ESTUIDOPLASTIDIOS

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
ESTUDIO DE LOS PLASTÍDIOS EN CÉLULAS

in vitro DE Tagetes erecta L., MEDIANTE
MICROSCOPÍA ÓPTICA, ELECTRÓNICA Y
TRATAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES
TESIS
Que para obtener el grado de Maestría en
Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
P R E S E N T A:
BIÓL. LINO SÁNCHEZ SEGURA
DIRECTOR DE TESIS: DR. ANTONIO RUPERTO JIMÉNEZ APARICIO

DIRECTORA DE TESIS: DRA. OLGA MARGARITA ECHEVERRÍA MARTÍNEZ
YAUTEPEC, MORELOS. DICIEMBRE, 2008.

El presente trabajo de tesis “ESTUDIO DE LOS PLASTÍDIOS EN CÉLULAS in vitro
DE Tagetes erecta L., MEDIANTE MICROSCOPÍA ÓPTICA, ELECTRÓNICA Y
TRATAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES” se realizó Laboratorio de Cultivo de
Células y Tejidos Vegetales del Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo
de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, bajo la tutoría del Dr. Antonio
Ruperto Jiménez Aparicio. Este trabajo es parte del Proyecto SIP20080336 y
CONACYT 61034 “Estudio cinético-fractal del efecto de la luz sobre la expresión de
genes carotenogénicos y la acumulación de carotenoides en cempaxuchil (Tagetes erecta
L.)”.
La enseñanza del procesamiento de muestras, corte y observación en microscopio

electrónico de transmisión se realizó en el Laboratorio de Microscopía Electrónica del
Departamento de Biología Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
Autónoma de México, bajo la tutoría de la Dra. Olga Margarita Echeverría Martínez.
Las observaciones en el Microscopio Confocal de Barrido Láser se realizaron en el

Departamento de Embriología de la Facultad de Medicina de la U.N.A.M. a cargo de la
Dra. Carmen Méndez Herrera; los análisis cromatográficos se realizaron en el
Departamentote Graduados en Alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
del IPN, bajo la asesoría de la Dra. María Eugenia Jaramillo Flores.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Antonio R. Jiménez Aparicio por dedicarme su tiempo, conocimientos,

experiencia, así como de trasmitirme su entusiasmo por la ciencia y el espíritu innovador,
pero sobre todo lo más valioso para mí, su amistad. A la Dra. Martha Lucia Arenas
Ocampo, por inculcarme las ganas de estudiar, aprender y seguir siendo un mejor
compañero y amigo.
A la Dra. Olga M. Echeverría Martínez por darme la oportunidad de ser su alumno y

recibir su experiencia en la biología celular y microscopía electrónica, además de
brindarme su apoyo, orientación y dirección a lo largo de este trabajo.
Al resto de los miembros del comité revisor integrado por la Dra. Alma Angélica del
Villar Martínez, Dra. Kalina Bermúdez Torres y al Dr. José Jorge Chanona Pérez, por
sus valiosos comentarios, sugerencias y por contribuir a mi formación académica en el
programa de maestría.
Al Dr. Gerardo Hebert Vázquez Nin, por darme el honor de ser su alumno y compartirme
un poco de lo tanto que sabe e inculcarme los valores de los Microscopistas Clásicos.
A la Dra. Carmen Méndez Herrera, por apoyarme en la realización de este trabajo de

tesis y por darme la oportunidad de conocer la calidez de su amistad.
A la Dra. María Eugenia Jaramillo Flores por su apoyo en la realización de análisis

cromatografico y sus valiosas sugerencias.
A la M. en C. Silvia Juárez Chavero, por enseñarme las técnicas de procesamiento y corte

para microscopía electrónica.
A la M. en C. Guadalupe Salcedo Morales, por su valioso aporte en el mantenimiento del

cultivo de células in vitro.
A la M. en C. María Luisa Escobar Sánchez por su apoyo en la realización de este
proyecto de investigación, enseñanzas y valiosa amistad.
A la M.V.Z. Silvia Reyes Maya y Q.F.B. Carmen Mondragón Huerta por su

contribución en la realización de este proyecto de investigación y por su valiosa amistad.
A la M. en C. Denisse Ubaldo Suárez por su apoyo y orientación en la búsqueda de

material bibliográfico, pero sobre todo por su comprensión y afecto.
A mi compañero y amigo Dr. Roberto Campos Mendiola, por brindarme su amistad y

compartir la experiencia de comenzar una nueva etapa en el Laboratorio de Microscopía del
CeProBi.
A mi amigo, Biól. Julio Cesar González Laurrabaquio, porque aun seguimos pateando
juntos en este difícil juego.
“LO QUE SE NECESITA ES EXACTITUD Y CLARIDAD; DESPUÉS SI SE
PUEDE ELEGANCIA, PERO LO PRIMERO ES EXACTITUD”
(PIO BAROJA) 1872-1976.
“CONFORME EL TIEMPO PASA, TE VAS FABRICANDO UN ENTRAMADO DE

ASIDEROS IDEOLÓGICOS QUE TE PERMITEN DESPERTAR PENSANDO QUE
ESTÁS DEL LADO DE LA REJA QUE SEPARA AL PODER DEL ABUSO Y LA
GRAN MALDAD, DEL TERRITORIO DE LOS PARIAS DE LA TIERRA, Y TE
PERMITE ACOSTARTE CON LA BUENA CONCIENCIA DE QUE HAS
RESISTIDO AL SISTEMA UN DÍA MÁS. UNA DE LAS LIANAS DE ESA TRAMA
ESTÁ FORMADA POR LA TERQUEDAD; ESA IRRACIONAL VIRTUD QUE
POSEEN LOS ADOLESCENTES Y QUE IMPIDE QUE LA LÓGICA DE LOS
ADULTOS, QUE LA LÓGICA DEL PODER, LOS ENGAÑEN; QUE EL ENEMIGO
EN NOMBRE DE –LO RACIONAL Y LO POSIBLE, LO SENSATO Y LO
ADECUADO– LES OCUPE SU ESPACIO VITAL HASTA EXPULSARLOS”
PACO IGNACIÓ TAIBO II

ARCANGELES
Índice
ÍNDICE
ÍNDICE i
LISTA DE FIGURAS v
LISTA DE CUADROS vii
LISTA DE ABREVIATURAS viii
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN 3
2. MARCO TEÓRICO 5
2.1. Plastídios. 5
2.2. El estímulo lumínico excita los pigmentos plastídicos 6
2.3. Fluorescencia y autofluorescencia de pigmentos plastídicos 8
2.4. Pigmentos fotosintéticos y accesorios 9
2.5. Pigmentos carotenoides 10
2.6. Biosíntesis de carotenoides 12
2.7. Cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) 15
2.8. Aspectos generales de Tagetes erecta L. 16
2.9. Cultivo in vitro de células de Tagetes erecta L. 16
2.10. Origen, tipo y función de los plastídios 17
2.11. Cromoplastos 19
2.12. Características morfológicas del cromoplasto durante la diferenciación 20
2.13. Características del cromoplasto en lígulas y células cultivadas in vitro de T.

21
erecta L.
i
Índice
2.14. Morfología y estructura interna de callos in vitro. 22
2.15. Aplicación del tratamiento digital de imágenes (TDI) en el estudio de la

24
morfología y morfometría celular vegetal
3. JUSTIFICACIÓN 26
4. OBJETIVOS 27
4.1. Objetivo General 27
4.2. Objetivos Particulares 27
5. MATERIALES Y MÉTODOS 28
5.1. Materiales 28
5.1.1. Material biológico 28
5.1.2. Medio de cultivo 28
5.2. Equipo 28
5.2.1. Equipo de laboratorio para cultivo de células 28
5.2.2. Equipo para microscopía óptica, confocal y electrónica de

28
transmisión
5.2.3. Equipo para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 29
5.2.4. Equipo y software para tratamiento digital de imágenes 29
5.3. Metodología 29
5.3.1. Siembra y mantenimiento de cultivos de T. erecta L., fenotipo

29
amarillo
5.3.2. Procesamiento de células de T. erecta L. para microscopía

31
óptica y electrónica de transmisión (MET)
a. Fijación 31
b. Contraste y post-fijación 31
c. Deshidratación 32
ii
Índice
d. Pre-inclusión 32
e. Inclusión y polimerización 32
f. Cortes semifinos (microscopia óptica) 32
g. Cortes ultrafinos (MET) 33
h. Post-contraste 33
i. Observación y captura de imágenes (MET) 33
5.3.3. Observación de autofluorescencia plastídica en MCBL 33
a. Inmovilización de células 33
b. Observación y captura de imágenes 34
5.3.4. Tratamiento digital de imágenes y medición de los descriptores

34
morfométricos
5.3.5. Detección de carotenoides en callos de T. erecta L. mediante

36
cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
a. Extracción de pigmentos 36
b. Obtención de perfiles de luteína de T. erecta L. por HPLC 36
6. RESULTADOS 38
6.1. Composición de los callos de Tagetes erecta L. 38
6.2. Descripción morfológica de la transformación plastídica de Tagetes erecta L.

43
durante los diferentes tiempos de resiembra
6.3. Cortes y autofluorescencia mediante MCBL de células de Tagetes erecta L.

49
cultivadas in vitro
6.4. Morfometría de los plastídios de Tagetes erecta L. mediante TDI 60
6.5. Identificación de los pigmentos presentes en oleorresinas de callos de Tagetes

65
erecta L.
iii
Índice
7. DISCUSIÓN 69
8. CONCLUSIONES 77
9. BIBLIOGRAFÍA 79
iv
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura Título
Pag.
1 Esquema del ciclo de desarrollo del plastídio y diferenciación a varios tipos de
plastídios.
5
2 Espectro de radiación electromagnética y energía de los fotones en la gama

visible del espectro.
7
3 Pigmentos encontrados en el sistema membranal plastídicos y espectro de

absorción de luz.
10
4 Esquema de la posición de los carbonos de una molécula de carotenoides y

estructura de la luteína, zeaxantina, licopeno, β-caroteno y α-caroteno.
11
5 Ruta de biosíntesis de los precursores de carotenoides e isoprenoides vinculados

al plastídios.
12
6 Continuación de la ruta de biosíntesis de los carotenoides y xantofilas. 14

7 Diagrama de flujo de la estrategia experimental. 30
8 Micrografía óptica de un agregado celular de Tagetes erecta L. a ocho horas
después de la siembra
38
9 Micrografías ópticas de un agregado celular de Tagetes erecta L. a siete días

después de la siembra.
39
10 Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. a catorce días

después de la siembra.
40
11 Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. a veintiún días

después de la siembra
41
12 Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. de veintiocho

días después de la siembra.
42
13 Cromoplasto maduro en célula de Tagetes erecta L. a ocho horas después de la

siembra in vitro.
44
14 Cloroplastos juveniles de células de Tagetes erecta L. a siete días después de la

siembra in vitro.
45
15 Cloroplastos maduros en células de Tagetes erecta L. a catorce días después de

la siembra in vitro
46
16 Amiloplastos de células de Tagetes erecta L. a veintiún días después de la

siembra in vitro.
48
v
Lista de figuras
17 Cromoplastos juveniles de forma ameboide en células de Tagetes erecta L. a

veintiocho días después de la siembra in vitro.
49
18 Micrografías de fluorescencia de células de Tagetes erecta L. a ocho horas de la

siembra. Empalme de imágenes de contraste de fases y fluorescencia verde- roja.
50
19 Micrografías de cortes mediante MCBL de una célula de Tagetes erecta L. a ocho

horas de la siembra. Empalme de imágenes de contraste de fases y fluorescencia 52
verde.
20 Micrografías de cortes mediante MCBL de una célula de Tagetes erecta L. a siete
días de resiembra. Empalme de imágenes de contraste de fases y fluorescencia 53
verde - roja.
21 Micrografías de células de Tagetes erecta L. a catorce días de resiembra. Empalme
de imágenes de contraste de fases y fluorescencia verde - roja.
55
22 Micrografías de células de Tagetes erecta L. a veintiún días de resiembra. Empalme

de imágenes contraste de fases. No se observa fluorescencia verde y roja.
57
23 Micrografías de cortes mediante MCBL de una célula de Tagetes erecta L. a

veintiocho días de resiembra. Empalme de imágenes de contraste de fases y 59
fluorescencia verde.
24 Cambios en el perímetro () y área () de los plastídios de Tagetes erecta L. a
diferentes días de recrecimiento
61
25 Perfiles cromatográficos del HPLC obtenidos de las oleorresinas de callos de

Tagetes erecta L.
66
26 Propuesta de modelo descriptivo para la diferenciación plastídica en células de

Tagetes erecta L. cultivadas in vitro durante 28 días
70
vi
Lista de tablas
LISTA DE TABLAS
Tabla Título
Pag.
1 Resultados del cálculo de los descriptores morfométricos (adimensionales) y del
Dfer de los plastídios de células de T. erecta L. cultivadas in vitro.
64
2 Resultados del análisis HPLC de oleorresinas de callos de Tagetes. erecta L.

crecidas a diferentes tiempos.
67
vii
Lista de abreviaturas
LISTA DE ABREVIATURAS
A Área
ABA Ácido Absicico
2,4-D Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético
ADI Análisis Digital de Imágenes
AIA Ácido Indolacético
ANA Ácido Naftalénacético
ATP Trifosfato de Adenosina
BA Benciladenina
CCTV Cultivo de Células y Tejidos Vegetales
CDP-ME 4-Difosfocytidil-Metilerytritol
CDP-MEP 4-difosfocytidil-metilerytritol 2-fosfato
CnV Células no Viables
CV Células Viables
DIC Contraste Interferencial Diferencial
DMAPP Dimetilalil Pirofosfato
DXP 1-Desoxi-Xilulosa-5-Fosfato
DXR DXP-reductoisomerasa
DXS Deoxixilulosa 5-Fosfato Sintasa
FFE Factor de Forma Elíptica
FPP Farnesil Pirofosfato
GAP Gliceraldehído-3-Fosfato
GGPP Geranilgeranil Pirofosfato
GPF Proteína Verde Fluorescente
GPP Genaril Pirofosfato
HDR HMBPP Reductasa
HMBPP Hidroximethylbutenyl 4-Difosfato
HPLC Cromatografía Liquida de Alta Resolución
IPP Isopentenil Difosfato
KJ Kilo Joules
viii
Lista de abreviaturas
LCH Complejos Colectores de Luz

MCBL Microscopía Confocal de Barrido Láser
MEP Vía de la Metil Erytritol 4-Fosfato
ME-cPP Metilerytritol 2,4- Ciclodifosfato
MET Microscopio Electrónico de Transmisión
MS Medio de cultivo-Murashing y Skoog
mV Mili Volts
NADPH Nicotiamida-Adenina Dinucleótido Fosfato
nm Nanometros
OsO4 Tetraóxido de Osmio
P Perímetro
Pb Plomo
PBS Buffer de Fosfatos
PDS Fitoeno Desaturasa
PSY Fitoeno Sintasa
RFA Radiación Fotosintéticamente Activa
rpm Revoluciones Por Minuto
TDI Tratamiento Digital de Imágenes
.tiff Tagged Image File Format
TRIS-HCL Hidroximetil Aminoetanol Hidroclorido
μm Micras
Ur Uranilo
UV Ultravioleta
ZDS ζ-Caroteno Desaturasa
ix
Resumen
RESUMEN
El cromoplasto es el organelo donde se lleva a cabo la biosíntesis y acumulación de los

carotenoides, estos pigmentos son los responsables del color característico de las lígulas de
Tagetes erecta L. La diferenciación del cromoplasto es un proceso que involucra complejas
transformaciones metabólicas y morfológicas dadas bajo ciertos factores ambientales. Esta
serie de transformaciones plastídicas no han sido observadas y descritas en cultivos in vitro
de células productoras de carotenoides de T. erecta. Este trabajo tiene como objetivo
estudiar la transformación de los plastídios en células in vitro de T. erecta L. y su relación
con la presencia de carotenoides, utilizando microscopía óptica, electrónica y tratamiento
digital de imágenes. Para las observaciones en microscopia se obtuvieron muestras de
callos de T. erecta de 8 hrs, 7, 14, 21 y 28 días de crecimiento. Los cortes semifinos fueron
teñidos con azul de toluidina para microscopía óptica; mientras que cortes ultrafinos fueron
contrastados con Ur/Pb para microscopia electrónica de transmisión. También, muestras de
células fueron disgregadas en gliceraldehído al 50% para ser observadas en microscopia
confocal de barrido láser. Para identificar el principal carotenoide producido por las células
de T. erecta, las oleorresinas fueron extraídas con una mezcla de acetona/éter. La
identificación se realizó en un sistema de HPLC usando condiciones isocráticas. La
morfometría se evaluó mediante el procesamiento digital de imágenes de las micrografías
electrónicas de los plastídios celulares a los diferentes tiempos de crecimiento. Los
principales resultados mostraron que los callos sufrieron cambios estructurales durante los
veintiocho días de recrecimiento in vitro. Los callos de 8 hrs estaban formados por células
no viables y viables, en las que se observaron cromoplastos; la luteína fue el principal
carotenoide detectado en esta etapa. A los 7 días, se observaron numerosas células no
viables; las pocas células viables presentaban principalmente cloroplastos. Este
comportamiento cambió a los 28 días de cultivo. En esta etapa se observó una
revascularización celular de los callos. Las células presentaban cromoplastos y la
concentración de luteína incrementó como resultado de esta característica. La
autofluorescencia mostró la presencia de carotenoides y clorofila como pigmentos
fotoexitables. Los descriptores morfométricos permitieron describir los plastídios
dependiendo de la rugosidad del perímetro, la extensión del área y del factor de forma.
1
Abstract
ABSTRACT
The chromoplast is an organelle where the biosynthesis and accumulation of carotenoids

are carried out; these pigments are responsible for the characteristic color of Tagetes erecta
L. ligules. Chromoplast differentiation is a process that involves complex metabolic and
morphological transformations given under certain environmental factors. This kind of
plastids transformations has not been observed and described in the culture of T. erecta L.
for producing carotenoids. Then, the aim of this work is to study the transformation of
plastids of T. erecta in vitro cells and its relation with the presence of carotenoids in cells,
using optical, electron microscopy and digital treatment for images. Specimens to
microscopy observations were obtained from Tagetes erecta L. calluses at 8 hours, 7, 14,
21 and 28 days of growth. The thin sections were stained with blue toluidine and observed
in optical microscopy; while the ultra-thin sections were contrasted with Ur / Pb and
observed in transmission electronic microscopy. Also, samples of cells were disaggregated
in glyceraldehyde to 50% and observed in a confocal-laser scanning microscopy. To
identify mainly carotenoid produced by T. erecta cell culture, oleoresin was extracted with
acetone/ether mixture. The identification was carried out in HPLC system using isocratic
conditions. Morphometry was evaluated through digital image processing of the electronic
micrographics of the cells plastids at the different times of growth. The main results
showed that the calluses suffered structural changes during the twenty-eight days of in vitro
re-growth. The calluses of 8 hrs were formed by viable and non-viable cells and the main
plastid found was the chromoplast; lutein was the main pigment detected at this stage. At 7
days, a numerous non-viable cells were observed; the few viable cells presented
chloroplasts as a main plastid. The lutein concentration decreased and cholorphyll was
detected. This behavior changed with the cells of 28 days of growth. At this stage, a cellular
revascularization of callus was observed. The cells presented chromoplasts and the lutein
concentration increased as a result of this characteristic. The autofluorescence showed the
presence of carotenoid (green) and chlorophyll (red) like photoexcitable pigments. The
morphometric descriptors allowed describing the plastids depending on the roughness of
the perimeter, the area extension and its shape factor.
2
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
Los plastídios son organelos vegetales que se caracterizan por adoptar una diversidad de
formas debido al estímulo ambiental. Son los responsables de la fotosíntesis, la
compartamentalización de rutas de biosíntesis y almacenamiento de metabolitos
secundarios. Estos procesos se encuentran asociados al fenómeno de diferenciación y
plasticidad, por lo que hasta cierto punto todos los plastídios son interconvertibles, es decir
cualquier plastídio puede transformarse a otro de mayor o menor complejidad morfo-
estructural y metabólica.
Los carotenoides y la clorofila son pigmentos plastídicos que están ordenados en conjuntos
o dispositivos funcionales denominados fotosistemas, los que pueden absorber luz de todo
el espectro visible pero más eficientemente de 400 a 500 en el caso de los carotenoides y
de 600 a 700 nm para la clorofila. Estos pigmentos pueden absorber luz debido a su
ordenamiento de electrones alrededor de los núcleos atómicos en su estructura, la que
puede absorber la energía de un fotón y pasar a un estado excitado. La molécula excitada
decae dejando ir el quantum absorbido en forma de fluorescencia.
El cempasúchil (Tagetes erecta L.) es una planta herbácea anual, cuya inflorescencia es una
cabezuela solitaria que presenta una gama de colores que van del amarillo al rojo, lo que se
debe a la presencia de pigmentos carotenoides; éstos son compuestos pertenecientes al
grupo de los isoprenoides poliénicos de 40 átomos de carbono (C40), de naturaleza lipídica.
Este grupo de metabolitos se sintetiza a través de la vía no mevalónica o MEP (vía de la
metil eritritol 4-fosfato) la cual se compartamentaliza en los plastídios.
El primer carotenoide que surge es el fitoeno cuya característica es la de ser incoloro, sin
embargo la desaturación de la cadena hidrocarbonada del fitoeno, produce dobles enlaces
conjugados, lo que da a la molécula la capacidad de absorber luz de ciertas longitudes de
onda y proporcionar color a los plastídios. Esta propiedad ha sido usada para visualizar los
pigmentos plastídicos mediante microscopía de fluorescencia. En Tagetes erecta L. existen
algunos trabajos que describen el desarrollo vegetal y diferenciación plastídica, en los que
se han asociado la presencia de algunos genes involucrados en la biosíntesis de
3
Introducción
carotenoides, con los diferentes estados de apertura de la inflorescencia y del plastídio; así
como las diferencias estructurales en los plastídios presentes en las lígulas expuestos a
diferentes condiciones de radiación fotosinteticamente activa (RFA).
El interés por los pigmentos de T. erecta L. además de orientarse a la industria alimenticia

y agroindustrial, actualmente se enfoca en sus potenciales usos en la industria
farmacéutica, como agente preventivo de enfermedades cardiovasculares en la salud
humana, propiciando respuestas inmunitarias y antioxidantes. Es por esta razón que se ha
propuesto el cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) como una herramienta
biotecnológica útil en la obtención de callos de T. erecta L. dirigidas a la producción de
carotenoides.
Además la aplicación de herramientas útiles como lo son la microscopia y el tratamiento de

imágenes digitales para describir y cuantificar los cambios morfométricos en cultivos
celulares, puede ser aplicada a la transformación plastídica, lo que contribuiría a la mejor
comprensión de estos organelos en células vegetales cultivadas in vitro. En este trabajo se
presenta un estudio de los plastídios en células in vitro de Tagetes erecta L., utilizando
microscopía óptica, electrónica y tratamiento digital de imágenes el cual incluye la
descripción de la organización celular en agregados celulares así como las transformaciones
plastídicas que se llevan a cabo en distintas etapas del crecimiento celular complementada
con la detección de carotenoides tanto por autofluorescencia en microscopía confocal,
como por HPLC en las distintas etapas del crecimiento. Todo ello con el objeto de proponer
un modelo descriptivo de las posibles transformaciones plastídicas que ocurren en células
in vitro de Tagetes erecta L.
4
Marco teórico
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Plastídios.
Schimper, en 1883, usó por primera vez el nombre de plástido para distinguir a organelos
citoplasmáticos presentes en las células vegetales, los cuales son responsables de la
fotosíntesis, de la compartamentalización de las rutas de biosíntesis y almacenamiento de
una amplia variedad de metabolitos secundarios (De Robertis et al., 1981; Buchanan et al.,
2000). Todos los plastídios tienen una serie de características comunes. Las más notables
son que todos los tipos y formas de plastídios contiene múltiples copias del mismo genoma,
relativamente corto y al igual que la mitocondria, se encuentran rodeados por una envoltura
compuesta por dos membranas concéntricas (Alberts et al., 1983).
Figura 1. Esquema del ciclo de desarrollo del plastídio y diferenciación a varios tipos de plastídios.
( → ) representa los pasos normales del desarrollo del cloroplasto. ( - -› ) muestra la transformación
plastídica que ocurre bajo ciertas condiciones ambientales.
(Tomado y modificado de: Buchanan et al., 2000).
5
Marco teórico
Los plastídios existen en diversas formas asociadas a diferentes funciones metabólicas. El

termino plastídio se refiere a esta diversidad de formas que puede adoptar debido a un
estímulo ambiental, porque hasta cierto punto todos los plastídios son interconvertibles, es
decir cualquier tipo de plastídio puede diferenciarse a otro de mayor o menor complejidad
estructural y metabólica. Por ejemplo, un proplastídio puede diferenciarse en cloroplasto y
éste a su vez puede regresar a un estado primigenio como es el proplastídio (Alberts et al.,
1983), como se muestra en la Figura 1.
Además, en las células que componen algunos tejidos vegetales existe una predominancia
plastídica debido a la especialización funcional de los tejidos, en las masas celulares
fotosintéticamente activas existe una mayor abundancia de cloroplastos, mientras que en los
tejidos foliares modificados (flores o lígulas) se encuentra una mayor predominancia de
cromoplastos (Kirk y Tilney-Bassett, 1967). Esta serie de transformaciones morfo-
estructurales de los plastídios está acompañada de una inducción masiva de enzimas que
cataliza la biosíntesis de pigmentos verdes (clorofila), así como de pigmentos - accesorios
como los carotenoides.
2.2. El estímulo lumínico excita los pigmentos plastídicos.
La luz visible es la radiación electromagnética de longitud de onda entre 400 y 700 nm, que
es una pequeña parte del espectro electromagnético, el cual abarca desde el violeta al rojo.
La energía de un fotón (un quantum de luz) es mayor en el extremo violeta del espectro que
en el rojo (Bidwell, 1979), tal como se muestra en la Figura 2. La energía de un mol de
fotones (un Einstein; 6 x 1023 fotones) es 170 a 300 kJ, alrededor de un orden de magnitud
superior a la energía requerida para sintetizar un mol de ATP. La energía de un Einstein en
la región del infrarrojo o de las microondas del espectro es demasiado pequeña para ser útil
en los procesos fotoquímicos que tienen lugar en la fotosíntesis. La luz UV y los rayos X,
por otro lado, tienen tanta energía que pueden dañar las proteínas y los pigmentos que se
encuentran en el plastídio (Lehninger et al., 1995).
6
Marco teórico
Figura 2. Espectro de radiación electromagnética y energía de los fotones en la gama visible del
espectro. (Tomado y modificado de: Lehninger et al., 1995).
La capacidad que tiene un pigmento para absorber luz depende de su ordenamiento de

electrones alrededor de los núcleos atómicos en su estructura. Cuando se absorbe un fotón,
se eleva un electrón a un nivel energético superior. Para ser absorbido, el fotón ha de
contener una cantidad de energía (un quantum) que iguale exactamente la energía de la
transición electrónica. Una molécula que ha absorbido un fotón se encuentra en estado
excitado que, en general, es inestable (Lehninger et al., 1995).
Los electrones elevados a orbitales de energía superior usualmente vuelven rápidamente a

sus orbitales normales de menor energía y la molécula excitada decae al estado basal
estable, dejando ir el quantum absorbido en forma de luz o calor, utilizándolo para realizar
trabajo químico. La luz emitida durante el decaimiento de las moléculas excitadas, se
denomina fluorescencia; ésta se manifiesta en una longitud de onda superior (menor
energía) que la luz absorbida. La excitación de moléculas por la luz y su decaimiento
fluorescente son procesos muy rápidos que tienen lugar en aproximadamente 10-15 y 10-12 s,
respectivamente (Dey y Harborne, 1997).
7
Marco teórico
2.3. Fluorescencia y autoflorescencia de pigmentos plastídicos.
La autofluorescencia en tejidos y células vegetales es un fenómeno natural y observable en

la microscopía de fluorescencia, esto se produce por la una variedad de biomoléculas
endógenas del metabolismo vegetal, las cuales tienen la propiedad de absorber luz en varias
regiones del espectro, principalmente entre el ultravioleta-cercano y la región visible del
espectro de absorción. El principal pigmento autoflorescente es la clorofila, debido a la
importancia y abundancia de este pigmento, sin embargo también existen algunas
moléculas que producen un importante nivel de autofluorescencia, en la microscopia de
fluorescencia, por ejemplo las ligninas, carotenos y xantofilas, las cuales al ser estimulados
en la longitud de onda que excita a la molécula, producen autofluorescencia. Este fenómeno
puede aprovecharse en la microscoscopia confocal de barrido láser (MCBL), en el que se
pueden utilizar múltiples longitudes de onda de excitación (Olympus, 2008).
La fluorescencia de los pigmentos fotosintéticos se ha usado para visualizar las estructuras

plastídicas, en particular del cloroplasto. Por ejemplo, Tirlapur y Koning (2001), en células
del mesófilo de hojas de Arabidopsis silvestre, observaron la fluorescencia de los
pigmentos plastídicos mediante microscopía de fluorescencia con iluminantes láseres
infrarrojos. Además, lograron registrar la división del cloroplasto en tiempo real, en alta
resolución y de forma no invasiva. Por su parte, Hanson y Köhler (2000), en cultivos in
vitro de Lycopersicum esculentum en medio líquido, utilizaron microscopía de
fluorescencia para observar la pérdida gradual de la clorofila, así como la regionalización
de los plastídios en la periferia de la célula, en donde entraban en contacto con la
membrana celular. Además, observaron el alargamiento del estroma en cloroplastos que
comenzaban a diferenciarse en cromoplastos, al mismo tiempo que se observaban con
mayor frecuencia alrededor del núcleo, todo esto durante la maduración de los agregados.
Gunning (2005, 2007) mediante contraste interferencial diferencial (DIC, abreviatura en
inglés) y microscopía de fluorescencia, obtuvo imágenes de alta resolución y videos que
documentaron el crecimiento, la movilidad, la retracción, tensión, fijación, expansión-
extensión del cloroplasto de células de L. esculentum y pétalos de iris.
8
Marco teórico
La aparición de la tecnología de proteínas fluorescentes y sus variantes como la proteína

verde fluorescente (GPF), ha permitido hacer estudios más detallados de la maquinaria
metabólica del plástido. Sin embargo, la auto-fluorescencia de la clorofila también ha
servido para diferenciar diversas estructuras; por ejemplo, Hanson y Sattarzadeh (2008),
mediante MCBL y el uso de proteínas fluorescentes lograron observar las diferencias en
tamaño y forma del área estromal del plástido de diferentes tejidos vegetales; además,
mediante el barrido y la detección espectral del microscopio lograron evidenciar la auto-
fluorescencia de la clorofila y con el empalme de fotomicrografías de contraste de fases y
fluorescencia lograron ubicar las membranas tilacoidales.
2.4. Pigmentos fotosintéticos y accesorios.
Los pigmentos más importantes en la fotosíntesis son las clorofilas, estos pigmentos verdes
son estructuras policíclicas planas. La clorofila a, presente en las membranas de los
tilacoides de los cloroplastos de todas las plantas verdes contienen cuatro anillos pirrólicos
sustituidos, uno de los cuales (anillo IV) está reducido y un quinto anillo no es pirrol. Todas
las clorofilas tienen una cadena lateral larga de fitol, esterificado a un grupo carboxilo
sustituyente del anillo IV (Lehninger et al., 1995; Goodwin y Mercer, 1983). El sistema de
cinco anillos heterocíclicos que rodean el Mg2+ tiene una estructura poliénica extendida con
enlaces sencillos y dobles alternantes, esto hace que la mayor absorción de luz sea en la
región visible del espectro (Figura 3).
Además de las clorofilas, las membranas tilacoidales contienen pigmentos secundarios que
también absorben la luz, llamadas conjuntamente pigmentos accesorios, como son los
carotenoides. Estos pigmentos pueden presentar coloraciones amarillas, rojas y púrpuras;
absorben luz de longitud de onda diferente a la absorbida por las clorofilas, por lo que son
receptores luminosos suplementarios (Bosch-Munné y Alegre, 2000; Buchanan et al.,
2000).
La proporción relativa de clorofila y pigmentos accesorios es característica en cada especie

vegetal. La variación en la concentración de estos pigmentos accesorios da como resultado
la gama de colores del rojo al amarillo claro, que suele encontrarse en las hojas, tallos,
9
Marco teórico
estructuras florales y raíces modificadas. Los pigmentos que absorben luz están ordenados
en conjuntos o dispositivos funcionales denominados fotosistemas, éstos pueden absorber
luz de todo el espectro visible y más eficientemente de 400 a 500 y de 600 a 700 nm
(Bosch-Munné y Alegre, 2000).
Figura 3. Pigmentos encontrados en el sistema membranal plastidico. La clorofila a presenta

coeficientes de absorción molar anormalmente elevados. Los pigmentos accesorios carotenoides y
xantofilas absorben luz en longitudes de onda diferente al de la clorofila. (Tomado y modificado de:
Lehninger et al., 1995; Buchanan et al., 2000).
2.5. Pigmentos carotenoides.
Los carotenoides son compuestos pertenecientes al grupo de los isoprenoides poliénicos de

40 átomos de carbono (C40), de naturaleza lipídica, originados de un precursor común, una
molécula de cinco átomos de carbono llamada isopreno (Buchanan et al., 2000; Ubaldo-
Suárez, 2007). Los carotenoides son metabolitos de las plantas y se dividen en dos grupos;
las xantófilas cuya principal característica es la tener uno o más átomos de oxígeno en
forma de grupos ceto, oxo, hidroxi, epoxi en diferentes posiciones de la molécula del
10
Marco teórico
caroteno, por ejemplo la luteína (3R,30R,60R β, ε-caroteno-3,3´diol), zeaxantina (3,3´R- β,

β-caroteno-3,3´diol), y los carotenos hidrocarbonados como el β-caroteno (β, β -caroteno),
α-caroteno (60R, β, ε-caroteno) y el licopeno (ψ, ψ-caroteno) (Kopsell y Kopsell, 2006)
como se muestra en la Figura 4.
Posición de los carbonos en la molécula de caroteno
Luteína Licopeno
Zeaxantina β-Caroteno
α-Caroteno
Figura 4. Esquema de la posición de los átomos carbono de una molécula de caroteno y estructura
de la luteína, zeaxantina, licopeno, β-caroteno y α-caroteno. Los dobles enlaces conjugados de las
posiciones 5, 6 y 5´, 6´ son altamente efectivos en el intercambio de oxígenos singulete.
(Tomado y modificado de: Kopsell y Kopsell, 2006).
En las plantas los carotenoides se sintetizan, localizan y almacenan en los plastídios, donde
se encuentran asociados a los complejos colectores de luz (LCH por su sigla en ingles) de
las membranas tilacoidales del plastídio o presentes como estructuras semicristalias o
globulares en el estroma del plastídio (Lehninger et al., 1995).
11
Marco teórico
2.6. Biosíntesis de carotenoides.
En plantas, la ruta de biosíntesis de isoprenoides se realiza mediante dos vías, la del

mevalonato, que se lleva a cabo en el citoplasma para la síntesis de esteroles y
sesquiterpenos y la vía no mevalónica que conduce a la biosíntesis de los carotenoides en
los plastídios por enzimas codificadas en el núcleo (Figura 5). Como el resto de los
isoprenoides, los carotenoides se forman a partir del isopentenil difosfato (IPP) de 5
carbonos formados por 5 moléculas (Lichtenthaler, 1999; Kopsell y Kopsell, 2006).
Figura 5. Ruta de biosíntesis de los precursores de carotenoides e isoprenoides vinculados al

plastídio. (- - - →) indica la continuación de la ruta de síntesis de los carotenoides y xantofilas.
(Tomada y modificada de: Botella-Pavía y Rodríguez-Concepción, 2006)
La vía no mevalónica o MEP, vía de la metil eritritol 4-fosfato (Figura 5). La deoxixilulosa
5-fosfato sintasa (DXS) cataliza la reacción entre el Gliceraldehído-3-Fosfato (GAP) y el
12
Marco teórico
piruvato lo que da como resultado el 1-Desoxi-Xilulosa-5-Fosfato (DXP). Posteriormente

ocurre un rearreglo molecular y reducción de la DXP por la enzima DXP-reductoisomerasa
(DXR) obteniéndose el MEP; cabe señalar que este compuesto es considerado como el
primer precursor de esta vía biosintética (Botella-Pavía y Rodríguez-Concepción, 2006).
Después, el MEP es convertido en 4-difosfocytidil-metilerytritol (CDP-ME) por una

primera reacción enzimática, la segunda reacción da como resultado el 4-difosfocytidil-
metilerytritol 2-fosfato (CDP-MEP), la tercera reacción produce el metilerytritol 2,4-
ciclodifosfato (ME-cPP); el último paso de la vía MEP es la reducción del ME-cPP a
hidroximethylbutenyl 4-difosfato (HMBPP), el cual es convertido por la enzima HMBPP
reductasa (HDR) en una mezcla 5:1 de isopentenyl difosfato (IPP) y de dimetilalil
pirofosfato (DMAPP) (Botella-Pavía y Rodríguez-Concepción, 2006).
Posteriormente, se lleva a cabo una serie de reacciones de condensación con tres moléculas
de IPP: a) el dimetilalil pirofosfato para formar el genaril pirofosfato (GPP); b) el GPP a su
vez condensa con otra molécula de IPP para formar el farnesil pirofosfato (FPP) y c) el FPP
con la tercera molécula de IPP para dar origen al geranilgeranil pirofosfato (GGPP); las
enzimas involucradas en estas reacciones de condensación se conocen genéricamente como
preniltransferasas (Lichtethaler, 1999).
El primer carotenoide surge de la condensación cabeza-cola de 2 moléculas de GGPP

formando el fitoeno (Figura 6), cuya característica es la de ser incoloro y tener un esqueleto
de 40 átomos de carbono, esta reacción es catalizada por la fitoeno sintasa (PSY) la cual se
encuentra asociada a la membrana del plastídio. La posterior desaturación de la cadena
hidrocarbonada produce dobles enlaces conjugados, lo que da a la molécula la capacidad de
absorber luz de ciertas longitudes de onda y proporcionar color a tejidos productores de
carotenoides (Del Villar Martínez et al., 2007).
13
Marco teórico
GGPP GGPP
Fitoeno
Fitoflueno
ζ- Caroteno
Neurosporeno
Licopeno
δ-Caroteno γ-Caroteno
β-Caroteno
α-Caroteno
β-Criptoxantina
Zeinoxantina
Luteína Zeaxantina
Anteraxantina
5-6-Epoxiluteina
Violaxantina
Neoxantina
Figura 6. Continuación de la ruta de biosíntesis de los carotenoides y xantofilas.

(Tomada y modificada de: Kopsell y Kopsell, 2006)
Las etapas posteriores conducen a la síntesis de los carotenoides con color, se presentan
cuatro desaturaciones del fitoeno, por acción de la enzima fitoeno desaturasa (PDS), la cual
cataliza las dos primeras desaturaciones del fitoeno y fitoflueno a ζ-caroteno, mientras que
14
Marco teórico
la conversión de ζ-caroteno a neurosporeno y posteriormente a licopeno es realizada por la

acción de la enzima ζ-caroteno desaturasa (ZDS) (Hirschberg, 2001).
La ciclación del licopeno, en ambos extremos de la molécula da como resultado a los α-, β-
ó ε- carotenos. Estas reacciones son catalizadas por las enzimas β- ó ε-licopeno ciclasa.
Cuando la enzima β-licopeno ciclasa actúa en ambos lados de la molécula ocurre la
formación de β-caroteno, el cual es precursor de las xantofilas (zeaxantina, violaxantina y
anteraxantina) (Lois, 2000).
La neoxantina es precursor de ácido absicico (ABA), hormona vegetal que tiene múltiples
funciones, incluyendo el papel en la regulación de la función estomal y la dormancia de las
semillas. La enzima ε-licopeno ciclasa puede actuar en ambos extremos de la molécula y
producir ε-caroteno. Los anillos ε difieren de los β en la posición del doble enlace dentro
del ciclo hexano; en cualquier caso, en las plantas es común encontrar anillos modificados
(Kopsell y Kopsell, 2006).
2.7. Cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV).
El cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) se considera una herramienta

biotecnológica sumamente útil, para la producción de una gran variedad de metabolitos
secundarios de interés químico, farmacéutico y alimentario. Esto debido a que las células
cultivadas in vitro pueden llegar a producir, en determinadas condiciones, una cantidad
igual ó mayor de sustancias que las plantas en condiciones naturales (Martínez, 2003).
El CCTV constituye un conjunto de técnicas que permite el establecimiento, mantenimiento

y desarrollo de cualquier tipo de célula, tejido u órgano vegetal bajo condiciones
artificiales, asépticas y controladas (Robert, 1985). Una aplicación específica de esta
técnica es la de obtener líneas celulares para la caracterización de procesos fisiológicos,
bioquímicos genéticos y celulares, en particular del crecimiento, organogénesis y
diferenciación celular (Sánchez-Segura, 2007).
15
Marco teórico
2.8. Aspectos generales de Tagetes erecta L.
Tagetes erecta L. es una planta herbácea anual, erecta y aromática, de tallos estriados y
hojas pinnadas, cuya flor es una cabezuela solitaria conocida como capítulo, inflorescencia
que a su vez contiene flores individuales de tipo “tubulado” o “ligulado”. Estas
inflorescencias pueden presentar diferente morfología: tipo pompón, doble pompón,
sencillo, semidoble y apetalas (Serrato-Cruz, 2006), así como colores que varían del
amarillo débil al naranja intenso, esta gama se debe a la presencia de diversos pigmentos
carotenoides, de los cuales el principal es la luteína. Se le conoce con el nombre de
“cempoalxochilt”, palabra náhuatl, que significa flor de veinte pétalos, también se le
conoce como “cempasúchil”, “clavel de indias occidentales”, “marygold”, “damasquina”,
“copete”, “cimpual”, “apatzequa” y “flor de muertos”, este último vocablo se debe al uso
que tiene en las festividades religiosas del día de muertos en México (Serrato-Cruz, 2006;
Ubaldo-Suárez, 2007).
El mercado mundial de los pigmentos de T. erecta L. no sólo se orienta a la alimentación

animal y humana, actualmente se enfoca al desarrollo de productos conocidos como
funcionales, los que además de tener un objetivo alimenticio y nutricional, también tienen
un efecto terapéutico (preventivo y correctivo) en la salud humana, propiciando respuestas
inmunitarias, disminución de enfermedades cardiovasculares, como protectores de la piel
contra rayos ultravioleta y aminorar la degeneración macular relacionada a la edad y
formación de cataratas (antioxidantes) (Jaramillo-Flores y Mora Escobedo, 2003; Kopsell y
Kopsell, 2006).
2.9. Cultivo in vitro de células de Tagetes erecta L.
En el CCTV, la obtención de células vegetales desdiferenciadas de T. erecta L.

generalmente se ha realizado a partir de explantes de hojas jóvenes de plantas cultivadas en
invernadero, los cuales a su vez se siembran en medios de cultivo que contienen una fuente
de carbono y de nitrógeno, así como sales, minerales, oligoelementos y vitaminas. Estos
medios de cultivo son adicionados con una combinación de reguladores de crecimiento
vegetal, los que permiten la desdiferenciación y proliferación celular en los cultivos in
16
Marco teórico
vitro; confiriéndoles a su vez, características morfoestructurales particulares (Vanegas et

al., 2002; Del Villar Martínez et al., 2007).
En el caso de T. erecta L., la desdiferenciación celular se logra con explantes obtenidos de

hoja o tallos, sembrados en un medio de cultivo denominado MS (Murashige y Skoog,
1962), al cual se adiciona una auxina, cuya función es la de inducir la división, el
crecimiento y la diferenciación celular, dando como resultado la estructuración de
vegetales; además se añade una citocinina cuya función es la de estimular la continua
división celular (Pérez-Molphe et al., 1999). Cabe señalar que ciertas combinaciones de
auxinas y citocininas dan como resultado la desdiferenciación celular, formando masas
compactas y duras, con células íntimamente unidas llamadas “callos”; modificando esta
combinación, se originan callos friables de fácil disgregación, enraizamiento,
rediferenciación y otros procesos (organogénesis, embriogénesis somática) (Lina, 2006).
Los reguladores de crecimiento más usados en los cultivos in vitro de T. erecta son la
auxina 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y la citocinina BA (benciladenina) (Pérez-
Molphe et al., 1999).
2.10. Origen, tipo y función de los plastídios.
Todos los plastídios se desarrollan a partir de proplastídios, que son organelos cuyo
diámetro oscila entre 0.2 a 1.0 μm cuya forma varía de esférica a ovoide (Buchanan et al.,
2000); están presentes en las células inmaduras de los meristemos de las plantas. En
algunas micrografías, el espacio interno del proplastídio, el estroma, se observa
uniformemente denso y finamente granular. Los proplastídios se desarrollan en cada célula
en vías de diferenciación y la transformación de éstos está determinada por el genoma
nuclear. La clasificación de los plastídios está dada por la función-contenido al interior, es
decir la actividad metabólica y los compuestos almacenados.
En los tejidos vegetales expuestos a la oscuridad, los proplastídios aumentan de tamaño y

se transforman en etioplastos, los cuales presentan un eje semicristalino de membranas
internas que contiene protoclorofila precursora. Cuando son expuestos a la luz, los
etioplastos se transforman en cloroplastos, mediante la biosíntesis de clorofila, pigmentos
17
Marco teórico
accesorios, enzimas fotosintéticas y componentes de la cadena de transporte electrónico, así

como la transformación de lamelas plastidicas a tilacoides (Bidwell 1979; Buchanan et al.,
2000).
Los leucoplastos son plastídios que aparecen en la epidermis y en muchos tejidos internos
que no se vuelven verdes, ni fotosintéticos. Son incoloros y ligeramente más grandes que
los proplastídios. Participan en la síntesis de monoterpenos, los compuestos volátiles
contenidos en los aceites esenciales. Esta capacidad se asocia a las características
morfológicas, como son las dos membranas, un estroma denso, la poca cantidad de
membranas internas y ribosomas, así como pequeños plastoglóbulos, que son diminutas
vesículas lipídicas, que en las micrografías se observan oscurecidas por la reacción con el
tetraóxido de osmio (Buchanan et al., 2000).
El amiloplasto es una plastídio sin pigmento, que acumula gránulos de almidón. Su nombre
se deriva de amilasa, un polisacárido lineal, soluble en agua, compuesto de unidades α(1 →
4)-glucopiranosil, el cual es el mayor constituyente del almidón. El amiloplasto es un
organelo común en órganos de almacenamiento. Los granos de almidón se producen y
almacenan en el estroma de plastídio. En algunas plantas el tamaño del amiloplasto puede
llegar a ser tan grande como una célula animal (Kirk y Tilney-Bassett, 1967; Bonora et al.,
2000).
El cloroplasto es el organelo de mayor importancia en las células vegetales ya que realiza la

fotosíntesis durante el estímulo lumínico. Los productos de la fotosíntesis son utilizados
para la biosíntesis y también son transformados en azúcares de bajo peso molecular como la
sacarosa, éstos son exportados para satisfacer las necesidades metabólicas de muchas de las
células no fotosintéticas de la planta. Alternativamente, los productos pueden ser
almacenados como polisacáridos osmóticamente inertes. La forma característica de este
organelo es semiesférica o lentiforme, mide aproximadamente entre 5 y 8 μm de longitud y
entre 3 y 4 μm de espesor y la cantidad de éstos es variable en las células. Por ejemplo, las
células del mesófilo empalizada contienen aproximadamente 36 cloroplastos, mientras que
las del mesófilo esponjoso contienen 20. El aparato fotosintético del cloroplasto está
18
Marco teórico
contenido dentro de un sistema membranoso extendido denominado tilacoides (Bidwell

1979; De Robertis et al., 1981).
En los plastídios no solo tiene lugar la fotosíntesis o el almacenamiento de materiales de

reserva; sino que también los plastídios regulan la compartamentalización celular del
metabolismo secundario. Los plastídios producen una cantidad mayor de energía en forma
de ATP y mayor número de moléculas reductoras (NADPH), que las que son utilizadas
para las reacciones biosintéticas de las plantas. La síntesis de las purinas y pirimidinas, la
mayoría de los aminoácidos y de algunos ácidos grasos de las plantas tiene lugar en los
plastídios.
2.11. Cromoplastos
El cromoplasto es el organelo celular que da el color característico a las flores y frutos, así
como a otros órganos de las plantas; puede tener coloraciones amarillas, anaranjadas y
rojas, dependiendo de la concentración y combinación específica de carotenos y xantofilas
presentes (Whatley y Whatley, 1987). El cromoplasto se puede diferenciar directamente de
proplastidios o por la rediferenciacion de cloroplastos como sucede en la maduración de los
frutos del jitomate. En algunas ocasiones se puede rediferenciar en cloroplastos como
sucede cuando se expone a la luz la superficie de las raíces de la zanahoria o en algunas
frutas cítricas que reverdecen dentro de estímulos lumínicos característicos (Kirk y Tilney-
Bassett, 1967).
El desarrollo y diferenciación del cromoplasto es acompañado por una inducción masiva de

enzimas que catalizan la biosíntesis de carotenoides. Aunque las formas inactivas de estas
enzimas se encuentran en el estroma, las formas activas sólo se presentan en las membranas
del plastídio, donde existe una alta cantidad de precursores lipofilicos de los carotenos. De
hecho, la composición química de los depósitos de carotenoides es la causa principal de la
gran variedad de formas, tamaño y estructuras internas del cromoplasto (Kirk y Tilney-
Bassett, 1967).
19
Marco teórico
2.12. Características morfológicas del cromoplasto durante la diferenciación.
En los frutos, el cromoplasto no siempre se desarrolla desde cloroplasto. Guilliermond

(1941), realizó los primeros estudios de la transformación de amiloplastos a cromoplastos
en frutos de Asparagus officinalis usando microscopia óptica. El almidón de los
amiloplastos desaparece y se forman plastídios coloreados; los glóbulos de pigmentos
carotenoides se forman en el estroma del plastídio junto a la membrana interna. El plastídio
tiende a separarse en pequeños plastídios dando como resultado la formación de
cromoplastos pequeños, redondos y vesiculados.
La ultraestructura, bioquímica y aspectos genéticos del proceso de transformación del

cloroplasto a cromoplasto ha sido estudiada en los frutos de Lycopersicum sp., Campsicum
sp. y Citrus sp. Bonora et al., (2000) encontraron que en Arum italicum Miller, los cambios
que se dieron durante la maduración del fruto consistían en la inusual transformación de
amiloplasto-cloroplasto-cromoplasto con la subsecuente pérdida de clorofila y la
acumulación de pigmentos carotenoides.
En la primera etapa de maduración, los plastídios eran de forma oval y redonda, además se
encontraban rodeados por una doble membrana que contenía el estroma de tipo granular
ocupado a su vez por un grano de almidón y por pequeños plastoglóbulos. La segunda etapa
de maduración se caracterizó por la transición de amiloplastos a cloroplastos. En esta etapa,
la región del estroma que ocupaba el grano de almidón se encontraba completamente
ocupada por un abundante sistema membranoso, previamente diferenciado en estroma y
grana tilacoidal. La etapa tres correspondió al fruto verde, en el que se encontraron
plastídios con estructuras lentiformes cristalinas, así como el desarrollo de un sistema
membranal – tilacoidal, con un apilamiento del grana, pequeños plastoglóbulos y gránulos
de almidón pequeños. Sin embargo del 5 al 10% de los cloroplastos presentaban cierto
estado de diferenciación hacia cromoplasto. La cuarta etapa correspondió al fruto amarillo
y se caracterizó por el desarrollo de los primeros cromoplastos, que fueron identificados por
la pérdida de la maquinaria fotosintética y de los gránulos de almidón en su totalidad. En la
etapa cinco el fruto era naranjo-rojo, observándose cromoplastos maduros; así mismo, en
esta etapa el sistema membranoso desapareció completamente, sin embargo existían
20
Marco teórico
remanentes membranosos difusos. La madurez del cromoplasto se caracterizó por la gran

cantidad de pequeños glóbulos osmiófilos (plastoglóbulos) dispersos, pero además se
encontraron abundantes cristales elípticos de carotenoides dentro del estroma y no hubo
signos de división plastídica (Bonora et al., 2000).
En los pétalos de flores verdaderas, compuestas y estructuras adventicias, el cromoplasto se

distingue por el contenido de carotenoides, pero además por la etapa de apertura floral
(edad de la planta) y madurez del tejido. La ultraestructura del cromoplasto se ha
investigado en varias especies y se han descrito por lo menos cinco categorías estructurales
reconocibles, globulosas, tubulosas, retículo-tubuloso, membranosas y cristalinas, asociadas
a la composición química de los carotenoides (Whatley y Whatley, 1987). Pero el principal
carácter morfológico es la presencia de glóbulos osmiófilos que se concentran alrededor o
junto al material membranoso. Generalmente en las micrografías electrónicas los glóbulos
se manifiestan como zonas de alta densidad de electrones y son inherentes a los
cromoplastos de células de flores de edades maduras (Kirk y Tilney-Bassett, 1967).
2.13. Características del cromoplasto en lígulas y células in vitro de T. erecta L.
En el caso de T. erecta, son escasos los trabajos que describen el desarrollo y diferenciación
plastídica. En este sentido, Del Villar Martínez et al., (2005) asociaron la presencia de
algunos de los genes involucrados en la biosíntesis de carotenoides, con diferentes estados
de apertura de los capítulos florales y el tipo de plastídios presentes. Cuando el capítulo
floral estaba completamente abierto, los principales plastídios observados eran
cromoplastos y el pigmento predominante era la luteína.
Por su parte Ubaldo-Suárez (2007) reportó diferencias entre los organelos presentes en
lígulas de los capítulos florales expuestos a diferentes condiciones de radiación
fotosintéticamente activa (RFA). Esta autora encontró que en las lígulas había plastídios
con un sistema de membranas altamente ramificadas, cuando los capítulos florales fueron
expuestos a una RFA promedio de 220 mol mes-1; los cromoplastos contenían cuerpos
lipídicos evidenciados como manchas electrodensas, así como el grana se encontraba
21
Marco teórico
rodeado de gránulos de almidón. Por otra parte, las lígulas expuestas a intensidades
promedio de 630 mol mes-1, el sistema membranoso fue menos abundante y las bandas
tilacoidales fueron escasas y desorganizadas; en estas lígulas dominó la presencia de
gránulos de almidón.
Recientemente, en una primera aproximación Ramos-Viveros (2007) observó células

desdiferenciadas de T. erecta cultivadas in vitro provenientes de callos friables, de diferente
coloración (rojos, verdes y amarillos). Esta autora reportó que en las células de callos
amarillos los principales plastídios observados fueron cromoplastos, conteniendo
estructuras que describió como vesículas lipídicas sin observarse electrodensos al paso del
haz de electrones del microscopio electrónico de transmisión; en cambio, las células de
callos de color verde contenían principalmente cloroplastos y las de callos rojos,
presentaban grandes vacuolas conteniendo algún pigmento hidrosoluble, distinto a los
carotenos.
2.14. Morfología y estructura interna de callos in vitro.
Los primeros estudios del crecimiento y organización estructural del callo fueron realizados
en Nicotiana sp. cultivada in vitro. Estos callos se encuentran formados por masas de
células vivas y muertas, las que se encuentran separadas por espacio intersticiales de
tamaño variable, algunas zonas del callo presentan agregados celulares cuya dinámica es la
constante división celular (células meristemales) y agregados celulares que se especializan
en el almacenamiento de nutrientes y metabolitos (células parenquimáticas) (Thorpe,
1981).
Después de una resiembra, sólo una pequeña parte de las células contribuyen a la formación
de nuevos callos, éstos generalmente se originan a partir de varios tipos de células
parenquimáticas. El tamaño de las células parenquimáticas de almacenamiento es de 200 a
427µm de longitud y de 45 a 90 µm de ancho; las células parenquimáticas meristemales
miden de 60 a 130 µm de longitud y de 60 a 95 µm de ancho (Thorpe, 1981).
22
Marco teórico
Las células parenquimáticas de almacenamiento se caracterizan por presentar una o varias

vacuolas grandes y los plastídios se localizan en el citoplasma, el cual se encuentra cercano
a la pared celular, que es de aspecto grueso (Poljuha et al., 2003). Las células
parenquimáticas meristemales se caracterizan por presentar varias vacuolas pequeñas, ser
isodiamétricas, cuya pared celular es de aspecto delgado (Poljuha et al., 2003).
Gómez (2003), realizó estudios sobre la histología y estructura interna de callos inducidos a
partir de explantes de hipocótilo, pecíolo, hojas cotiledonares y raíz de Ipomea murucoides
utilizando medio MS, adicionado con reguladores de crecimiento: ácido naftalénacético
(ANA), indolacético (AIA) y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Los callos de 8 semanas
eran de aspecto compacto, con poco crecimiento y de apariencia nodular, los cortes
histológicos mostraron que el proceso de desdiferenciación se produjo a partir de células
parenquimáticas que rodeaban los haces vasculares, dando como resultado que los callos
estuvieran constituidos por células meristemáticas y parenquimáticas; además, durante el
proceso de diferenciación celular, ésta conducía a la rizogénesis directa e indirecta.
Lina (2005), realizó la descripción estructural de callos de Ipomea intrapilosa, generados

con ANA 18.09 µM a 45 días de siembra y expuestos a luz constante. Estos callos
estuvieron formados por células pequeñas de tipo parenquimático de forma irregular. En la
zona correspondiente a la parte compacta del callo no se observaron espacios celulares
dentro de la masa celular; además, se observaron restos de haces vasculares (elementos
traqueales) del explante original, así como células que solo presentaban pared secundaria.
Al interior de las células parenquimáticas es posible observar la presencia de inclusiones
cercanas a la membrana celular. Mientras que los callos generados con ANA 13.57 µM +
cinetina 1.1 µM en luz constante se observó que la masa celular estuvo formada por células
de tipo parenquimáticas irregulares en forma y tamaño, sin espacios intercelulares en la
zona de callo compacto y células en las que sólo se observó una delgada pared primaria.
En la literatura consultada disponible, hasta el momento no existe una descripción

histológica del la formación del callo de Tagetes erecta L. a partir de explantes y de callos
mantenidos en un cultivo in vitro a las concentraciones de reguladores de crecimiento que
23
Marco teórico
plantea este trabajo. Sin embargo, los estudios en otros modelos vegetales indican la
constante tendencia de los tejidos desdiferenciados mantenidos in vitro a regresar a las
condiciones de tejidos diferenciados (Dodds y Roberts, 1985).
2.15. Aplicación del tratamiento digital de imágenes (TDI) en el estudio de la

morfometría celular vegetal.
En el CCTV se han desarrollado recientemente herramientas novedosas para el tratamiento

y análisis de imágenes digitales con el fin de dar seguimiento a la morfometría de los
cultivos de células vegetales, o bien, para estudiar in vivo procesos biológicos y
posteriormente, caracterizar y cuantificar a través del tiempo dichos fenómenos. Estas
herramientas complementarias a la microscopía óptica, tienen una serie de ventajas tales
como el no ser destructivas, proporcionar información cuantitativa de la imagen y su
implementación no es costosa. Sin embargo en la microscopia electrónica de transmisión
(MET), sucede lo contrario.
También presentan una serie de limitaciones que se deben considerar al utilizarlas; por
ejemplo, las imágenes obtenidas son bi-dimensiones, además se basan en el conteo y
medición de píxeles por lo que la precisión depende de la resolución del número de píxeles
utilizado; mientras que la textura extraída de las imágenes analizadas generalmente no se
puede usar como elemento cuantitativo (Jiménez, 2005). Es por ello que se dificulta el
análisis de la imagen en procesos donde existen eventos de formación y crecimiento. En la
biotecnología vegetal y en particular en el CCTV, se han reportado aplicaciones del TDI; a
continuación se citan algunos ejemplos.
Pepin et al., (1999) aplicando herramientas del tratamiento de imágenes digitales, lograron
medir el tamaño, la distribución de agregados y la pigmentación celular por acumulación de
antocianinas en células de Vaccinium paleae. Las mediciones revelaron que la acumulación
de pigmento no se encuentra correlacionada con el tamaño de los agregados. La frecuencia
relativa de agregados pigmentados fue más alta, en comparación con las clases de
agregados alargados. Sin embargo, las áreas pigmentadas estuvieron principalmente
confinadas solo a la periferia de los agregados. Por su parte, Ibaraki, Y. y K. Kenji (2001).
24
Marco teórico
utilizaron TDI para determinar la morfología y el tamaño de embriones somáticos. Con el

sistema desarrollado lograron discernir entre embriones “normales” y “anormales” de
acuerdo a parámetros morfológicos estandarizados. Además demostraron que algunas
características morfológicas de los embriones cambiaron significativamente, en estados
particulares del desarrollo.
Trejo-Tapia et al., (2001) analizaron cambios morfológicos de las células de Solanum

chysotrichum crecidas en un tanque agitado. Utilizando ADI, encontraron que al inicio del
cultivo los agregados con un factor de forma elíptica (FFE) menor a 2 representaba el 52%
de la población, sin embargo, en la fase estacionaria la proporción se incremento al 77%
sugiriendo que durante el tiempo de cultivo existe una tendencia a que los agregados
adquieran una forma redonda. Además, reportaron que el 80% de las células tuvieron un
área menor a 0.1 mm2 y no se presentaron cambios en el tamaño de los agregados.
Trejo-Tapia et al., (2007) utilizando un microscopio de fluorescencia y acoplado a un

sistema de captura y análisis de imágenes, establecieron correlaciones entre la
concentración de betacianinas y de la viabilidad de células de B. vulgaris, con porcentajes
de áreas teñidas y áreas fluorescentes, respectivamente. Además evaluaron distintos
descriptores morfométricos de los cultivos durante su crecimiento en matraces.
Sin embargo, la aplicación de herramientas para el tratamiento y análisis de imágenes

(ADI) en microscopía electrónica de transmisión, no ha sido reportada hasta el momento.
25
Justificación
3. JUSTIFICACIÓN
En inflorescencias de cempoalxochilt (Tagetes erecta L.) se han realizado estudios de la

biosíntesis de carotenoides, además de algunos factores ambientales que estimulan la
diferenciación plastídica. Sin embargo, hasta el momento se desconoce la transformación
de plastidios asociada a la morfometría de éstos y a la producción de metabolitos.
El presente estudio pretende aportar información sobre la estructura del callo durante el
crecimiento, asociado a la transformación plastídica hasta la aparición del cromoplasto y a
la biosíntesis de pigmentos; información que puede ser utilizada en posteriores estudios de
células in vitro productoras de metabolitos, en lo que se refiere a la utilización del
tratamiento digitales de imágenes, así como hacer una propuesta para el establecimiento de
la ruta de diferenciación plastídica asociada al crecimiento de células in vitro de T. erecta
L.
26
Objetivos
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Estudiar los plastídios y su relación con la presencia de carotenoides en células in vitro de

Tagetes erecta L., durante diferentes etapas de crecimiento, utilizando técnicas de
microscopía óptica, electrónica, tratamiento digital de imágenes y de cromatografía.
4.2. Objetivos particulares
• Describir la estructura celular, así como los estados de diferenciación morfológica

de los plastídios de células de T. erecta L., en diferentes etapas de crecimiento in
vitro; utilizando microscopía óptica y electrónica de transmisión (MET).
• Determinar la presencia de pigmentos clorofílicos y carotenoides a través de

fluorescencia en células de T. erecta L. de las diferentes etapas de resiembra,
mediante microscopía confocal de barrido de láser (MCBL).
• Evaluar diferentes descriptores morfométricos para cada estado de diferenciación

plastídica, utilizando herramientas de tratamiento digital de imágenes.
• Evidenciar la presencia de pigmentos carotenoides en extractos de T. erecta L.

mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).
• Establecer un posible modelo descriptivo de las etapas de diferenciación plastídica

en células de T. erecta L. crecidas in vitro, a través de imágenes de ultraestructura.
27
Materiales y métodos
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Materiales.
5.1.1. Material biológico.
Se utilizaron células desdiferenciadas (callos) de Tagetes erecta L. del fenotipo amarillo

proporcionados por la Dra. Alma Angélica del Villar Martínez, del CeProBi -IPN.
5.1.2. Medio de cultivo.
Se utilizó medio MS (Murashing y Skoog, 1962) la auxina 2,4-D (ácido 2,4-

diclorofenoxiacético) y la citocinina BA (benciladenina) como reguladores de crecimiento.
Al medio de cultivo se le adicionó sacarosa, como fuente de carbono y Phytagel como
agente gelificante, de acuerdo a la metodología propuesta por García-Chavarría (2007).
Todos los reactivos fueron grado analítico de las marcas Sigma-Aldrich (USA) y Merck
(Alemania). Para sembrar las células se utilizaron frascos con tapa.
5.2. Equipo.
5.2.1. Equipo de laboratorio para el cultivo de células.
• Autoclave vertical, AESA, modelo CV250 (México).

• Balanza analítica, OHAUS, modelo 6230N (U.S.A.)
• Campana de flujo laminar, ALDER (México)
• Medidor de pH, JENCO, modelo 6A200D (Alemania)
5.2.2. Equipo para microscopía óptica, confocal y electrónica de transmisión.
• Microscopio Óptico NIKON Eclipse 80i. Voltaje (12V-100W), (Japón); con cámara
de video (Data image DS33, Japón).
• Microscopio Confocal de Barrido Láser: LEICA TCS SP5 (Alemania).
• Microscópio Electrónico de Transmisión ZEISS EM10 (Alemania).
• Microscopio Electrónico de Transmisión JEOL 1010 (Japón).
28
• Ultramicrotomo Leica Ultracut R (Alemania).
5.2.3. Equipo para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
• Cromatógrafo de Líquidos de Alta Presión Perkin Elmer

• Bomba de vacío
5.2.4. Equipo y software para tratamiento de digital de imágenes.
• Computadora genérica (Intel Pentium IV, procesador 2.66 Ghz), con interfaz de
usuario para captura de imágenes.
• Monitor de alta definición (ViewSonic, 21 pulgadas, USA).
• Sigma Scan Pro (V5.0, SPSS, USA).
• Metamorph (V5.0, Metaview Imaging Corporation, USA).
• Excel 2007 (V.XP, Microsoft Corporation, USA).
• Corel Draw Essential Edition 3 (Corel Corporation, USA).
• Corel Paint Shop Pro Photo Xl (Corel Corporation, USA).
• Image J V. 1.34 (National Institute of Health, USA).
5.3 Metodología.
La metodología seguida en este trabajo, se resume en el diagrama de flujo mostrado en

la Figura 7.
5.3.1 . Siembra y mantenimiento de cultivos de T. erecta L., fenotipo amarillo.
Los callos se sembraron en medio MS adicionado con 2-4-D (2 mg/l) y BA (2 mg/l), de

acuerdo a lo reportado por García-Chavarría (2007). Para las resiembras subsecuentes y con
la finalidad de obtener una mayor friabilidad del callo, la concentración de los reguladores
de crecimiento se modificó a 1.0 mg/l de 2-4-D y 0.2 mg/l de BA; el pH del medio se ajustó
a 5.8.
29
Figura. 7. Diagrama de flujo de la estrategia experimental
30
Los frascos conteniendo los callos de T. erecta, fueron mantenidos bajo condiciones
constantes de temperatura (20 ± 1º C), fotoperiodo (16 horas de luz) e iluminación (2,500
luxes de los cuales 120 µmol m2 s-1corresponden a la radiación fotosintéticamente activa).
Para las observaciones al microscopio se obtuvieron células de 8 hrs, 7, 14, 21 y 28 días de
crecimiento.
5.3.2. Procesamiento de células de T. erecta L. para microscopía óptica y

electrónica de transmisión (MET).
Se utilizó un protocolo estándar que incluyó un proceso de fijación de acuerdo a lo

reportado por Karnovsky (1961) y modificado por Sánchez-Segura, (2008); describiéndose
a continuación:
a. Fijación.
Se prepararon 5 ml de fijador glutaraldehído-paraformaldehído 4% y 2.5% respectivamente

en regulador de fosfatos (PBS). Se agregaron 2.5 ml del fijador en un vial de vidrio de 10
ml de capacidad, posteriormente se colocaron pequeños agregados del callo, tomados
siempre de la región central-apical, posteriormente se agregaron 1.5 ml del fijador para
cubrir las muestras, teniendo la precaución de que éstas se mantuvieran sumergidas. El
tiempo de fijación fue de 1½ hrs. después del cual, el fijador se retiró con una pipeta
pasteur y se realizaron 3 lavados (10 minutos c/u) con regulador de fosfatos.
b. Contraste y Post-fijación.
El contraste y post-fijación se realizó con tetraóxido de osmio (OsO4) al 1% con regulador

de fosfatos. Una vez que fueron lavados en el paso anterior, a los especímenes se les
agregaron 2 ml de la solución de OsO4 y se mantuvieron en esta solución durante 1 hora; al
término de ésta, se realizaron 3 lavados con regulador de fosfatos durante 10 minutos cada
lavado.
31
c. Deshidratación.
Se utilizaron “trenes” de deshidratación utilizando soluciones hidroalcohólicas de metanol

en las siguientes concentraciones (seriadas): 50 % durante 5 minutos (sólo en esta
concentración se hizo por duplicado), 60 %, 70 %, 80%, 90%, así como en metanol
absoluto, por 10 minutos.
d. Pre-inclusión.
Una vez que se retiró el metanol absoluto, se agregaron 3 ml de óxido de propileno

directamente al espécimen y éste se dejó reposar durante 10 minutos; la operación se repitió
en tres ocasiones. Se preparó una mezcla de óxido de propileno:resina en una proporción
2:1 y se mantuvo durante 24 horas, después otra 1:1 durante otras 24 horas y la ultima en
proporción 1:3 (24 horas).
e. Inclusión y polimerización.
Una vez que el espécimen pasó por la pre-inclusión, se dejó evaporar el óxido de propileno
y los fragmentos del tejido mejor contrastados y que tuvieron un tamaño entre 0.5 y 1 mm2,
fueron extraídos y colocados en los extremos del molde de inclusión. Se rellenó cada uno
de los pozos de inclusión con la resina (100%) y se retiraron las burbujas de aire que se
formaron; posteriormente, se colocó la placa de inclusión en un horno a 60°C por 48 horas.
Una vez transcurrido este tiempo, se retiró la placa del horno y se dejó enfriar a temperatura
ambiente; finalmente, se sacaron los bloques del molde y almacenaron.
f. Cortes semifinos (microscopía óptica).
Se escogieron los bloques que tuvieran un espécimen bien contrastado; cada bloque se
montó en el ultramicrotomo y se llevó a cabo el tallado de la pirámide en una de las caras
del bloque; se realizaron cortes semifinos de aproximadamente 350 nm a una velocidad de
1.2 mm/s, se montaron en un portaobjetos y se tiñeron con azul de toluidina al 1%; se
observaron en un microscopio óptico en diferentes amplificaciones y se capturaron
imágenes digitalmente con un formato * tiff.
32
g. Cortes ultrafinos (MET).
Se realizó un nuevo retallado del bloque con el objeto de disminuir el área de la cara de la
pirámide. Una vez que se retalló el bloque, se obtuvieron cortes ultrafinos de
aproximadamente 60 y 50 nm a una velocidad de 0.8 mm/s, con cuchillas de vidrio, estos
cortes se montaron en rejillas de cobre de 50 y 100 mesh recubiertas de “Fomvar” y
posteriormente se almacenaron en cajas Petri cubiertas con papel filtro.
h. Post-contraste.
Los contrastantes usados fueron acetato de uranilo acuoso y citrato de plomo, estos se
centrifugaron durante 5 minutos a 30000 rpm antes de usarse. Las rejillas fueron pasadas a
acetato de uranilo durante 20 minutos en oscuridad y lavadas con agua destilada y
desionizada, posteriormente se pasaron a citrato de plomo durante 10 minutos, seguido de
un lavado con abundante agua, secadas y almacenadas en cajas KLB para rejillas.
i. Observación y captura de imágenes (MET).
Se realizaron observaciones previas en el microscopio electrónico (Zeiss) para evaluar las

rejillas con mejores cortes. Una vez seleccionadas fueron pasadas a otro microscopio
electrónico (JEOL) en el que se realizó la segunda observación. La captura de imágenes se
realizó de forma sistemática al registrar entre 6 y 7 imágenes por rejilla para tener un
muestreo confiable. Se almacenaron en tamaño 1024 x 1184 en formato *.tiff,
5.3.3. Observación de la autofluorescencia plastídica en MCBL.
a. Inmovilización de células.
Se preparó una solución “madre” de gliceraldehído (50%) diluida con agua destilada. Se
agregó 1 ml de la solución en un vial Eppendorf de 2 ml de capacidad, posteriormente se
colocaron trozos del callo, tomados siempre de la región central-apical, se sumergieron las
muestras y agitaron suavemente, con la finalidad de promover la disgregación celular, se
cubrió el tubo Eppendorf con papel aluminio y se dejó reposar durante 1 minuto. Una vez
33
transcurrido ese tiempo se tomó una porción con una pipeta Pasteur y se depositaron 2
gotas en un portaobjeto y se cubrió; se mantuvo en la oscuridad hasta su observación.
b. Observación y captura de imágenes.
La observación se realizó en un microscopio invertido motorizado y automatizado acoplado

a una unidad de barrido láser con sistema de detección espectral y sistema AOBS (Acousto-
Optical Beam Splinter) que permitió de forma simultánea gestionar 8 líneas de excitación
en un rango de espectral de 350 a 800 nm sobre la muestra en una frecuencia de 2800 líneas
por segundo y adquirir 5 canales de confocal (fluorescencia); esto permitió ubicar el
intervalo de excitación-emisión de las sustancias fluorescentes de interés (pigmentos). El
primer intervalo de excitación fue de λ=400 a 450 nm y el segundo fue de λ= 650 a 750
nm, estos intervalos fueron posteriormente configurados como longitud de onda
predeterminada por el operador.
La observación de la emisión se centró en células disgregadas y micro-agregados que

presentaron autoflorescencia verde en un intervalo de emisión de λ=425 a 440 nm y
autoflorescencia roja en λ= 680-720 nm; posteriormente, con la herramienta de seguimiento
de movimiento y co-localización se realizaron cortes de acuerdo al grosor que marcaba el
software que gobierna la operación del confocal, esto con el fin de obtener diferentes
imágenes de autofluorescencia de plastídios. Posteriormente, las imágenes se almacenaron
digitalmente en el disco duro de la computadora y finalmente, se realizaron empalmes de
las imágenes para detectar las estructuras que presentaban los dos tipos de autoflorescencia
(vista en la imágen como áreas amarillas) y discernir de las zonas que mostraban una
fluorescencia absoluta en verde ó rojo.
5.3.4. Tratamiento digital de imágenes y medición de los descriptores

morfométricos.
Las imágenes de los plastidios fueron tratadas a través de la herramienta “enfoque de paso
alto” del programa Corel Paint Shop. Primeramente se realizó una pre-segmentación que
34
consistió en el ajuste del brillo (-25), contraste (25) y la intensidad (17). A las imágenes
pre-segmentadas se les extrajo la figura del plástidio de interés a través de la herramienta
“selección a mano alzada” del programa Corel Draw Essential; los objetos segmentados
(plastídios) y la barra de escala de cada imagen fueron trasladados a una nueva imagen con
fondo blanco, de dimensiones ajustadas al tamaño de los plastídios y con una resolución de
300 ppp, en formato *.tiff. Estas imágenes fueron binarizadas a través de la herramienta
“thresholder” del software Image J .
Con el software de análisis de imágenes Sigma Scan Pro se realizó la medición de los
siguientes descriptores morfométricos:
a) Área (A): es la medición de 2 planos dimensionales limitados; calculados a partir de

pixeles previamente calibrados, en una región u objeto. Por lo que la formula es
A=πr2.
b) Perímetro (P): es la medición de la distancia formada por los pixeles que delimitan
el contorno de la figura. El algoritmo se define como P= πD.
c) Diámetro de Feret (Dfer): corresponde al diámetro teórico de mayor longitud (Dfer

= Lmax), si la figura fuera un círculo, es decir un diámetro equivalente.
d) Factor de Forma (FF): Esta dado por la relación FF=4πA/P2 que es la medida que
corresponde al grado en que un objeto tiene forma circular, para valores cercanos a
1, la forma tiende a ser circular y conforme el valor del factor de forma tiende a 0, la
forma del objeto medido se vuelve alargada y plana.
e) Factor de compactación (Fcomp): se define como el P2/A donde A, es el área y P, el

perímetro promedio, por lo que en un circulo formado por píxeles el Fcomp será 4
veces π, es decir aproximadamente 12.57; este factor es un descriptor de la
“sinuosidad” o “tortuosidad” del perímetro y de que tan irregular es un objeto.
Cabe destacar que se realizó la calibración del programa con una imagen de referencia
conocida, tomada bajo las mismas condiciones de la imagen analizada (barra de escala).
Esto se debió a que las imágenes fueron tomadas en diferentes escalas de observación.
35
5.3.5. Detección de carotenoides en callos de T. erecta L. mediante

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
a. Extracción de pigmentos.
Los callos provenientes de tres frascos se colocaron en un mortero al que previamente se

habían adicionado 10 g de polvo de diatomeas y 3 ml de acetona; posteriormente, se
procedió a la maceración de la mezcla, hasta que no se observaran fragmentos de los callos,
esta operación se repitió 3 veces para asegurar la mayor extracción de pigmentos.
La mezcla se vertió a un filtro de porcelana recubierto con un disco de papel filtro

(Whatman No. 5) colocado en un matraz Kitazato y acoplado a una bomba de vacío. La
fase líquida se recuperó y se vertió a un embudo de separación en el que se agregaron 4 ml
de éter de petróleo y agua destilada. La mezcla se agitó manualmente durante 3 -4 minutos,
se cubrió con papel aluminio para evitar la oxidación de los pigmentos y se dejó reposar
durante 2 minutos.
A continuación, se separaron las dos fases, una acuosa y la fase del disolvente orgánico; se
adicionó una mayor cantidad de agua destilada y se retiró la fase acuosa de tal forma que no
quedasen residuos de acetona. La fase del disolvente orgánico se recuperó en un vaso de
precipitado y se le agregó un 1g de sulfato de sodio anhidro para deshidratarla,
posteriormente se retiró el sulfato de sodio que se precipito en fondo del vaso; la
oleorresina se envasó en tubos de cristal ámbar a -10°C. Antes de que fueran analizadas las
muestras fueron saturadas con nitrógeno, durante 30 minutos aproximadamente.
b. Obtención de los perfiles de luteína de T. erecta L. por HPLC.
La detección de los pigmentos contenidos en la oleorresina se realizó en un cromatógrafo

de líquidos, de acuerdo a la metodología de Rodríguez-Amaya (1999). El sistema estaba
conformado por una bomba binaria LC 250 y detector UV/VIS (intervalo de 360 a 800 nm).
La fase estacionaria consistió en una columna (fase reversa) marca SUPELCOSILTM C30 (5
36
mm, 250 × 4.6mm; Wilmington, USA) se operó de manera isocrática, utilizándose como
fase móvil, dos mezclas de disolventes constituidos por:
⇒ Disolvente A: Acetato de Etilo (100%)
⇒ Disolvente B: Acetonitrilo: Metanol: (9:1 v/v) TRIS-HCL pH 8.0 0.1 M
La elusión se realizó con una mezcla de 20% del disolvente A y 80% del disolvente B,
teniendo un tiempo total de análisis de 70 minutos; el flujo fue constante (1.0 mL/min)
inyectándose 50 µl de muestra. Se utilizó como estándar trans-luteína (Sigma-Aldrich Cat.
95507), detectándose a una longitud de onda de 423 nm. La cantidad relativa de pigmento
se estimó con base en la altura del pico, medida en mV en el cromatograma obtenido por el
equipo.
37
Resultados
6. RESULTADOS
6.1. Composición celular de los callos de Tagetes erecta L.
Las observaciones al microscopio óptico de los callos de Tagetes erecta L. permitieron

establecer la composición celular de los agregados; de tal manera que fue posible clasificar
a las células en dos grupos: las células viables (Cv), fueron aquellas en las que se
observaron núcleo, nucleolo, vacuola, citoplasma, paredes celulares primarias y
secundarias; y las células no viables (Cnv), que se caracterizaron por presentar paredes
celulares y sin contenido. La Figura 8 muestra la micrografía óptica de un agregado celular
de Tagetes erecta L. a ocho horas de la siembra.
A) B)
Va
Nl
Nu
Cv Pc
Ei
Va
Cnv
100 μm 10 μm
Figura 8. Micrografía óptica de un agregado celular de Tagetes erecta L. a ocho horas de la

siembra: A) Estructura de células con aspecto parenquimático compuesto de células viables (Cv) y
no viables (Cnv) con espacios intersticiales (Ei); B) Detalle de célula viable en la que se observa la
vacuola (Va), núcleo (Nu), nucleolo (Nl) y pared celular (Pc).
Los agregados se caracterizaron por constituir masas celulares irregulares conformadas por
células viables y no viables, ambas formaban estructuras parecidas a tejidos
38
Resultados
parenquimáticos de almacenamiento, además se observaron espacios intersticiales (Figura

8A); estos espacios se relacionan a la característica de friabilidad de los agregados celulares
y su función es la de favorecer el transporte apoplástico de nutrientes (Buchanan et al.
2000). Las células viables midieron aproximadamente 50 µm, presentaron un núcleo
pequeño y se observaron de 3 a 4 vacuolas cuyo tamaño abarco la mayor parte del área
celular (Figura 8B), esta particularidad es resultado de la acumulación de agua y
metabolitos secundarios (Bidwell, 1979), el citoplasma se limita junto a la membrana
celular. Además se observó el engrosamiento de la pared celular.
Los callos de 7 días de resiembra, se caracterizaron por la abundancia de células no viables,

y pocas células viables, ambas formaban una estructura parecida a la de un haz vascular
(Figura 9A). La mayor cantidad de células no viables durante este tiempo de resiembra,
puede deberse a que estas células son colocadas en un nuevo medio de cultivo, por lo que el
estrés mecánico y fisiológico durante la manipulación y traslado a su nuevo ambiente
probablemente las condujo a la muerte.
A) B)
Cnv
Pcs
Va
Cv
Cl
100 μm 10 μm
Figura 9. Micrografías ópticas de un agregado celular de Tagetes erecta L. a siete días después de
la siembra: A) Células viables y no viables conformando una estructura parecida a un haz vascular,
B) Células viables en oscuro (Cv) de aproximadamente 30 µm longitud y mostraron pared celular
secundaria (Pcs), vacuola (Va) y citoplasma (Cl).
39
Resultados
Las células viables tuvieron un tamaño aproximado de 30 µm, se observó que el citoplasma
se encontraba desplazado a la periferia celular por la vacuola; el citoplasma se hizo
evidente por su reacción con el azul de toluidina. Además, se observó la pared celular
secundaria como un engrosamiento de la línea que delimita a la célula, esto respecto al
anterior tiempo de crecimiento (Figura 9B).
Los agregados celulares de 14 días de resiembra (Figura 10) estuvieron conformados

aproximadamente por una proporción similar de células viables y no viables, estas últimas
se caracterizaron por estar vacías, es decir sin núcleo, citoplasma, ni vacuolas y se
mantenían unidas en forma de estructuras redondas.
A) Pcp B)
Cv
Cnv
Nu Va
Nl
100 μm Cl
10 μm
Figura 10. Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. a catorce días después
de la siembra: A) Agregados de células no viables (Cnv) y viables (Cv) estas ultimas median aprox.
30 µm B) Célula mostrando el núcleo (Nu), nucleolo (Nl), pared celular primaria (Pcp), citoplasma
(Cl) y vacuolas (Va).
Las células viables se observaron unidas, formando una estructura similar

(geométricamente autosimilar) a un microagregado, el cual pudiera repetirse hasta formar
un callo, probablemente se trata de la forma básica de crecimiento de un callo de Tagetes
erecta L. in vitro (Figura 10A), la aparición de espacios insterticiales puede estar
40
Resultados
relacionado con el aumento de friabilidad del callo. En un mayor aumento en el

microscopio, se observaron células viables que median aproximadamente 30 µm, una de las
células de este grupo presentó de 2 a 3 vacuolas, núcleo con su respectivo nucleolo,
abundante citoplasma y pared celular primaria (Figura 10B).
En los agregados de 21 días (Figura 11) se observó una organización compuesta de células
viables y pocas células no viables, las células viables presentaron una disposición laminar,
desorganizada.
A) Cc B)
Pc
Nu
Va
Nl
100 μm Co 10 μm
Figura 11. Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. a veintiún días después
de la siembra: A) Organización de células viables se presentaron en dos tipos de células, unas
menos oscurecidas (Co) y otras más contrastadas (Cc); B) Célula de aspecto parenquimatoso con
vacuolas grande (Va), pared celular (Pc), núcleo (Nu) y nucleolo (Nl).
Estos agregados mostraron la organización de un tejido diferenciado, en donde los callos

se caracterizaron por presentar una orientación del crecimiento vegetal axial (expansión) y
radial (extensión). El grupo de células viables estaba formado por dos tipos de células, que
se evidenció porque unas se ven menos oscurecidas, mientras que las cercanas al borde del
agregado se muestran más contrastadas con el azul de toluidina (Figura 11A). El grupo de
células menos contrastadas, se asemejó a células de tipo parenquimático de
41
Resultados
almacenamiento (Pa), el segundo tipo de células eran de apariencia similar a la de un

parénquima meristemal (Pm) (Figura 11B). El acercamiento se realizó en la células menos
contrastadas, las células midieron aproximadamente 50 µm y se caracterizaron por contener
una vacuola grande, núcleo con su respectivo nucleolo, citoplasma junto a la membrana
celular y pared celular primaria (Figura 11B).
Finalmente, los agregados celulares correspondientes a los 28 días de resiembra (Figura

12), se caracterizaron por presentar una estructura celular parecida a un tejido
parenquimático de almacenamiento, distribuido de forma irregular. En esta etapa se
encontraron agregados celulares formados de 8 a 10 células, midieron entre 100 y 120 µm,
que se desprendían de una masa celular más aglutinada; además, se observaron, en una
menor proporción, células turgentes conteniendo varias vacuolas (Figura 12A); no se
observaron espacios intersticiales, por lo que es probable que la aglutinación de los
agregados haya disminuido su friabilidad.
A) Cl B)
Nu
Va
Va
Cm
Pc
Nl
Va
100 μm 10 μm
Figura 12. Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. de veintiocho días
después de la siembra: A) Agregados celulares compactos (línea punteada), células maduras (Cm);
B) Célula madura de aproximadamente 80 µm en la cual se puede distinguir claramente el núcleo
(Nu) y nucleolo (Nl), citoplasma (Cl), con varias vacuolas (Va) y pared celular (Pc).
42
Resultados
En un mayor aumento, se observaron células cuyo tamaño se encontraba entre los 50 y 60

µm aproximadamente, se observó el núcleo y nucleolo bien desarrollados, con varias
vacuolas; estas células presentaron engrosamiento de la pared celular (Figura 12B).
6.2. Descripción morfológica de la ultraestructura y de la transformación

plastídica de Tagetes erecta L. durante los diferentes tiempos de resiembra.
A través de la microscopía electrónica de transmisión, las células de Tagetes erecta L. se

observaron bien conservadas y sin daños estructurales, por lo que en las imágenes
correspondientes a cada tiempo de resiembra se lograron identificar los siguientes
organelos celulares: núcleo, nucleolo, mitocondrias, retículo endoplásmico, pared celular y
los plastídios. Estos organelos presentaron formas y tamaños variados, así como diferentes
estructuras internas, en diversos arreglos al interior del plastídio.
En las micrografías electrónicas de los plastídios, se observaron consistentemente las

siguientes estructuras: sistema endomembranal, estroma, lamela con y sin arreglo granal ó
difusas, sugiriendo que éstos son componentes estructurales fundamentales en los
plastídios. Mientras, que la presencia de plastoglóbulos, granos de almidón o arreglos
particulares de las membranas para formar granas (tilacoides), estarían evidenciando la
diferenciación de un plastídio; lo que explica que no en todos los tiempos de muestreo fuera
posible la observar tales estructuras.
Las células correspondientes a las ocho horas de resiembra (Figura 13) mostraron en la
mayoría de los casos, secciones de retículo endoplásmico ribosomal, vacuola, mitocondrias
y membrana celular asociada a la pared celular. Los plastídios se encontraron generalmente
rodeados de mitocondrias y situados en la periferia celular, el grado de diferenciación del
plastídio correspondió al de un cromoplasto maduro de forma alargada, rodeado por una
doble membrana, estroma de tipo uniforme, lamelas difusas o electrodensas e
invaginaciones de la membrana plastídica (Figura 13A).
43
Resultados
A) Iv B)
Rer
M
Ld
Pg
Pg
Ld
500 nm 100 nm
Figura 13. Cromoplasto maduro en célula de Tagetes erecta L. a ocho horas después de la siembra
in vitro. Mitocondria (M), retículo endoplásmico rugoso (Rer), plastoglóbulos (Pg), lamela difusa
(Ld), invaginaciones (Iv) (X 60000); Detalle de plastoglóbulo (Pg), rodeado por lamelas difusas
(Ld) (X 200 000).
La madurez del cromoplasto se caracterizó por la presencia de pequeños glóbulos

osmiófilos (plastoglóbulos) dispersos en el estroma (Figura 13B). La presencia de
plastoglóbulos fue constante en la mayor parte de las observaciones correspondientes a las
ocho horas de resiembra. Por lo que, la reacción osmiófila observada en las micrografías
como zonas oscuras o de mayor electrodensidad al paso del haz de electrones del
microscopio electrónico de transmisión, no se debió únicamente a la reacción del osmio con
los carotenoides, sino con todas aquellas sustancias cuya naturaleza química sea lipídica.
44
Resultados
Esta característica sugiere que los plastoglóbulos pudiesen tener una composición en la que
probablemente están presentes compuestos de la ruta de biosíntesis de carotenos
(carotenoides y xantofilas).
En células con siete días de resiembra se observó citoplasma granular, membrana celular
asociada a la pared celular y pequeños plastídios. La micrografía electrónica de la figura 14
corresponde a un cloroplasto en etapa juvenil de forma alargada por los extremos,
produciendo un adelgazamiento en la mitad. Este plastídio se caracterizó por estar rodeado
por una doble membrana plastídica, estroma uniforme, invaginaciones de la membrana
plastídica y resalta la existencia de lamelas primarias electrodensas generalmente en
número de tres (Figura 14A).
A) B)
Pcs
Pg
Ld
Ti
Va
500 nm 500 nm
Figura 14. Cloroplastos juveniles de células de Tagetes erecta L. a siete días después de la siembra
in vitro. A) Plastídio de forma alargada por los extremos, con arreglo trilamelar difuso (Ld) (X 60
000); B) Plastídio con lamelas formando el arreglo tilacoidal primario (Ti) y plastoglóbulo (Pg), se
observa una parte de la vacuola (Va) y pared celular secundaria (Pcs) (X 50 000).
45
Resultados
Algunos cloroplastos juveniles de forma globosa presentaron dos lamelas menos

electrodensas y plastoglóbulos de tonalidad clara (Figura 14B). Las lamelas parecen estar
apiladas sugiriendo el inicio de la formación del arreglo tilacoidal primario (Kirk y Tilney-
Bassett, 1967). Las lamelas situadas en la periferia del plastídio comienzan a apilarse y
posteriormente migran hacia el centro del estroma, este tipo de plástidos se situó cercano a
la membrana plastídica.
En células de catorce días después de la siembra (Figura 15) se observaron plastídios

diferenciados en cloroplastos de forma ovoide - lentiforme. El cloroplasto se encuentra
rodeado por una doble membrana, en la cual se observaron varias invaginaciones, así como
lamelas periféricas que se extienden hacia el centro del estroma.
A) B)
Pg
Pg Cl
Ti
Pcp
500 nm 500 nm
Figura 15. Cloroplastos maduros en células de Tagetes erecta L. a catorce días después de la
siembra in vitro. A) Cloroplastos cercanos a la pared celular primaria (Pcp), en los que se observan
arreglos tilacoidales (Ti) y plastoglóbulo (Pg) (X 150 000); C) Cloroplasto ovoide (Cl) y
mitocondria (M), en el plastídio se observan plastoglóbulos (Pg) (X 150 000).
46
Resultados
En el centro del estroma se encuentra un sistema de membranas lamelares con un

característico arreglo tilacoidal secundario (sacos trilamelares apilados) (Figura 15A). Esta
forma ha sido descrita por algunos autores como grana (Kirk y Tilney-Bassett, 1967), es
decir la apilación de 2 a 100 tilacoides, lo que indica la madurez de una estructura
fotosintética. Adicionalmente, se observó la presencia de plastoglóbulos en diferentes
intensidades de gris, lo que denota la probable presencia de carotenos y otros compuestos
accesorios para la fotosíntesis. A tales compuestos se les atribuye propiedades
antioxidantes, que estarían aminorando la desnaturalización de los complejos triplete de la
clorofila, evitando así el daño foto-oxidativo (Ubaldo-Suárez, 2007).
Además, se observaron cloroplastos de forma globosa-ovoide, con ramificaciones

membranales tilacoidales, presentando mayor electrodensidad respecto al estroma. Se
observó una mayor presencia de glóbulos osmiófilos, dispersos en el estroma y entre los
tilacoides, a mayores aumentos se observó que los plastoglóbulos no estaban rodeados por
membranas, se encontraban suspendidos en el estroma y separados de las lamelas. Algunos
cloroplastos de tipo ovoides se encontraban rodeados por mitocondrias y desplazados a la
periferia celular (Figura 15B).
En las células con veintiún días de resiembra (Figura 16) se observaron abundantes
plastídios dispersos en un citoplasma uniforme y rodeado de mitocondrias, situados
generalmente cerca de la membrana celular, junto a la pared celular, estos plastídios se
encontraron diferenciados en amiloplastos, debido a la presencia de almidón en forma
polimerizada (grano). Este grano de almidón se observó como una forma circular o elíptica
de menor electrodensidad y con un característico borde opaco (anillo de crecimiento) y una
zona de transición de color blanco que está en contacto con el estroma (zona hidratada)
(Figura 16A).
En la micrografía electrónica de la Figura 16B se muestra un amiloplasto de forma redonda

debido al grano de almidón. El amiloplasto se encuentra rodeado por una doble membrana,
el estroma es de tipo uniforme y contiene algunas lamelas electrodensas rodeando al grano
47
Resultados
de almidón, probablemente se trató de un arreglo lamelar secundario, así como

plastoglóbulos menos electrodensos respecto a los hallados en un cromoplasto.
A) B)
Ga
Gam Ld
Ac
M Ga
M Gaj
Zh
500 nm 500 nm
Figura 16. Amiloplastos de células de Tagetes erecta L. a veintiún días después de la siembra in
vitro. A) Mitocondrias (M) y amiloplastos con grano de almidón (Ga) amiloplasto maduro de
almacenamiento (Gam) y juvenil (Gaj) (X 50 000); B) Grano de almidón (Ga) anillo crecimiento
(Ac), zona hidratada (Zh), lamelas difusas (Ld) alrededor del granulo (X 75 000).
En las células de veintiocho días de resiembra (Figura 17), se observó citoplasma uniforme
con algunos ribosomas dispersos, secciones de retículo endoplásmico liso, mitocondrias,
vacuolas, membrana celular, pared celular secundaria y plastídios de formas diversas. Los
plastídios se caracterizaron por ser de forma ameboidal alargada (Figura 17A), rodeados de
una doble membrana, presentaban estroma de tipo uniforme e invaginaciones periféricas
orientadas al centro del estroma, las lamelas mostraron un arreglo apilado en número de
tres, esta disposición es parecida al arreglo tilacoidal primario (Kirk y Tilney-Bassett,
1967), además se observaron plastoglóbulos, esto indica la diferenciación del plastídio en
cromoplastos. El cromoplasto de la figura 17B es de forma ameboide, con grana difuso
electrodenso y plastoglóbulos inmersos en el estroma, el cual es de tipo uniforme, los
plastoglóbulos se caracterizaron por ser menos electrodensos respecto a los observados en
anteriores tiempos de resiembra.
48
Resultados
Rel B)
A)
Va
Iv
Pg
Ld
Gd
Pc M
500 nm 500 nm
Figura 17. Cromoplastos juveniles de forma ameboide en células de Tagetes erecta L. a veintiocho
días después de la siembra in vitro. A) Secciones de retículo endoplásmico liso (Rel), pared celular
(Pc), el plastídio presenta grana difuso (Gd) (X 50 000); B) Mitocondria (M), vacuola (Va),
lamelas difusas apiladas (Ld) e invaginaciones (Iv) plastoglóbulo (Pg) (X 60 000).
Las lamelas se encontraron apiladas sugiriendo un arreglo tilacoidal primario e

invaginaciones de la membrana plastídica, algunos plastídios se encontraron rodeados de
mitocondrias y presentaron adelgazamiento de un extremo, formando una constricción. En
algunos cromoplastos juveniles se observaron plastoglóbulos de forma elíptica, en
diferentes tonos de grises y distribuidos en el centro del estroma entre lamelas difusas ó en
algunos casos en la periferia del cromoplasto.
6.3. Cortes y autofluorescencia mediante MCBL de células de Tagetes erecta L.

cultivadas in vitro.
Las observaciones de células de Tagetes erecta L. en el microscopio confocal de barrido

láser (MCBL) evidenciaron la autofluorescencia verde (producida por pigmentos
carotenoides) y roja (pigmentos clorofílicos) en distintas o en la mismas estructuras
celulares. La Figura 18 muestra una serie de micrografías ópticas y de fluorescencia
49
Resultados
correspondientes a células de Tagetes erecta L. a ocho horas de la siembra. La imagen en

contraste de fases (Figura 18A) permitió identificar grupos de 3 a 5 células de un diámetro
aproximado de 30 μm e identificar en algunas de ellas el núcleo, nucleolo, pared celular,
vacuola y organelos hialinos (probablemente plastídios). En la imagen en fluorescencia
verde (Figura 18B), indica la presencia de estructuras plastídicas que contienen más de un
pigmento excitable entre 425 (mínima) y 440 nm (máxima), lo que sugiere la presencia de
estructuras almacenadoras de carotenoides y xantofilas.
A) B)
Va
Pigmento
Pc excitable
25 μm Nu Nl 25 μm
C) D)
Delineado
en rojo Crm
25 μm 25 μm
Figura 18. Micrografías de células de Tagetes erecta L. a |ocho horas de la siembra. A) Imagen en contraste de fases,
en la que se distingue el núcleo (Nu), nucleolo (Nl), vacuola (Va) y pared celular (Pc). B) Imagen de
autofluorescencia verde donde se observan organelos almacenadores de pigmentos. C) Imagen de autofluorescencia
roja en la que sólo se observa ruido de fondo. D) Empalme de las tres imágenes anteriores, los plastídios hialinos son
los mismos que autofluorescen, por lo que se trata de cromoplastos maduros (Crm).
50
Resultados
Mientras que la imagen de la Figura 18C, corresponde a la iluminación en el intervalo de

emisión de λ= 650 a 750 (longitud de onda correspondiente al rojo) en esta imagen no se
observaron estructuras autofluorescentes, sólo se percibió un delineado de color rojo que
podría deberse a ruido de fondo atribuible a la saturación en el detector de emisiones
provenientes de la muestra. Por último, en la imagen del empalme (Figura 18D) se observa
la abundancia de las estructuras autoflorescentes verdes, sobrepuestas en los organelos que
en el contraste de fases se observaron como hialinos, lo que sugiere que tales estructuras
corresponderían a cromoplastos maduros almacenadores de pigmentos carotenoides.
Las micrografías de la Figura 19 corresponden a una célula de Tagetes erecta L. de 8 horas

de resiembra. Está célula fue cortada mediante el sistema confocal en 14 imágenes de 2.14
µm c/u, se muestran 7 pares de imágenes (contraste de fases con fluorescencia y
fluorescencia). La Figura 19A corresponden al empalme de la imagen en contraste de fases
e imágenes de autofluorescencia en esta se observa el casquete de la célula y una estructura
fluorescente cuyo contenido podría tratarse de pigmentos carotenoides (Figura 19A1). Esta
presentó una vacuola grande, citoplasma en el cual se observaron plastídios, los que
probablemente se traten de cromoplastos, la abundancia de estos cromoplastos incrementa
conforme se profundiza el corte (Figura 19B1) y éstos se sitúan en el citoplasma junto a la
membrana plasmática (Figura 19B).
En la figura 19C, se observan cromoplastos maduros, la forma de estas estructuras es

redonda y se observa en mejor detalle en la imagen de fluorescencia verde (Figura 19C1);
en la figura 19D se observa un grupo de plastídios de diferentes tamaños, que
corresponderían a cromoplastos juveniles y cromoplastos maduros, ambos presentan una
intensa luminosidad (Figura 19D1), probablemente debida a la cantidad de carotenoides. El
núcleo, nucleolo, vacuola, citoplasma, cromoplastos de forma alargadas (ovoides) y
redondas se observa en la figura 19D, la forma ovoide se aprecia con mayor detalle en la
imagen de fluorescencia (Figura19E1). En las imágenes de la Figura 19F1 es posible
observar la distribución de los cromoplastos, la cual se mantiene en la periferia del
citoplasma.
51
Resultados
A) A1) B) Mc
Pigmento Va
carotenoide
Cr
10 μm Pc 10 μm 10 μm Ct
B1) Grupo de C) C1)

cromoplastos
Cromoplasto
Va maduro
Forma redonda
Pc
10 μm 10 μm 10 μm
D) D1) E)
Va
Ct
Grupo de Crj Nu
plastídios Crm
Crm
Pc Nl
10 μm 10 μm 10 μm
E1) F) F1)
Va Cromoplasto
Nu redondos
Forma
ovoide
Nu
10 μm 10 μm Ct 10 μm
Figura 19. Micrografías de cortes mediante MCBL de una célula de Tagetes erecta L. a ocho horas de la siembra.
A- F) Empalmes de contraste de fases e imágenes de fluorescencia se observa, núcleo (Nu), nucleolo (Nl), vacuola (Va),
pared celular (Pc), citoplasma (Ct), cromoplastos juveniles (Cr) y cromoplastos maduros (Crm); A1-F1) Imagen de
fluorescencia verde, se observan en detalle la abundancia, distribución y forma de los cromoplastos; no se observó
autofluorescencia roja.
52
Resultados
A) A1) A2)
Nu Pigmento Pigmento
Va carotenoide clorofílico
Nl
10 μm Pc 10 μm 10 μm
B) B1) baja B2) alta

concentración concentración
Va Cl-j
10 μm 10 μm 10 μm
Alrededor
C) Cloroplastos C1) Alrededor C2) del núcleo
asilados del núcleo
Va
10 μm 10 μm 10 μm
D) D1) D2)
Cl-j
Va Cl-j Cl-j
Nl
10 μm 10 μm 10 μm
E) Nu E1) E2)
Va
Nl
10 μm 10 μm 10 μm
Figura 20. Cortes mediante MCBL de una célula de Tagetes erecta L. a siete días de resiembra. A-E) Empalmes de
contraste de fases e imágenes de fluorescencia, se observa: núcleo (Nu), nucleolo (Nl), vacuola (Va), pared celular (Pc)
y cloroplastos juveniles (Cl-j); A1-E1) Autofluorescencia verde debido a carotenoides, cloroplastos juveniles (Cl-j);
A2-A2) Autofluorescencia roja debido a clorofila, cloroplastos juveniles (Cl-j).
53
Resultados
El corte de la figura 19 corresponde a la región ecuatorial, el área del citoplasma

incrementa así como la abundancia de cromoplastos; además, en algunas imágenes se
observan cambios en la forma, al pasar de formas alargadas (ovoides) a más redondos
(Figura 19F1).
La serie de micrografías de la Figura 20 corresponden a una célula de Tagetes erecta L. de

7 días de resiembra. Está célula fue cortada en 10 imágenes de 2.85 µm c/una (sólo se
muestran 15 imágenes) mediante el sistema confocal. Se caracterizaron por presentar
autofluorescencia, tanto para los pigmentos clorofílicos, como para los carotenoides y
xantofilas en el mismo plastídio. Las imágenes correspondientes al empalme de las
fluorescencia con el contraste de fases (Figura 20A a 20E) muestran una secuencia de
cortes que inicia en un casquete y termina en la parte ecuatorial de la célula, por lo que se
presume que ésta era de forma alargada, además se observó el citoplasma, núcleo, nucleolo,
vacuola y plastídios que rodean al núcleo; éstos probablemente son cloroplastos juveniles
debido a que presentan ambos tipos de pigmentos autofluorescentes (Figura 20A1 a 20E1).
Los planos de autofluorescencia verde (carotenoides y xantofilas) y rojo (clorofila) se
observaron casi en una misma área, pero los puntos de mayor intensidad de color se
encontraron desfasados, lo que sugiere que se trata de estructuras u organelos comunes
conteniendo tales pigmentos, aunque probablemente en diferentes cantidades (Figura 20B1
y 20B2).
Se observó un incremento de la abundancia de los cromoplastos juveniles conforme se

profundiza en los cortes y hasta llegar al otro extremo de la célula. Las imágenes
correspondientes a la autofluorescencia roja muestran puntos específicos de luminiscencia
que coinciden (Figura 20A2 a 20E2), con las imágenes de autoflorescencia verde; además,
la distribución de estos plastídios se mantiene en todos los cortes, así como la abundancia,
sugiriendo que se trata de un mismo plastídio, en el que probablemente se esté presentando
la biosíntesis de los dos tipos de pigmentos. Finalmente, se observa un decaimiento de la
fluorescencia en las imágenes de la Figura 20E1 a 20E2.
54
Resultados
Los células de catorce días de resiembra (Figura 21) se observaron formando

microagregados compactos, conformados en promedio, por 15 células de 30 a 40 μm de
diámetro estructurándose de forma similar (geométricamente autosimilar) a un agregado de
mayor tamaño. Las células observadas se situaron en la periferia del microagregado, en una
de ellas se logró identificar varios organelos. En la imagen de contraste de fases (Figura
21A), se observa el núcleo, nucleolo, vacuola y citoplasma, en el que se distinguen
organelos oscuros que probablemente sean plastídios conteniendo pigmentos.
A) B)
Nu Pigmento
Nl
carotenoide
Va
Cl
Ct
10 μm 10 μm
C) D)
Pigmento
clorofílico Cl-
10 μm 10 μm
Figura 21. Micrografías de células de Tagetes erecta L. a catorce días de resiembra. A) Imagen en
contraste de fases, en la que se distingue el núcleo (Nu), nucleolo (Nl), vacuola (Va), citoplasma (Ct) y
cloroplastos (Cl). B) Imagen de autofluorescencia verde correspondiente a pigmentos carotenoides.
C) Imagen de autofluorescencia roja correspondiente a pigmentos clorofílicos. D) Empalme de las tres
imágenes anteriores, los plastídios oscuros son los que autofluorescen, por lo que se trata de cloroplastos
maduros (Clm).
55
Resultados
La imagen correspondiente a la autofluorescencia verde indica la presencia de plastídios,

que contienen pigmentos foto-excitables correspondientes a la longitud de onda de las
xantofilas y carotenoides, la imagen demuestra que se encuentran distribuidos en la
periferia de la célula y la luminosidad esta limitada a zonas puntales (Figura 21B), por lo
que no se trataría de estructuras especializadas en la biosíntesis y almacenamiento de
carotenoides, sino que su presencia refleja su importancia como pigmentos accesorios, que
permitirían llevar a cabo la fotosíntesis.
La imagen de autofluorescencia roja muestra estructuras en una alta luminiscencia roja, de

formas redondas y situadas en la periferia de las células, estas estructuras podrían tratarse
de cloroplastos debido a la abundancia de pigmento de tipo clorofila (Figura 21C). En la
imagen superpuesta (Figura 21D) se observó que las áreas de autofluorescencia verde y
autofluorescencia roja se empalman (zonas de color naranja), pudiéndose tratar de la misma
estructura plastídica conteniendo pigmentos clorofílicos en mayor abundancia y
carotenoides en menor abundancia; de acuerdo a las observaciones de la ultraestructura,
este plastídio pudiese tratarse de un cloroplasto maduro que presenta un aparato
fotosintético desarrollado y pigmentos accesorios que complementan la captación de luz.
Las micrografías de la Figura 22 corresponden a una célula de Tagetes erecta L. de veintiún

días de resiembra. Está célula fue cortada mediante el sistema confocal en 11 imágenes de
2.7 µm c/u (sólo se muestran 3 series de imágenes). La Figura 22A corresponde al empalme
de la imagen en contraste de fases e imágenes de autofluorescencia; en estás se observa una
secuencia que inicia desde un casquete hasta la parte ecuatorial de la célula, por lo que, se
presume que está era de forma semi-esférica, observándose citoplasma y organelos hialinos
que pudieran tratarse de un plastídio que no contenía pigmentos (amiloplastos). No se
detectó autofluorescencia verde y roja (Figura 22A1 y 22A2), por lo que se presume que la
biosíntesis de pigmentos se encontraba en una etapa, en la que sólo se estarían produciendo
carotenos incoloros tales como el fitoeno.
56
Resultados
A) Ct A1) A2)
Ap
10 μm 10 μm 10 μm
B)
Ct Ap B1) B2)
Va
10 μm 10 μm 10 μm
C) C1) C2)
Nu Nl
Ct
Ap
10 μm 10 μm 10 μm
Figura 22. Micrografías de células de Tagetes erecta L. a veintiún días de resiembra. A-C) Imagen
correspondiente al empalme de contraste de fases y fluorescencia, en la que se distingue el núcleo (Nu),
nucleolo (Nl), vacuola (Va), citoplasma (Ct) y amiloplastos (Ap); A1-C1) Imagen de autofluorescencia
verde (no se observó luminiscencia); A2-C2) Imagen de autofluorescencia roja (no se observó
luminiscencia).
En la imagen de contraste de fases (Figura 22B), se identifico la vacuola, los mismos

amiloplastos hialinos y otros organelos de apariencia más oscura, mismos que se
encuentran inmersos en el citoplasma; cabe destacar que en las imágenes de fluorescencia
verde y roja no se detecta ninguna emisión (Figura 22B1 y 22B2). El último plano (Figura
57
Resultados
22C) muestra el casquete inferior de la célula en el cual se vuelve a observar el citoplasma,

plastídios hialinos (amiloplastos), núcleo y nucleolo, pero en este corte se observan
organelos oscuros parecidos a los plastídios, mientras que las imágenes correspondientes a
la autofluorescencia verde y roja no se observa ninguna emisión (Figura 22C1 y 22C2).
Los agregados celulares de veintiocho días de resiembra tuvieron una alta disgregación,
pudiéndose observar células aisladas de 40 µm de diámetro de forma irregular. Las
micrografías de la Figura 23 corresponden a una célula de Tagetes erecta L. cortada
mediante el sistema confocal en 14 imágenes de 2.7 µm c/u (sólo se muestran 6 pares de
imágenes). La figura 23A corresponde al empalme de la imagen en contraste de fases e
imágenes de autofluorescencia, en está se observa el casquete de la célula, se identifica el
citoplasma y estructuras que autofluorescen (plastídios). En la imagen correspondiente a
autofluorescencia verde se observan seis plastídios de entre 1 y 2 μm de longitud de
apariencia elíptica (Figura 23A1), mientras que en la autofluorescencia roja no se observó
luminiscencia en ningún corte (imágenes no presentadas).
En la subsecuentes micrografías (Figuras 23B y 23C) se observaron estructuras plastídicas

similares, que se visualizaron en el empalme de imágenes. Se observa la aparición de la
vacuola y el citoplasma, este se ubica en la periferia de la célula, mientras que, en las
imágenes de autofluorescencia verde, los plastídios son abundantes y su distribución se
mantiene en la periferia de la célula (Figuras 23B1 y 23C1); además, la forma es mas
redonda. También se observaron las mismas estructuras autofluorescentes (Figuras 23D a
23F) que quizás se traten de cromoplastos de acuerdo a lo observado en la ultraestructura.
En estas imágenes se observa la vacuola, citoplasma y aparece el núcleo, nucleolo, además
se observan organelos oscuros que no son luminiscentes. En la imágen correspondiente a
autofluorescencia verde (Figuras 23D1 a 23F1) se observa la redistribución de los
cromoplastos, además éstos son más pequeños y tienen una forma alargada.
58
Resultados
A) A1) B) Cr
Pigmentos
Cr fluorescentes
Va
Ct
20 μm 20 μm 20 μm Ct
B1 C) Cr C1)
Cr
Formas
Va redondas
20 μm 20 μm Ct 20 μm
D) D1) E)
Cr Cr
Va Va
Cr
Nu
Nu
Ct
20 μm Nl 20 μm 20 μm Nl
E1) Forma F) F1)

alargada
Va
Nu
Nl
20 μm 20 μm Cr 20 μm
Figura 23. Cortes mediante MCBL de una célula de Tagetes erecta L. a veintiocho días de resiembra. A-E)
Empalmes de contraste de fases e imágenes de fluorescencia, se observa: núcleo (Nu), nucleolo (Nl),
vacuola (Va), citoplasma (Ct) y cromoplastos (Cr); A1-F1) Autofluorescencia verde debido a pigmentos
carotenoides, cromoplastos (Cr); No se observó autofluorescencia roja.
59
20 μm 20 μm
Resultados
En las micrografías de autofluorescencia roja no se observaron estructuras luminiscentes,

por lo que la fluorescencia (verde) esta dada únicamente por los pigmentos carotenoides y
xantofilas. Conforme a lo observado en las imágenes de ultraestructura, los cromoplastos
pudiesen encontrase morfológicamente en estados juveniles (alargados), por lo que la
MCBL permitió evidenciar formas maduras del cromoplasto (redondas).
6.4. Morfometría de los plastídios de Tagetes erecta L. mediante TDI
El tratamiento digital de las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de los

diferentes plastídios identificados en cada tiempo de resiembra permitió realizar las
mediciones de los siguientes descriptores: perímetro, área, factor de forma, factor de
compactación y diámetro de Feret en las propias imágenes digitales. Sin embargo, al no
existir una metodología estandarizada para llevar a cabo la medición en micrografías
electrónicas, se realizó el tratamiento y la recalibración de los programas para cada imagen;
esto permitió reducir los errores por el cambio de la magnificación de cada imagen.
Además, cabe señalar que los cortes ultrafinos se localizaron en un intervalo de 50 a 60 nm
de espesor, por lo que las imágenes se refieren exclusivamente a un segmento de los
plastídios. Los resultados del perímetro y del área se muestran en la Figura 24.
Referente al perímetro, de manera general se observó que el valor experimental de este

descriptor era mayor al perímetro teórico, considerando que los plastídios fueran objetos
geométricos perfectos; así por ejemplo, cuando el área tenía un valor de 0.533 µm2, el
perímetro teórico posible debería ser de 2.57 µm, siendo que el perímetro experimental fue
de 3.90 µm; para este valor el área equivaldría a 1.21 µm2, es decir, más del doble del área
experimental; esta particularidad indica que se trata de perímetros cuya longitud es mucho
mayor al área que deberían abarcar por lo que son un referente de contornos “sinuosos” o
“tortuosos”.
El perímetro experimental de los plastídios de células de ocho horas de crecimiento fue de

3.906 µm promedio ± 0.291 de desviación estándar, lo que se observó en las micrografías,
fueron estructuras de forma alargada, por lo que un cromoplasto debe tener un perímetro
60
Resultados
mayor, respecto al área (Figura 24). A los siete días se observó una disminución de 0.463
µm de perímetro, respecto al anterior intervalo de recrecimiento, esto se debe a que
probablemente se trata de plastídios “juveniles” provenientes de las plastídios “maduros”
que lograron sobrevivir al estrés producido por la resiembra; estos plastídios en las
micrografias presentaron la forma alargada, pero de menor tamaño, es decir la relación del
perímetro es mayor respecto al área que presenta (Figura 24). Los plastídios de células de
catorce días de resiembra, median un perímetro promedio de 4.66 µm ± 0.269 de
desviación estándar, por lo que éstos estarían correspondiendo a estructuras cloroplásticas
de bordes extensos y formas redondas-elípticas; quizás esta sea la causa del incremento del
tamaño en el perímetro.
5 1
4 0.8
Perímetro µm
3 0.6
Área µm 2
2 0.4
1 0.2
0 0
0.3 7 14 21 28
Tiempo de resiembra (días)
Figura 24. Cambios en el perímetro () y área () de los plastídios de Tagetes erecta L. a
diferentes días de recrecimiento (promedio de 64 mediciones ± error estándar).
Los plastídios correspondiente a los 21 días, promediaron 4.161 µm de perímetro ± 0.302

de desviación estándar este tipo de plastídios se identificaron como amiloplastos y se
61
Resultados
caracterizaron por presentar formas redondas de bordes “lisos”, quizás esto se debió al
crecimiento en el estroma del granulo de almidón; por lo que, ésta inclusión afectaría la
extensión del perímetro volviéndolo menos “sinuoso” respecto al área. Finalmente, los
plastídios del tiempo de resiembra de 28 días, midieron en promedio 3.282 µm de
perímetro ± 0.180 de desviación estándar, este plastídio corresponde en imágenes de
ultraestructura a cromoplastos “juveniles” que posiblemente estarían en una etapa de
transformación.
Mientras que, el área presentó un comportamiento diferente; cabe señalar que este
descriptor es el resultado de la medición de dos planos dimensionales limitados; calculado a
partir de pixeles previamente calibrados en un objeto determinado (barra de escala). La
medición de los plastídios de células de ocho horas de resiembra dio como resultado un
área promedio de 0.533 µm2 ± 0.0525, estos plastídios eran de forma alargada por los
extremos y en algunos casos se observaba una constricción por el centro, esto hace suponer
que presentan una mayor extensión que expansión. A los siete días de resiembra, las
mediciones en promedio de los plastídios fue de 0.509 µm2 ± 0.0525 de área, esto hace
suponer que la forma de los plastídios aparte de ser menos alargada tiende a volverse
“globosa” (forma circular o “redonda”), esta característica es apreciable en las micrografías
correspondientes a este tiempo de crecimiento en donde los cloroplastos muestran una
estroma uniforme, que es característico de los estados juveniles de los plastídios, y en
donde no existe un sistema lamelar que ocupe este espacio.
Las mediciones de los plastídios de células de 14 días de resiembra promediaban 0.775 µm2
± 0.0415 de área; en las imágenes de ultraestructura, estos plastídios se identificaron como
cloroplastos maduros de formas circulares y ovoides, en el estroma se observó un sistema
lamelar apilado indicando la formación del característico arreglo tilacoidal secundario
(sacos trilamelares), lo que pudiera explicar el incremento del área en un orden de 0.266
µm2 respecto al tiempo anterior de medición. A los 21 días de resiembra los plastídios
diferenciados en amiloplastos promediaron 0.785 µm2 ± 0.0642 de área, siendo éste, el
punto de mayor área. Se debe principalmente a la aparición de gránulos de almidón, los
cuales por su naturaleza química presentan una polimerización radial y extensiva formando
62
Resultados
anillos de crecimiento, esto le proporciona espacialmente, una forma circular que debe
amoldarse al espacio del estroma del plastídio.
Finalmente, los cromoplastos “juveniles” de 28 días de resiembra median un área

promedio de 0.348 µm2 ± 0.0255, por lo que hubo una disminución de 0.437 µm2 en el
tamaño de los plastídios respecto al tiempo anterior, la pérdida fue de la mitad de área
promedio de los amiloplastos. Posiblemente, la disminución del área se pudo deber a que la
acumulación de carbohidratos en forma de almidón se reutiliza, para formar ATP para la
biosíntesis de metabolitos, entre ellos los carotenoides; por lo que se estaría reiniciando el
ciclo de transformaciones plastídicas; cabe señalar, que la biosíntesis de carotenoides es
una las vías que requiere de un mayor gasto energético, se podría inferir que el ATP
utilizado en estas rutas de síntesis estaría disponible a partir de carbohidratos de reserva,
como el almidón. Además, el tamaño de los cromoplastos “juveniles” y los “maduros” es
muy parecido y sólo difiere en 0.185 µm2 de área, esto indica que probablemente la
“madurez” sucede cuando se lleva a cabo una transformación química de los pigmentos y
posteriormente un reordenamiento espacial al interior del cromoplasto.
En la tabla 1 se presentan los resultados referentes a los cambios en los cálculos de los
factores adimensionales morfométricos de los plastídios, para cada uno de los días de
resiembra de células de Tagetes erecta L. Los plastídios pueden tener una apariencia
“redonda” ó “circular”, sin embargo, como se comentó anteriormente el perímetro al ser
muy sinuoso, alteraría directamente al factor de forma, ya que es un descriptor que se
calcula mediante la relación de (4πA) sobre el perímetro al cuadrado (P2) es decir, el valor
del perímetro afecta cuadráticamente el resultado del factor de forma.
El cálculo del factor de forma en las imágenes de los plastídios de ocho horas de resiembra,
describe un objeto que mantiene un “desequilibrio” entre el área y el perímetro, es decir,
son estructuras cuyo perímetro es muy sinuoso y el área es proporcional a ese perímetro,
este cálculo se mantiene con pocas variaciones, por lo que se considera constante hasta el
día veintiuno en el que se observa un factor de forma tendiente a 1, es decir a una forma
“redonda” con bordes lisos y con un área extensa, muy parecida en la ultraestructura a los
63
Resultados
amiloplastos. La súbita disminución del factor de forma en el día veintiocho podría deberse
a que la morfología de los plastídios es un proceso dinámico y cambian durante el
crecimiento y maduración de las células cultivadas in vitro.
Tabla 1. Resultados del cálculo de los descriptores morfométricos (adimensionales) y del Dfer de
los plastídios de células de T. erecta L. cultivadas in vitro.
Factor de forma Factor de compactación Diámetro de Feret

(µm)
8 (horas) 0.523 30.79 0.824
Error std. ± 0.192 ± 2.78 ± 0.052
7 (días) 0.584 24.00 0.805
Error std. ± 0.16 ± 1.19 ± 0.052
14 (días) 0.527 27.99 0.993
Error std. ± 0.182 ± 1.70 ± 0.041
21(días) 0.631 21.6 0.999
Error std. ± 0.147 ± 0.87 ± 0.064
28 (días) 0.545 32.83 0.666
Error std. ± 0.215 ± 2.90 ± 0.025
• Promedio de 64 mediciones
• Factor de forma y de compactación (adimensionales)
Mientras que el cálculo del factor de compactación o compacidad (es decir la rugosidad o
sinuosidad del contorno de un objeto) está dado por el área (A) y el perímetro promedio
(P), y calculado por P2/A, donde el resultado describe la “sinuosidad” del perímetro y por lo
tanto, que tan irregulares son los plastídios. Manteniendo la tendencia del anterior
descriptor, el factor de compacidad para los plastídios de ocho horas de resiembra es alto
por lo que se puede describir como cromoplastos “maduros” de aspecto sinuoso, es decir
alargados en los que el perímetro no es liso y por el contrario se observa invaginado. De
manera contrastante, el día veintiuno de resiembra muestra plastídios con un borde liso, sin
“sinuosidades” o invaginaciones lo que coincidiría con la descripción del aspecto general
de un amiloplasto; esta característica se revirtió después de siete días, es decir a los
64
Resultados
veintiocho días de resiembra, en donde el aspecto vuelve a ser “sinuoso”; esto se podría
deber a cambios metabólicos favorecidos por algún estímulo ambiental.
El diámetro de Feret de cada tiempo de resiembra se refiere al diámetro equivalente de los

plastídios, sí estos fueran perfectamente esféricos, siendo su área proyectada la de una
circunferencia perfecta; pudiéndose observar que las formas descritas subjetivamente tienen
un equivalente razonable a partir de las mediciones de cada día de resiembra.
Los plastídios muestreados a los 21 días de resiembra presentaron un diámetro perfecto,

por lo que la forma de los amiloplastos es la más cercana una esfera si se considera que
estos cuerpos tienen volumen en un espacio tridimensional como lo es el citoplasma
celular. Y el decrecimiento en el diámetro de Feret de los cromoplastos “juveniles” de 28
días de resiembra presentan una forma distante al concepto de circularidad por lo que se
tratan de formas irregulares y alargadas, quizás como anteriormente se describió
“ameboidales”.
6.5. Identificación de los pigmentos presentes en oleorresinas extraídas de

callos de Tagetes erecta L.
Los espectros de absorción de los extractos de callos de Tagetes erecta L. obtenidos por
HPLC, usando una columna C30 de fase reversa, en función a los días de resiembra, se
muestra en la Figura 25; cabe señalar que, los extractos fueron saponificados. En la Figura
25A se muestra el pico máximo correspondiente al estándar de luteína (Sigma Aldrich- Cat.
95507), con un tiempo de retención de casi 21 minutos. Este valor corresponde con los
valores previamente reportados por diversos autores, usando una metodología de análisis
similar a la que se utilizó en este trabajo (Del Villar Martínez et al., 2007). De manera
general, la totalidad de picos detectados se encuentran en el orden de 19 a 21 minutos, por
lo que se puede decir que todos ellos corresponden a luteína, en un mayor o menor grado de
pureza.
65
Resultados
A) B) C)
luteína
D) E) F)
Figura 25. Perfiles cromatográficos del HPLC obtenidos de las oleorresinas de callos de Tagetes erecta L. A) Corrida correspondiente al
estándar de luteína, las flechas indican el pico correspondiente a luteína. Cromatogramas de oleorresinas de B) Callos de 8 hrs de resiembra.
C) Callos de 7 días de resiembra. D) Callos de 14 días de resiembra. E) Callos de 21 días de resiembra. F) Callos de 28 días de resiembra.
66
Resultados
El análisis de la oleorresina de callos de 8 horas de crecimiento (Figura 25B), la altura del

pico presenta una respuesta de 62 mV y un área bajo la curva de 32957.13 µV.s por lo que
la acumulación de luteína es superior al encontrado en los días 7 y 14 días (Tabla 2); esta
situación se deriva de que la células de 8 horas, provienen de una resiembra de callos de 16
días, en los que ya había una acumulación previa e importante de carotenoides y por lo
tanto se obtuvo una mayor respuesta en área bajo la curva de luteína.
Tabla 2. Resultados del análisis HPLC de oleorresinas de callos de Tagetes erecta L. crecidas a
diferentes tiempos.
Tiempo de retención Respuesta Área Área

(minutos) (mV) (µV.s) (%)
8 (horas) 19.03 62 329575.13 18.98
7 (días) 20.18 74 277402.00 13.33
14 (días) 19.94 63 322990.90 18.19
21(días) 20.31 79 369375.60 19.46
28 (días) 20.31 79 369375.60 15.53
Al día 7 de la resiembra (Figura 25C), la cantidad de luteína disminuyó en el área bajo la

curva de luteína (Tabla 2), debido a que las células se encontraban recuperándose del estrés
debido a la manipulación en la resiembra, seguido de una fase de adaptación. Además, el
porcentaje que ocupó el pico de luteína fue menor, respecto a otros compuestos que registró
el HPLC, esto se debió a que la biosíntesis de compuestos estaba dirigida a la reparación
del daño y división celular (Cosgrove, 2000).
El día 14 (Figura 25D), se observó que el pico de luteína era muy parecido al identificado
en la muestra de 8 hrs de crecimiento, la respuesta en mV, así como el área bajo el pico de
luteína y el porcentaje del área que ocupaba en el cromatograma coinciden con los
resultados obtenidos a 8 horas (Tabla 2). La resiembra se realizó a partir de callos de 16
días de crecimiento por lo que estos resultados son parecidos debido a que fueron muestras
de tiempos de crecimiento muy cercanos.
67
Resultados
En el día 21 y 28 (Figura 25E), los picos de luteína se registraron a los 20.31 minutos, que
fue el tiempo más cercano a el estándar de luteína (21 minutos); además la respuesta del
pico es similar, así como el área bajo la curva de luteína (Tabla 2), sin embargo, el
porcentaje de área que ocupa el pico en el cromatograma es menor en las oleorresinas de
callos de 28 días, esto se debió a que se registró un mayor número de especies químicas de
carotenoides y xantofilas (datos no mostrados).
68
Discusión
7. DISCUSIÓN
Los cambios que se dieron de forma gradual en la estructura celular, transformación

plastídica, biosíntesis y acumulación de pigmentos en los callos de Tagetes erecta L. se
pudieron deber a que estos provenían de partes seleccionadas de callos maduros de 16 días
de crecimiento (únicamente los fragmentos de aspecto amarillo y friable), que se
encontraban ya adaptados al medio ambiente del cultivo in vitro, como ocurre para otras
especies (Dixon, 1988). El proceso de resiembra implica una manipulación durante el
trasladado a un nuevo medio cultivo con una misma cantidad de reguladores de crecimiento
y nutrientes. Esto ocurre de forma cíclica cada 16 días produciendo un estrés continuo de
tipo mecánico, fisiológico y bioquímico, lo cual podría ser la causa de la desincronización
celular que caracteriza el crecimiento in vitro de Tagetes erecta L. (Cosgrove, 2000). Cabe
señalar que en este trabajo, el tiempo de recrecimiento evaluado se extendió hasta los 28
días.
Los agregados celulares de T. erecta L. estuvieron conformados principalmente por dos

grupos de células: viables y no viables. De manera posterior a la resiembra, las células no
viables se encontraron en mayor abundancia formando estructuras similares a los tejidos
diferenciados de los cuales provienen (haces vasculares y tejido del parénquima). Esta
tendencia comenzó a revertirse después de catorce días, observando un incremento de
células viables, las cuales aumentaron en tamaño y en agregamiento (compactación celular
por disminución de espacios intersticiales), lo que se observó al final de los 28 días de
crecimiento.
Las observaciones de la estructura de los callos coinciden con lo reportado por Gómez
(2003) y Lina (2006), quien al hacer estudios anatómicos comparativos de explantes de I.
murucoides tratados con auxinas con explantes de I. intrapilosa, crecidos in vitro
respectivamente, observaron que los callos mostraron cambios estructurales a partir del
séptimo día y sucesivamente se observó una rediferenciación a tejidos especializados
(elementos traqueales, haces vasculares, xilema y floema).
69
Discusión
La Figura 25 muestra la propuesta de un modelo descriptivo de los probables estados de

diferenciación plastídica que se identificaron para los diferentes tiempos de recrecimiento
celular, así como la posible la ruta que estarían siguiendo tales transformaciones,
provenientes de las observaciones y hallazgos de este trabajo. Este modelo se propone
particularmente para las células de T. erecta cultivadas in vitro, bajo las condiciones de
cultivo señaladas, tomando como base los conceptos de Kirk y Tilney-Bassett, (1967), de
Buchanan et al., (2000) y de Bonora et al., (2003), el cual posiblemente sería un ciclo que
se repetiría durante cada resiembra.
Figura 26. Propuesta de modelo descriptivo para la diferenciación plastídica en células de Tagetes
erecta L. cultivadas in vitro durante 28 días. El símbolo (Ö) representa la probable ruta de
diferenciación que siguen los plastídios a partir de las 8 hrs de siembra de células; (Ù) indica las
posibles etapas que son reversibles; (- - →) en la vía de diferenciación; (+) la presencia y
abundancia de pigmentos y (0) la ausencia de éstos. T, indica el tiempo de resiembra celular.
70
Discusión
A las 8 horas de ser resembrados los agregados celulares, los plastídios observados fueron
cromoplastos maduros (T0), los cuales se caracterizaron por la presencia de estructuras
osmiófilas, denominadas plastoglóbulos, las cuales contienen los precursores e
intermediarios, así como los carotenoides esterificados como lo señalan Botella y Pavia,
(2006), por lo que se sugiere que tales plastoglóbulos serían el principal carácter
morfológico para identificar un cromoplasto (Bonora et al., 2000); otras características
como forma, tamaño y el estado fisicoquímico del carotenoide, establecen si el cromoplasto
se puede definir como juvenil, maduro o senescente.
La continuación de la vía se dirigirá entonces hacia un cloroplasto “juvenil” (T1), que en

algunos estudios se le reporta como plastídio “pregranal” (Buchanan et al., 2000), en el que
se evidenciaron pigmentos clorofílicos, así como carotenoides; morfológicamente, ambas
estructuras son similares. Cabe señalar que la transformación de una estructura
almacenadora de carotenoides (T0) a una pre-fotosintética (T1) frecuentemente se presenta
en tejidos modificados (Kirk y Tilney-Bassett, 1967).
Una etapa crítica es la descrita como cloroplasto maduro (T2), el cual sólo se produce bajo
el estímulo de ciertas condiciones abióticas, siendo la más importante la luz (Buchanan et
al., 2000). En este trabajo, los agregados celulares, además de estar expuestos a un
fotoperiodo de 16 horas, reciben una cantidad de radiación fotosintéticamente activa (RFA)
de aproximadamente 120 µMol m2 s-1. La presencia de plastoglóbulos presupone la
presencia de carotenoídes y compuestos accesorios para la fotosíntesis, ya que tales
compuestos han sido reportados por Ubaldo-Suárez (2007), Botella-Pavía y Rodríguez-
Concepción (2006), como atenuadores de la desnaturalización de los complejos triplete de
la clorofila, la cual se ubica en el sistema endomembranal (tilacoides) que caracteriza a el
cloroplasto. Esto sugiere que en ésta etapa de la resiembra las células se encontraron en una
etapa de autotrofía- cloroplástica, pero además sometidas a un estrés foto-oxidativo,
probablemente por la intensidad de luz y el tiempo de exposición a que son sujetas en el
cuarto de cultivo.
El paso de un cloroplasto a amiloplasto (T3), es una transición poco usual la que es posible
debido a que todos los plastídios son interconvertibles (De Robertis et al., 1981); bajo esta
71
Discusión
premisa cualquier tipo de plastídio puede diferenciarse a otro de mayor o menor

complejidad estructural y metabólica (Buchanan et al., 2000); estos amiloplastos
presentaron más de un grano de almidón en el estroma así como glóbulos de naturaleza
lipídica. Posiblemente, su presencia estaría explicada en virtud que el amiloplasto es una
estructura de almacenamiento, común en las células vegetales (Bidwell, 1979; De Robertis
et al., 1981; Buchanan et al., 2000) lo que explicaría su presencia.
Finalmente, los plastídios de 28 días (T4) se encontraron en una etapa juvenil de

diferenciación cromoplástica, debido a la presencia de plastoglóbulos y arreglo lamelar
difuso, indicando una mayor presencia de células maduras con cromoplastos juveniles y
maduros. En este sentido, a pesar de que los agregados de células in vitro de T. erecta son
cultivos asíncronos, en la etapa de crecimiento estacionario (28 días) tienden a
sincronizarse debido a que el gasto metabólico probablemente está dirigido de manera
preferencial a la producción de metabolitos secundarios y no al crecimiento (metabolismo
primario) (Cosgrove, 2000; Leboeuf et al., 2004). Esto estaría dando como resultado una
mayor presencia de estructuras dirigidas a la biosíntesis y almacenamiento de los
carotenoides.
Las observaciones al microscopio confocal de barrido láser (MCBL) de las células de T.

erecta L. presentaron autofluorescencia verde y roja en distintas estructuras celulares; la
fluorescencia verde es producto de pigmentos fotoexitables entre 350 a los 425 nm de la
longitud de onda del espectro de absorción de la luz (λ), dentro de los cuales se encuentran
los carotenoides asociados con ácidos grasos en forma esterificada (Kopsell y Kopsell,
2006; Olympus, 2008; Maureen et al., 2008); así como algunos de los isoprenoides
precursores e intermediarios.
La fluorescencia en color rojo se debe a los pigmentos excitables en el intervalo de longitud

de onda de 680 a 720 nm contenidos en estructuras plastídicas; el segundo valor de
absorción de luz coincide con la segunda λmax de absorción de la clorofila; cabe señalar
que la localización de esta fluorescencia se restringió a las membranas tilacoidales de
72
Discusión
cualquier etapa transitoria del cloroplasto (Kirk y Tilney-Bassett, 1967; Maureen et al.,
2008).
Es importante señalar que la línea celular de T. erecta cultivada in vitro utilizada en este
trabajo está dirigida a la biosíntesis de carotenoides, principalmente la luteína; esta
característica se obtuvo a través de la manipulación de los nutrimentos del medio de
cultivo, fitohormonas y condiciones de incubación como la intensidad de luz, fotoperiodo y
temperatura (Del Villar Martínez et al., 2007).
Los descriptores morfométricos cuantificaron los cambios que se dieron durante cada etapa
de siembra, por lo que las descripciones subjetivas de las formas plastídicas identificadas
pudiesen ser analizadas en términos de pérdida o ganancia de perímetro, área, circularidad
y compacidad. En cromoplastos maduros (T0), estas mediciones confirman la existencia de
objetos alargados en los que el perímetro es muy sinuoso y por lo tanto, el área no es
proporcional a ese perímetro; ésta tendencia se observó en los otros descriptores. De aquí
que en términos morfométricos, caracterizados por tratamiento digital de imágenes, un
cromoplasto tiene la apariencia de un objeto extendido, de bordes “sinuosos”, poco esférico
y de un diámetro equivalente pequeño con relación a la extensión del perímetro. Estas
características morfométricas podrían aportar nuevos elementos que coadyuvarían a
redefinir el concepto del cromoplasto en términos de ser un cilindro alargado ó tubular
(Whatley, 1985; Whatley y Whatley, 1987).
Análogamente, el cloroplasto “juvenil” pasa a ser un objeto con una geometría menos
irregular, con una mayor circularidad (factor de forma) de bordes lisos y menos extendidos
y por lo tanto, con un diámetro equivalente cercano al que teóricamente circundaría el área
del objeto; en este caso la forma subjetiva “globosa ó globulosa” podría considerarse
adecuada a la descrita por estas mediciones (Whatley, 1985; Whatley y Whatley, 1987).
Por otra parte, se infiere que los cambios al interior del cloroplasto continúan debido al
estímulo lumínico, por lo que el sistema endomembranal-fotosintético se desarrolla,
produciendo cambios estructurales que según Kirk y Tilney-Bassett (1967) y Buchanan et
73
Discusión
al., (2000), da lugar a la conformación de una estructura descrita como lentiforme ó

semiesférica; sin embargo la descripción métrica indica la pérdida de circularidad y la
ganancia en extensión y área, por lo un cloroplasto es un objeto “ovoide” cuya forma se
extiende por las extremidades y se engrosa en el centro describiendo un plano circular.
Diversos autores mencionan que el cloroplasto maduro es una de las estructuras celulares
de mayores dimensiones (Kirk y Tilney-Bassett, 1967; Glynn et al., 2007); las mediciones
realizadas en este trabajo coincidieron con tal afirmación.
Quizás el amiloplasto (T3) es la estructura que morfológicamente ha sido menos descrita, lo

que probablemente se debe a que su forma es variable como resultado del crecimiento de
los distintos gránulos de almidón (Platonova et al., 2005) y al reordenamiento espacial que
sufre en el estroma. La descripción morfométrica de los amiloplastos de las células de T.
erecta cultivadas in vitro, indica que se trata de objetos con perímetros extendidos y de área
extensa, con una mayor circularidad y con un diámetro equivalente muy cercano a la de una
esfera; sin embargo la compactación indica que los bordes tienden a ser sinuosos. Estos
resultados no pudiesen ser relacionados con otros amiloplastos, puesto que, como se señaló
anteriormente la forma de estas estructuras está condicionada a la biosíntesis y acumulación
del almidón en el grano o granos, de tal forma que cuando éstos crecen deforman los bordes
e incrementa el tamaño del amiloplasto, proporcionándole su forma característica en estas
células.
El cromoplasto juvenil (T4) ha sido descrito como que presenta una forma ameboide
(Whatley, 1985; Whatley y Whatley, 1987); algunos autores plantean que se trata
estructuralmente de un cromoplasto pero que en su interior los carotenoides pueden
cambian su estado físico y químico (Bonora et al., 2000), sin embargo los descriptores
morfometricos demuestran que se trata de un objeto que presenta casi las mismas
dimensiones de un cromoplasto maduro, sin embargo la forma perimetral es mas sinuosa
para el área abarcada; de igual forma el diámetro equivalente indica que se trata de
plastídios de poca circularidad cuya forma más bien es irregular.
74
Discusión
Finalmente los perfiles cromatográficos de HPLC, mostraron una aparente dinámica

metabólica en la síntesis de carotenoides en los callos de Tagetes erecta L.; inicialmente
cuando son resembrados (8 hrs, Figura 25B) muestran una acumulación de luteína, lo que
podría deberse a que las células provienen de agregados celulares que fueron seleccionados
para su resiembra, precisamente de aquellas porciones que presentaban, visualmente una
mayor coloración amarilla y por ende un mayor contenido aparente de carotenoides. Esta
característica se ve afectada a los siete días de resiembra (Figura 25 C) en donde la cantidad
de luteína (en términos de altura del pico en mV) es menor. Este resultado, en términos
cuantitativos es posible atribuirlo a una menor presencia de células viables, como lo
muestran las imágenes de microscopía óptica (Figura 9A). Desde el punto de vista
fisiológico y después del estrés originado por la manipulación en la resiembra, las células in
vitro se estarían primeramente adaptando al nuevo medio de cultivo para después iniciar su
recrecimiento durante los primeros siete días; durante ese tiempo, una cantidad importante
de células pueden morir (Dixon, 1988). Cabe resaltar que estos sistemas de cultivo in vitro
además de los factores ambientales, también la competencia interpoblacional afecta el
acceso de las células a los nutrientes, humedad y oxígeno; estos factores de estrés provocan
la muerte celular.
En la etapa subsecuente (14 días de resiembra, Figura 25D), las células viables (Figura
10A) además de iniciar el proceso de crecimiento y división celular, las condiciones de
iluminación a las que son expuestas las inducen a ser fotosintéticas (Figura 21C);
paralelamente, también los mecanismos contra el posible daño foto-oxidativo se reactivan,
destacando la vía DXOP (Lichtenthaler, 1999; Kopsell y Kopsell, 2006; Botella-Pavía y
Rodríguez-Concepción,2006), y de ésta la carotenogénesis y la acumulación de luteína,
como pigmento accesorio de la fotosíntesis (Figura 21B). A partir de los 14 días y hasta los
28 días, la cantidad de células viables aumenta (Figuras 11A y 12A), en una etapa donde
éstas han adquirido mayor complejidad estructural (Figuras 11B y 12B), más no se han
agotado los recursos nutritivos del medio, que limitarían el crecimiento del callo (Jimenez,
2005; Sánchez-Segura, 2007) por lo que se continúa con la acumulación de luteína
(Figuras, 25E y 25F), llegando a cantidades similares (en términos de respuesta en mV) a
las obtenidas al primer tiempo de muestreo (Figura 25B).
75
Discusión
En este sentido, los agregados celulares de 28 días están compuestos por células cuya
madurez fisiológica, organización estructural y complejidad metabólica estarían orientada a
la síntesis de carotenoides, así como a una probable sincronía celular. Tratando de hacer
una analogía con lo que pasa en las células in vivo en tejidos altamente organizados
(inflorescencias), en un reciente trabajo realizado por Ubado-Suárez (2007), con lígulas de
T. erecta cultivada dos ambientes distintos de radiación fotosinteticamente activa (RFA), la
biosíntesis de carotenoides se vio afectada en los ambientes foto-oxidantes disminuyendo,
tanto la biomasa como la acumulación de carotenoides. Por el contrario en radiaciones
estables y cuya longitud de onda corresponda al espectro de excitación de los carotenoides,
la biosíntesis se favorece. También encontró diferencias ultraestructurales en los
componentes plastídicos en las muestras provenientes de los dos diferentes tipos de
ambientes.
Por su parte, Bonora et al., (2000) encontraron que en Arum italicum Miller, durante la
maduración del fruto ocurría la inusual transformación de amiloplasto-cloroplasto-
cromoplasto. Del Villar et al., (2005) asociaron los estados de apertura de los capítulos
florales de Tagetes erecta L. sugiriendo que el botón floral verde contenía cloroplastos, la
segunda etapa de apertura del botón floral (verde-naranja) se observaron estados
transitorios entre cloroplastos-cromoplastos juveniles y en la tercera etapa de apertura total
se observaron cromoplastos maduros.
Finalmente, lo observado conjuntamente a lo largo de este trabajo con células in vitro de

Tagetes erecta L., mediante las evidencias morfoestructurales, de autoflorescencia y
bioquímicas obtenidas, coadyuvaron a plantear la probable ruta de diferenciación
plastídica: cromoplasto-cloroplasto-amiloplasto-cromoplasto. Por lo que el aporte original
de este trabajo radica en que dicha ruta de diferenciación no se encuentra reportada en la
literatura consultada, pero probablemente sucede en los tejidos in vivo, de algunas raíces
modificadas (zanahorias) y frutos (cítricos) los cuales reverdecen dentro de cierto estímulo
lumínico característico (Kirk y Tilney-Bassett, 1967).
76
Conclusiones
8. CONCLUSIONES
• Los callos de Tagetes erecta L., sufrieron cambios estructurales durante veintiocho
días de recrecimiento in vitro; en los que las células resembradas después de 8
horas, mostraron una mayor proporción de células no viables; tendencia que revirtió
respecto al tiempo hasta la revascularización celular a los veintiocho días de
resiembra.
• El análisis ultraestructural de los plastídios de células de Tagetes erecta L. crecidas

in vitro sugirió que la vía de diferenciación plastídica inicia con cromoplastos
maduros, presencia de cloroplastos juveniles a los siete días y cloroplastos maduros
a los catorce días.
• En células de veintiún días se presentó una inusual transformación de cloroplastos a

amiloplastos y finalmente a cromoplastos juveniles a los veintiocho días de
resiembra debido a la presencia de plastoglóbulos osmiófilos y cuando el callo
alcanza la madurez celular.
• Los plastoglóbulos fueron estructuras asociadas a la acumulación de pigmentos

accesorios (carotenoides), debido a que se presentó autofluorescencia de estos
correspondiente a este tipo de pigmentos accesorios.
• Las micrografías de fluorescencia evidenciaron la presencia de pigmentos

fotoexcitables entre 425 - 440 nm y 680 - 720 nm de la longitud de onda de emisión
del MCBL correspondientes a carotenoides y clorofílicos respectivamente.
• El análisis morfométrico de los plastídios mostró que el cromoplasto maduro es una

estructura rugosa y alargada; la división plastídica originó estructuras redondas de
bordes semi-lisos, seguido de una reorganización del sistema tilacoidal hasta la
transformación en cloroplasto de forma ovoide.
77
Conclusiones
• La transformación en amiloplasto implicó el aumento en área y el alisamiento de los

bordes, formando un esferoide mientras que el cromoplasto juvenil era una
estructura irregular y alargada de bordes sinuosos.
• Mediante la cromatografía de líquidos de alta resolución se evidenció la presencia

de luteína; cuya abundancia incrementó de manera paralela a la madurez del callo y
a la diferenciación del cromoplasto.
• Los resultados obtenidos sugieren que las resiembras celulares deben realizarse a
partir de agregados de más de 21 días de crecimiento, debido a que éstos se
encuentran en un mayor estado de maduración estructural, bioquímica y fisiológica.
78
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

ESTUDIO DE LOS PLASTÍDIOS EN CÉLULAS

DIRECTOR DE TESIS: DR. ANTONIO RUPERTO JIMÉNEZ APARICIO

YAUTEPEC, MORELOS. DICIEMBRE, 2008.

La enseñanza del procesamiento de muestras, corte y observación en microscopio

Las observaciones en el Microscopio Confocal de Barrido Láser se realizaron en el

Al Dr. Antonio R. Jiménez Aparicio por dedicarme su tiempo, conocimientos,

A la Dra. Olga M. Echeverría Martínez por darme la oportunidad de ser su alumno y

A la Dra. Carmen Méndez Herrera, por apoyarme en la realización de este trabajo de

A la Dra. María Eugenia Jaramillo Flores por su apoyo en la realización de análisis

A la M. en C. Silvia Juárez Chavero, por enseñarme las técnicas de procesamiento y corte

A la M. en C. Guadalupe Salcedo Morales, por su valioso aporte en el mantenimiento del

A la M.V.Z. Silvia Reyes Maya y Q.F.B. Carmen Mondragón Huerta por su

A la M. en C. Denisse Ubaldo Suárez por su apoyo y orientación en la búsqueda de

A mi compañero y amigo Dr. Roberto Campos Mendiola, por brindarme su amistad y

(PIO BAROJA) 1872-1976.

“CONFORME EL TIEMPO PASA, TE VAS FABRICANDO UN ENTRAMADO DE

PACO IGNACIÓ TAIBO II

LISTA DE CUADROS vii

LISTA DE ABREVIATURAS viii

2.2. El estímulo lumínico excita los pigmentos plastídicos 6

2.3. Fluorescencia y autofluorescencia de pigmentos plastídicos 8

2.4. Pigmentos fotosintéticos y accesorios 9

2.5. Pigmentos carotenoides 10

2.6. Biosíntesis de carotenoides 12

2.7. Cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) 15

2.8. Aspectos generales de Tagetes erecta L. 16

2.9. Cultivo in vitro de células de Tagetes erecta L. 16

2.10. Origen, tipo y función de los plastídios 17

2.12. Características morfológicas del cromoplasto durante la diferenciación 20

2.13. Características del cromoplasto en lígulas y células cultivadas in vitro de T.

2.14. Morfología y estructura interna de callos in vitro. 22

2.15. Aplicación del tratamiento digital de imágenes (TDI) en el estudio de la

4.1. Objetivo General 27

4.2. Objetivos Particulares 27

5.1.1. Material biológico 28

5.1.2. Medio de cultivo 28

5.2.1. Equipo de laboratorio para cultivo de células 28

5.2.2. Equipo para microscopía óptica, confocal y electrónica de

5.2.3. Equipo para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 29

5.2.4. Equipo y software para tratamiento digital de imágenes 29

5.3.1. Siembra y mantenimiento de cultivos de T. erecta L., fenotipo

5.3.2. Procesamiento de células de T. erecta L. para microscopía

f. Cortes semifinos (microscopia óptica) 32

g. Cortes ultrafinos (MET) 33

i. Observación y captura de imágenes (MET) 33

5.3.3. Observación de autofluorescencia plastídica en MCBL 33

b. Observación y captura de imágenes 34

5.3.4. Tratamiento digital de imágenes y medición de los descriptores

5.3.5. Detección de carotenoides en callos de T. erecta L. mediante

b. Obtención de perfiles de luteína de T. erecta L. por HPLC 36

6.1. Composición de los callos de Tagetes erecta L. 38

6.2. Descripción morfológica de la transformación plastídica de Tagetes erecta L.

6.3. Cortes y autofluorescencia mediante MCBL de células de Tagetes erecta L.

6.4. Morfometría de los plastídios de Tagetes erecta L. mediante TDI 60

6.5. Identificación de los pigmentos presentes en oleorresinas de callos de Tagetes

2 Espectro de radiación electromagnética y energía de los fotones en la gama

3 Pigmentos encontrados en el sistema membranal plastídicos y espectro de

4 Esquema de la posición de los carbonos de una molécula de carotenoides y

5 Ruta de biosíntesis de los precursores de carotenoides e isoprenoides vinculados

6 Continuación de la ruta de biosíntesis de los carotenoides y xantofilas. 14

9 Micrografías ópticas de un agregado celular de Tagetes erecta L. a siete días

10 Micrografías ópticas de agregados celulares de Tagetes erecta L. a catorce días