Manual de Prácticas de Genética Microbiana

PRÁCTICA No 9

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA MEDIANTE SHOCK TÉRMICO

1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años se han diseñado varias técnicas para la introducción

de moléculas de DNA al interior de E. coli. Estos generalmente se basan en el
método hallado por Mandel y Higa (1970), quienes demostraron que la incubación
de las células con el DNA de un bacteriófago en una solución de cloruro de calcio
frío resultó en la captación del virus y que un shock de calor por un corto tiempo a
la mezcla de reacción elevó enormemente la eficiencia de transformación.
Posteriormente, este método ha sido usado para introducir una variedad de
moléculas de DNA circulares y lineales al interior de E. coli, y muchas variantes han
sido descritas que elevan la producción de transformantes (o tranfectantes en el
caso del bacteriófago M13). Se ha descrito que agentes como el polientilenglicol
(PEG) también inducen transformación de la célula bacteriana (Chung y Miller,
1988).
El mecanismo involucrado en la transformación por DNA no es comprendido
en su totalidad, pero los requerimientos principales para el éxito del ensayo son la
presencia de cationes multivalentes, una temperatura de incubación cercana a 0oC,
y un cuidadoso control del shock de calor a 42oC. Aún en el método más eficiente
la proporción de células competentes en una población es limitada. En las mejores
condiciones sólo el 10% de células de toda la población pueden convertirse en
competentes. Por esta razón las células competentes deben ser preparadas en el
momento de su uso o en todo caso deben de mantenerse alicuotadas y congeladas
a –70oC para su uso posterior.
En esta práctica utilizaremos un método nuevo para la preparación de células
bacterianas competentes que rinden una alta eficiencia de transformación, en
comparación a otros métodos éste es más simple y más conveniente que otras

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técnicas, y las células competentes que se obtengan se utilizarán para el ensayo de

transformación.

2. OBJETIVOS:

1. Comprobar la naturaleza transformante del DNA.

2. Proporcionar al estudiante las bases de una técnica de recombinación
genética.

3. METODOLOGÍA

Obtención de células competentes

1. Cultivo de E. coli BH101 en 10 mL de caldo LB, que estén en fase temprana

de crecimiento (DO600 = 0.3 – 0.5).
2. Centrifugar en tubos de microcentrífuga a 1000 x g, por 3 min a 4ºC.
Eliminar el sobrenadante.
3. El pellet es resuspendido en un volumen de 250 L de solución de
transformación.

Ensayo de transformación

1. Agregar sobre la alícuota de 250 L, de células bacterianas competentes,

10 L de plásmido pGLO (50 ng/10 L) que confiere resistencia a antibiótico
y que codifica para el marcador de fluorescencia. Incubar por 10 minutos
en cubos de hielo. Luego incubar a 42oC por 50 segundos, retornando
inmediatamente el tubo de microcentrífuga a los cubos de hielo por 2
minutos.
2. Luego agregar 250 L de medio LB nutritivo (pH 7,0) que contenga 10 mM
de Mg2+ más 10 L de 20 mM de glucosa. Incubar por 10 minutos a
temperatura ambiente.

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Selección de células transformantes

1. Sembrar en placas de Petri alícuotas de 100 L por diseminación con una

espátula Drigalski.

2. Incubar las placas a 37oC por 24 h.

4. CÁLCULO DE LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN

Se refiere a la determinación de la cantidad de células de E. coli genéticamente
transformadas. En muchos experimentos es necesario conocer la cantidad de células
que han sido transformadas genéticamente, por ejemplo, en algunos casos de terapia
génica las células son colectadas del paciente, transformadas en el laboratorio y,
posteriormente son reinyectadas al paciente. Por ello, el cálculo de la eficiencia de
transformación se realiza para determinar científicamente que tan bien se está
trabajando.
La eficiencia de transformación nos indica qué cantidad de moléculas de DNA está
ingresando a las células bacterianas. Se calcula con la siguiente formula:

Número total de células que crecen sobre la placa (UFC)

Eficiencia de transformación =
Cantidad de DNA estriado sobre la placa de agar (en µg)

Antes de calcular la eficiencia de transformación, debemos contar con la siguiente

información:
1. El número total de colonias transformantes en la placa con LB/amp.
2. El cantidad de DNA plasmídico con el cual se obtuvo las colonias en la placa
con LB/amp.

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4.1. Determinar el número total de células transformantes.

Se cuantifica mediante el recuento de colonias en las placas correspondientes y se
expresa en Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
4.2. Determinar la cantidad de DNAp que se ha sembrado conjuntamente con las
células bacterianas sobre la placa LB/amp.
Para este cálculo requerimos los datos siguientes:
1. ¿Cuál fue la cantidad de DNAp usada al inicio del experimento?
2. ¿Cuál es la fracción de DNAp que corresponde a las colonias que
crecieron en la placa con LB/amp?
a. Determinar la cantidad de DNAp total:
(DNA en µg) = (concentración de DNA en µg/µl) x (volumen de DNAp en µl)
Si en un experimento usamos 10 µl de DNAp a una concentración de 0.08
ug/ul, significa que por cada µl de solución tenemos 0.08 µg de DNAp.
Calculamos la cantidad total de DNAp usado en este experimento:
Cantidad total de DNAp (µg) = 10 x 0.08 = 0.8 µg
b. Determinar la fracción de DNAp (en la bacteria) que ha crecido sobre la
placa de BL/amp:

Vol estriado sobre la placa de LB (µL)

Fracción de DNAp usado =
Vol total de muestra en el tubo (µL)

Si se sembró 100 µl de células desde un tubo de ensayo que tiene el DNAp en

un volumen total de 510 µL de solución, entonces debemos usar la siguiente formula
para calcular la fracción de DNAp que se ha sembrado en la placa con LB/amp:

Fracción de DNAp = Volumen en placa/Volumen total en el tubo

= 100/510 = 0.2

DNAp sembrado en µg = Cantidad total de DNA usado en µg x fracción de

DNAp usado
En nuestro caso sería: 0.8 µg x 0.2 = 0.016 µg

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Por lo tanto, la eficiencia de transformación será:

Et = Número total de células que crecen sobre la placa (en UFC)

Cantidad de DNA estriado sobre la placa de agar (en µg)

Et = Número total de células que crecen sobre la placa (en UFC)

0.016 (en µg)

3. SOLUCIONES

Solución de Transformación:
- CaCl2 50mM, pH 6.1

Para 1 mL de caldo LB pH 6,1:

Caldo LB 735 L
PEG al 40% 250 L
DMSO 5 L
20 mM Mg2+ 10 L

4. BIBLIOGRAFÍA

Mandel, M. y A. Higa. 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.

J. Mol. Biol. 53: 159-162.

Chung, C.T. y R.H. Miller. 1988. A rapid and convenient method for the
preparation and storage of competent bacterial cells. Nucleic Acids Res. 16:
3580.

Harwood, A.J. 1996. Basic DNA and RNA protocols. Humana Press Inc, New
Jersey.

Biotechnology Explorer - pGLO™ Bacterial Transformation Kit. Recuperado de:

http://www.bio-rad.com/en-us/sku/1660003edu-pglo-bacterial-transformation-
kit?ID=1660003edu

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