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Joes O • FzRuzi'fTATIO1't nxD BIOBl4OINBERIuo

vol. 76, núm. 2, 94-97. 1993

Optimización del medio mediante un diseño factorial fraccionado para

la producción de lipasa por Rhizopus delemar
PATRICIA MARTINBZ CRUZ', PIERRE CHRIST BN,2 AMELIATARIFAS*
Departamento de Alimentos y Biotecnología, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de
México,04510' y ORSTOM, Cicerdón 609, Col. Los Morales, 11530, 2México, DF, México
Recibido el 13 de enero de 1993/Aceptado el 2 de junio de 1993

El objetivo principal del trabajo de precalentamiento es probar la producción de lipasa extracelular

mediante el uso de fuentes de nitrógeno y carbono de grado industrial y la optimización estadística del medio
de producción. La pasta de soja y la dextrina se seleccionaron en la primera fase de este trabajo como las
mejores fuentes de carbono y nitrógeno y se utilizaron en los siguientes experimentos. La optimización de la
composición del medio se realizó con un diseño factorial fraccionado en dos pasos. La actividad lipolítica a las
48 h fue 12 veces mayor que con el medio inicial. Los resultados muestran que es necesario modlficar la
relación fuente de carbono-fuente de nitrógeno, para reducir el aceite de oliva.concentración y agregar
Tween 80 al medio para lograr la máxima producción.

Las lipasas son enzimas ampliamente distribuidas que se * Autor correspondiente.

pueden obtener de animales, plantas y microorganismos.
Sus propiedades varían según la fuente. El uso de estas 94
enzimas se ha limitado principalmente a la industria
alimentaria, siendo el mercado principal la generación de
sabor de productos lácteos (1, 2). Últimamente, la
transesterificación y la interesterificación, junto con la
posibilidad de utilizar las enzimas en disolventes orgánicos
(3), han dado lugar a un mercado muy interesante en el
sector de la síntesis química.
Una de las lipasas fúngicas más utilizadas es la producida
por Rhizopus delemar. Las aplicaciones incluyen la síntesis
de ésteres (4), el intercambio de acilo de fosfolípidos (5), la
elaboración de pan (6), la síntesis de emulsionantes
alimentarios (7) y la transesterificación para la
modificación de grasas (8); nuestro grupo lo ha utilizado en
el desarrollo de sabores lácteos. Iwai y Tsujisaka (1979)
realizaron los primeros estudios sobre la producción de
enzimas por este moho y detectaron la producción de tres
enzimas (9).
En un artículo anterior (10) se exploraron los factores
nutricionales que afectan la producción de enzimas para
sentar las bases para mejorar los niveles de producción de
enzimas. Los estudios económicos realizados por este
grupo han demostrado que es necesario un aumento de al
menos 10 veces en el rendimiento de la enzima para
considerar la producción a escala industrial de esta lipasa.
El método de optimización considerado es un diseño
factorial fraccionado de dos niveles (11). Se encuentran
disponibles algunos informes sobre el uso de este método
en procedimientos de fermentación (12, 13), así como para
protocolos de síntesis orgánica (14). Los resultados
presentados en estos trabajos muestran el gran potencial de
este método para lograr la optimización en un número corto
de experimentos, permitiendo la prueba de muchos
constituyentes del medio.
El objetivo de esta investigación es sobreproducir lipasa
a partir de este moho, utilizando fuentes de nitrógeno y
carbono de grado industrial disponibles y baratas.

MATERIALESY MÉTODOS
Organismofi. A lo largo de este estudio se utilizó
delemar CDBB H313, utilizado previamente (10), obtenido
del CINVESTAV-IPN, México. El cultivo de stock se
mantuvo en inclinaciones de parafina.
 CulturaMediaSpores de fi. delemar se produjeron en
agar patata-dextrosa en matraces Erlenmeyer 3 de 500 ml
durante 6 d. Se colectaron en una mezcla de glicerol-agua
1:1, hasta alcanzar una OD,p= 0.06 y luego se almacenaron a
4°C. Se utilizó medio de cultivo D (15) con la siguiente
composición (g/f): fuente de carbono, 10i KNO„ 2; MgSO4 ·
7HtO, 0,5; KtHPO„ I y oligoelementos, 1. La composición de
la solución de oligoelementos fue (mg/f): ZnSO- 7H2 , 439,8;
Fe(NO,) . 723,5 y MnS44H2, 203,0. 10 g/f Casa-
aminoácidos (Difco, Michigan, EE. UU.) o el nitrógeno
indicado
fuentese utilizaron para complementarlo, junto con 20 gif de
aceite de oliva (10).
Condiciones de fermentación
Preparación del inóculoEl medio de cultivo se esterilizó a
121°C durante 20 min y se añadieron 2 ml de las esporas
previamente colectadas a matraces Erlenmeyer de 250 ml que
contenían 50 ml de medio de cultivo estéril.
Condiciones de incubaciónLos matraces se incubaron a 29
°C durante 2 días en un agitador rotatorio (150 rpm).
Preparación de enzimasAl final del período de incubación,
el micelio se filtró a través de papel de filtro Whatman #1 y
se usó para el ensayo de actividad enzimática. Cada
experimento se duplicó, excepto cuando se menciona.
AnálisisLa actividad de la lipasa se cuantificó por
titulación de ácidos grasos libres con NaOH 50 mM durante 5
min (16). La mezcla de ensayo se modificó para contener 6
ml de sustrato (una emulsión de tributirina al 5 % en tampón
Tris-maleato 2,5 mM, pH 6,0) y 4 ml de muestra de filtrado
dializado (previamente incubada a 37 °C durante 5 min). La
reacción se llevó a cabo a 37°C. La actividad lipolítica se
expresó como 9M de ácidos grasos libres liberados por ml.
Una unidad (U) de actividad de lipasa se definió como la
cantidad de enzima que libera I PM de ácidos grasos libres en
I min. Cada ensayo enzimático se duplicó.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Selección de fuentes industriales de nitrógeno y carbono Se
seleccionaron reactivos de grado industrial entre diferentes
proveedores locales. Las marcas escogidas son las de mayor
distribución en este país y son de aquellos proveedores que
garantizan un mejor control de calidad. La selección de
reactivos de grado industrial se realizó modificando el tipo de
Tú. 76, 1993 MEDIOOPTIMIZACIÓN95

TABLA 1. Sustratos de grado industrial utilizados para MESA3. Matriz de diseño experimental de ocho corridas no. 1 (ED
el primer paso de selección 1)
Corre A B C D mi F GR Y(U/ml)
Fuentes de carbono Comprador Precio r1 — — — + + + A
— 12.52
(US$/tonelada)* M
Glucosa Arancia 670 2 + — — — — + O
+ 1.51
Amarillodextrina Aranal SA 646 3 — + — — + — + 8.77
Amidex Arancia 612 4 + -I- — + — — — 10.74
Glucosa• Merck 5 — — + + — — + 6.39
6 + — + — + — — 4.05
Nitrógenofuentes 7 — -I- + — — + — 7.87
Sodiocaseinato Ind. deAlimentos 8225 8++++++++3.84

Sojapegar Indianade 570
Alimentos
Haba de sojaharina Arancia 675
Levaduraextracto Arancia 4000
Casaminoácidos•Mtrck —6.96
• Sustratos de grado de laboratorio utilizados
como control.
" En 1991.
fuentes de nitrógeno y carbono una a la vez. La Tabla 1
muestra los diferentes tipos de fuentes industriales probadas
en este estudio. Los controles fueron reactivos de
laboratorio: glucosa (Merck) como fuente de carbono y
casaminoácidos (Difco) como fuente de nitrógeno.
Los resultados ilustrados en la Tabla 2, que son los
valores promedio de las fermentaciones realizadas por
triplicado, muestran que los casaminoácidos (control) son la
fuente de nitrógeno más pobre. La actividad lipolítica se
incrementa significativamente con fuentes industriales de
nitrógeno (excepto con harina de soja), especialmente con
caseinato de sodio y pasta de soja, donde los incrementos
fueron 4,6 y 5,6 veces mayores. No hay diferencias
significativas entre las dos fuentes de nitrógeno de mayor
rendimiento. Se eligió la pasta de soya porque es más barata
que el caseinato de sodio (570 dólares EE.UU./tonelada
frente a 8225 dólares EE.UU./tonelada).
La Tabla 2 muestra que las mejores fuentes industriales
de carbono son las dextrinas, conocidas localmente como
dextrina amarilla y Amidex 20, donde los incrementos en la
actividad lipolítica fueron de 1,5 y 1,3 veces en
comparación con el control. La dextrina amarilla es una
dextrina menos soluble y menos hidrolizada que Amidex
20. Estos hallazgos son similares a los informados
anteriormente.
(10) y podría explicarse por los efectos reguladores que
presenta la glucosa, así como por el mejor crecimiento que
presenta el moho en las dextrinas, que sirven de soporte y
permiten la formación de gránulos. Los resultados
conducen al uso de una fuente económica de carbono
(US$646/tonelada). En los experimentos de optimización
posteriores, se utilizaron pasta de soja y dextrina amarilla
como fuentes de nitrógeno y carbono.
Optimización La optimización cuantitativa del medio
se realizó con un diseño factorial fraccionado en dos
pasos: el primero se utilizó para determinar qué
componentes tienen un efecto significativo en la
producción de lipasa y el segundo para ajustar sus
concentraciones, así como para probar
b — 3.85 1.69 —2.85 2.82 0,67 — 1.05 — 3.67
lipolítico actividad (F) determinado después 2 días de cultura T
U/ml) y coeficientes de contraste (b) para cada componente.
la influencia de otro ingrediente.
Diseño experimental No. yo7) Un 2' • experiencia
se realizó diseño mental (17). Consta de 8 corridas que
permiten el estudio de 7 parámetros (ver matriz en Tabla
3). La concentración de cada constituyente al nivel— y +
se da en la Tabla 4.
Se determinó la actividad lipolítica para cada diseño
experimental y se calcularon los coeficientes de contraste,
que permiten determinar el efecto de cada constituyente, de
acuerdo con la siguiente fórmula (13):
4
donde: b; — coeficiente de contraste del
constituyente j A, ——nivel del
constituyente j (+ o —)
Y, ——actividad lipolítica para el experimento i en
unidades de lipasa
(U/ml).
En cada diseño experimental se calculó un valor
promedio denominado F.
La Tabla 3 muestra los resultados experimentales de ED
1. De acuerdo con los coeficientes de contraste obtenidos,
se puede concluir que la pasta de soya y el sulfato de
magnesio tuvieron un efecto positivo en la producción de
enzimas y su concentración inicial se incrementó en el
siguiente paso de optimización (ver Tabla 3). 5). La
dextrina amarilla, el nitrato de potasio y el aceite de oliva
presentaron un efecto negativo sobre la producción de
enzimas, por lo que su concentración inicial se vio
disminuida. El coeficiente de contraste para fosfato de
potasio y oligoelementos fue cercano a cero y su
concentración no se modificó.
Los resultados muestran que la actividad lipolítica
aumenta 5,9 veces en comparación con la actividad (1,19
U/ml) obtenida a las 48 h en el medio D original.
Diseño experimental No. 2 (ED 2)El número de
parámetros no modificados en el diseño anterior permite
el estudio de al menos otro ingrediente en el segundo paso.
Por lo tanto, se utilizó un diseño experimental de 2°', que
al-

TABLA 2. Resultados experimentales para fuentes de carbono y

nitrógeno

Fuentes de Actividad Desviación

mediaF(p/j) TABLA 4. Campo experimental para ED 1
Estándar
carbonoGlucos Concentración (g/f)
4.05
0.099
a
dextrina 4.94 0.317 Constitucion
amarillaGlucos 4.427 0.226
a Amidex• 3.343 0.03 Amarillodextrina (A)
 5
al nivel
1
Nitrógenofuentes Sojapegar (B) 515
Caseinato de 3.004 0.575 SABER (C) 3
sodio Pasta de 3.675 0.591 MgSO,(D) 0.25 0.75
soja Harina de 0.623 0.144 kzHPO, 0.5 1.5
soja Extracto de 2.418 0.492 (MI
levadura 0.682 0.255 ) 0.5 1.5
Casaminoácidos• Solución de 10 30
oligoelementos
• Igual que la (mlZf) (F) aceite de
Tabla 1. oliva (ml/f) (G)
96CRUZ ET AL. jFERBIENTE. Biozxo. ,

TABLA 5. Matriz de diseño experimental de ocho corridas no. 2 (ED 15

2)
Corr A B C D mi F F(U/ml)
er
1 — + — — — — 12.67
2 + — + + — — 15.96
-1- — — 13.98
4 + 1 — + + — 10.96
5 + + — + 14.82
6 — — — + — + 12.11
7 — — — + + 15.08
8 — + + + + + 13.19
b1.22 — 1.37 1.78 — 1.08 —0,59 0.41
24 72
Actividad lipolítica () determinada después 2 días de cultura Y ——
Hora fh\
13.60U/ml) y coeficientes de contraste (b) para el componente de
caché. HIGO. 1.Cinética comparativa de producción de lipasa con
control y medios optimizados. Símbolos: • , medio inicial; O ,
medio optimizado.
El resultado es el estudio de 6 parámetros en 8 corridas
(ver la matriz dada en la Tabla 5): cinco parámetros fueron
fijados en su nivel anterior y el nuevo parámetro probado interfiere con la transferencia de oxígeno. Esto solo
fue un surfactante, Tween 80. Estudios previos puede probarse mediante experimentos adicionales en
demostraron que su presencia estimula la liberación de la fermentadores instrumentados.
enzima al medio extracelular (10). La concentración de Los resultados obtenidos con este procedimiento de
cada constituyente se da en la Tabla 6. optimización nos permitieron lograr el objetivo original,
El segundo diseño experimental permitió un aumento de es decir, al menos un aumento de 10 veces en la
100% en actividad lipolítica como se muestra en las Tablas producción de enzimas. Probablemente podrían
3 y 5: Y obtenerse aumentos adicionales con el uso de diseños
= 13,6 U/ml en ED 2 y Y —7,0 U/ml en ED 1. Los experimentales que permitan el estudio de las
coeficientes de contraste de la Tabla 5 muestran que las interacciones entre los constituyentes del medio, así
concentraciones de algunos constituyentes aún podrían como estudios reguladores y de secreción más
modificarse ligeramente, aunque las concentraciones profundos.
finales obtenidas son bastante cercanas a las utilizadas en
ED 2. Las concentraciones de aceite de oliva y Tween 80 se
pueden mantener constantes en 1 y 0,2%, respectivamente. AGRADECIMIENTOS
Cinética de producción de lipasa El comportamiento Los autores desean agradecer a la Dra. Gloria Soberón, al Dr.
comparativo de la producción de lipasa por A. delemar en Pablo Pérez Gavilán y al Dr. Sergio Sánchez por sus útiles
un matraz Erlenmeyer, utilizando el medio D inicial y el comentarios ya Isabel Pérez Confort y Pat Hayward por la
medio optimizado se representa en la Fig. 1. Producción traducción. Se agradece el apoyo financiero de CONACYT
máxima de lipasa extracelularción se alcanzó después de 2 d P22CCOT894677 e IFS 1478/2, así como la beca de CONACYT
en ambos casos. El medio optimizado permitió un aumento de a P. Martínez.
12 veces en la producción de enzimas. La disminución
observada a partir del segundo día puede explicarse por la REFERENCIA
liberación de proteasas al medio que probablemente S
hidrolizan la lipasa.
La composición del medio optimizado es (g/f): 1. Macrae,r e Ilnmuiond, J.: Presente y futuras aplicaciones de
dextrina amarilla, 6; pasta de soja, 11; KNO„ 2,5; MgSO„ las lipasas. Biotecnología. Gineta. Ing. Rev., 3, 193-217 (1985).
0,5; 2. Godfrey, T. y Hawklns, D.: Modificación enzimática de grasas
para
K HP4. 1; oligoelementos, 1 ml/l; aceite de oliva, 10 ml/f sabor. EUR. Food Drink Review, 25-27 (1991).
yTween 80, 2,3ml//. Debe enfatizarse que la relación fuente 3Wtlsh, F., Murray, W. y Williams, R.: microbiológicos y
de carbono-nitrógeno es muy importante para la producción enzimático producción de sabor y fragancia productos quimicos
de lipasa, ya que un aumento en la producción de enzimas es crítico
obtenido cuando se modificó de 1 : 1 a 1 : 2. La estimulación de Rev. Biotechnol., 9, 105-169 (1989).
la secreción enzimática demostró ser importante, como lo 4. Langrand, G., Trinntaphylides,C. y Baratti, J.: Lipase cata-
demuestra el efecto positivo ejercido por Tween 80. Se formación lisada de ésteres de sabor. Biotecnología. Lett., 10, 549-
podrían ensayar otros potenciadores de la secreción. Por otro 554 (1988).
lado, es necesario reducir a la mitad la concentración de aceite 5. yagui,T., Nakanishl, Z., Yoshlzawn, Y. y FuLul, F.: The en-
intercambio de acilo zimático de fosfolípidos con lipasas. J.
de oliva. La razón puede ser que en cantidades bajas actúa
Fermento.Bioeng., 69, 23-25 (1990).
como inductor enzimático (10 ml/f o menos), pero si se elevan
6. Multitudseo, S., Allan, A., Attia, R. y El Azbary, Z.: especificidad
los niveles, de la lipasa producida por Rhizopus delemar y su utilización
enla elaboración del pan. Egipto. J. Food Sci., 14, 175-182 (1986).
TABLA 6. Campo experimental para ED 2 7. Nagao, A. y Kiio, M.: Síntesis de O-acil-t-homoserina por lipasa.
JAOCS, 66, 710-713 (1989).
Concentración(g/f)
Constitucio al nivel 8. Ostortierg, E., Blomstrom, A. y Holmberg, K.: Lipase cata-
n — + transesteriñcación lisadade lípidos insaturados en una
dextrina amarilla (A) 4 6 microemulsión. JAOCS, 66, 1330-1333 (1989).
Pasta de soja (B) 9.6 14.4 9. Iwal, M. y Tsu)isaka, Y.: Interconversión de dos lipasas de
KNO (C) 0.9 1.44 Rhizopus delemar.agricola Biol. Chem., 38, 1249-1254 (1979).
MgSO, (D) 0.6 0.84 10. Espinoza,E., Sanchez, S., and Farms, A.: Factores
Aceite de oliva (MI) 8 12 nutricionalesafectando la producción de lipasa por fi. delemar
(ml/f) CDBBH313. Bio-tecnología Lett., 12, 209-214 (1990).
Interpolación 80 (F) 1.6 2.4 11. Pavellc, V. and Saxena, V.: Fundamentos del experimento estadístico
(ml/f)
 K HPO y la solución de oligoelementos fueronmantenida diseño. Ingeniero Químico, 6, 175-180 (1969).
constante a lg// y 1 ml/l respectivamente. 12. Christen, P. and Ralmbault, M.: Optimization of culture me-