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Química de los alimentos 188 (2015) 439–445

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Química de Alimentos

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Caracterización de una cutinasa ácida adaptada al frío a partir deThielavia

terrestrisy su aplicación en la síntesis de ésteres de sabor
haibo xua, Qiaojuan Yanb, Xiaojie Duana, Shaoqing Yanga,⇑, Zhengqiang Jianga,⇑
aDepartamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias de los Alimentos e Ingeniería Nutricional, Universidad Agrícola de China, Beijing 100083, China
bLaboratorio de Utilización de Biorecursos, Facultad de Ingeniería, Universidad Agrícola de China, Beijing 100083, China

información del artículo abstracto

Historial del artículo: Una cutinasa ácida (TtcutB) deThielavia terrestrisCAU709 se purificó hasta homogeneidad aparente con 983 U mg-1
Recibido el 13 de diciembre de 2014 Recibido en forma actividad específica. La masa molecular de la enzima se estimó en 27,3 y 27,9 kDa mediante SDS-PAGE y filtración en
revisada el 14 de abril de 2015 Aceptado el 5 de mayo de
gel, respectivamente. Una búsqueda de homología de secuencias peptídicas no reveló cutinasas homólogas deT.
2015
terrestris,excepto por un gen putativo de cutinasa (XP003656017.1), lo que indica que TtcutB es una enzima nueva.
Disponible en línea el 6 de mayo de 2015
TtcutB exhibió un óptimo de pH ácido de 4.0 y estabilidad a pH 2.5-10.5. La actividad óptima fue a 55 °C, fue estable
hasta 65 °C y retuvo más del 30 % de actividad a 0 °C.kmetrovalores hacia pag-nitrofenilo (pagNP) acetato,pagNP-
Palabras clave:
butirato ypagNP-caproato fueron 8,3, 1,1 y 0,88 mM, respectivamente. La cutinasa exhibió una fuerte actividad
Thielavia terrestris
sintética sobre el butirato de butilo de éster de sabor en un ambiente no acuoso, y se observó la eficiencia de
cutinasa
Adaptación al frío
esterificación más alta del 95% en las condiciones de reacción optimizadas. Las propiedades bioquímicas únicas de la
Caracterización enzima sugieren un gran potencial en las industrias productoras de ésteres de sabor.
Síntesis de ésteres de sabor
- 2015 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción industria, se ha desarrollado una preparación enzimática que contiene

La cutinasa (EC 3.1.1.74) es una enzima lipolítica/estrolítica inducible,
capaz de catalizar la escisión no solo de los enlaces éster de la cutina, el
principal polímero alifático de la cutícula vegetal, sino también de otros
ésteres solubles en agua y triglicéridos insolubles (Chen, Su, Chen y Wu,
2013; Sulaimán et al., 2012). Las cutinasas se consideran intermedias entre
las esterasas y las lipasas, ya que pueden hidrolizar eficazmente los ésteres
solubles y los triacilgliceroles emulsionados. Sin embargo, no exhiben
activación interfacial, que es una característica típica de la lipasa (Egmond y
Van Bemmel, 1997). Recientemente, las cutinasas han recibido mucha
atención debido a su potencial aplicación en varios campos industriales
como alimentos, química fina, farmacéutica y ambiental (Chen et al., 2013).
En la industria alimentaria, se pueden utilizar para hidrolizar el exceso de
grasa en alimentos ricos en grasa como la leche, con el objetivo de reducir la
energía alimentaria, o se pueden utilizar para sintetizar ésteres de sabor
como biocatalizador en bioprocesos limpios y verdes, que se ha considerado
como un ruta alternativa a la industria química sintética tradicional (De
Barros, Azevedo, Cabral y Fonseca, 2012). En la industria química, se utilizan
para producir detergentes para la eliminación de grasas en la ropa
doméstica (Castro-Ochoa et al., 2012). en la farmaceutica
⇑Autores correspondientes.
Correos electrónicos:ysq9926@163.com (S.Yang),zhqjiang@cau.edu.cn (Z. Jiang).
cutinasa para aumentar el efecto farmacológico de los agentes
agrícolas (Pío y Macedo, 2007). En la industria ambiental, las cutinasas
se pueden utilizar para la degradación de plásticos biodegradables (
Watanabe et al., 2014; Yang, Xu et al., 2013).
La disponibilidad de cutinasas que posean características
funcionales deseables para propósitos específicos es un factor limitante
en su aplicación. Por lo tanto, el aislamiento de nuevas cutinasas que
poseen propiedades especiales tiene un gran valor e importancia
económica potencial. Las cutinasas se encuentran principalmente en
diferentes especies de hongos (Castro-Ochoa et al., 2012; Fraga,
Carvalho y Macedo, 2012; Nyyssölä et al., 2014; Pío & Macedo, 2007;
Roussel et al., 2014; Esperanza & Macedo, 2013), aunque también se
han reportado varias enzimas cutinolíticas bacterianas (Dutta,
Krishnamoorthy y Dasu, 2013; Hegde y Veeranki, 2013; Kitadokoro et
al., 2012). Se han purificado y caracterizado varias cutinasas a partir de
diversos hongos, incluidosAlternaria brassicícola (Koschorreck, Liu,
Kazenwadel, Schmid y Hauer, 2010),Coprinopsis cinerea (Merz,
Schembecker, Riemer, Nimtz y Zorn, 2009),Fusarium oxysporum (Fraga
et al., 2012; Esperanza & Macedo, 2013),Fusarium solani (Kwon, Kim,
Yang, canción y canción, 2009),Monilinia fructícola (Wang, Michailides,
Hammock, Lee y Bostock, 2002),Sirococcus conigenus (Nyyssölä et al.,
2014),Trichoderma harzianum (Rubio, Cardoza, Hermosa, Gutiérrez y
Monte, 2008) yTrichoderma reesei (Roussel et al., 2014). La mayoría de
estos son hongos mesófilos; allá

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.05.026 0308-8146/-
2015 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
440 H. Xu et al. / Química de los alimentos 188 (2015) 439–445
no hay informes sobre cutinasas de hongos termofílicos, a excepción de
Insolens de Humicola (Nielsen, Borch y West, 2007).Thielavia terrestrises un
tipo de ascomiceto termofílico del suelo que puede crecer normalmente a
un pH relativamente bajo (p. ej., 4,5) y temperatura elevada (40–45 °C) (Yang,
Xu et al., 2013). No existe reporte sobre la producción o caracterización de
cutinasas de ninguna de las especies deThielavia,excepto una cutinasa de
bajo peso molecular (TtcutA), que fue reportada en nuestro laboratorio
recientemente (Yang, Xu et al., 2013). Aquí, describimos la purificación y
caracterización bioquímica de otra cutinasa ácida deT. terrestrisCAU709.
Luego investigamos la aplicación de esta cutinasa en la síntesis de ésteres
de sabor.
2. Materiales y métodos
2.1. Producción de materiales, microorganismos y enzimas
pag-Nitrofenol (pagNP) ypagésteres NP incluyendopag-acetato de
nitrofenilo (pagANP),pag-butirato de nitrofenilo (pagNPB),pag-caproato
de nitrofenilo (pagPNJ),pag-dodecanoato de nitrofenilo (pagDNP),pag-
miristato de nitrofenilo (pagMNP) ypag-palmitato de nitrofenilo (pag
NPP) eran productos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.).
pag-Hexacaprato de nitrofenilo (pagNPH) se compró a HEOWNS
Company (Tianjing, China). La triacetina, la tributirina, la tricaproína, la
tricaprilina y la tricaprina se adquirieron de TCI Co. (Tokio, Japón). Fast
Red TR Salt y butirato de 4-metilumbeliferil (MUF-butirato) también se
obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). Las resinas
Sephacryl™ S-100 High Resolution, Q Sepharose™ Fast Flow y CM
Sepharose™ Fast Flow se obtuvieron de GE Healthcare (Piscataway, NJ,
EE. UU.). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico a
menos que se especifique lo contrario.
La cepa fúngica utilizada en el presente estudio se depositó en el
Centro General de Recolección de Cultivos Microbiológicos de China
(CGMSS, número de acceso 6233). La cepa se mantuvo en agar papa
dextrosa (PDA) a 4 °C y se transfirió cada 6 a 7 semanas. Para la
producción de cutinasa,T. terrestrisCAU709 se incubó en una placa PDA
a 45 °C durante 2 días y luego se incubó un trozo de medio (1 cm2)
cubierto de micelio se transfirió al medio de cultivo. El medio de cultivo
(1 L) consistió en 10 g de aceite de oliva, 25 g de salvado de trigo, 10 g
de triptona, 1 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4y agua destilada. Después
de la incubación a 50 °C en un agitador rotatorio (200 rpm) durante 3
días, se recogió el caldo de cultivo y se centrifugó (10.000gramo),y el
sobrenadante se usó como enzima cruda.
2.2. Ensayo enzimático
La actividad cutinasa se determinó por el método deSumby,
Matthess, Grbin y Jiranek (2009)con ligeras modificaciones: 50yol de
enzima adecuadamente diluida se añadió a 400yol de tampón de
citrato de sodio 50 mM (pH 4,0) y precalentado durante 2 min, y luego
50yol de 20 mMpagSe añadió NPB preparado en isopropanol puro. La
mezcla de reacción se incubó a 50 °C durante 10 min y luego a 500yoSe
añadió l de tampón de fosfato de sodio 300 mM enfriado (pH 7,0) que
contenía SDS al 5% (p/v) para terminar la reacción. Después de que la
mezcla se enfrió en hielo durante 2 min, el liberado pagLa NP se
cuantificó midiendo la absorbancia a 410 nm. Una unidad de actividad
enzimática se definió como la cantidad de enzima que libera 1yomol
pagNP por min en las condiciones anteriores. La concentración de
proteína se estimó de acuerdo con el método deLowry, Rosebrough,
Farr y Randall (1951). La actividad específica se expresó en términos de
unidades de enzima por miligramo de proteína.
2.3. SDS–PAGE, análisis de zimograma y determinación
molecular nativa
SDS-PAGE se realizó de acuerdo con el método deLaemmli (1970)
utilizando un gel de apilamiento al 4,5 % y un gel de separación al 12,5 %. El
las bandas de proteína se tiñeron con azul brillante de Coomassie
R-250. Se utilizó un kit de calibración de bajo peso molecular (GE
Healthcare). La tinción de actividad de cutinasa se realizó como se
describe por Karpushova, Brümmer, Barth, Lange y Schmid (2005).
La masa molecular nativa de la cutinasa purificada se estimó
mediante filtración en gel: se cargaron 0,5 ml de muestra concentrada
(2 mg) en una columna Sephacryl S-100 (100 - 1,0 cm) preequilibrada
con Tris-HCl 50 mM pH 8,5 ( que contiene NaCl 100 mM), y luego se
eluyó con el tampón de equilibrio a una velocidad de flujo de 0,3 ml min
-1. Las proteínas estándar utilizadas para la calibración fueron
citocromoC (12,4 kDa),a-quimotripsinógeno A (tipo II, de páncreas
bovino, 25,6 kDa), albúmina de huevo (45,0 kDa), fracción V de
albúmina sérica bovina (66,2 kDa) y fosforilasa b (de músculo de conejo,
97,2 kDa).
2.4. Purificación de una cutinasa de T. terrestris CAU709 y análisis de sus
secuencias peptídicas internas
TtcutB se purificó de acuerdo con el protocolo de purificación para TtcutA
informado porYang, Xu et al. (2013). Hay una pequeña diferencia en la purificación
de la columna Q Sepharose Fast Flow. Las fracciones activas para TtcutA se
eluyeron con un gradiente de NaCl de 0 a 50 mM en el estudio anterior (Yang, Xu
et al., 2013). Después de eso, las fracciones activas para TtcutB en el presente
estudio se eluyeron mediante una elución constante de NaCl 50 mM. Las
fracciones recolectadas se monitorearon mediante un ensayo de actividad y la
pureza de la enzima se verificó mediante SDS-PAGE. La cutinasa purificada (TtcutB)
se usó para estudios adicionales.
Para determinar su secuencia parcial de aminoácidos, la cutinasa
purificada se envió al Centro Nacional de Análisis Biomédico (China) para su
secuenciación mediante espectrometría de masas en tándem de ionización
por electropulverización-cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC-
ESI-MS/MS). La secuenciación espectral de masas se realizó según los
protocolos descritos en el estudio anterior (Yang, Tang et al., 2013).
2.5. Caracterización bioquímica de la cutinasa purificada
La actividad enzimática se midió en diferentes tampones (50 mM)
con valores de pH que oscilaban entre 2,5 y 10,5 usando el ensayo
enzimático estándar (Sección2.3). Los tampones utilizados fueron
glicina-HCl (pH 2,5-3,5), tampón citrato (pH 3,0-6,0), tampón MES (pH
5,5-6,5), tampón fosfato (pH 6,0-8,0), tampón Tris-HCl (pH 7,5-9,0 ) y
glicina-NaOH (8,5-10,5). Para la determinación de la estabilidad del pH,
la enzima se incubó en los mismos tampones a 50 °C durante 30 min y
la actividad residual se midió a 50 °C en tampón de citrato 50 mM (pH
4,0).
La temperatura óptima de la cutinasa purificada se determinó
midiendo su actividad en el rango de temperatura de 0 a 100 °C en
tampón de citrato 50 mM (pH 4,0). Para determinar la termoestabilidad
de la cutinasa purificada, la enzima se trató a diferentes temperaturas
(0-100 °C) durante 30 min y las actividades residuales se midieron a 50
°C en tampón de citrato 50 mM (pH 4,0).
2.6. Especificidad del sustrato y parámetros cinéticos
La especificidad de sustrato de la cutinasa purificada se determinó a 50
°C durante 10 min en tampón citrato 50 mM (pH 4,0) según el método deLiu
et al. (2013). Los sustratos probados contienenpagésteres NP incluyendopag
ANP,pagNPB,pagPNJ,pagNP caprilato,pagNPD,pagNPH, pagMNP ypagNPP y
sustratos sintéticos de triacilglicerol que incluyen triacetina, tributirina,
tricaproína, tricaprilina y tricaprina. Una unidad de actividad enzimática se
definió como la cantidad de enzima requerida para liberar 1yomol de ácido
graso por minuto en las condiciones de ensayo anteriores.
Se investigó la propiedad de hidrólisis de la enzima purificada sobre las
cutinas. Los cortes se prepararon a partir de cáscaras de manzana según el
método deWalton y Kolattukudy (1972). 40yog de purificado
 H. Xu et al. / Química de los alimentos 188 (2015) 439–445 441

se añadió cutinasa en 1 ml de solución de cutina al 1% (p/v) en tampón de

citrato 25 mM (pH 4,0), y se incubó a 50ºC durante 18 h. La cantidad de
ácidos grasos liberados se cuantificó por titulación con NaOH 10 mM como
se mencionó anteriormente. La actividad cutinasa se expresó como la
cantidad de cutina (yomol) por hora por miligramo de proteína.
Los parámetros cinéticos constantes de la cutinasa purificada hacia
pagANP,pagNPB ypagLos NPC se determinaron midiendo las
actividades de la enzima con diferentes concentraciones de sustrato en
tampón de citrato 50 mM pH 4,0 a 50ºC durante 5 min. ElkmetroyVmáximo
los valores fueron calculados por el software ''GraFit''.

2.7. Síntesis de butirato de butilo por la cutinasa purificada de T.

terrestris

La reacción de síntesis se realizó en 10 ml de una mezcla de

solvente que contenía a partes iguales ácido butírico y 1-butanol (100
mM) y 5 U ml-1de cutinasa liofilizada. La mezcla se incubó a 50 -C con
agitación constante a 150 rpm durante 14 h, y 50yol de la mezcla de
reacción extraída cada 2 h se analizó por cromatografía de gases según
el método deDe Barros, Fonseca, Fernandes, Cabral y Mojovic (2009).
Se estudió la optimización de las condiciones de reacción para la síntesis
de butirato de butilo. Se examinó el efecto del disolvente sobre la eficacia de
la esterificación cambiando varios disolventes orgánicos, incluidos n-hexano,
ciclohexano, n-heptano, isoheptano y acetona. Luego, la temperatura de
reacción se optimizó variando las temperaturas de 35 °C a 55 °C bajo el
solvente optimizado. Finalmente, se optimizaron las concentraciones de los
dos sustratos en la síntesis de butirato de butilo. Los experimentos se
llevaron a cabo de la siguiente manera: en primer lugar, la concentración de
1-butanol se mantuvo constante en 0,1 M, mientras que la concentración de
ácido butírico se varió de 0,04 a 0,14 M, luego se mantuvo constante la
concentración de ácido butírico óptima obtenida, mientras que el 1-butanol
se varió de 0,04 a 0,14 M. 0,04 a 0,14 M.
3. Resultados
3.1. Purificación e identificación de una cutinasa de T. terrestris
Una cutinasa extracelular se purificó hasta la homogeneidad a partir del
sobrenadante del cultivo deT. terrestrisCAU709 con un pliegue de
purificación de 16 y un rendimiento de recuperación del 10% (tabla 1). La
actividad específica de la enzima se incrementó de 62 U mg-1a 983 Umg-1. La
cutinasa purificada era electroforéticamente homogénea según lo
observado por SDS-PAGE con una masa molecular de aprox. 27,3 kDa (Figura
1), mientras que la masa molecular nativa de la cutinasa resultó ser de
aproximadamente 27,9 kDa mediante filtración en gel, lo que indica que se
trata de una proteína monomérica.
TtcutB se digirió con tripsina y los fragmentos peptídicos se analizaron
mediante espectrometría de masas. Las secuencias de aminoácidos de cinco
fragmentos peptídicos principales fueron SGTETGNLGNGVYPEVADLGK
(Péptido 1), PQFSDTATDELDNATGLCPK (Péptido 2), GPAWLHEK
Figura 1.SDS-PAGE y análisis de zimograma de la cutinasa purificada deT. terrestris. Carril
M, estándares de proteínas de bajo peso molecular; carril 1, cutinasa purificada; carriles 2
y 3, análisis de zimograma de cutinasa en SDS-PAGE usando MUF-butirato ya- acetato de
naftilo, respectivamente.
(Péptido 3), VLFLRCK (Péptido 4) y VNDQDANWAVR (Péptido 5). Las
secuencias peptídicas se enviaron a NCBI BLAST para la búsqueda de
homología. Los péptidos 1 y 3 mostraron una identidad del 75 % y el 100 %,
respectivamente, con una cutinasa putativa deT. terrestrisNRRL 8126
(XP003656017.1), mientras que los péptidos 2, 4 y 5 no mostraron una
similitud de secuencia significativa con otras enzimas lipolíticas o estrolíticas
conocidas.
3.2. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad y estabilidad de la
cutinasa purificada
El TtcutB purificado mostró una actividad óptima a pH 4,0 (Figura 2
a). La actividad enzimática disminuyó menos del 40 % cuando el pH
aumentó a 9,0 o disminuyó a 3,0, lo que indica un amplio rango de pH
para una actividad enzimática relativamente alta (Figura 2b). La
cutinasa también mostró una excelente estabilidad al pH, ya que más
del 80 % de su actividad se mantuvo cuando se mantuvo a 50 °C
durante 30 min dentro del rango de pH de 2,5 a 10,5 (Figura 2b). La
enzima fue más activa a 55 -C (Figura 2c), y mostró una alta actividad a
temperaturas relativamente bajas, con un 55 % y un 31 % de su
actividad máxima a 20 °C y 0 °C, respectivamente (Figura 2d). La enzima
fue estable hasta 65 -C, conservando más del 90% de su actividad (
Figura 2d). Las semividas de desnaturalización térmica de la cutinasa
purificada a 50, 55, 60, 65, 70 y 80 °C fueron 867, 637, 369, 245, 51 y 49
min, respectivamente (Figura 2mi).
3.3. Especificidad de sustrato y parámetros cinéticos del TtcutB purificado

Actividades específicas de la cutinasa deT. terrestrisCAU709 hacia

tabla 1
Purificación de una cutinasa (TtcutB) deT. terrestris. diferentes sustratos se muestran enTabla 2. La enzima hidrolizó elpag
Derivados NP con cadenas acilo de C2a Cdieciséis, mostrando la mayor
Paso de purificación Total Total Específico Purificación
actividad conpagNPB (C4) como sustrato. Cuando el número de átomos
Producir

actividad proteína actividad factor (%)

(tú)a (mg) (U mg-1) (-doblar)
de carbono en los sustratos aumentó por encima de 4 o disminuyó por
debajo de 4, las actividades específicas disminuyeron drásticamente (
Extracto sin células 23,900 385 62 1 100
(NUEVA HAMPSHIRE4)2ENTONCES4 18,900 160 118 1.9 79 Tabla 2).
fraccionamiento La especificidad de sustrato de TtcutB hacia los triglicéridos sintéticos mostró
CM-Sepharose rápido 15,400 108 143 2.3 64 la misma tendencia y, por lo tanto, las actividades específicas disminuyeron
fluir notablemente a medida que el número de átomos de carbono en el sustrato
Q-sefarosa de flujo rápido 7660 9 851 14 32
aumentó por encima de 4 o disminuyó por debajo de 4 (Tabla 2); la actividad
Sephadex G-75 2460 2.5 983 dieciséis 10
específica más alta se observó con tributirina (C4) como sustrato (Tabla 2). Tenga
aLa actividad enzimática se determinó a 50ºC en tampón de citrato 50 mM, pH 4,0. en cuenta que la cutinasa también hidrolizó eficientemente la aceituna
442 H. Xu et al. / Química de los alimentos 188 (2015) 439–445

100 a 100 b

Actividad relativa (%)

Actividad relativa (%)

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH pH

100 C 100 d
Actividad relativa (%)

Actividad relativa (%)

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0

T T

5
mi
4
ln (Actividad residual (%))

0
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo de incubación (min)

Figura 2.pH óptimo (a), estabilidad del pH (b), temperatura óptima (c), termoestabilidad (d) y vidas medias de desnaturalización térmica (e) de TtcutB deT. terrestris.El efecto del pH sobre la actividad
enzimática se determinó a 50 -C utilizandopagNPB como sustrato en diferentes tampones (50 mM) con pH que oscilan entre 2,5 y 10,5. Para la estabilidad del pH, las actividades residuales se midieron a
50 °C en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 4,0) después de que la enzima se hubiera incubado a 50 °C durante 30 min. Los tampones utilizados fueron tampón (-) glicina-HCl (pH 2,5-3,5), (h)tampón
de citrato de sodio (pH 3,0–6,0), (d)Tampón MES (pH 5,5–6,5), (j)tampón de fosfato de sodio (pH 6,0–8,0), (s)Tampón Tris-HCl (pH 7,5-9,0) y (}) tampón glicina-NaOH (8,5-10,5). La temperatura óptima se
determinó midiendo la actividad enzimática a diferentes temperaturas (0-100 -C) en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 4,0). Para la determinación de la termoestabilidad, las actividades residuales
de la cutinasa se midieron después de que la enzima se hubiera incubado a diferentes temperaturas (0–100 °C) durante 30 min. Para la determinación de las vidas medias de desnaturalización térmica,
la cutinasa purificada se incubó a diferentes temperaturas (50–80 °C) en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 4,0) durante 5 h, se tomaron alícuotas en diferentes puntos de tiempo y las actividades
enzimáticas residuales se midieron. Las temperaturas determinadas fueron (-) 50 -C, (h)55 -C, (NORTE)60-C, (})65 -C y (4)70 -C. Los experimentos se realizaron tres veces y se indican los errores estándar.

aceite (Tabla 2). TtcutB hidrolizó eficientemente las cutinas con una tasa de Se optimizaron las concentraciones de los dos sustratos, cuando la
degradación de 4.7yomol/h/mg de proteína, lo que sugiere que debería ser concentración de 1-butanol se mantuvo constante en 0,1 M, se
una cutinasa. Valores de la constante de Michaelis-MentenkmetroyVmáximo determinó que la concentración óptima de ácido butírico para la
haciapagANP,pagNPB ypagNPC se presentan enTabla 3. producción de butirato de butilo era de 0,12 M, donde se obtuvo la
mayor eficiencia de esterificación del 82 % a 5 d (Fig. 3C). Luego,
3.4. Síntesis de butirato de butilo por la cutinasa purificada cuando el ácido butírico se mantuvo constante a 0.12 M, se determinó
el 1-butanol óptimo a 0.08 M, ya que se obtuvo la mayor eficiencia de
El efecto del solvente de reacción sobre la eficiencia de esterificación se esterificación (95%) (Fig. 3C). Por lo tanto, se encontró que la relación
presentó enFig. 3a, es claro que el n-heptano fue el medio de reacción molar óptima final de ácido butírico a 1-butanol era 3:2.
óptimo para la síntesis de butirato de butilo, ya que la mayor eficiencia de
esterificación del 70% se obtuvo a las 10 h (Fig. 3b). Por lo tanto, se eligió 4. Discusión
como disolvente de reacción en el experimento posterior. La temperatura de
reacción también mostró un efecto significativo en la síntesis de butirato de Las cutinasas han sido purificadas y caracterizadas a partir de varios
butilo. La eficiencia de esterificación aumentó con el aumento de la hongos (Fraga et al., 2012; Koschorreck et al., 2010; Kwon et al., 2009;
temperatura de reacción de 40 a 45 °C, un aumento adicional de la Roussel et al., 2014; Esperanza & Macedo, 2013; Wang et al., 2002),
temperatura a 60 °C dio como resultado una disminución gradual de la especialmente hongos fitopatógenos comoFusarium solani pisi,cuya
síntesis y la eficiencia de esterificación más alta del 71 % se obtuvo a 45 °C cutinasa ha sido extensamente estudiada con respecto a su estructura
después de 8 h de incubación. (Fig. 3b). y función. Sin embargo no hay reportes
 H. Xu et al. / Química de los alimentos 188 (2015) 439–445 443

Tabla 2 100
Especificidad de sustrato del TtcutB purificado deT. terrestris. a
Sustrato Actividad específica (U mg-1) Actividad relativa (%) 80
ésteres pNPa

Esterificación (%)
pagANP (C2) 140 ± 3,1 14.2
pagNPB (C4) 983 ± 4,2 100.0
60
pagPNJ (C6) 382 ± 4,2 38,9
pagNP caprilato (C8) 140 ± 3,2 14.2
40
pagNPH (C10) 89 ± 0,7 9.1
pagDNP (C12) 53 ± 0,4 5.4
pagMNP (C14) 27 ± 0,08 2.7 20
pagCN (Cdieciséis) 4,3 ± 0,01 0.4
triglicéridosb
0
Triacetina (C2) 132 ± 5,3 13.4
Tributirina (C4) 1.938 ± 44 197.2
2 4 6 8 10 12 14
Tricaproína (C6) 925 ± 21 94.1 Tiempo (h)

Tricaprilina (C8) 616 ± 11 62.7

Tricaprina (C10) 176 ± 8,9 17.9 100
Aceite de oliva 219 ± 9,5 22.3 b
aEnsayos conpagLos ésteres de NP se realizaron a 50ºC en tampón de citrato de sodio 50 mM 80
(pH 4,0) que contenía Triton X-100 al 0,1 % y goma arábiga al 0,1 %.
bLas actividades con aceite de oliva y triglicéridos sintéticos como sustratos se midieron en
60

Esterificación (%)
tampón de citrato de sodio 2,5 mM (pH 4,0) que contenía 0,1 % de sustrato y 0,1 % de goma
arábiga. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (norte =3).

40
Tabla 3
Parámetros cinéticos del TtcutB purificado deT. terrestris.a
20
Sustrato Vmáximo kmetro(mM) kgato kgato/Kmetro
(yomol min-1miligramos-1) (s-1) (mM-1s-1)
0
pagANP 1281,4 ± 2,2 8,3 ± 0,1 0.58 0.07 2 4 6 8 10 12 14
pagNPB 1857,9 ± 10,8 1,1 ± 0,05 0.85 0.77
Tiempo (h)
pagNBC 1339,6 ± 5,9 0,88 ± 0,03 0,61 0,68

aLa actividad enzimática se determinó a 50 °C en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 100

4.0). Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (norte =3). C
80
en cutinasa deThielaviaspp, excepto una cutinasa de bajo peso
molecular (TtcutA) reportada recientemente en nuestro laboratorio (
Esterificación (%)

Yang, Xu et al., 2013). Aquí, describimos la purificación y caracterización 60

de otra cutinasa ácida (designada como TtcutB) deT. terrestris CAU709.
La masa molecular de TtcutB (27,3 kDa) (Figura 1) en el presente
estudio estuvo de acuerdo con los informados para otras cutinasas
microbianas (rango de 25–30 kDa) (Castro-Ochoa et al., 2012; Fett,
Wijey, Moreau y Osman, 1999; Rubio et al., 2008), siendo ligeramente
superior a la de la cutinasa deM. fructicola (20,2 kDa) (Wang et al., 2002)
yT. terrestrisCAU709 (25,3 kDa) (Yang, Xu et al., 2013), y mucho más
bajo que el de la cutinasa deColletotrichum kahawae (40kDa) (Chen,
Franco, Baptista, Cabral y Coelho, 2007). Una búsqueda de homología
de secuencias peptídicas no reveló cutinasas homólogas deT. terrestris,
excepto por un gen putativo de cutinasa (XP003656017.1). Por lo tanto,
TtcutB en el presente estudio es una nueva enzima.
TtcutB mostró una actividad óptima a pH 4,0 y estabilidad en un
amplio rango de pH (2,5–10,5) (Figura 2). El pH óptimo es similar al de la
cutinasa (TtcutA) deT. terrestrisCAU709 (Yang, Xu et al., 2013), pero fue
más bajo que el de todas las cutinasas reportadas de otros microbios,
comoThermomonospora fusca (pH 11,0) (Fett et al., 1999),A.
brassicícola (pH 8,0) (Koschorreck et al., 2010), Thermobífida fusca (pH
8,0) (Chen et al., 2008),Aspergillus niger CBS 513,88 (pH 6,0) (Nyyssölä
et al., 2013) yS. conigenus (pH 4,1–5,2) (Nyyssölä et al., 2014). La
mayoría de las cutinasas informadas muestran estabilidad en
condiciones casi neutras o alcalinas (Fett et al., 1999; Koschorreck et al.,
2010; Kwon et al., 2009), mientras que la cutinasa en el presente
estudio exhibió una excelente estabilidad en todos los pH probados (pH
2.5–10.5). El rango de estabilidad del pH en el presente estudio es
mucho más amplio que el de otras dos cutinasas ácidas (Nyyssölä et al.,
2013, 2014). Esta estabilidad de amplio rango puede hacer que la
cutinasa sea útil para procesos industriales llevados a cabo en
ambientes tanto ácidos como alcalinos.
40
20
0
0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14
Ácido butírico/1-butanol (mM)
Fig. 3.Efecto del solvente de reacción orgánico (a), temperatura (b) y concentración de sustrato (c)
en la producción de butirato de butilo por TtcutB a partir deT. terrestris. En la figura a, los
disolventes utilizados fueron ciclohexano (}), n-hexano (h),n-heptano (4), isoheptano (j)y acetona (
NORTE).En la figura b, las temperaturas utilizadas fueron 40 -C (}), 45 -C (4),50 -C (j),55 -C (h)y 60 -C
(NORTE).En la figura c, (h)significa que la concentración de 1-butanol se mantuvo constante en 0,1
M, mientras que la concentración de ácido butírico se varió de 0,04 a 0,14 M, (j)significa que la
concentración de ácido butírico se mantuvo constante en 0,12 M, mientras que la concentración
de 1-butanol se varió de 0,04 a 0,14 M.
Las temperaturas óptimas de la mayoría de las cutinasas
microbianas oscilan entre 40 y 60 °C. La temperatura óptima de TtcutB
(55 -C, Figura 2c) es comparable a la de la enzima deT fuscasp. (Hegde y
Veeranki, 2013), pero superiores a las de las cutinasas de
A. brassicícola (40 -C) (Koschorreck et al., 2010),F. solani (40 -C) (Kwon et
al., 2009) yT. terrestrisCAU709 (50-C) (Yang, Xu et al., 2013), y un poco
más bajo que el de la cutinasa deT. fusca (60 -C) (Chen et al., 2008).
TtcutB en el presente estudio mostró termoestabilidad hasta 65 -C,
conservando más del 95% de su actividad después del tratamiento a 65
-C durante 0,5 h (Figura 2d). Las enzimas termoestables son necesarias
para muchas reacciones catalíticas industriales que deben llevarse a
cabo a altas temperaturas. Curiosamente, TtcutB mostró una actividad
relativamente alta a bajas
444 H. Xu et al. / Química de los alimentos 188 (2015) 439–445
temperaturas, conservando más del 31% de su actividad a 0 -C (Figura 2
d). Solo unas pocas enzimas microbianas adaptadas al frío han
mostrado actividad catalítica a temperaturas tan bajas.Sumby et al.,
2009; Yadav et al., 2011), lo que sugiere que la cutinasa deT. terrestris
podría tener valor como aditivo para la maduración del queso y el vino,
dado que estos productos suelen almacenarse a temperaturas
inferiores a 20 -C (Sumby et al., 2009).
TtcutB exhibió una amplia gama de especificidad de sustrato (Tabla 2).
No solo hidrolizó eficientementepagésteres NP, pero también triglicéridos y
aceite de oliva. La mayor actividad enzimática para variospagLos sustratos
NP se obtuvieron conpagNPB (C4), y los niveles de actividad disminuyeron
con el aumento de la longitud de la cadena de carbono en el sustrato (Tabla
2); esto es consistente con el comportamiento de las cutinasas deT.
harzianum (Rubio et al., 2008),A. brassicícola (Koschorreck et al., 2010) y una
biblioteca de ADN de compost de hojas y ramas (Sulaimán et al., 2012). La
enzima fue activa en varios triglicéridos con la misma variación cuandopag
Se utilizaron ésteres NP como sustrato (Tabla 2). Esta propiedad es similar a
la de la cutinasa deA. brassicícola (Koschorreck et al., 2010). TtcutB deT.
terrestrismostró una fuerte preferencia por sustratos con cadena de acilo de
longitud corta, que es una característica típica de las cutinasas (Chen et al.,
2010; Rubio et al., 2008). Aunque la especificidad de sustrato de TtcutB hacia
pagLos ésteres NP son similares a los de TtcutA deT. terrestrisCAU709 (Yang,
Xu et al., 2013), las actividades específicas de TtcutB para los triglicéridos son
aproximadamente 2-3 veces mayores que las de TtcutA (Tabla 2). Vale la
pena señalar que la cutinasa en el presente estudio podría hidrolizar el
aceite de oliva con una actividad específica de 219 U mg-1proteína (Tabla 2),
que es claramente diferente de otras cutinasas reportadas (Chen et al., 2010;
Rubio et al., 2008; Sulaimán et al., 2012). El parámetro cinético,kmetrovalores
de TtcutB parapagANP,pagNPB ypagNPC son todos un poco más altos que
los de TtcutA para los sustratos correspondientes (Tabla 3), aunque
comparten la misma tendencia de variación de afinidad hacia diferentes
sustratos con varias longitudes de cadena de carbono (Yang, Xu et al., 2013).
El butirato de butilo es importante para la industria de los alimentos y las
fragancias, ya que contribuye significativamente al aroma de la manzana, la
piña, el plátano, el albaricoque y la mantequilla (Chen et al., 2013; De Barros
et al., 2012; Torres, Baigorí, Swathy, Pandey y Castro, 2009). Las cutinasas
han mostrado propiedades únicas que pueden explotarse para la síntesis de
diferentes ésteres de sabor (De Barros et al., 2012). TtcutB en el presente
estudio exhibió una eficiencia de esterificación significativa para la síntesis
de butirato de butilo (Fig. 3). La temperatura de reacción óptima para
butirato de butilo por TtcutB es 45 -C (Fig. 3b), la temperatura más alta o
más baja condujo a una disminución de la eficiencia de esterificación. Los
resultados similares también se observaron a partir de las cutinasas de
Acinetobactersp. EH28 (Ahmed, Raghvendra y Madamwar, 2010) yCándida
rugosa (Raghavendra, Sayania y Madamwar, 2010). Las concentraciones
óptimas de sustrato (0,08 M para 1-butanol y 0,12 M para ácido butírico)
para la síntesis del éster fueron relativamente bajas, lo que está de acuerdo
con la cutinasa deF. solani pisi,que tiene una concentración óptima de
sustratos inferior a 0,2 M (Ahmed et al., 2010; De Barros et al., 2012). La
eficiencia de esterificación de la cutinasa alcanzó un alto de hasta el 95%,
que es comparable a los rendimientos de las enzimas deF. solani pisi (De
Barros et al., 2012), acinetobacteriasp. EH28 (Ahmed et al., 2010) yC rugosa (
Raghavendra et al., 2010). Sin embargo, cabe señalar que el tiempo (8 h)
para la síntesis de butirato de butilo en el presente estudio es mucho más
corto que los tiempos informados en otros artículos (8 días,Ahmed et al.,
2010; 8 dias,Raghavendra et al., 2010; 3 días,Dheeman, Henehan, & Frías,
2011).
5. Conclusiones
Una nueva cutinasa ácida y adaptada al frío (TtcutB) de
T. terrestres fue purificado y caracterizado. El pH óptimo y
temperatura de la enzima son pH 4,0 y 55 -C, respectivamente. La
enzima es estable en un amplio rango de valores de pH y
temperaturas, y también muestra una actividad relativamente alta a
bajas temperaturas. La enzima exhibe una amplia especificidad de
sustrato. Además, la enzima sintetizó butirato de butilo de éster de
sabor usando 1-butanol y ácido butírico con alta eficiencia de
esterificación. Estas excelentes propiedades hacen de esta enzima un
candidato atractivo para aplicaciones biotecnológicas.
Agradecimientos
Damos las gracias al Dr. Priti Katrolia para la lectura crítica del
manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencias
para Jóvenes Académicos Distinguidos (No. 31325021) y la Fundación
Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31371718).
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