TEMA 6: HISTOENZIMOLOGÍA.

1. CONCEPTO

Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que se encuentran en los tejidos, y la
emisión consiste en catalizar las reacciones bioquímicas que ocurren en las células para que
éstas puedan realizar sus funciones.

La Histoenzimología es la rama de la histotecnología que tiene por objeto demostrar la

actividad enzimática presente en un tejido. Para ello se emplean diversas sustancias
(cromógenos) que bajo la acción de la enzima adquiere una coloración determinada indicativa
de la presencia de dicha enzima.

2. CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

Las enzimas se suelen clasificar según el tipo de reacción o sustrato cuya descomposición
catalizan. Dentro de las más importantes tenemos:

• Las hidrolasas que catalizan reacciones de hidrólisis. Tenemos las glucidasas, esterasas y
proteasas.
• Las óxido-reductasas que intervienen en oxidaciones y reducciones celulares. Tenemos las
deshidrogenasas y oxigenasas.
• Las transferasas que catalizan transferencia de un grupo funcional desde una molécula a
otra. Tenemos las transmetilasas, las transaminasas y fosfomutasas.
• Las liasas que catalizan la ruptura de enlace, dando compuestos más sencillos. Tenemos
las descarbosilasas y aldolasas.
• Las ligasas o sintetasas que catalizan las reacciones de síntesis.
• Las isomerasas que catalizan la transformación de un compuesto en otro.

3. FIJACIÓN, INCLUSIÓN DEL MATERIAL Y CONSERVACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA

Fijación

La actividad enzimática solo está presente en los tejidos vivos, y ello plantea graves
inconvenientes a la hora de su análisis histológico. Por lo mismo, los métodos ideales de
fijación para realizar estudios histoenzimológicos, son la criosustitución y la criodesecación.

En síntesis, la criodesecación consiste en extraer agua de los tejidos mediante la exposición al

vacío, tras congelación previa en nitrógeno líquido.

La criosustitución se fundamenta en sustituir el agua del tejido por el líquido de sustitución a

muy baja temperatura, por lo que la actividad enzimática no se altera y el tejido queda incluido
y dispuesto para ser cortado en congelación.

En determinadas circunstancias, es posible realizar la fijación del tejido con algunos líquidos
fijadores, como el formol tamponado al 10%, que inactivan escasamente algunas enzimas.
Pero en la mayoría de los casos se realiza el corte en congelación mediante criostato a -20ºC,
previa congelación en isopentano a -50ºC. Para realizar esto, los cortes se fijan en acetona al
100%, que sirve para deshidratar y favorecer las posteriores técnicas de coloración.

Inclusión

En relación con la inclusión previa a la obtención de los cortes en el microtomo, existen 3

alternativas principales:

1. Imbibición en algún medio hidrosoluble de tipo OCT antes de la congelación para

obtener secciones criostáticas.
2. Inclusión en gelatina o propilenglicol, que no necesita extracción de agua tisular ya que
ambas sustancias son solubles en agua.
3. Inclusión en parafina en bajo grado de fusión. En este caso, la actividad enzimática se
conserva relativamente, y como agente deshidratante se utiliza la acetona.

4. FUNDAMENTO GENERAL DE LAS TÉCNICAS HISTOENZIMOLÓGICAS

Pese a que las enzimas no se perciben con los métodos histológicos convencionales, pueden
ser detectadas al actuar como catalizadores de reacciones químicas, pues la acción de la
enzima sobre un sustrato adecuado, produce una sustancia insoluble, opaca o coloreada,
visible al microscopio.

El producto inicial de la reacción entre la enzima y el sustrato recibe el nombre del producto
primario de reacción (PPR).

Cuando el PPR no es opaco o está desprovisto de color, necesita ser ligado a una sustancia o
cromógeno mediante una segunda reacción, para que se genere el producto final de reacción,
que es coloreado.

En el primer caso, el mecanismo de coloración recibe el nombre genérico de método de

captura simultánea, y en el segundo método post- copulación.

5. PRINCIPALES PROBLEMAS DE LAS TÉCNICAS HISTOENZIMOLÓGICAS

Los problemas que plantean principalmente son:

1. La excesiva rigidez de las condiciones en las que hay que realizar las técnicas debido a
que las reacciones enzimáticas ocurren tan solo a un PH y a una temperatura
determinada. Ello plantea importantes problemas metodológicos que exigen al técnico
de laboratorio el dominio de los métodos para realizar soluciones tampón y manejar el
PH neutro.
2. La frecuencia en la aparición de falsos negativos o preparaciones en las cuales a causa
de una alteración de las condiciones de temperatura o PH, o de una mala realización
técnica, no se demuestra la actividad enzimática por encontrarse inactivada. Puede
ser:

- Por la presencia de elementos naturales que interfieren bloqueando el sustrato, con lo

cual la reacción de coloración no ocurre.
 - Por contaminación bacteriana, ya que las bacterias contienen enzimas que pueden
intervenir en la reacción en lugar de sus homónimas tisulares.
- Por una absorción inespecífica del tejido de algunos reactivos debido a una atracción
en superficie similar a la que ocurre en determinadas impregnaciones metálicas.
- Por la difusión de enzimas de unos territorios a otros, por los que se desplace
igualmente el área de positividad.

6. CONTROLES GENERALES EN HISTOENZIMATOLOGÍA

Se basan en la confección de preparaciones que persiguen específicamente detectar tanto los

falsos positivos como los falsos negativos.

Detección de falsos positivos:

1. La eliminación de la actividad enzimática por acción del calor incubando la enzima
a alta temperatura (de 60-90ºC) se introduce su inactivación. Por tanto, si en la
preparación control la técnica es positiva, lo coloreado en ella no se debe a la
actividad enzimática, sino otra causa.
2. Un baño de incubación desprovisto de sustrato. Si la técnica es positiva, el
resultado no se debe a la actuación específica de la enzima sobre el sustrato, sino
a un falso positivo.
Detección de falsos negativos: por lo común, se realiza aplicando simultáneamente el
procedimiento técnico al tejido problema, en el que se pretende determinar la
actividad conocida. Esta última preparación actúa como testigo de una correcta
manipulación técnica y confirma la validez del método.

7. APLICACIONES DE LA HISTOENZIMOLOGÍA

Desde la introducción de la inmunohistoquímica en la práctica histotecnológica de rutina, los

métodos histoenzimológicos han ido perdiendo terreno.

La razón es que resulta más sencillo determinar la presencia de la enzima atendiendo a su

estructura antigénica por métodos inmunológicos que determinarla por su actividad biológica.

Sin embargo, las aplicaciones secundarias de la histotecnología para demostrar mediante

anticuerpos marcados específicamente con enzimas la existencia de una reacción inmune
previa, constituye la base de la inmunohistoquímica, técnica hoy esencial en anatomía
patológica, biología celular e inmunología.

Con todo esto, la determinación de la actividad enzimática de un tejido todavía conserva

vigencia en:

- Biopsia de músculo esquelético

- Para la detección de ganglios y tejido nervioso en la enfermedad de Hirschprung.
- La demostración de defectos enzimáticos, por ejemplo en la biopsia yeyunal.
- La identificación de células del sistema hematopoyético.
- La demostración de los mastocitos.
- La identificación de la actividad osteoblástica.
- La realización de estudio neurohistológicos complejos.