Según la investigación de Carril ga, et all (1987) citado por Dietrich, et all.

(2006) nos
dice que la licoisoflavona B mostró la mayor actividad fungitóxica contra los hongos
Colletotrichum gloesporioides y Cladosporium cladosporioid es, seguida de la luteona y
la licoisoflavona A, mientras que las otras isoflavonas (2'-hidroxigenisteína, agustona A,
B, C y genisteína) mostraron una actividad baja y que no se dieron más detalles sobre si
esto puede tener una mayor incidencia o no en la resistencia a la antracnosis, o al menos
en la tolerancia. Pero en la búsqueda de información que se tiene se demuestra que la 2´-
hidroxigenisteina es un precursor de isoflavona antimicótica al catalizar 3´- B- anillos de
prenilación que produce isowighteone el cual es una isoflavona antimicótica que produce
lupinus ante calletotrichum. Las estructuras de isoflavonas presente es chocho o tarwi
(lupinis mutabilis) son:

Según los resultados obtenidos en la investigación de Dietrich, et all. (2006) la hoja parece
ser un buen material para evaluar el contenido de isoflavonas debido a la cantidad de
ellas. De las distintas variedades estudiadas en la variedad Tiptop, que tolera bien el
ataque de antracnosis, se observa la mayor variación de la concentración de isoflavonas
durante el desarrollo de la planta, mostrando la mayor isoflavona total en roseta (I: 145
días después de la siembra) y la menor al final de la floración (III: 198 después de la
siembra). Las variedades probadas de L albus muestran un patrón decreciente de
isoflavonas totales. Además, en todas las variedades, además de Tiptop al final de la
floración, la principal isoflavona fue la licoisoflavona A. En hojas de diferentes cultivares
de L. angustifolius durante la temporada 1999, se observó una concentración de
isoflavonas significativamente mayor al inicio (roseta, I: 30 días después de la siembra)
que en el estadio de desarrollo I de L. albus. Sin embargo, al final de la floración (L albus
y L angustifolius), la cantidad de isoflavonas fue similar y el patrón decreciente de las
mismas durante el desarrollo también fue bastante similar.
En la Figura Nº 7 se compara la actividad fungistática de la genisteína con la de un
fungicida sintético (benomyl) en un medio de cultivo sólido (Agar Malta). Estos
compuestos inhiben el crecimiento de C. lupini, sin embargo, bajas a altas
concentraciones de benomilo mostraron una actividad inhibitoria entre 70% y 97% y la
inhibición debida a la genisteína alcanzó solo 13% a 75%. La actividad antifúngica de las
isoflavonas se evaluó mediante bioensayos en placa de TLC (bioautografía) utilizando C.
lupini como hongo de prueba. La licoisoflavona B fue más fungitóxica que la 2´OH-
genisetina, y el efecto inhibidor de la genisteína fue leve después de 8 días de incubación.
La actividad fungitóxica de los compuestos de prueba disminuye en el orden siguiente:
licoisoflavona A > lupinalbina A > licoisoflavona B - 2'-hidroxigenisteína > genisteína -
wighteona (Fig. 8). De acuerdo con el estudio de Dietrich, et all. (2006), en una
bioautografía utilizando Cladosporium herbarum como hongo de prueba, la
licoisoflavona A mostró una fuerte actividad fungitóxica, seguida por la wighteona y la
licoisoflavona B, sin embargo, la 2´OH-genisteína y la genisteína fueron compuestos
fungitóxicos leves [10].
AISLAMIENTO FÚNGICO Y MATERIAL VEGETAL según Guillaume Dubrulle, et
all. (2020)
1. Condición de cultivo fúngico y preparación de inóculo
La cepa RB221 de C. lupini (IMI 504893; UBOCC-A-117274) se aisló de un cultivo de
lupino en Bretaña en 2014. La secuencia del genoma de esta cepa se obtuvo utilizando
los instrumentos Illumina GAII y HiSeq 4000, y también utilizando la tecnología de
Pacific Biosciences. (PacBio, Menlo Park, CA, EE. UU.). El inóculo de la cepa RB221
se preparó a partir de un cultivo de PDA de dos semanas de edad a 25 °C, agregando al
cultivo 1,5 mL de agua destilada estéril. La concentración de esporas se ajustó a 1 x 104
esporas mL-1 . Se utilizaron cinco microlitros de la suspensión de esporas para inocular
semillas hervidas de lupino esterilizadas (adaptado de Saubeau et al (2014)) colocadas en
placas de Petri con agua y agar al 1,3 %. Después de una semana de incubación a 25 °C,
las esporas se recolectaron agitando las semillas de lupino infectadas en 3–4 ml de agua
destilada y el inóculo de esporas se ajustó a 1 x 107 esporas ml-1 . Para cada repetición
biológica se preparó un nuevo cultivo fúngico e inóculo.
2. Crecimiento de la planta
La variedad de lupino utilizada para la inoculación fue una variedad primaveral,
denominada Feodora (Jou ray-Drillaud, Cissé, Francia). Las semillas se desinfectaron
durante un minuto en etanol al 70 %, luego se enjuagaron tres veces con agua destilada
estéril antes de colocarlas en medio agua-agar y se incubaron a 25 °C en la oscuridad
durante tres días hasta la germinación. Las plantas inoculadas se cultivaron a 25 C día y
noche, con 16 h de luz y 8 h de oscuridad y 60% de humedad. Las plantas se regaron cada
dos días durante todo el experimento. Los síntomas se evaluaron en todas las plantas
inoculadas midiendo la longitud de la lesión siempre que fuera visible. Se realizó un
ANOVA para estudiar la influencia de la repetición biológica en la longitud de la necrosis,
utilizando el software RStudio (versión 3.2.5). Las diferencias entre variables se
determinaron con pruebas de comparaciones múltiples con el método post hoc Tukey
HSD. El nivel de significación se fijó en = 0,05.
3. Condiciones de inoculación e incubación
Veinte microlitros del inóculo ajustado a 1 x 107 esporas mL-1 se dejaron caer en la base
de la radícula que emerge de la semilla. Las plántulas inoculadas se colocaron en macetas
Ji y® (pellets de turba, 41 mm de diámetro) (Ji y Products International BV, Zwijndrecht,
Países Bajos) durante 24, 36, 48, 60, 72, 84 y 96 hpi. Los tiempos de muestreo se
seleccionaron para apuntar a las primeras etapas de la infección, el supuesto cambio entre
las fases biotrófica y necrotrófica y la fase necrotrófica. A las 24, 48, 60, 72 y 84 hpi, se
usaron 10 plántulas inoculadas para el análisis de RNAseq, mientras que a las 36, 60, 72,
84 y 96 hpi, se usaron 10 plántulas adicionales para el análisis proteómico. Se realizaron
cuatro repeticiones biológicas (excepto a las 96 hpi, cuando se realizaron tres repeticiones
biológicas). Las plántulas inoculadas con agua se usaron como controles negativos.
Las condiciones de control para los análisis proteómicos y transcriptómicos se realizaron
in vitro en un medio líquido Czapek Dox con 0,5 g.L-1 de sacarosa en lugar de 30 g.L-1
(adaptado de la composición de caldo BD DifcoCzaPEK-Dox, BD, Franklin Lakes , NJ,
EE. UU.) para simular la baja disponibilidad de carbohidratos en la superficie de la planta
durante la infección por hongos y la germinación. Para cada una de las cuatro
repeticiones, cinco matraces Erlenmeyer que contenían 100 mL de medio líquido fueron
inoculados con 2 x 106 esporas de C. lupini, como se describió anteriormente. Luego, los
matraces se incubaron durante 24 h con agitación a 120 rpm a 25 °C antes de la filtración
para la extracción de ARN.
Se obtuvieron observaciones microscópicas de estructuras morfológicas de plantas
infectantes de C. lupini a partir de secciones de tallo de plantas de lupino de dos semanas
cultivadas in vitro en medio Farheus bajo el mismo fotoperíodo descrito anteriormente.
En condiciones estériles, los extremos cortados se sellaron con cera de parafina fundida
y se colocaron gotas de suspensiones de esporas a 10 5 esporas mL-1 a intervalos a lo largo
del hipocótilo. Después de 12, 24, 48 y 72 hpi, las tiras epidérmicas se retiraron
cuidadosamente, se colorearon con azul de algodón lactofenol y luego se colocaron en
una gota de agua para observación microscópica.
Preparación de muestras de ARN para análisis de secuenciación de ARN
2.2.1. Extracción de ARN de C. lupini de cultivo puro
La extracción de ARN de cultivos puros de C. lupini se realizó a partir de micelio
cultivado en medio Czapek Dox con 0.5 g L-1 de sacarosa como se describió
anteriormente. El micelio se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 m
por el método de filtración Büchner y se congeló en nitrógeno líquido. Se molieron cien
miligramos de micelio congelado en un molino mezclador (Retsch, MM400, Éragny,
Francia) cuatro veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto en un tubo de matriz
A de lisis (MP biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.). La extracción de ARN se realizó
con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las muestras se agitaron utilizando Mixer Mill (Retsch, MM400, Éragny,
Francia) tres veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto, después de agregar el
tampón de lisis RLT. El paso de digestión con ADNasa con el juego de ADNasa libre de
ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania) se añadió después del paso de precipitación de
ácidos nucleicos y siguiendo las instrucciones del fabricante.
2.2.2. Extracción de ARN total de plantas inoculadas
En cada punto de tiempo, las plantas infectadas se retiraron de las macetas Ji y®.
Aproximadamente 100 mg de la radícula de diez plantas inoculadas en las mismas
condiciones se cortaron con bisturí alrededor del área de inoculación o necrosis. Las diez
piezas de plantas se juntaron y congelaron en nitrógeno líquido. Samples GmbH, Bergisch
Gladbach, Alemania) con tubos GentleMACS C tres veces a 4000 rpm durante 20 s. La
extracción de ARN se realizó con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania)
siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen total de tampón de lisis RLT se
ajustó a 1 g de planta molida correspondiente al grupo de diez plantas. Después de la
precipitación del ácido nucleico se añadió el paso de digestión con ADNasa con el
conjunto de ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania). El control de calidad
y cantidad de ARN total se validó utilizando Nanodrop1000 (Thermo Fischer Scientific,
Waltham, MA, EE. UU.) y el análisis del sistema Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent
technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con el kit RNA 6000 Nano LabChip® de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Se esperaba que las muestras examinad as
tuvieran un RIN (número de integración de ARN) superior a ocho, un área total bajo la
curva 18S y 25S superior al 50 % y una proporción de ARNr (25S/18S) superior a 1,8.
Preparación de muestras de ARN para análisis de secuenciación de ARN
1. Extracción de ARN de C. lupini de cultivo puro
La extracción de ARN de cultivos puros de C. lupini se realizó a partir de micelio
cultivado en medio Czapek Dox con 0.5 g.L-1 de sacarosa como se describió
anteriormente. El micelio se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm
por el método de filtración Büchner y se congeló en nitrógeno líquido. Se molieron cien
miligramos de micelio congelado en un molino mezclador (Retsch, MM400, Éragny,
Francia) cuatro veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto en un tubo de matriz
A de lisis (MP biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.). La extracción de ARN se realizó
con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las muestras se agitaron utilizando Mixer Mill (Retsch, MM400, Éragny,
Francia) tres veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto, después de agregar el
tampón de lisis RLT. El paso de digestión con ADNasa con el juego de ADNasa libre de
ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania) se añadió después del paso de precipitación de
ácidos nucleicos y siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Extracción de ARN total de plantas inoculadas
En cada punto de tiempo, las plantas infectadas se retiraron de las macetas Ji y®.
Aproximadamente 100 mg de la radícula de diez plantas inoculadas en las mismas
condiciones se cortaron con bisturí alrededor del área de inoculación o necrosis. Las diez
piezas de plantas se juntaron y congelaron en nitrógeno líquido. Samples GmbH, Bergisch
Gladbach, Alemania) con tubos GentleMACS C tres veces a 4000 rpm durante 20 s. La
extracción de ARN se realizó con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania)
siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen total de tampón de lisis RLT se
ajustó a 1 g de planta molida correspondiente al grupo de diez plantas. Después de la
precipitación del ácido nucleico se añadió el paso de digestión con ADNasa con el
conjunto de ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania). El control de calidad
y cantidad de ARN total se validó utilizando Nanodrop1000 (Thermo Fischer Scientific,
Waltham, MA, EE. UU.) y el análisis del sistema Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent
technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con el kit RNA 6000 Nano LabChip® de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Se esperaba que las muestras examinadas
tuvieran un RIN (número de integración de ARN) superior a ocho, un área total bajo la
curva 18S y 25S superior al 50 % y una proporción de ARNr (25S/18S) superior a 1,8.

COLECTA, AILAMIENTO Y CULTIVO DE Colletotrichum según Dietrich, et all.

(2006)
Colecta de aislamientos. Los aislamientos fueron colectados en campo a partir de tallos,
hojas y vainas infectadas de plantas con antracnosis. Inicialmente se cultivaron en un
medio sólido de agar papa-dextrosa (APD). El aislamiento se llevó a cabo según el
protocolo descrito por AGRIOS (1996). Los cultivos monospóricos se almacenaron a 4
ºC en tubos de ensayo conteniendo APD inclinado.
Repique de aislamientos. El primer repique se realizó en APD, previamente esterilizado
en autoclave a 121 °C por 15 min, mediante un sacabocado de 5 mm de diámetro,
depositándose el disco de micelio al centro de cada placa Petri estéril. Se incubó a 25 °C
por 7 días. El segundo repique se llevo a cabo en frascos Schott o matraces pequeños, con
25 ml de caldo papa-dextrosa (CPD). Se inocularon del mismo modo que el primer
repique, siempre con la precaución de tomar los discos de micelio del margen de los
cultivos (zona de activo crecimiento) anteriormente repicados. Se incubaron a
temperatura ambiente en un agitador a 150 revoluciones por minuto (r.p.m.) por 7 días
(KURAMAE-IZIOKA et al., 1997)
Cultivo de aislamientos: Para el medio sólido 39 g de agar papa-dextrosa (APD) por litro
y 12,5 g glucosa con 200 g de papa por litro de solución, para el medio líquido caldo
papa-dextrosa (CPD).

Extracción de ADN: Nitrógeno líquido. Tampón o buffer de extracción (Tris 1M pH 8,0;

NaCl 3M; β mercaptoetanol; 20 %SDS; EDTA 0.5 M). Acetato de potasio 5M.
Isopropanol frío a –20°C. Tampón TE (Tris 1M pH 8,0; etilendiaminotetra acetato
(EDTA)) 0,5 M. RNAasa (10 mg/mL) (MBI-Fermentas). Fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25: 24: 1). Acetato de sodio 3M. Etanol frío (- 20º C) de 95 y 70%.

Reacción PCR: tampón para PCR 10X (200 mM Tris-HCl pH 8,4 500 mM KCl), MgCL2
50 mM, 100 mM de desoxirribonucleótidos trifosfato dNTP´s (dATP, dGTP, dCTP y
dTTP) (Invitrogen), Taq DNA polimerasa 5U/μl (Invitrogen), agua destilada desionizada
estéril y partidores específicos para amplificar regiones ITS (Internally Transcribed
Spacer) y fragmentos de ADN polimorficos al azar (RAPDs) (10 pmol/μL) (MWG-
Biotech).

Resisitencia de Lupinus albus

En el caso de Lupinus albus, la resistencia a antracnosis es del tipo cuantitativo (Phan et
al., 2007; Yang et al., 2009). La fenotipificación de una población de líneas
recombinantes endogámicas (RILs) en F8, producto de la cruza entre un parental
susceptible y otro altamente resistente, ha demostrado que ese rasgo es cuantitativamente
heredado, dada la distribución fenotípica continua de la resistencia.

- Isoflavonoides como compuestos de defensa. Estos compuestos presentan

actividad antimicrobial, siendo muy tóxicos frente a un amplio rango de patógenos
fúngicos. Estos inhiben la germinación de esporas, la elongación del tubo
germinativo y el crecimiento de las hifas, dañando los sistemas de membrana
(Gould y Lister, 2006)
- Isoflavonoides en la reacción de defensa contra antracnosis en Lupinus. Los
trabajos de Subramanian et al. (2004) y Subramanian et al. (2005), en soya,
apoyan la hipótesis de que las isoflavonas juegan un rol importante en ciertas
formas cuantitativas de resistenciano-raza específica a patógenos. En el caso de la
resistencia de L. albus a C. lupini se trata de un caso de resistencia de control
poligénico de herencia cuantitativa, como lo demuestran Phan et al. (2007).

Se ha reportado la presencia de numerosos compuestos isoflavonoides en lupino

(Gagnon et al., 1992; Katagari et al., 2000) y su actividad fungitóxica ha sido
reportada por Harborne et al. (1976) y Von Baer et al. (2006).

Los principales isoflavonoides encontrados en lupino blanco son: genisteina,

2‘OH genisteina, lupiwighteone, wighteone, licoisoflavone‐B, licoisoflavona A,
OH‐genostin, lupalbine‐A. Los isoflavonoides genisteina, 2‘ hydroxigenisteina,
wighteona, luteone y lupisoflavona son metabolitos secundarios constitutivos en
lupino, no inducidos por el patógeno (Von Baer et al. 2006; D‘Agostina et al.,
2008).

Muth et al. (2009) reportaron aumentos significativos en la concentración de estos

compuestos en tejidos de Lupinus angustifolius inoculados con C. lupini.
 Por otra parte, Bednarek et al. (2001) señalan que se producen cambios
cualitativos y cuantitativos en el contenido de isoflavonoides al estimular tejidos
de L. albus con elicitores fúngicos (YE). Estos autores detectaron un aumento en
las concentraciones de isoflavonoides modificados, principalmente derivados
prenilados (wighteona y luteína).

Figura 1. Vía metabólica de biosíntesis de compuestos fenilpropanoides, entre los que

se encuentran los isoflavonoides (Zabala et al., 2006). Flechas rojas indican enzimas
codificadas por los genes estudiados en el presente trabajo. Abreviaciones: PAL
(Fenilalanina Amonio Liasa), CHS (Chalcona sintasa), CHI (Chalcona isomerasa), CHR
(Chalcona reductasa), IFS (Isoflavona sintasa), IFR (Isoflavona reductasa). Resto de las
abreviaturas ver en artículo citado.

REFERENCIAS:
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de isoflavonoides y su asociación con la resistencia a antracnosis en Lupinus
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concentration during plant development and effect on anthracnose causing fungus
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1029.
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Pensec, F. (2020). Deciphering the infectious process of Colletotrichum lupini in
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