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productos farmacéuticos

Artículo
Actividad antiinflamatoria del piquerol aislado de
Piqueria trinervia Cav.
Nimsi Campos-Xolalpa, Ana Laura Esquivel-Campos, Rubria Marlen Martínez-Casares , Salud Pérez-Gutiérrez, Julia
Pérez-Ramos * y Ernesto Sánchez-Mendoza *

Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, Calzada del Hueso 1100,
Ciudad de México 04960, México; nimsicaxo@hotmail.com (N.C.-X.);
aesquivel@correo.xoc.uam.mx (A.L.E.-C.); rmartinezc@correo.xoc.uam.mx (R.M.M.-C.);
msperez@correo.xoc.uam.mx (S.P.-G.)
* Correspondencia: jperez@correo.xoc.uam.mx (J.P.-R.); esanchez@correo.xoc.uam.mx (E.S.-M.)

Resumen: Antecedentes: La inflamación es un proceso complejo como respuesta a varios

Citación: Campos-Xolalpa, N.;
Esquivel-Campos, A.L.;
Martínez-Casares, R.M.;
Pérez-Gutiérrez, S.; Pérez-Ramos, J.;
Sánchez-Mendoza, E.
Actividad antiinflamatoria de
estímulos, como una infección, un irritante químico y el ataque de un cuerpo extraño. Se aisló el
piquerol de la Piqueria trinervia y se evaluó su actividad antiinflamatoria utilizando modelos in vivo e in
vitro. Métodos: El piquerol es un monoterpeno que se identificó mediante RMN, espectroscopia FT-IR y
análisis de espectrometría de masas. La actividad antiinflamatoria se probó in vivo en el edema de
oído inducido con TPA en ratones. El piquerol también se probó en macrófagos J774A.1
estimulados con lipopolisacárido (LPS), y los niveles de NO, NF-κB, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 se
determinaron mediante ELISA. Resultados: Los resultados muestran que el piquerol disminuyó el edema
auricular (66,19%). A 150,51 µM, también inhibió los niveles de NO (31,7%), TNF-α (49,8%), IL-
1β (69,9%), IL-6 (47,5%) y NF-κB (26,7%), y aumentó la producción de IL-10 (62,3%). El piquerol
tiene una propiedad de estabilización de la membrana en el eritrocito, y a 100 µg/mL, la
protección de la membrana fue del 86,17%. Conclusiones: El piquerol tiene actividad
antiinflamatoria, y su posible mecanismo de acción es a través de la inhibición de mediadores
proinflamatorios. Este compuesto podría ser un candidato en el desarrollo de nuevos fármacos para
tratar problemas inflamatorios.

Palabras clave: citoquinas; macrófagos; monoterpeno

Piquerol Aislado de Piqueria
trinervia Cav. Pharmaceuticals 2022, 15,
4.0/).
771. https://doi.org/10.3390/
ph15070771

Editor académico: Thomas Efferth

Recibido: 25 de mayo de 2022

Aceptada: 18 de junio de 2022
Publicado: 21 junio 2022

Nota del editor: MDPI se mantiene

neutral con respecto a las
reclamaciones jurisdiccionales en los
mapas publicados y las
a f i l i a c i o n e s institucionales.

Copyright: © 2022 por los autores.

Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza.
Este artículo es un artículo de acceso
abierto distribuido bajo los términos y
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Commons Attribution (CC BY)
(https://
creativecommons.org/licenses/by/
 macrófagos son células muy sensibles al proceso inflamatorio patológico y responsables de la
1. Introducción
síntesis y liberación de muchos mediadores; la activación de kappa nuclear (NF-κB) impulsa la
La inflamación es un expresión de quimiocinas y citocinas proinflamatorias [2], como el factor de necrosis
proceso complejo como tumoral (TNF-α), la interleucina-1β (IL-1β) y la IL-6 [3]. El NF-κB también
respuesta a varios interviene en otros procesos, como la apoptosis y la tumorigénesis [2].
estímulos, como una Los antiinflamatorios no esteroideos (AINES) se descubrieron hace más de 100 años
infección, un irritante y siguen encabezando la lista del tratamiento farmacológico de las enfermedades
químico y el ataque de un inflamatorias. Sin embargo, suelen asociarse a una elevada incidencia de efectos
cuerpo extraño [1]. adversos, sobre todo en el tracto gastrointestinal y el sistema cardiovascular [4]. Por ello,
Durante el proceso existe un interés creciente por identificar nuevos fármacos con mayor eficacia terapéutica
inflamatorio se liberan y menores efectos tóxicos. Dentro de la amplia gama de compuestos obtenidos de forma
mediadores exógenos y natural, los terpenos han ido ganando importancia, representando la gran mayoría de los
endógenos, cuyo componentes identificados en los aceites esenciales, con predominio de monoterpenos y
principal objetivo es la sesquiterpenos, y encontrándose en muchas plantas en la naturaleza [5]. Algunos de estos
reparación de los tejidos compuestos han demostrado tener actividad farmacológica, y los estudios han
y el restablecimiento de demostrado que diferentes monoterpenos, como el m-cimeno y el L-carveol,
la homeostasis. Los

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tienen actividad antiinflamatoria in vitro mediante la supresión de las vías de

señalización de NO y NF-κB [6,7].
Piqueria trinervia Cav., conocida como "hierba de San Nicolás", pertenece a la
familia Asteraceae y es una planta herbácea que crece en diferentes regiones de México
[8], utilizada en la medicina tradicional para aliviar el dolor, para tratar la malaria y como
antipirético. De P. trinervia se han aislado piquerol A, piquerol B, trinervinol y acetato
de carquejilo [9]. El piquerol se ha probado como agente molusquicida contra ocho
especies de caracoles pulmonados [10], se ha evaluado su efecto inhibidor sobre el crecimiento
de epimastigotes de Trypanosoma cruzi [11] y se ha demostrado que tiene efectos antimicrobianos
contra bacterias patógenas [12]. En 2017, Rufino-González et al. descubrieron que el
piquerol y el trinervinol tenían efectos antigiardia contra Giardia intestinalis [13]; sin
embargo, no hay informes sobre la actividad antiinflamatoria de P. trinervia. Por lo tanto,
en este estudio, aislamos piquerol de P. trinervia y evaluamos su actividad antiinflamatoria
en un modelo in vivo e in vitro en macrófagos estimulados con lipopolisacárido (LPS).

2. Resultados
2.1. Estructura del piquerol
Se aislaron cristales blancos del extracto diclorometano en la fracción 65:35 de una
mezcla hexano-acetato de etilo. El análisis espectroscópico y espectrométrico confirmó
que este compuesto era piquerol (Figura 1 y Figuras S1-S4, Materiales Suplementarios),
que es un monoterpeno previamente reportado por Romo et al. [9], y sus datos
cristalográficos fueron reportados por Soriano-García et al. [14]. En este estudio, los
datos espectroscópicos y espectrométricos son los siguientes: 1H RMN (600 MHz,
cloroformo-d) δ 6,03 (ddd, J = 9,7, 4,7, 2,0 Hz),
5,86 (dd, J = 9,7, 2,9 Hz), 5,45-5,41 (m), 5,36 (dt, J = 2,2, 1,1 Hz), 5,09 (t, J = 1,7 Hz), 5,03
(q, J = 1,8 Hz), 4,66-4,58 (m), 4,34 (ddd, J = 10,4, 4,7, 3,2 Hz), 3,33 (dd, J = 8,7, 2,9 Hz), 2,94
(s), 2,12 (d, J = 10,4 Hz), 1,79 (s); 13C RMN (151 MHz, cloroformo-d) δ 146,09, 142,70, 132,99,
131,98, 113,86, 110,28, 77,21, 70,34, 67,97, 52,27, 23,45; FT-IR, 3263,8 cm-1 (OH), 3177 cm-1
(=C-H), 2920, 2850,7, 2826,17 cm-1, y 1370 (C-H), 1661 y 1642 cm-1 (C=C), 1083 cm-1 (C-O);
[α]25D = +96,94 (MeOH); CG, tR = 9,9 min y 166,10 m/z.

Figura 1. Estructura química del piquerol. Estructura química del piquerol.

2.2. Actividad antiinflamatoria in vivo

La Tabla 1 muestra las diferencias en el peso de las orejas de cada grupo evaluado.
El grupo negativo es significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con los
grupos IND y piquerol, y también, entre los grupos IND y piquerol, no hay diferencia
significativa (p > 0,05). Por lo tanto, el piquerol a dosis de 2 mg/oreja disminuyó el
edema de oído inducido con TPA en ratones en un 66,19%, efecto similar al obtenido
con el grupo tratado con indometacina (IND), que inhibió el 61,44%.
Tabla 1. Actividad antiinflamatoria aguda: edema inducido por TPA.

Grupo Diferencia de peso (mg) % Disminución de la

inflamación
Negativo 11.45 ± 0.5 ** 0.0
IND (2 mg/año) 4.41 ± 0.5 * 61.44 ± 4.2
Piquerol (2 mg/año) 4.36 ± 0.6 * 66.19 ± 5.3
Los valores son la media ± E.S.M. (n = 8). * p < 0,05 diferencia estadísticamente significativa en comparación con
el grupo negativo y ** p < 0,05 diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo IND.
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2.3. Medición de Mediadores: Proinflamatorios y antiinflamatorios

La viabilidad celular del piquerol se evaluó en macrófagos J774A.1 a concentraciones de
37,62 a 1204 µM. La actividad citotóxica del piquerol mostró el IC50 = 1151,71 µM; por
tanto, en los siguientes experimentos se utilizó una concentración de 150,51 µM.
Los macrófagos J774A.1 se estimularon con LPS para aumentar la producción de
NF-κB, NO, IL-1β, IL-6 y TNF-α. Los macrófagos estimulados se trataron con piquerol
e IND a concentraciones de 150,51 µM y 47,8 µM, respectivamente, y se demostró que
la producción de NO disminuía en un 31,7% y un 28,0%, respectivamente. El efecto
inhibidor del piquerol
fue similar a la observada con IND (Figura 2a).

Figura 2. Actividad del piquerol y el IND a 150,51 µM y 47,8 µM, respectivamente, en macrófagos
J774A.1 estimulados con LPS sobre la producción de (a) NO; (b) IL-1β; (c) IL-6; (d) TNF-α;
(e) IL-10; y (f) NF-κB. El gráfico representa la media ± desviación estándar de tres experimentos
independientes (n = 6). ** p < 0,01 y * p < 0,05 diferencia estadísticamente significativa en
comparación (a-d,f) con LPS, y IL-10 (e) el grupo piquerol se comparó con el grupo IND.

El piquerol también disminuyó otros mediadores implicados en el proceso

inflamatorio, como las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α. El nivel de IL-1β disminuyó en
los grupos tratados con piquerol e IND en un 65,9% y un 47,3%, respectivamente
(Figura 2b), mientras que la producción de IL-6 también se redujo en un 47,5% y un
33,3%, respectivamente (Figura 2c). El piquerol mostró una disminución muy
significativa (p < 0,01) en comparación con el LPS, y la concentración de TNF-α también
disminuyó en un 50,2% y un 50,2%, respectivamente (Figura 2d); es decir, el efecto del piquerol
fue similar al obtenido con el IND, sin diferencia estadística.
La IL-10 es una citoquina antiinflamatoria que se produce para restablecer la
homeostasis. El piquerol aumentó la concentración de esta interleucina un 63,6% (Figura
2e).
NF-κB es un factor de transcripción inducible que puede activar la transcripción de varias
y, por tanto, regulan la inflamación. El NF-κB aumenta la producción de citocinas
inflamatorias, quimiocinas y moléculas de adhesión. El piquerol inhibió la producción de
NF-κB en los macrófagos J774A.1 estimulados con LPS en un 26,6% (Figura 2f), efecto similar
al observado con el IND (25,0%).

2.4. Propiedad de estabilización de la membrana

El piquerol en concentraciones de 25, 50, 100 y 200 µg/mL inhibió significativamente
la lisis de la membrana de eritrocitos humanos inducida por la solución hipotónica. A estas
concentraciones, el piquerol mostró un porcentaje de protección sobre la estabilización de la
membrana de los eritrocitos del 86,98%, 85,20%, 86,17% y 76,65%, respectivamente (Tabla
2), lo cual fue comparable a la inhibición de la lisis inducida por la solución hipotónica.
la obtenida con diclofenaco (87,93%, 84,19%, 84,97% y 77,84%, respectivamente). Estos
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Los resultados indican que el piquerol favorece la reducción de la inflamación, ya que

protege la membrana eritrocitaria de forma similar al diclofenaco.

Tabla 2. Porcentaje de estabilización de la membrana de los eritrocitos humanos por el piquerol.

µg/mL Diclofenaco Piquerol

200 77.84 ± 0.32 76.65 ± 1.21
100 84.97 ± 0.45 86.17 ± 0.47
50 84.19 ± 0.11 85.20 ± 1.22
25 87.93 ± 0.56 86.98 ± 0.14
Los valores son la media ± E.S.M. de tres experimentos independientes (n = 4).

3. Debate
Muchos monoterpenos tienen diferentes actividades biológicas, como citotóxica,
antiparasitaria, antimicrobiana y antiinflamatoria, entre otras [11,15-17]. En este estudio,
determinamos por primera vez que el piquerol, un monoterpeno aislado de P. trinervia,
tiene actividad antiinflamatoria.
En el edema auricular inducido por TPA en ratones, el TPA promueve la
inflamación mediante la activación de la proteína quinasa C, prostaglandinas y
fosfolipasa A2, NF-κB, IL-1β y TNF-α, entre otras [18,19]. La administración de
piquerol redujo significativamente la inflamación, y su actividad fue similar a la del
fármaco de referencia (IND).
Durante la inflamación, la membrana del lisosoma se rompe, liberando una
variedad de en- zimas, y la descarga del contenido lisosomal provoca una
inflamación aguda y la degradación del tejido conectivo [20]. Los AINE inhiben la
liberación de enzimas lisosomales o estabilizan las membranas lisosomales [21].
Además, los compuestos que tienen un efecto sobre la estabilización de la membrana
pueden inhibir la producción de fosfolipasas disminuyendo la liberación de diferentes
mediadores inflamatorios [22]. El piquerol inhibió la lisis inducida de las membranas
eritrocitarias, que se consideran similares a las membranas lisosomales. Estos resultados
sugieren que el efecto antiinflamatorio del piquerol podría estar asociado a la liberación
de fosfolipasas.
La inflamación de mediadores, como el NO, el TNF-α, la IL-1β y la IL-6, entre otros, es
activados debido a la presencia de daño tisular o infección; por tanto, las concentraciones
de estos mediadores aumentan en las zonas dañadas [6]. El LPS promueve un proceso
inflamatorio agudo en los macrófagos mediante la producción de estos mediadores
inflamatorios [23]. Ad- dicionalmente, Tong et al. demostraron que la inflamación
inducida por LPS en macrófagos promueve la fosforilación de JNK, ERK y p38 MAPK.
Además, está bien establecido que la activación de MAPK está implicada en la
producción de mediadores inflamatorios a través de macrófagos estimulados por LPS
[24].
La sobreproducción de NO induce la inflamación en condiciones anormales [25];
este compuesto promueve la liberación de citocinas, quimiocinas y moléculas de
adhesión endotelial-leucocitaria, induciendo la vasodilatación y la producción de
especies reactivas de nitrógeno, implicadas en el daño tisular [26].
La IL-1β es una interleucina que desempeña una función importante en condiciones
normales, tales como
como el sueño, la temperatura y la regulación de la alimentación; sin embargo, esta
citocina está implicada en las respuestas de defensa del huésped frente a diferentes
afecciones, como infecciones, artritis y osteoartritis [27], aumentando el daño tisular
[28]. La IL-1β también está implicada en la progresión del dolor [29].
La IL-6 emite una señal de alarma como resultado de un evento de daño, como una
lesión tisular o una infección [30], contribuyendo a la defensa del huésped mediante la
estimulación de respuestas de fase aguda; sin embargo, la IL-6 tiene un efecto patológico
de inflamación crónica [31].
El TNF-α es una citocina proinflamatoria que desempeña un papel importante en
las enfermedades innatas y
inmunidad adaptativa [32] y regula la liberación de otras citocinas proinflamatorias,
como la IL-6. Esta citocina desempeña un papel importante en la vasodilatación y la
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formación de edema [33]. Esta citocina desempeña un papel importante en la
vasodilatación y la formación de edema [33].
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La IL-10 es una interleucina con un potente efecto antiinflamatorio. Tiene un papel

importante en la prevención de patologías autoinmunes e inflamatorias, manteniendo así
la salud [34]. Por lo tanto, la producción de IL-10 ayuda a regular el proceso
inflamatorio, y esta citoquina promueve la disminución de los mediadores NF-κB, NO,
TNF-α, IL-1β e IL-6, reduciendo así la inflamación.
El NF-κB es un factor de transcripción implicado en la inducción de la expresión de
diferentes citocinas proinflamatorias y desempeña un papel importante en la activación y
diferenciación de las células T inflamatorias. Por lo tanto, la inhibición de NF-κB
contribuye al tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias [35].
En este estudio, descubrimos que el piquerol disminuía la liberación de NO, TNF-α, IL-1β,
IL-6 y NF-κB y promovía la producción de IL-10 en macrófagos estimulados con LPS en
la misma proporción que el fármaco de referencia. La reducción de estos mediadores y
promotores proinflamatorios sugiere que se está viendo afectada la vía MAPK.
En resumen, el piquerol reguló a la baja la producción de NF-κB y de las citocinas
proinflamatorias, IL-1β, TNF-α e IL-6, y aumentó significativamente la liberación de la citocina
antiinflamatoria IL-10. Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que el efecto
antiinflamatorio del piquerol debe deberse a la inhibición de la proteína NF-κB, que promueve la
producción de mediadores proinflamatorios y de proteína quinasa C.
La inhibición de NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 y NF-κB y el aumento de IL-10 son los
objetivos para el tratamiento de la inflamación. La demostrada actividad antiinflamatoria
del piquerol apoya el uso de este compuesto como alternativa para la resolución de la
inflamación asociada a diferentes enfermedades crónicas degenerativas, sobre todo
teniendo en cuenta el hecho de que el piquerol muestra una baja toxicidad en los
macrófagos J774A.1.

4. Materiales y métodos
4.1. Material
Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS),
antibióticos, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT), indometacina
(IND), dimetilsulfóxido (DMSO), polivinilpirrolidona (PVP), reactivo de Griess, 12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) y lipopolisacárido (LPS) se adquirieron a Sigma
Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Los macrófagos murinos J774A.1 se adquirieron a ATCC
(Manassas, VA, EE.UU.). Los kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) procedían de
TONBO bioscience.

4.2. Material vegetal

Las partes aéreas de Piqueria trinervia Cav. fueron colectadas en agosto de 2019 en la
carretera 70 SLP-Rio Verde (22.0942829; -100.7173475). La planta fue identificada por M.
en C. Gabriel Flores Franco de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM), y
se depositó un ejemplar voucher (HUMO37542) en el herbario HUMO de la UAEM.

4.3. Extracción y aislamiento del piquerol

Las partes aéreas de P. trinervia se secaron a la sombra y se molieron. El extracto se
preparó por maceración con 300 g de material vegetal y 2 L de diclorometano (CH Cl22 )
durante 8 días. La mezcla se filtró, el CH Cl22 se eliminó a presión reducida y el extracto
se separó mediante cromatografía en columna abierta empaquetada con gel de sílice
(Macherey-Nagel 60, 70-230 malla ASTM). La fase móvil fue una mezcla de hexano y
acetato de etilo, y se aumentó la polaridad. Se obtuvo un compuesto cristalino blanco
(rendimiento 0,014%) con una p.m . de 138-139 ◦C en la fracción 65:35 (hexano-acetato de
etilo). La pureza del compuesto se determinó mediante cromatografía en capa fina y la
estructura se dilucidó mediante RMN, IR y espectrometría de masas.

4.4. Análisis estructural

Los espectros infrarrojos se obtuvieron utilizando un espectrómetro Spectrum
Two FT-IR (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) con reflexión total atenuada (ATR);
las muestras se
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analizados formando una película con cloroformo. Los espectros de RMN se registraron
en una solución de CDCl3 a 299 K en un espectrómetro Agilent DD2 600 . Los
desplazamientos químicos de 1H y 13C RMN se comunicaron en relación con TMS y
CDCl3 , respectivamente. Los datos espectrales GC-MS se digitalizaron utilizando el
programa Mass Spectrum Digitizer del National Institute of Standards and Technology
(NIST). La rotación óptica del compuesto se determinó utilizando un polarímetro Perkin
Elmer 341 en metanol (MeOH).

4.5. Animales
Los ratones machos CD1 (20-25 g) procedían del animalario de la Universidad
Autónoma Metropolitana- Xochimilco. El protocolo experimental (No. 140) fue
aprobado por el Comité de Bioética en Investigación de la Universidad Autónoma
Metropolitana-Xochimilco. Los ratones se mantuvieron con libre acceso a alimento y
agua y se alojaron a 24 ◦C ± 1 ◦C con ciclos de luz/oscuridad de 12 h.

4.6. Actividad antiinflamatoria aguda: Edema inducido por TPA

Groups of eight CD1 mice were topically administered with a solution of TPA
(2.5 µg/mouse) in acetone (20 µL) on the external and internal surface of the right ear
of each animal, and acetone (vehicle) was administered to the internal surface and outer
left ear. After 30 min, 2 mg/ear of IND (reference drug group), 2 mg/ear of piquerol (test
group), or 20 µL/vehicle (negative control group) was administered to the right ears of
the mice, while vehicle was applied to the left ear. After 6 h, the animals were sacrificed,
and 6 mm portions of the central sections of both ears were obtained. The portions were
weighed to obtain the percentage of edema inhibition using the following equation 2 [36]:

(Wt - Wnt) control - (Wt - Wnt) tratado

%Inhibición = × 100 (1)
(Wt - Wnt) control

Wt: peso de la oreja tratada, Wnt: peso de la oreja no tratada.

4.7. Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad de los macrófagos tratados con piquerol se determinó del siguiente
modo: Se sembraron 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos; se aplicó piquerol
a concentraciones de 37,6 a 1204 µM durante 24 h; a continuación, se colocaron 10 µL
de solución de MTT (5 mg/mL) en cada pocillo; 4 h después, se eliminó el medio y se
disolvieron los cristales de formazán con DMSO. La absorbancia se determinó a 540 nm
[37]. El IC50 se calculó mediante regresión lineal.

4.8. Determinación de los niveles de óxido nítrico (NO), citoquinas y NF-κB

Inicialmente, se sembraron 5 × 105 macrófagos J774A.1 por pocillo en placas de 6
pocillos, y las células se estimularon con LPS (5 µg/mL). Después de 2 h, los
macrófagos se trataron con
150,51 µM de piquerol, fármaco de referencia IND (47,8 µM), o vehículo. Tras 24 h, se
obtuvieron los sobrenadantes para la cuantificación de IL-1β, IL-6, IL-10 y TNF-α, así como
NF-κB
(en el citoplasma), mediante ELISA comercial, siguiendo las instrucciones del
fabricante. La absorbancia se determinó a 405 nm.
Para la cuantificación de la producción de NO, 100 µL de sobrenadante y 100 µL de
Griess
en una placa de 96 pocillos, se incubó la placa a 37 ◦C durante 30 minutos y se determinó
la absorbancia a 540 nm [38]. Se consideró una producción de óxido nítrico del 100%
para el grupo LPS.

4.9. Metodología de la propiedad de estabilización de la membrana

Se recogieron muestras de sangre en condiciones asépticas de voluntarios humanos
sanos que no consumieron AINE, esteroides ni anticonceptivos orales durante dos
semanas. Las muestras de sangre se lavaron con un volumen igual de solución Alsever
(dextrosa al 2%, citrato sódico al 0,8%, ácido cítrico al 0,05% y cloruro sódico al 0,42% en
agua), se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos y las células empaquetadas se
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lavaron tres veces con solución Alsever.
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Se mezcló una suspensión de eritrocitos al 5% con diferentes concentraciones (25-

200 µg/mL) de piquerol o diclofenaco preparadas en tampón PBS. Como controles
negativos se utilizaron agua destilada y tampón PBS. Todas las muestras se incubaron a
37 ◦C durante 30 min y se centrifugaron a 3500 rpm durante 5 min [39]. La densidad
óptica se leyó a 450 nm. El
%Protection was calculated with Equation (2):

densidad óptica de la muestra de ensayo

%Protección = 100 - × 100 (2)
control
Densidad óptica del

4.10. Análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± DE. Los análisis estadísticos se realizaron con
una prueba ANOVA y la prueba post hoc de Tukey, utilizando el programa estadístico iner-
STAT20-a v1.3. Los valores de * p < 0,05 y ** p < 0,01 se consideraron estadísticamente
significativos.

5. Conclusiones
Las plantas son una fuente importante de compuestos con diferentes actividades
biológicas. El piquerol, aislado de la Piqueria trinervia Cav., mostró actividad
antiinflamatoria in vitro y en modelos in vivo, su posible mecanismo de acción es a
través de la inhibición del NO, y de los niveles de citoquinas proinflamatorias (IL-1β e
IL-6), así como el aumento de los niveles de la citoquina antiinflamatoria IL-10. Este
monoterpeno redujo la inflamación aguda inducida por TPA en el oído del ratón, también
es un agente protector contra la lisis de membrana. Los resultados sugieren que el
piquerol podría utilizarse en el tratamiento de afecciones inflamatorias.

Materiales complementarios: La siguiente información complementaria puede descargarse en:

https:
//www.mdpi.com/article/10.3390/ph15070771/s1, Figura S1: espectro FT-IR; Figura S2: cromatograma
GC/MS (a) y espectro MS (b); Figura S3: espectro 1H-NMR; Figura S4: espectro 13C-NMR.
Contribuciones de los autores: Conceptualización, S.P.-G., E.S.-M. y J.P.-R.; metodología, E.S.-M.,
N.C.-X., A.L.E.-C. y R.M.M.-C.; análisis formal, J.P.-R., S.P.-G., E.S.-M., N.C.-X. y A.L.E.-C.;
investigación, E.S.-M., S.P.-G. y J.P.-R.; redacción-revisión, J.P.-R.G. y J.P.-R.; redacción-proyecto
original, N.C.-X. y S.P.-G.; redacción-revisión, J.P.-R., S.P.-G., E.S.-M., N.C.-X., R.M.M.-C. y A.L.E.-C.;
supervisión, J.P.-R., S.P.-G., E.S.-M.,
N.C.-X., R.M.M.-C. y A.L.E.-C. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del
manuscrito.
Financiación: Esta investigación no ha recibido financiación externa.
Declaración del Comité de Revisión Institucional: El protocolo del estudio con animales fue
aprobado por el comité de ética de la Unidad de Producción y Experimentación de Animales de
Laboratorio (UPEAL) de la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (código de protocolo
140).
Declaración de consentimiento informado: No procede.
Declaración de disponibilidad de datos: Los datos figuran en el artículo y en los materiales
suplementarios.
Conflictos de i n t e r e s e s : Los autores declaran no tener ningún conflicto de i n t e r e s e s .

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