermolecular. Ademas, tambien se va a estudiar el mismo proceso autocatalitico pero
incluyendo un sustrato cromogenico del enzima activa en el medio de reaccion (Esquema
1.4), lo que permite monitorizar en continuo el progreso de la reaccion. Dicho proceso
autocatalitico se va a ilustrar experimentalmente mediante la activacion de pepsinogeno-
pepsina, que es un interesante sistema enzimatico Iisiologico.
En esta memoria tambien se van a sugerir parametros adimensionales que
proporcionen la contribucion al proceso de activacion, a cualquier tiempo de reaccion, de
ambas rutas de activacion, es decir, las rutas intramolecular y la intermolecular para el
Modelo general de autoactivacion de zimogenos propuesto.
1.3.3 Ejemplos fisiolgicos
En el metabolismo se encuentran numerosos ejemplos de procesos de activacion de
zimogenos. La digestion de las proteinas en el duodeno requiere la accion coordinada de
varias enzimas proteoliticas, puesto que cada una es especiIica para un numero limitado de
cadenas laterales. Por ello, los zimogenos deben ser activados de uno en uno. El control
coordinado se consigue por la accion de la tripsina como el activador comun de todos los
zimogenos pancreaticos: tripsinogeno, quimotripsinogeno, proelastasa y
procarboxipeptidasas. Las celulas que tapizan el duodeno producen una enzima, la
enteropeptidasa (enteroquinasa), que hidroliza un determinado enlace peptidico lisina-
isoleucina del tripsinogeno cuando entra en el duodeno. La pequea cantidad de tripsina
Introduccion


producida de esta Iorma activa el tripsinogeno y los otros zimogenos. En la Figura 1.7 se
esquematiza este proceso de activacion.

Figuru 1,7, Esquemu simpIificudo de Iu uctivucin de zimgenos en eI duodeno,

Otro ejemplo mas complejo de activacion de zimogenos en cascada se presenta en la
coagulacion de la sangre (Holzer y Heinrich, 1980; Wohl y col., 1980; Tankersley y
Finlayson, 1984; Mann y col., 1988). Asi, el Iibrinogeno, para cumplir su mision Iormadora
de coagulos que taponen las heridas, debe transIormarse proteoliticamente en Iibrina. En la
cascada de la coagulacion sanguinea participan numerosos Iactores, la mayor parte de los
cuales son proteasas (Tabla 1.2). La existencia de esa cascada de coagulacion permite que la
activacion de unas pocas moleculas de Iactores iniciales engendre miles de moleculas de
Iibrina en el momento de producirse la herida.

CeIuIos deI infesfino
secrecion
Enferopepfidoso
CeIuIos poncreoficos
secrecion
Tripsinogeno Tripsino
ProfosfoIiposo
ProeIosfoso
Quimofripsinogeno
Procorboxipepfidoso A
Procorboxipepfidoso 8

secrecion
FosfoIiposo
EIosfoso
Quimofripsino
Corboxipepfidoso A
Corboxipepfidoso 8

Introduccion


TubIu 1,Z, Fuctores que purticipun en Iu couguIucin sunguneu

Fuctor Nombre
I Fibrinogeno
Profrombino (II) II
Trombino (IIo)
III Focfor fisuIor o frombopIosfino
IV Iones coIcio
ProoceIerino (V) V
AceIerino (Vo)
VII Proconverfino
VIII Focfor onfihemofIico
IX Focfor Chrisfmos
X Focfor Sfuorf
XI TrombopIosfino pIosmofico
XII Focror Hogemon
XIII TronsgIufominoso

En la Figura 1.8 aparecen las vias intrinseca y extrinseca de la coagulacion sanguinea,
que convergen en las etapas Iinales para la Iormacion del coagulo.
Los Iactores de la coagulacion se indican por numeros romanos y la Iorma activa de
los mismos se designa por la letra a. Las etapas que requieren Ca
2
se cree que ocurren en las
superIicies IosIolipidicas in vivo. Las Iormas precursoras de estos Iactores y de otras proteasas
reguladoras son de cadena mas larga y presentan estructuras mas complejas que las de las
proteasas digestivas.
Introduccion


Figuru 1,, Reucciones de uctivucin de zimgenos en cuscudu que se presentun en Iu
couguIucin de Iu sungre (LoffIer y Pefrides, I988).

SISTEMA INTRAVASCULAR SISTEMA EXTRAVASCULAR
EndofeIio
Acfivocion de confocfo
Focfor XII Focfor XII o
Focfor XI Focfor XI o
Focfor VIII Focfor VIII
FosfoIpido
CoIcio
Tejido
Focfor III
Focfor VII Focfor VII o
FosfoIpido
CoIcio
Focfor X Focfor X o Focfor V o
FosfoIpido CoIcio
Profrombino Trombino
Fibrinogeno
Monomero
de Fibrino
PoImeros
de Fibrino
inesfobIes
PoImeros
de Fibrino
esfobIes
Focfor XIII Focfor XIII o
Introduccion


La Iibrinolisis, otro mecanismo complejo de activacion de zimogenos es el mecanismo
compensatorio de la coagulacion sanguinea. Consiste en la disolucion, catalizada por
plasmina, del coagulo de Iibrina. En la Figura 1.9 se representa la cascada de activacion de
zimogenos en la Iibrinolisis.

Figuru 1,9, Esquemu simpIificudo de Iu fibrinoIisis,

En esta memoria se va a estudiar tambien un Modelo de activacion de :imogenos
concreto que corresponde a la activacion de plasminogeno a plasmina por estreptoquinasa.
El mecanismo a estudiar (Esquema 1.5) Iue propuesto por Boxrud y col. (2004) y Boxrud y
Bock (2004). Estos autores obtuvieron las ecuaciones de progreso con el tiempo del producto
de la reaccion bajo suposiciones muy exigentes. En la presente contribucion hemos analizado
el mecanismo del Esquema 1.5 bajo condiciones menos restrictivas y hemos obtenido las
ecuaciones de progreso con el tiempo de las especies que intervienen en el sistema, validas
tanto para la Iase de transicion como para el estado estacionario.

FIRINOLISIS
Acfivodor de
PIosminogeno
CompIejo
PIosminogeno PIosmino
CoIicreno o
Uroquinoso
PoImeros de
Fibrino
esfobIes
Lisis deI
cooguIo
COASULACIN
SANSUNEA
Introduccion


Esquemu 1,, Mecunismo de uctivucin de pIusmingeno u pIusminu por
estreptoquinusu {orud y coI, Z004; orud und ock, Z004}, A es Io en;imo ocfivonfe,
esfrepfoquinoso, Z es eI ;imogeno, pIosminogeno, E es Io en;imo ocfivodo, pIosmino, AZ es eI
compIejo conformocionoImenfe ocfivodo, que puede unirse oI susfrofo (S), y generor eI producfo
(P), de dos formos, por un Iodo por medio de Io formocion de un compIejo fernorio, AZX, por union
con eI susfrofo, y por ofro Iodo por medio de Io formocion deI en;imo ocfivo y de esfo monero por
Io formocion de un compIejo ocfivo en;imo-susfrofo, ES, AZZ es un compIejo fernorio y W es uno
o mos pepfidos Iiberodos de Z duronfe Io formocion de E.

Otro ejemplo Iisiologico lo constituyen los cambios estructurales de los zimogenos de
las proteasas reguladoras implicadas en la transIormacion proteolitica de la
acetilcolinesterasa, enzima que hidroliza la acetilcolina despues de que esta haya realizado su
accion neurotransmisora. La acetilcolinesterasa suIre una proteolisis limitada que la escinde
en dos Iragmentos con actividad tripsina y carboxipeptidasa, respectivamente.
Los zimogenos intervienen tambien en el sistema inmune, asi el termino
'complemento se reIiere a un complejo grupo de enzimas del suero sanguineo normal que,
colaborando con los anticuerpos u otros Iactores, interviene de una manera destacada como
mediador de reacciones tanto inmunes como alergicas.
Las reacciones en las que participa el complemento se producen en el suero sanguineo
y en otros liquidos corporales, razon por la cual se les considera reacciones humorales. Hay
A Z AZ Z AZZ AZ E W

S
AZS

S
ES
AZ P E P

k
1

k
4
k
6

k
7

k
3
k
2

k
5

k-
4

k-
1
k-
2

k-
6

Introduccion


11 proteinas en el sistema del complemento que se designan con la letra C y un numero: C1,
C2, C3 y asi sucesivamente hasta C9. La proteina C1 es en realidad un conjunto de
subunidades designadas por C1q, C1r y C1s. En el sistema del complemento (Hemker y
Hemker, 1969; Klein, 1982; Wetsel y col., 1987; Mller-Eberhard, 1988; Havsteen y Varon,
1990), la cascada consecutiva de activacion de zimogenos produce la histolisis de celulas
bacterianas y tumorales.
En la Tabla 1.3 se ilustran ejemplos de Ienomenos Iisiologicos en los que participan
los zimogenos. Como puede observarse, las proteasas cumplen tambien una Iuncion destacada
en la replicacion virica. En retrovirus (el del SIDA incluido), rinovirus (el del catarro comun,
entre ellos), enterovirus (por ejemplo, los de la polio y la hepatitis A), y en diversos virus de
plantas, se ha demostrado que las proteinas de la capside se sintetizan en Iorma de
poliproteinas precursoras y que, previamente, deben escindirse en sus unidades mediante
degradacion limitada a cargo de proteasas.
Otros procesos biologicos donde tambien esta implicada la activacion de zimogenos
son: la conversion de proinsulina en insulina (Mihalyi, 1972; Holzer y Heinrich, 1980; la
transIormacion de angiotensinogeno en angiotensina (Holzer y Heirich, 1980) y la de
protirosinasa en tirosinasa (Galindo y col., 1983) La activacion de zimogenos presenta
tambien aplicaciones en la terapia Iarmacologica, asi por ejemplo, la administracion del
activador tisular de plasminogeno (t-PA) a un enIermo despues de la Iormacion de un trombo
sanguineo en una arteria coronaria aumenta la probabilidad de sobrevivir a un ataque cardiaco
(Van de WerI y col., 1984).

Introduccion


TubIu 1,3, EgempIos de zimgenos fisioIgicos y fenmenos concretos ufectudos
{AviIs y coI, 1994},
FUNCION
IOLSICA
FAMILIA DE ZIMSENOS
O FENMENO
CONCRETO AFECTADO
EJEMPLOS DE ZIMSENOS
INVOLUCRADOS O DE SU
ACTIVADOR
Tronsporfe
profeico

Profenos. Lo moyoro de Ios profenos de
segregocion ceIuIor exferno o de
IocoIi;ocion en membronos o en orgonuIos
ceIuIores (muchos de eIIos pre-profenos.

Esfrucfurocion
ceIuIor y
fisuIor

EnsombIoje deI fejido
conecfivo.
ModeIodo deI cifoesquIefo y
oporofo confrocfiI.
ProfeoIisis Iimifodo de
profenos unidos o
membronos.
ProcoIogeno, proeIosfino.
Precursor de Io profeoso dependienfe deI
Co (CAMP o coIpono).
Profeosos de membrono de
microorgonismos.
Comunicocion
inferceIuIor y
reguIocion
mefoboIico
Prohormonos y producfos
vosoconsfricfores.
Proneuropepfidos .
Proen;imos.
ProinsuIino, progIucogon, quininogeno,
ongiofensinogeno.
ProopiomeIonocorfino.
Profirosinoso, profenoxidoso.

ConfroI deI
desorroIIo
ceIuIor y de Io
fecundocion

Mefomorfosis de onfibios y
regenerocion uferino.
Crecimienfo neuronoI (y
fisuIor, en generoI).
Precursores de focfores de
crecimienfo.
Oncogenesis.
Peumofismo.
PepIicocion vrico.
Formocion de esporos.
Fecundocion.
ProcoIogenoso.
AcefiIcoIinesferosoProfeoso.
Precursor deI focfor de crecimienfo
nervioso.
EsfromieIisino, ocfivodor pIosminogeno.
MefoIoendopepfidosos.
PoIiprofeno precursoro de Io profeoso
VIH-I deI SIDA.
Profeosos A y 8 de Ievoduros.
Proocrosino.

Defenso
CooguIocion songuneo.
Sisfemo inmuniforio/sisfemo
compIemenfo.
Sisfemo inmuniforio/
mosfocifos-onofiIoxis IocoI.
Venenos.
Focfores de cooguIocion (XII, XI, IX, X,
efc).
CompIejo oIigomerico CI deI sisfemo deI
compIemenfo.
Serino y mefoIproprofeosos de
mosfocifos.
PromefiIino de obejos.
Degrodocion y
recombio
profeico
Sisfemo digesfivo de
verfebrodos.
Degrodocion infroceIuIor.
Pepsinogeno, fripsinogenos,
procorboxipepfidosos, efc.
Precursores de profeosos de membronos.
Introduccion


1.4 SISTEMA ENZIMTICO PEPSINGENO-PEPSINA
La pepsina se Iorma a partir del pepsinogeno mediante la proteolisis de 44 residuos del
extremo N-terminal. El zimogeno es estable a pH neutro, pero por debajo de pH 5 se activa
rapida y espontaneamente. El proceso de activacion se lleva a cabo por dos rutas separadas,
un proceso catalizado por la pepsina y otro catalizado intramolecularmente. Existen muchas
pruebas de que el pepsinogeno se puede autoactivar por un proceso unimolecular en el que el
sitio activo rompe el extremo N-terminal de su propia cadena polipeptidica (Al-Janabi y col.,
1972; Dykes y Kay, 1976; Richter y col., 1998). Quizas la demostracion mas elegante de este
intrigante Ienomeno es la autoactivacion del pepsinogeno unido covalentemente a una resina
de seIarosa (Bustin y Conway-Jacobs, 1971). Las moleculas estan inmovilizadas y, en
general, no estan en contacto entre ellas y sin embargo, al exponerlas a pH 2 el pepsinogeno
se activa espontaneamente. Existe una competencia entre las dos rutas de activacion,
dominando la activacion bimolecular a concentraciones de zimogeno elevadas y por encima
de pH 2.5, mientras que la activacion intramolecular es dominante a pH bajo y
concentraciones de zimogeno menores de 1 mg/ml. El resultado de esta activacion espontanea
del zimogeno puro es que la mayoria de moleculas de pepsinogeno seran activas 10 segundos
despues de que se produzca la mezcla con el acido clorhidrico en el estomago.
El proceso de activacion de las proteinasas asparticas, grupo al que pertenecen el
pepsinogeno y la pepsina, ha sido estudiado ampliamente mediante tecnicas bioquimicas y
bioIisicas. Los estudios cineticos llevados a cabo por Roger Herriott a Iinales de los aos
1930 mostraron que la conversion de pepsinogeno a pepsina a pH bajo es una reaccion
autocatalitica que involucra la Iormacion de intermedios (Herriott, 1939). Estudios posteriores
utilizando tecnicas espectroIotometricas en los aos 1970 establecieron que tienen lugar
cambios conIormacionales durante la conversion. Bajo una exposicion inicial del zimogeno a
acido ocurre un cambio conIormacional sin la ruptura proteolitica en la escala de tiempos de 5
ms a 2 s (Auer y Glick, 1984).
El sitio activo de las proteinasas asparticas esta compuesto por dos residuos de
aspartato (Asp32 y Asp215 en pepsina; Asp32 y Asp217 en gastricsina). Una molecula de
agua esta unida por enlace de hidrogeno a los dos sitios activos del residuo Asp. Durante la
catalisis el agua es desprotonada y seguidamente ataca al carbono carbonilico del enlace a
Introduccion


susceptible de ataque del sustrato Iormando un intermedio tetraedrico (Davies, 1990; James y
col., 1992). A diIerencia de las serina proteinasas, el residuo catalitico de Asp no Iorma
complejos covalentes con sus sustratos.
Mientras que las estructuras de las enzimas activas son conocidas para muchos
organismos, las unicas estructuras de zimogenos que han sido determinadas son las de
pepsinogeno de especie humana y de cerdo, asi como progastricsina (Khan y James, 1998).
Las secuencias identiIicadas contienen entre el 50 de las Iormas maduras de esas enzimas,
pepsina y gastricsina. Por ultimo, se ha determinado la estructura cristalograIica de rayos X de
la Iorma del intermedio de gastricsina humana, probandose asi los detalles moleculares de
varias etapas en el mecanismo de activacion. (Khan y col., 1997).
En el pepsinogeno humano el peptido seal esta constituido por los aminoacidos 1 al
15. La activacion tiene lugar mediante un segundo corte proteolitico, que elimina el peptido
de 16 al 62. La pepsina A humana madura tiene 326 aminoacidos (del 63 al 388). La
secuencia o estructura primaria del precursor tal como se sintetiza en el ribosoma es
(www.expasy.org; SWISS-PROT: P00790):

10 20 30 40 50 60 70 80
MKWLLLLGLV ALSECIMYKV PLIRKKSLRR TLSERGLLKD FLKKHNLNPA RKYFPQWEAP TLVDEQPLEN YLDMEYFGTI
90 100 110 120 130 140 150 160
GIGTPAQDFT VVFDTGSSNL WVPSVYCSSL ACTNHNRFNP EDSSTYQSTS ETVSITYGTG SMTGILGYDT VQVGGISDTN
170 180 190 200 210 220 230 240
QIFGLSETEP GSFLYYAPFD GILGLAYPSI SSSGATPVFD NIWNQGLVSQ DLFSVYLSAD DQSGSVVIFG GIDSSYYTGS
250 260 270 280 290 300 310 320
LNWVPVTVEG YWQITVDSIT MNGEAIACAE GCQAIVDTGT SLLTGPTSPI ANIQSDIGAS ENSDGDMVVS CSAISSLPDI
330 340 350 360 370 380 388
VFTINGVQYP VPPSAYILQS EGSCISGFQG MNLPTESGEL WILGDVFIRQ YFTVFDRANN QVGLAPVA

En las siguientes Iiguras se presentan las estructuras tridimensionales del pepsinogeno
A y de la pepsina humanos:
Introduccion


Figuru 1,10, Estructuru tridimensionuI deI pepsingeno A humuno, Lo porfe
remonenfe de pepsino de Io moIecuIo se ho dibujodo en gris (8ofemon, I998).

En la siguiente Iigura se presenta la estructura de la pepsina humana

Figuru 1,11, Estructuru de Iu pepsinu humunu, Los osporfofos deI sifio ocfivo con su
union cofoIfico o Io moIecuIo de oguo se hon coIoreodo en rojo. (Fujinogo y coI., I99b).

Introduccion


La pepsina es la principal enzima del jugo gastrico, es una endopeptidasa, un termino
que se reIiere al hecho que hidroliza los enlaces peptidicos interiores de una proteina. Al igual
que en otras proteasas, el sitio activo es un area extensa que puede acomodar como minimo
cuatro o cinco, y quizas hasta siete, restos aminoacidos. Presenta una preIerencia por los
aminoacidos hidroIobicos en cualquiera de los lados del enlace escindible. Una inspeccion
estadistica de las roturas de enlaces en las proteinas demuestra que hay una especiIicidad por
la leucina, Ienilalanina, triptoIano y glutamato en el sistio
1
S y por triptoIano, tirosina,
isoleucina y Ienilalanina en el sitio
'
1
S (Fersht, 1980).
Introduccion


1.5 SISTEMA ENZIMTICO PLASMINGENO-PLASMINA
El plasminogeno se sintetiza en el higado y se secreta dentro del plasma. La activacion
de plasminogeno a plasmina es el evento central en la lisis de coagulos de sangre por el
sistema Iibrinolitico. Mientras que diIerentes proteasas son capaces de activar plasminogeno
in vitro, incluyendo el Iactor XIIa (Goldmith y col., 1978), Iactor XIa (Mandle y Kaplan,
1979), calicreina de plasma (Colman, 1980) y tambien tripsina (Kocholaty y col., 1952), los
activadores de plasminogeno mas ampliamente estudiados in vivo son el activador de
plasminogeno de tipo tisular (t-PA) y el activador de plasminogeno de tipo uroquinasa (u-
PA), que se emplean clinicamente para la terapia trombolitica. Los activadores de
plasminogeno bacteriano (estreptoquinasa y estaIiloquinasa) son tambien muy importantes a
causa de su potencial trombolitico in vivo (Barrett y col., 2004). Cada activador genera una
Iorma diIerente de plasmina.
La molecula madura de plasminogeno humano consiste en 791 residuos de
aminoacidos en una cadena polipeptidica simple (Robbins et al. 1967; GroskipI y col., 1969;
Wiman, 1973; Forsgren y col., 1987). t-PA y u-PA, activan plasminogeno por ruptura del
enlace Arg
561
-Val
562
en el dominio catalitico del zimogeno, iniciando de este modo la
degradacion de Iibrina por plasmina (revisado en Henkin y col., (1991) y Poting y col.
(1992)). La estreptoquinasa activa al plasminogeno por un mecanismo diIerente al de t-PA y
u-PA (Bock y col., 1996). La estreptoquinasa no posee actividad catalitica intrinseca pero
interacciona con plasminogeno y plasmina, convirtiendo ambos, el zimogeno y proteinasa
activa en activadores proteoliticos especiIicos de plasminogeno (McClintock y Bell 1971;
Wohl y col., 1978; Reddy y Markus 1972; Schick y Castellino 1974; Bajaj y Castellino 1977;
Davidson y col., 1990).
En el mecanismo de activacion del plasminogeno por estreptoquinasa, de la union de
estreptoquinasa a plasminogeno resulta una expresion conIormacional del sitio activo
catalitico en el zimogeno sin la requerida ruptura del enlace peptidico (McClintock y Bell
1971; Reddy y Markus 1972; Schick y Castellino 1974; Boxrud y Bock, 2004). A la
activacion conIormacional le siguen la conversion proteolitica del plasminogeno a plasmina
por ruptura del enlace Arg
561
-Val
562
, y la union de estreptoquinasa a plasmina propaga la
Introduccion


activacion proteolitica del plasminogeno (Wang, y col., 1998; Boxrud y col., 2000; Boxrud y
Bock, 2004).
La plasmina es una serina proteasa de dos cadenas derivada a partir del plasminogeno.
Dos uniones de peptidos en plasminogeno se rompen para Iormar la plasmina, uno en Arg
561[Val562 (numeracion de plasminogeno humano), catalizada por activadores de
plasminogeno (Robbins y col., 1967), y un segundo, Lys[Lys78, catalizada solo por la
plasmina Iormada durante la activacion (Sodetz y Castellano, 1975; Violand y Castllino,
1976). Las cadenas peptidicas estan unidas por dos puentes disulIuro, Cys548-Cys666 y
Cys558-Cys566 (Wiman, 1977; Sottrup-Jensen y col., 1978).
La plasmina es una enzima clave en la lisis de coagulos de sangre, y sus sustratos
Iisiologicos mas importantes son Iibrinogeno y Iibrina. La plasmina cataliza la ruptura de
enlaces Lys[ y Arg[, con una especiIicidad similar a la de tripsina. Sin embargo, la plasmina
es una enzima mucho menos eIiciente que la tripsina y rompe solo algunos de esos enlaces en
proteinas. Muchos inhibidores de tripsina tambien inhiben a plasmina, como los inhibidores
de serina proteasas.
Las diIerentes Iormas moleculares de la plasmina interaccionan con los mismos
sustratos e inhibidores, pero en diIerentes extensiones (Robbins y col., 1981). Se nota una
mayor diIerencia en comparacion con plasmina, en la especiIicidad enzimatica del complejo
estreptoquinasa-plasmina. Plasmina sola no cataliza la activacion de plasminogeno, pero el
complejo estreptoquinasa-plasmina, aunque posee la actividad proteolitica general
disminuida, sirve como un eIiciente activador de plasminogeno (Schick y Castellano, 1974).

Antecedentes y Estado Actual del Tema


CAPITULO 2. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL
DEL TEMA



Cuando algunos miembros de nuestro grupo comenzaron a estudiar la cinetica de la
activacion de zimogenos, los unicos estudios existentes sobre la materia se limitaban a
esquemas de reaccion muy simpliIicados (Kosow, 1975; Wohl y col., 1978, 1980) y en todos
los casos el analisis se reducia unicamente al estado estacionario de la reaccion. En 1983, que
sepamos, se publico el primer analisis de la cinetica de la Iase de transicion de un sistema
enzimatico de activacion de zimogenos: el caso de la activacion de la protirosinasa por
tripsina (Galindo y col., 1983). A partir de ahi han sido numerosos los sistemas enzimaticos
de activacion de zimogenos cuya cinetica de la Iase de transicion ha sido abordada. Ejemplos
de estas contribuciones son: el estudio de la cinetica de la Iase de transicion de la activacion
del plasminogeno (Varon y col., 1986; 1993), la cinetica de activacion del tripsinogeno a
tripsina por enteroquinasa y tripsina (Varon y col., 1990d), la cinetica de activacion de
zimogenos a traves de proteolisis limitada (Varon y col., 1987), la activacion de zimogenos en
presencia de altas concentraciones de enzima activante (Varon y col., 1988), la activacion de
protrombina catalizada por protrombinasa (Krishnaswamy y col., 1987), la activacion de Glu-
plasminogeno y de Lys-plasminogeno por pro-uroquinasa (Liu y col., 1992), la cinetica de
inactivacion termica de catepsina D bovina (Hayes y col., 2001), la activacion del Iactor XI en
el plasma y su dependencia sobre el Iactor XII (Brunee y col., 1993), la inIluencia de la
caseina para estimular la velocidad de activacion del plasminogeno (Markus, y col., 1993), el
eIecto de la modulacion de la heparina sobre la activacion del plasminogeno por t-PA (Young
y col., 1992), etc.
Las contribuciones anteriores, que se reIieren a sistemas enzimaticos concretos de
interes Iisiologico, eran abordadas de modo individualizado, planteando el correspondiente
sistema de ecuaciones diIerenciales que describe el comportamiento cinetico del sistema y,
despues de determinadas suposiciones razonables que linealizaban el sistema, se integraba
analiticamente el mismo para obtener las correspondientes soluciones aproximadas. Una
alternativa a este procedimiento Iue estudiar cineticamente modelos generales de mecanismos
de activacion de zimogenos, que no respondiendo en principio a ningun sistema real concreto,
incluian, como casos particulares, muchos de estos sistemas. La particularizacion del modelo
general al caso particular de interes Iisiologico es inmediata. Esta Iorma de proceder es
practica y ahorra mucho esIuerzo en el analisis cinetico de un sistema concreto. La
generalidad de estos modelos sera tanto mayor, evidentemente, cuantos mas mecanismos
diIerentes puedan considerarse casos particulares del modelo propuesto. En 1993 Havsteen y


col., (1993) llevaron a cabo el analisis cinetico de un modelo general de mecanismo de
reaccion de activacion de zimogenos que incluye practicamente todos los sistemas reales de
activacion de zimogenos, con la unica salvedad de que no exista ninguna etapa de
autoactivacion. Sin embargo, esta limitacion es importante, pues la mayoria de los sistemas
complejos de activacion de zimogenos tales como las cascadas de activacion de las enzimas
involucradas en la hemostasis (coagulacion sanguinea y Iibrinolisis) y en la digestion
involucran etapas de autoactivacion, tales como por ejemplo la activacion de tripsinogeno a
tripsina por tripsina, la activacion de precalicreina a calicreina por calicreina, etc.
Aunque la autoactivacion de zimogenos es un topico clasico en Bioquimica y se ha
estudiado cuidadosamente desde un punto de vista estructural, el analisis cinetico de este tipo
de reacciones se encuentra todavia en un estado preliminar, en el cual solo se han determinado
parametros globales (McPhie, 1972; Tans y col., 1983, 1987; Wu y col., 2001). Uno de los
ejemplos de autoactivacion mejor estudiados ha sido la activacion de la precalicreina del
plasma humano (Tans y col., 1987). Varon et al. (1992) realizaron un analisis cinetico global
de un proceso autocatalitico en presencia de una reaccion acoplada y un analisis de datos
cineticos para la determinacion de los parametros cineticos experimentales. A nivel
experimental se ha estudiado el mecanismo de activacion de tripsinogeno por tripsina bajo
condiciones de equilibrio rapido (Garcia-Moreno y col., 1991) y en presencia de un inhibidor
reversible (Manjabacas y col., 1995, 2002). En estos estudios se analizan las condiciones
experimentales en que la ruta de activacion predomina sobre la de inhibicion o viceversa. El
conocimiento de las condiciones en que una ruta prevalece sobre la otra es Iundamental para
el control de este tipo de procesos.
Tambien se ha publicado un articulo en el que se realiza un analisis cinetico de un
esquema muy simpliIicado de activacion autocatalitica de zimogenos (Wu y col., 2001), que
tiene como principal novedad la introduccion de un nuevo procedimiento que no requiere la
suposicion habitual de exceso de zimogeno, pero que es unicamente valido para el esquema
simpliIicado al que se ha aplicado. El modelo es demasiado sencillo y no contempla la
inhibicion simultanea.
En todas esas contribuciones se considero al zimogeno sin actividad enzimatica. De
cualquier Iorma, las reIerencias que incluyen la actividad enzimatica del zimogeno estan


aumentando Irecuentemente (Lin y col., 1992; Tanaka y Yada, 1997; Richter y col., 1999; Liu
y Wang, 2004).
Existe un modelo que permite analizar los sistemas enzimaticos de activacion de
zimogenos como casos particulares del mismo que se ha mencionado anteriormente (Havsteen
y col., 1993), pero tiene la considerable limitacion de que no acepta mecanismos de reaccion
que involucren una o mas etapas de autoactivacion, aunque estas etapas estan presentes en la
mayoria de los sistemas complejos de cascadas de activacion enzimatica, tales como las que
participan en los procesos digestivos y de coagulacion.
Uno de los ultimos modelos mas completos que incluyen etapas de autoactivacion de
zimogenos asi como inhibicion reversible Iue propuesto y estudiado en 2002 por Manjabacas
y col., (2002), obteniendo tambien las ecuaciones cineticas para casos particulares del modelo
general estudiado. Posteriormente este modelo ha sido utilizado por otros autores para hacer
un analisis en el estado estacionario de las reacciones autocataliticas inducidas por ligando
(Liu y Wang, 2004) y tambien de la autoactivacion de zimogenos en presencia de un inhibidor
reversible (Wang y col., 2004), que es un caso particular del modelo previamente estudiado
por nuestro grupo. Sin embargo estos modelos no consideran tampoco la autoactivacion
intramolecular de los zimogenos.
Hay modelos en la bibliograIia donde si se considera la autoactivacion intramolecular
de zimogenos, como ya se ha mencionado anteriormente (Lin y col., 1992; Tanaka y Yada,
1997; Richter y col., 1999; Liu y Wang, 2004), pero no tienen en cuenta la Iormacion de un
complejo intermedio enzima activa-zimogeno en la etapa de activacion intermolecular, debido
a la complejidad matematica que este hecho implica, ya que el sistema de ecuaciones
diIerenciales correspondiente no es lineal y por tanto no tiene solucion analitica para el curso
completo de la reaccion. Sin embargo la Iormacion de dicho intermedio debe ser considerada,
ya que puede aIectar a la cinetica del proceso.
En la contribucion de Al-Janabi y col. (1972) que trata la activacion de zimogenos
incluyendo rutas de activacion intra- e intermolecular, el objetivo principal del analisis
cinetico Iue la determinacion de los parametros cineticos implicados en el mecanismo de
reaccion propuesto, y no se realizo un analisis teorico del grado de participacion en el proceso
de cada una de las rutas de activacion del zimogeno, la intramolecular y la intermolecular,


valida para todo el curso de la reaccion. Tampoco se tuvo en cuenta la participacion de un
complejo enzima-sustrato en la ruta de activacion intermolecular ya que ello conlleva una
mayor complejidad matematica en la resolucion del sistema de ecuaciones diIerenciales
correspondiente al mecanismo.
Respecto al sistema enzimatico plasminogeno-plasmina, y concretamente a la
activacion del plasminogeno por estreptoquinasa, los primeros modelos estudiados Iueron
realizados por Wohl y col. (1978, 1980). Sin embargo los resultados obtenidos por esos
autores tienen algunas limitaciones, ya que obtuvieron una ecuacion para la Iormacion de
producto asumiendo equilibrio rapido, que unicamente es valida para el estado estacionario.
Ranby (1982) realizo un estudio cinetico en presencia y ausencia de Iibrina, pero tambien
restringido al estado estaconario de la reaccion, mientras que Galindo y col. (1983)
consideraron despreciable la Iase de transicion de la enzima activada comparada con la
duracion de la Iase de transicion de la enzima activante. Varon y col. (1986) obtuvieron la
variacion de las concentraciones con el tiempo de todas las especies que intervienen en el
mecanismo de activacion de plasminogeno humano propuesto por Wohl y col. (1980), validas
para todo el curso de la reaccion, es decir, para la Iase de transicion y el estado estacionario.
Mas recientemente Boxrud y col. (2004) propusieron un nuevo mecanismo cinetico de
activacion del plasminogeno por estreptoquinasa en el que caracterizaron la etapa de
activacion conIormacional. Seguidamente Boxrud y Bock (2004) deIinieron el acoplamiento
de la activacion conIormacional del plasminogeno con el mecanismo de activacion
proteolitica de Iormacion de plasmina inducida por estreptoquinasa. Estas contribuciones han
contribuido signiIicativamente al estudio cinetico experimental de la activacion de
plasminogeno a plasmina por estreptoquinasa. Sin embargo, en ambas contribuciones las
ecuaciones de progreso con el tiempo del producto de la reaccion se obtuvieron bajo
suposiciones muy exigentes para linealizar el sistema de ecuaciones diIerenciales
correspondiente. Concretamente estos autores separaron el mecanismo en dos partes y
supusieron que en el instante inicial, es decir, a t 0, una de las partes ya se encontraba en
estado estacionario. En nuestra opinion, se pueden obtener las ecuaciones que describen la
variacion de las concentraciones de las especies implicadas en el mecanismo bajo condiciones
menos limitadas, validas para todo el curso de la reaccion, es decir, para la Iase de transicion
y el estado estacionario.
Objetivos


CAPITULO 3. OB1ETIVOS
Objetivos


Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, y la situacion actual del tema, en
esta memoria pretendemos realizar el analisis cinetico de dos Modelos de activacion de
zimogenos, uno de los cuales sera aplicado al estudio experimental de la autoactivacion de
pepsinogeno a pepsina y el otro a la activacion de plasminogeno a plasmina catalizado por
estreptoquinasa.
El primero de los modelos que se pretende estudiar es un modelo general que
corresponde a la autoactivacion de zimogenos de proteasas asparticas, en el que se incluyen
las etapas de activacion intramolecular e intermolecular, teniendo en cuenta ademas la
Iormacion de un complejo enzima activa-zimogeno en la etapa bimolecular. Asi mismo, se
pretende sugerir parametros adimensionales que permitan conocer la contribucion relativa al
proceso de activacion de ambas rutas de activacion, la intramolecular y la intermolecular. Se
realizara el estudio para dos Iormas diIerentes de seguimiento experimental de la reaccion: en
discontinuo y en continuo mediante una reaccion cromogenica acoplada. Todo ello se ilustrara
mediante el seguimiento experimental de la autoactivacion del pepsinogeno a pepsina.
El segundo de los modelos que se pretende estudiar corresponde al analisis cinetico
del mecanismo de activacion de plasminogeno a plasmina por estreptoquinasa, sugerido por
Boxrud y col. (2004) y Boxrud y Bock (2004), cuyo seguimiento experimental se realiza en
continuo mediante el acoplamiento de un sustrato cromogenico. Pretendemos obtener las
ecuaciones de progreso con el tiempo del producto de la reaccion, bajo condiciones menos
restrictivas y mas razonables que las utilizadas por estos autores.
Para ello los objetivos concretos son los siguientes:
1. Obtener las ecuaciones generales aproximadas concentracion-tiempo, mediante
linealizacion del sistema de ecuaciones diIerenciales correspondiente a cada uno de los
Modelos a estudiar.
2. VeriIicar la validez de las ecuaciones concentracion-tiempo obtenidas mediante
simulacion de curvas de progreso.
Objetivos


3. Obtener otras soluciones aproximadas para los mecanismos generales estudiados, en
condiciones simpliIicadas, obteniendo las correspondientes ecuaciones cineticas.
4. Proponer un diseo experimental y un analisis de datos cineticos para evaluar los
parametros cineticos que intervienen en el sistema, los cuales serian inmediatamente
aplicables a correspondientes simpliIicaciones de este.
5. Aplicar los procedimientos sugeridos anteriormente al estudio experimental de la
cinetica de autoactivacion del pepsinogeno a pepsina en ausencia y en presencia de un
sustrato cromogenico, asi como al estudio de la cinetica de activacion del
plasminogeno a plasmina por estreptoquinasa.
6. Obtener parametros adimensionales que proporcionen la contribucion relativa, para un
proceso de activacion autocatalitica que se ajuste al modelo general propuesto y a
cualquier tiempo de reaccion, de cada una de las rutas implicadas en el proceso, la
intramolecular y la intermolecular.
7. Extender el procedimiento sugerido en el objetivo anterior a cualquier proceso de
activacion de zimogenos que se pueda obtener como simpliIicacion del Modelo
general porpuesto.
8. Estudiar el eIecto de las concentraciones iniciales de las especies implicadas en el
mecanismo de reaccion sobre los parametros adimensionales obtenidos.

Materiales y Metodos


CAPITULO 4. MATERIALES Y MTODOS



4.1 MATERIALES
Pepsinogeno de estomago porcino (3300 unidades/mg proteina), puriIicado
cromatograIicamente y libre de actividad pepsina, hemoglobina de sangre bovina, pepsina de
la mucosa de estomago porcino (994 unidades/mg proteina), pepstatina A, Iormato de sodio,
citrato de sodio, acido tricloroacetico, plasminogeno de plasma humano (6.6 unidades/mg
proteina), plasmina de plasma humano (3-6 unidades x mg protein
-1
), disolucion acuosa
tamponada de estreptoquinasa (73,520 unidades x mg protein
-1
), D-Val-Leu-Lys-Nan2HCl,
Tris (hydroximetil)-aminometano, cloruro sodico y L-Lisina Iueron suministrados por Sigma
(Madrid, Espaa). H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-nitro-Phe-Arg-Leu-OH Iue suministrado por
Bachem (BubendorI, Switzerland). El resto de tampones y reactivos Iueron de grado analitico
y utilizados sin puriIicacion posterior. Todas las soluciones se prepararon en agua ultrapura
desionizada y no pirogenica (Milli Q, Millipore Iberica, S.A., Barcelona, Espaa).
Diariamente se prepararon soluciones stock de pepsinogeno a la concentracion
requerida disolviendolo en tampon Tris/HCL 0.02 M, pH 7.5. La concentracion de
pepsinogeno (previamente activado a pepsina por incubacion a pH 2.0 en tampon citrato de
sodio 0.2 M durante 30 minutos) se determino por valoracion del sitio activo con pepstatina A
como inhibidor 'tight-binding (Henderson, 1972). El grado de pureza del pepsinogeno
obtenido de esta manera Iue 60.75 + 10.92 (w/w), calculado teniendo en cuenta una masa
molecular de 41.000 D para el pepsinogeno (Wang y Edelman, 1971). La concentracion de
pepsina se determino de la misma manera.
Diariamente se prepararon soluciones stock de plasminogeno a la concentracion
requerida disolviendolo en tampon Tris/HCl 0.05 M, 0.1M NaCL, 20 mM L-Lisina, pH 7.4.



4.2 MTODOS
4.2.1 Ensayos espectrofotomtricos
Las lecturas espectroIotometricas se obtuvieron en dos espectroIotometros: Uvikon
XS de Bio-Tek Instruments (Basilea, Suiza) y Uvikon 940 de Kontron Instrumentos (Zurich,
Suiza). Los ensayos a 5 C se desarrollaron utilizando un bao HetroIrig Selecta equipado con
criostato usando un anticongelante comercial y comprobando la temperatura utilizando un
termometro digital Cole-Parmer con una precision de 1 . 0 C. Para los experimentos a 25 C
y 37 C se utilizo un bao de agua Precisterm Selecta.

Ensayos de activacin del pepsingeno
El esquema general de los experimentos en el caso del seguimiento experimental en
discontinuo del modelo general de activacion de zimogenos Iue el descrito con anterioridad
(Al-Janabi y col., 1972). Para ello se enIriaron a 5 C alicuotas de 100 l de la solucion stock
de pepsinogeno. En primer lugar se aadieron a esas disoluciones 100 l de tampon citrato de
sodio/HCl 0.1 M, pH 2.0, tambien a 5 C, agitando, y despues del intervalo de tiempo
apropiado, se aadieron 300 l de tampon Tris/HCl 0.5 M, pH 8.5. Estas adiciones se hicieron
tan rapido como Iue posible con ayuda de una jeringa. Los tubos a analizar Iueron
introducidos en un bao de agua a 37 C durante 20 minutos y despues de ese tiempo se
analizo la actividad del pepsinogeno que quedaba sin reaccionar en el medio de reaccion. Para
ello, se aadieron ahora 100 l de dichas soluciones a 1 ml de tampon citrato de sodio/HCl
0.2 M, pH 2.0, y se les permitio que se activaran durante 20 minutos. Entonces, se aadio a
cada tubo 1 ml de solucion de hemoglobina y, despues de exactamente 10 min, se aadio 1 ml
de solucion de acido tricloroacetico del 5. Se Iiltro la mezcla a traves de un Iiltro de papel
de poli(diIluoruro de vinilideno) (tamao de poro 0.45 m, diametro 13 mm) y se leyo la
absorbancia del Iiltrado a 280 nm contra un blanco que no contenia enzima. Todos los
ensayos se realizaron en tubos de polipropileno (Rich y col., 1985). Se ensayaron tambien
otras concentraciones de pepsinogeno activado por la dilucion apropiada de la solucion stock
en tampon Tris/HCl 0.02 M, pH 7.5. En la Iigura 4.1 se puede observar el proceso seguido.


Figura 4.1. Esquema general del experimento.

Para el seguimiento en continuo del modelo general de activacion de zimogenos, la
mezcla de reaccion estandar consistio en diIerentes cantidades de sustrato peptidico (H-Pro-
Thr-Glu-Phe-p-nitro-Phe-Arg-Leu-OH), tampon Iormato de sodio/HCl 0.1 M, pH 3.0 y
100 l Z 100 l Citrato de sodio/HCl 0.1 M, pH 2.0
5 C
+
t activacion
300 l Tris/HCl 0.5 M, pH 8.5
20 min
Z remanente inactivo
37 C
100 l Z remanente
inactivo
100l Citrato de sodio/HCl 0.2 M, pH 2.0
+
20 min
1 ml Hemoglobina
10 min
1 ml tricloroacetico 5
CentriIugar
Filtrar
Medida A
280
nm
37 C


diIerentes volumenes de soluciones stock de pepsinogeno, siendo el volumen Iinal de 1 ml. La
reaccion Iue iniciada por adicion del zimogeno. En todos los casos, la velocidad de hidrolisis
se monitorizo observando el decrecimiento en absorbancia a 300 nm debido al consumo de
sustrato, a 25 C. Previamente se realizaron experimentos en presencia de concentraciones
similares de pepsina en lugar de pepsinogeno bajo las mismas condiciones para asegurar una
relacion lineal entre la cantidad de pepsina Iormada en el medio de reaccion y el nivel de
actividad expresada. La constante de Michaelis-Menten para el sustrato peptidico con
respecto a la pepsina (
S
m
K ) se calculo bajo las mismas condiciones experimentales realizando
una serie de experimentos, variando la concentracion inicial de sustrato entre 7.0 y 385.1 M
a una concentracion Iija de pepsina (31.42 + 4.71 nM). Los datos de velocidad resultante
Irente a la concentracion de sustrato se ajustaron por regresion no lineal a la ecuacion de
Michaelis-Menten, obteniendo los siguientes parametros cineticos:
S
m
K 83.93 (+ 4.28) M y
J
max
7.24 (+ 0.12) x 10
-1
M s
-1
. Este valor de
S
m
K es muy similar al publicado por otros
autores (Dunn y Kay, 1985). S
0
se determino en cada caso midiendo la absorbancia de un
blanco en ausencia de zimogeno, bajo las mismas condiciones experimentales. De este modo
se evaluo tambien el coeIiciente de extincion molar a 300 nm para el sustrato peptidico (c
300

5.134 x 10
3
M
-1
cm
-1
), asi como su estabilidad durante el tiempo de reaccion Iue tambien
evaluada del mismo modo. Tambien se realizaron ensayos blanco a cada concentracion de
zimogeno utilizada, en ausencia de sustrato, siguiendo el cambio en la absorbancia a 300 nm
debido a la conversion de pepsinogeno a pepsina. Estas curvas blanco se restaron a las curvas
de progreso correspondientes a la autoactivacion del zimogeno en presencia del sustrato
cromogenico, previamente al ajuste por regresion no lineal.

Ensayo de activacin del plasmingeno
La activacion cinetica de plasminogeno se monitorizo espectroIotometricamente a 37
C y 405 nm, midiendo la aparicion del producto de la reaccion p-nitroanilida (c 1 x 10
4
M
-1

cm
-1
) (Wohl y col., 1980).



4.2.2 Determinacin de la concentracin de pepsingeno
Se determino por valoracion del sitio activo con el inhibidor 'tight-binding de la
pepsina, pepstatina A. Estos inhibidores actuan a una concentracion similar a la de la enzima.
Henderson (1972), proporciono la siguiente ecuacion para el estudio cinetico de este tipo de
inhibidores que, como se puede observar, permite estimar la concentracion de enzima en el
medio de reaccion:
i
ii is
m
m
t
i
t
v
v
K
S
K
K
K S
E
v
v
I
0
0
1
+
+
+ =
(4.24)
donde I
t
es la concentracion total de inhibidor, E
t
es la concentracion total de enzima, v
0
y v
i

son la velocidad de reaccion del enzima en ausencia de inhibidor y en presencia de inhibidor,
respectivamente, K
m
es la constante de Michaelis para el sustrato correspondiente, K
i
es la
constante de inhibicion y K
is
y K
ii
son las constantes de disociacion de los complejos EI y ESI
(o EIS) respectivamente.
Para obtener E
t
se utilizo la ecuacion anterior variando experimentalmente la
concentracion de inhibidor a diIerentes concentraciones de sustrato y de enzima constantes.

4.2.3 Ajuste de los datos experimentales
Las curvas de progreso experimentales obtenidas se ajustaron por regresion no lineal a
las ecuacion obtenidas en cada uno de los articulos utilizando el soItware SigmaPlot ScientiIic
Graphing System, version 8.02 (2002, SPSS Inc).

4.2.4 Integracin numrica
Las curvas de progreso simuladas se obtuvieron por integracion numerica del sistema
de ecuaciones diIerenciales que describen el comportamiento cinetico de la reaccion de
acuerdo con el mecanismo a estudiar en cada caso, utilizando valores tanto publicados en
bibliograIia como arbitrarios de las constantes de velocidad y de las concentraciones iniciales.


Esta solucion numerica se obtuvo utilizando la Iormula de Runge-Kutta de cuarto orden, pero
aplicando un control adaptativo del paso de integracion inventado por Fehlberg (Fehlberg,
1970; Mathews y Fink, 1999) utilizando un programa de ordenador implementado en Visual
C 6.0 (Garcia-Sevilla y col., 2000). Este programa se ejecuto en un ordenador PC
compatible basado en un procesador Pentium IV/2 GHz con 512 Mb de RAM.

4.2.5 Trasnformada de Laplace
Hemos utilizado el metodo de la TransIormada de Laplace (Darvey, 1977) para
resolver los sistemas de ecuaciones diIerenciales que describen cada uno de los mecanismos
en estudio, una vez linealizados. Este metodo transIorma un sistema de ecuaciones
diIerenciales, ordinario, lineal, de coeIicientes constantes en un sistema de ecuaciones
algebraicas, que puede ser resuelto por cualquier metodo clasico, como puede ser utilizando la
regla de Cramer.
Resultados y Discusion


Captulo 5. Resultados y Discusin



5.1 ~KINETICS OF INTRA- AND INTERMOLECULAR ZYMOGEN
ACTIVATION WITH FORMATION OF AN ENZYME-ZYMOGEN
COMPLEX


kINETICS OF INTRA- AND INTERMOLECULAR ZYMOSEN ACTIVATION
WITH FORMATION OF AN ENZYME-ZYMOSEN COMPLEX

ABSTRACT
Se ha hecho una descripcion matematica de un mecanismo de activacion autocatalitica de
un zimogeno que incluye tanto la ruta intramolecular como la intermolecular. Se ha incluido la
Iormacion reversible de un complejo intermedio enzima-zimogeno en la ruta de activacion
intermolecular, lo que permite deIinir una constante de Michaelis-Menten para la activacion del
zimogeno al enzima activa. Tambien se han obtenido las ecuaciones de progreso tiempo-
concentracion que describen la evolucion de las especies que participan en el sistema. Ademas, se
han derivado las correspondientes ecuaciones cineticas para casos particulares del modelo general
estudiado. Se ha sugerido un diseo experimental y un procedimiento de analisis cinetico de
datos para evaluar los parametros cineticos, basado en las ecuaciones cineticas derivadas. La
validez de los resultados obtenidos se chequeo utilizando curvas de progreso simuladas de las
especies involucradas. El modelo es suIicientemente bueno en general para ser aplicado al
estudio cinetico experimental de la activacion de diIerentes zimogenos de interes Iisiologico. El
sistema se ha ilustrado mediante la transIormacion cinetica de pepsinogeno a pepsina.


5.2 ~KINETICS OF AUTOCATALYTIC ZYMOGEN ACTIVATION
MEASURED BY A COUPLED REACTION: PEPSINOGEN
AUTOACTIVATION


kINETICS OF AUTOCATALYTIC ZYMOSEN ACTIVATION MEASURED
Y A COUPLED REACTION: PEPSINOSEN AUTOACTIVATION

ABSTRACT
Se ha realizado un estudio cinetico de un modelo para el proceso de activacion
autocatalitica de zimogenos incluyendo la etapa intramolecular y la intermolecular, a las
que se ha acoplado una reaccion cromogenica en la que la enzima activa actua sobre uno
de sus sustratos para medir en continuo el progreso de la reaccion. Se han obtenido las
ecuaciones cineticas que describen la evolucion con el tiempo de las especies implicadas
en el sistema. Estas ecuaciones son validas para cualquier proceso de activacion
autocatalitica de zimogenos bajo las mismas condiciones iniciales. Se ha sugerido un
diseo experimental y un procedimiento de analisis de datos cineticos para evaluar los
parametros cineticos, basado en las ecuaciones cineticas derivadas. Ademas, se ha
deIinido un coeIiciente de distribucion adimensional, que muestra matematicamente si
prevalece la ruta intramolecular o la intermolecular una vez se conocen los parametros
cineticos del sistema. La validez de los resultados obtenidos se ha comprobado mediante
curvas de progreso simuladas de las especies implicadas. Como ejemplo de aplicacion de
este metodo, se ha ilustrado el sistema experimentalmente mediante la medida en
continuo de la cinetica de transIormacion de pepsinogeno a pepsina.


5.3 ~CONTRIBUTION OF THE INTRA- AND INTERMOLECULAR
ROUTES IN AUTOCATALYTIC ZYMOGEN ACTIVATION:
APPLICATION TO PEPSINOGEN ACTIVATION

NOTA: Se incIuyen Ios pruebos de imprenfo deI orfcuIo junfo con Ios correcciones de Ios mismos
enviodos o Io revisfo Acfo 8iochimico PoIonico.


CONTRIUTION OF THE INTRA- AND INTERMOLECULAR ROUTES IN
AUTOCATALYTIC ZYMOSEN ACTIVATION: APPLICATION TO
PEPSINOSEN ACTIVATION

ABSTRACT
Tomando como punto de partida un esquema de reaccion sugerido recientemente para
la activacion de zimogenos incluyendo las rutas de activacion intra- e intermolecular y el
complejo enzima-zimogeno, nosotros hemos realizado un analisis completo de la contribucion
relativa de ambas rutas en el proceso. Este analisis sugiere la deIinicion de parametros
adimensionales nuevos que permiten la elaboracion de las curvas de progreso de la
contribucion de las dos rutas, a partir de los valores de las constantes de velocidad y de las
condiciones iniciales. El procedimiento mencionado anteriormente relacionado con un
esquema de reaccion concreto se ha extrapolado a cualquier otro modelo de activacion
autocatalitica de zimogenos incluyendo las rutas intramolecular e intermolecular. Finalmente,
hemos deducido la contribucion de cada una de las rutas de activacion correspondientes al
proceso de activacion del pepsinogeno a pepsina utilizando los valores de los parametros
cineticos dados en la literatura.


5.4 ~KINETIC ANALYSIS OF THE MECHANISM OF PLASMINOGEN
ACTIVATION BY STREPTOKINASE

NOTA: Se incIuyen Ios pruebos de imprenfo deI orfcuIo junfo con Ios correcciones de Ios mismos
enviodos o Io revisfo JournoI of MofhemoficoI Chemisfry.


kINETIC ANALYSIS OF THE MECHANISM OF PLASMINOSEN
ACTIVATION Y STREPTOkINASE

ABSTRACT
Se ha realizado un estudio cinetico de la activacion del plasminogeno a plasmina
catalizada por estreptoquinasa. El objetivo del presente articulo es la resolucion del
mecanismo correspondiente al proceso de activacion de un modo global, considerando el
mecanismo como un todo y bajo consideraciones menos restrictivas que las utilizadas por
otros autores. Se han obtenido las ecuaciones cineticas que describen la evolucion con el
tiempo de las especies implicadas en el sistema. Estas ecuaciones son validas para la Iase de
transicion y el estado estacionario de la reaccion. Se ha sugerido un diseo experimental y un
procedimiento de analisis de datos cineticos para evaluar los parametros cineticos, basado en
las ecuaciones cineticas obtenidas. La validez de los resultados obtenidos se ha comprobado
mediante curvas de progreso simuladas de las especies implicadas. Finalmente, hemos
demostrado que las ecuaciones de progreso con el tiempo obtenidas pueden ser aplicadas
directamente a diIerentes mecanismos de activacion de zimogenos que puedan ser
considerados como casos particulares del mecanismo general estudiado.

Conclusiones


CAPITULO 6. CONCLUSIONES
Conclusiones


En esta memoria se ha realizado un analisis cinetico de dos procesos de activacion de
zimogenos, los cuales se han aplicado a dos sistemas enzimaticos de interes Iisiologico como
son el sistema enzimatico pepsinogeno-pepsina y el sistema enzimatico plasminogeno-
plasmina, siendo en nuestra opinion, una herramienta muy util en el estudio cinetico de las
reacciones de proteolisis limitada, claves en la regulacion del metabolismo.
Con el Iin de oIrecer una base teorica para Iuturos estudios cineticos, experimentales y
teoricos, es importante analizar el comportamiento cinetico de los procesos de autoactivacion
de zimogenos desde un punto de vista general. Para ello, se ha propuesto un modelo general
de autoactivacion de zimogenos para las proteasas asparticas, que es suIicientemente bueno en
general para ser aplicado al estudio cinetico experimental de la autoactivacion de diIerentes
zimogenos que incluyan rutas de activacion intramolecular e intermolecular. El modelo ha
sido estudiado para dos Iormas diIerentes de seguimiento experimental de la reaccion: en
discontinuo y en continuo gracias al acoplamiento de una reaccion cromogenica. Ademas se
han obtenido, por primera vez, parametros adimensionales que permiten determinar la
contribucion relativa de las rutas de activacion intramolecular e intermolecular al proceso de
activacion autocatalitica de zimogenos.
Asi mismo se ha estudiado un modelo concreto de activacion de zimogenos que
corresponde al mecanismo de activacion de plasminogeno a plasmina por estreptoquinasa
propuesto por Boxrud y col. (2004) y Boxrud y Bock (2004), realizando el estudio bajo
limitaciones menos restrictivas y mas razonables que las utilizadas por estos autores.

Las conclusiones obtenidas son las siguientes:
1. Es posible obtener ecuaciones concentracion-tiempo para los dos Modelos propuestos,
bajo suposiciones razonables que permiten la linealizacion de los sistemas de
ecuaciones diIerenciales que describen el correspondiente comportamiento cinetico. A
partir de estas ecuaciones se han obtenido las de sus casos particulares.
2. El analisis cinetico del comportamiento de cada uno de los modelos se ha analizado
por ambas vias, analitica y numerica. Hay una buena concordancia entre los resultados
obtenidos por ambas vias, lo cual indica la bondad de los analisis cineticos realizados.
Conclusiones


3. Es posible proponer un diseo experimental y un analisis cinetico de los datos
obtenidos en el laboratorio que permita, a partir de las curvas de progreso
experimentales y de los resultados teoricos obtenidos, la determinacion de los
parametros cineticos de cualquier reaccion de autoactivacion de zimogenos que se
ajuste al modelo general aqui propuesto. Ello es valido tanto para el mecanismo que
permite el seguimiento experimental en discontinuo como para el seguimiento de la
reaccion en continuo.
4. El hecho de tener en cuenta la Iormacion de un complejo enzima activa-zimogeno en
la etapa de activacion intermolecular del modelo general de activacion autocatalitica
de zimogenos, ha permitido determinar, por primera vez, el valor de la constante de
Michaelis-Menten del pepsinogeno con respecto a la pepsina.
5. La concentracion de zimogeno disminuye de Iorma exponencial con el tiempo, para el
modelo general de autoactivacion de zimogenos, pudiendose considerar este
comportamiento de tipo uniexponencial desde aproximadamente el comienzo de la
reaccion, bajo las suposiciones aqui realizadas.
6. Es posible deIinir parametros adimensionales que permiten predecir si prevalece la
etapa unimolecular o la bimolecular en el proceso de autoactivacion bajo las
condiciones experimentales utilizadas, una vez los parametros cineticos involucrados
en el sistema han sido evaluados.
7. Es posible resolver el sistema de ecuaciones diIerenciales correspondiente al
mecanismo de activacion de plasminogeno a plasmina por estreptoquinasa, bajo
suposiciones menos restrictivas que las aparecidas hasta ahora en la literatura
cientiIica.
8. Es posible proponer un diseo experimental y un analisis cinetico de los datos
obtenidos en el laboratorio que permite, a partir de las curvas experimentales de
progreso y de los resultados teoricos obtenidos, la determinacion de los parametros
cineticos correspondientes al mecanismo de activacion del plasminogeno por
estreptoquinasa.
9. La concentracion de producto, para el modelo de activacion de plasminogeno por
estreptoquinasa, aumenta segun una ecuacion que consiste en la suma de un polinomio
Conclusiones


de segundo orden y dos terminos exponenciales con argumento negativo, pudiendo
considerarse este comportamiento de tipo parabolico desde aproximadamente el
comienzo de la reaccion, si las condiciones de equilibrio rapido prevalecen.
10. Este estudio contribuye a incrementar los conocimientos sobre los mecanismos de
activacion irreversible de proenzimas que tienen lugar en los seres vivos, asi como
constituye una herramienta muy util para otros cientiIicos que trabajen en temas
relacionados.
BibliograIia


CAPITULO 7. BIBLIOGRAFIA

La bibliografia aqui incluida contiene las citas correspondientes a los Capitulos de esta
memoria exceptuando el Capitulo 5.

BibliograIia


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hffp://exposy.org
NOTA: En oIgunos cosos no se ho dispuesfo deI orfcuIo originoI por Io dificuIfod de conseguirIo
por su onfiguedod o oI proceder de fuenfes poco occesibIes, y en esos cosos no oporece en
Io referencio eI ffuIo deI orfcuIo.

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Matilde Esther Fuentes Ortega

ANLISIS CINTICO DE LAS REACCIONES

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