Según la investigación de Carril ga, et all (1987) citado por Dietrich, et all.

(2006) nos
dice que la licoisoflavona B mostró la mayor actividad fungitóxica contra los hongos
Colletotrichum gloesporioides y Cladosporium cladosporioides, seguida de la luteona y
la licoisoflavona A, mientras que las otras isoflavonas (2'-hidroxigenisteína, agustona A,
B, C y genisteína) mostraron una actividad baja y que no se dieron más detalles sobre si
esto puede tener una mayor incidencia o no en la resistencia a la antracnosis, o al menos
en la tolerancia. Pero en la búsqueda de información que se tiene se demuestra que la 2
´- hidroxigenisteina es un precursor de isoflavona antimicótica al catalizar 3´- B- anillos
de prenilación que produce isowighteone el cual es una isoflavona antimicótica que
produce lupinus ante calletotrichum. Las estructuras de isoflavonas presente es chocho o
tarwi (lupinis mutabilis) son:

Según los resultados obtenidos en la investigación de Dietrich, et all. (2006) la hoja

parece ser un buen material para evaluar el contenido de isoflavonas debido a la
cantidad de ellas. De las distintas variedades estudiadas en la variedad Tiptop, que
tolera bien el ataque de antracnosis, se observa la mayor variación de la concentración
de isoflavonas durante el desarrollo de la planta, mostrando la mayor isoflavona total en
roseta (I: 145 días después de la siembra) y la menor al final de la floración (III: 198
después de la siembra). Las variedades probadas de L albus muestran un patrón
decreciente de isoflavonas totales. Además, en todas las variedades, además de Tiptop
al final de la floración, la principal isoflavona fue la licoisoflavona A. En hojas de
diferentes cultivares de L. angustifolius durante la temporada 1999, se observó una
concentración de isoflavonas significativamente mayor al inicio (roseta, I: 30 días
después de la siembra) que en el estadio de desarrollo I de L. albus. Sin embargo, al
final de la floración (L albus y L angustifolius), la cantidad de isoflavonas fue similar y
el patrón decreciente de las mismas durante el desarrollo también fue bastante similar.
En la Figura Nº 7 se compara la actividad fungistática de la genisteína con la de un
fungicida sintético (benomyl) en un medio de cultivo sólido (Agar Malta). Estos
compuestos inhiben el crecimiento de C. lupini, sin embargo, bajas a altas
concentraciones de benomilo mostraron una actividad inhibitoria entre 70% y 97% y la
inhibición debida a la genisteína alcanzó solo 13% a 75%. La actividad antifúngica de
las isoflavonas se evaluó mediante bioensayos en placa de TLC (bioautografía)
utilizando C. lupini como hongo de prueba. La licoisoflavona B fue más fungitóxica que
la 2´OH-genisetina, y el efecto inhibidor de la genisteína fue leve después de 8 días de
incubación. La actividad fungitóxica de los compuestos de prueba disminuye en el
orden siguiente: licoisoflavona A > lupinalbina A > licoisoflavona B - 2'-
hidroxigenisteína > genisteína - wighteona (Fig. 8). De acuerdo con el estudio de
Dietrich, et all. (2006), en una bioautografía utilizando Cladosporium herbarum como
hongo de prueba, la licoisoflavona A mostró una fuerte actividad fungitóxica, seguida
por la wighteona y la licoisoflavona B, sin embargo, la 2´OH-genisteína y la genisteína
fueron compuestos fungitóxicos leves [10].
AISLAMIENTO FÚNGICO Y MATERIAL VEGETAL según Guillaume Dubrulle,
et all. (2020)
1. Condición de cultivo fúngico y preparación de inóculo
La cepa RB221 de C. lupini (IMI 504893; UBOCC-A-117274) se aisló de un cultivo de
lupino en Bretaña en 2014. La secuencia del genoma de esta cepa se obtuvo utilizando
los instrumentos Illumina GAII y HiSeq 4000, y también utilizando la tecnología de
Pacific Biosciences. (PacBio, Menlo Park, CA, EE. UU.). El inóculo de la cepa RB221
se preparó a partir de un cultivo de PDA de dos semanas de edad a 25 °C, agregando al
cultivo 1,5 mL de agua destilada estéril. La concentración de esporas se ajustó a 1 x 10 4
esporas mL-1. Se utilizaron cinco microlitros de la suspensión de esporas para inocular
semillas hervidas de lupino esterilizadas (adaptado de Saubeau et al (2014)) colocadas
en placas de Petri con agua y agar al 1,3 %. Después de una semana de incubación a 25
°C, las esporas se recolectaron agitando las semillas de lupino infectadas en 3–4 ml de
agua destilada y el inóculo de esporas se ajustó a 1 x 10 7 esporas ml-1. Para cada
repetición biológica se preparó un nuevo cultivo fúngico e inóculo.
2. Crecimiento de la planta
La variedad de lupino utilizada para la inoculación fue una variedad primaveral,
denominada Feodora (Jou ray-Drillaud, Cissé, Francia). Las semillas se desinfectaron
durante un minuto en etanol al 70 %, luego se enjuagaron tres veces con agua destilada
estéril antes de colocarlas en medio agua-agar y se incubaron a 25 °C en la oscuridad
durante tres días hasta la germinación. Las plantas inoculadas se cultivaron a 25 C día y
noche, con 16 h de luz y 8 h de oscuridad y 60% de humedad. Las plantas se regaron
cada dos días durante todo el experimento. Los síntomas se evaluaron en todas las
plantas inoculadas midiendo la longitud de la lesión siempre que fuera visible. Se
realizó un ANOVA para estudiar la influencia de la repetición biológica en la longitud
de la necrosis, utilizando el software RStudio (versión 3.2.5). Las diferencias entre
variables se determinaron con pruebas de comparaciones múltiples con el método post
hoc Tukey HSD. El nivel de significación se fijó en = 0,05.
3. Condiciones de inoculación e incubación
Veinte microlitros del inóculo ajustado a 1 x 107 esporas mL-1 se dejaron caer en la base
de la radícula que emerge de la semilla. Las plántulas inoculadas se colocaron en
macetas Ji y® (pellets de turba, 41 mm de diámetro) (Ji y Products International BV,
Zwijndrecht, Países Bajos) durante 24, 36, 48, 60, 72, 84 y 96 hpi. Los tiempos de
muestreo se seleccionaron para apuntar a las primeras etapas de la infección, el supuesto
cambio entre las fases biotrófica y necrotrófica y la fase necrotrófica. A las 24, 48, 60,
72 y 84 hpi, se usaron 10 plántulas inoculadas para el análisis de RNAseq, mientras que
a las 36, 60, 72, 84 y 96 hpi, se usaron 10 plántulas adicionales para el análisis
proteómico. Se realizaron cuatro repeticiones biológicas (excepto a las 96 hpi, cuando
se realizaron tres repeticiones biológicas). Las plántulas inoculadas con agua se usaron
como controles negativos.
Las condiciones de control para los análisis proteómicos y transcriptómicos se
realizaron in vitro en un medio líquido Czapek Dox con 0,5 g.L -1 de sacarosa en lugar
de 30 g.L-1 (adaptado de la composición de caldo BD DifcoCzaPEK-Dox, BD, Franklin
Lakes , NJ, EE. UU.) para simular la baja disponibilidad de carbohidratos en la
superficie de la planta durante la infección por hongos y la germinación. Para cada una
de las cuatro repeticiones, cinco matraces Erlenmeyer que contenían 100 mL de medio
líquido fueron inoculados con 2 x 106 esporas de C. lupini, como se describió
anteriormente. Luego, los matraces se incubaron durante 24 h con agitación a 120 rpm a
25 °C antes de la filtración para la extracción de ARN.
Se obtuvieron observaciones microscópicas de estructuras morfológicas de plantas
infectantes de C. lupini a partir de secciones de tallo de plantas de lupino de dos
semanas cultivadas in vitro en medio Farheus bajo el mismo fotoperíodo descrito
anteriormente. En condiciones estériles, los extremos cortados se sellaron con cera de
parafina fundida y se colocaron gotas de suspensiones de esporas a 10 5 esporas mL-1 a
intervalos a lo largo del hipocótilo. Después de 12, 24, 48 y 72 hpi, las tiras epidérmicas
se retiraron cuidadosamente, se colorearon con azul de algodón lactofenol y luego se
colocaron en una gota de agua para observación microscópica.
Preparación de muestras de ARN para análisis de secuenciación de ARN
2.2.1. Extracción de ARN de C. lupini de cultivo puro
La extracción de ARN de cultivos puros de C. lupini se realizó a partir de micelio
cultivado en medio Czapek Dox con 0.5 g L-1 de sacarosa como se describió
anteriormente. El micelio se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 m
por el método de filtración Büchner y se congeló en nitrógeno líquido. Se molieron cien
miligramos de micelio congelado en un molino mezclador (Retsch, MM400, Éragny,
Francia) cuatro veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto en un tubo de matriz
A de lisis (MP biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.). La extracción de ARN se realizó
con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las muestras se agitaron utilizando Mixer Mill (Retsch, MM400,
Éragny, Francia) tres veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto, después de
agregar el tampón de lisis RLT. El paso de digestión con ADNasa con el juego de
ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania) se añadió después del paso de
precipitación de ácidos nucleicos y siguiendo las instrucciones del fabricante.
2.2.2. Extracción de ARN total de plantas inoculadas
En cada punto de tiempo, las plantas infectadas se retiraron de las macetas Ji y®.
Aproximadamente 100 mg de la radícula de diez plantas inoculadas en las mismas
condiciones se cortaron con bisturí alrededor del área de inoculación o necrosis. Las
diez piezas de plantas se juntaron y congelaron en nitrógeno líquido. Samples GmbH,
Bergisch Gladbach, Alemania) con tubos GentleMACS C tres veces a 4000 rpm durante
20 s. La extracción de ARN se realizó con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen total de tampón de
lisis RLT se ajustó a 1 g de planta molida correspondiente al grupo de diez plantas.
Después de la precipitación del ácido nucleico se añadió el paso de digestión con
ADNasa con el conjunto de ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania). El
control de calidad y cantidad de ARN total se validó utilizando Nanodrop1000 (Thermo
Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y el análisis del sistema Agilent 2100
Bioanalyzer (Agilent technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con el kit RNA 6000
Nano LabChip® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Se esperaba que las
muestras examinadas tuvieran un RIN (número de integración de ARN) superior a ocho,
un área total bajo la curva 18S y 25S superior al 50 % y una proporción de ARNr
(25S/18S) superior a 1,8.
Preparación de muestras de ARN para análisis de secuenciación de ARN
1. Extracción de ARN de C. lupini de cultivo puro
La extracción de ARN de cultivos puros de C. lupini se realizó a partir de micelio
cultivado en medio Czapek Dox con 0.5 g.L-1 de sacarosa como se describió
anteriormente. El micelio se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm
por el método de filtración Büchner y se congeló en nitrógeno líquido. Se molieron cien
miligramos de micelio congelado en un molino mezclador (Retsch, MM400, Éragny,
Francia) cuatro veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto en un tubo de matriz
A de lisis (MP biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.). La extracción de ARN se realizó
con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las muestras se agitaron utilizando Mixer Mill (Retsch, MM400,
Éragny, Francia) tres veces a una frecuencia de 30 Hz durante un minuto, después de
agregar el tampón de lisis RLT. El paso de digestión con ADNasa con el juego de
ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania) se añadió después del paso de
precipitación de ácidos nucleicos y siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Extracción de ARN total de plantas inoculadas
En cada punto de tiempo, las plantas infectadas se retiraron de las macetas Ji y®.
Aproximadamente 100 mg de la radícula de diez plantas inoculadas en las mismas
condiciones se cortaron con bisturí alrededor del área de inoculación o necrosis. Las
diez piezas de plantas se juntaron y congelaron en nitrógeno líquido. Samples GmbH,
Bergisch Gladbach, Alemania) con tubos GentleMACS C tres veces a 4000 rpm durante
20 s. La extracción de ARN se realizó con el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen total de tampón de
lisis RLT se ajustó a 1 g de planta molida correspondiente al grupo de diez plantas.
Después de la precipitación del ácido nucleico se añadió el paso de digestión con
ADNasa con el conjunto de ADNasa libre de ARNasa (Qiagen, Hilden, Alemania). El
control de calidad y cantidad de ARN total se validó utilizando Nanodrop1000 (Thermo
Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y el análisis del sistema Agilent 2100
Bioanalyzer (Agilent technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con el kit RNA 6000
Nano LabChip® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Se esperaba que las
muestras examinadas tuvieran un RIN (número de integración de ARN) superior a ocho,
un área total bajo la curva 18S y 25S superior al 50 % y una proporción de ARNr
(25S/18S) superior a 1,8.

COLECTA, AILAMIENTO Y CULTIVO DE Colletotrichum según Dietrich, et all.

(2006)
Colecta de aislamientos. Los aislamientos fueron colectados en campo a partir de
tallos, hojas y vainas infectadas de plantas con antracnosis. Inicialmente se cultivaron en
un medio sólido de agar papa-dextrosa (APD). El aislamiento se llevó a cabo según el
protocolo descrito por AGRIOS (1996). Los cultivos monospóricos se almacenaron a 4
ºC en tubos de ensayo conteniendo APD inclinado.
Repique de aislamientos. El primer repique se realizó en APD, previamente
esterilizado en autoclave a 121 °C por 15 min, mediante un sacabocado de 5 mm de
diámetro, depositándose el disco de micelio al centro de cada placa Petri estéril. Se
incubó a 25 °C por 7 días. El segundo repique se llevo a cabo en frascos Schott o
matraces pequeños, con 25 ml de caldo papa-dextrosa (CPD). Se inocularon del mismo
modo que el primer repique, siempre con la precaución de tomar los discos de micelio
del margen de los cultivos (zona de activo crecimiento) anteriormente repicados. Se
incubaron a temperatura ambiente en un agitador a 150 revoluciones por minuto (r.p.m.)
por 7 días (KURAMAE-IZIOKA et al., 1997)
Cultivo de aislamientos: Para el medio sólido 39 g de agar papa-dextrosa (APD) por
litro y 12,5 g glucosa con 200 g de papa por litro de solución, para el medio líquido
caldo papa-dextrosa (CPD).
Extracción de ADN: Nitrógeno líquido. Tampón o buffer de extracción (Tris 1M pH
8,0; NaCl 3M; β mercaptoetanol; 20 %SDS; EDTA 0.5 M). Acetato de potasio 5M.
Isopropanol frío a –20°C. Tampón TE (Tris 1M pH 8,0; etilendiaminotetra acetato
(EDTA)) 0,5 M. RNAasa (10 mg/mL) (MBI-Fermentas). Fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25: 24: 1). Acetato de sodio 3M. Etanol frío (- 20º C) de 95 y 70%.

Reacción PCR: tampón para PCR 10X (200 mM Tris-HCl pH 8,4 500 mM KCl),
MgCL2 50 mM, 100 mM de desoxirribonucleótidos trifosfato dNTP´s (dATP, dGTP,
dCTP y dTTP) (Invitrogen), Taq DNA polimerasa 5U/μl (Invitrogen), agua destilada
desionizada estéril y partidores específicos para amplificar regiones ITS (Internally
Transcribed Spacer) y fragmentos de ADN polimorficos al azar (RAPDs) (10 pmol/μL)
(MWG-Biotech).

Resisitencia de Lupinus albus

En el caso de Lupinus albus, la resistencia a antracnosis es del tipo cuantitativo (Phan et
al., 2007; Yang et al., 2009). La fenotipificación de una población de líneas
recombinantes endogámicas (RILs) en F8, producto de la cruza entre un parental
susceptible y otro altamente resistente, ha demostrado que ese rasgo es
cuantitativamente heredado, dada la distribución fenotípica continua de la resistencia.

- Isoflavonoides como compuestos de defensa. Estos compuestos presentan

actividad antimicrobial, siendo muy tóxicos frente a un amplio rango de
patógenos fúngicos. Estos inhiben la germinación de esporas, la elongación del
tubo germinativo y el crecimiento de las hifas, dañando los sistemas de
membrana (Gould y Lister, 2006)
- Isoflavonoides en la reacción de defensa contra antracnosis en Lupinus. Los
trabajos de Subramanian et al. (2004) y Subramanian et al. (2005), en soya,
apoyan la hipótesis de que las isoflavonas juegan un rol importante en ciertas
formas cuantitativas de resistenciano-raza específica a patógenos. En el caso de
la resistencia de L. albus a C. lupini se trata de un caso de resistencia de control
poligénico de herencia cuantitativa, como lo demuestran Phan et al. (2007).

Se ha reportado la presencia de numerosos compuestos isoflavonoides en lupino

(Gagnon et al., 1992; Katagari et al., 2000) y su actividad fungitóxica ha sido
reportada por Harborne et al. (1976) y Von Baer et al. (2006).

Los principales isoflavonoides encontrados en lupino blanco son: genisteina,

2‘OH genisteina, lupiwighteone, wighteone, licoisoflavone‐B, licoisoflavona A,
OH‐genostin, lupalbine‐A. Los isoflavonoides genisteina, 2‘ hydroxigenisteina,
wighteona, luteone y lupisoflavona son metabolitos secundarios constitutivos en
lupino, no inducidos por el patógeno (Von Baer et al. 2006; D‘Agostina et al.,
2008).

Muth et al. (2009) reportaron aumentos significativos en la concentración de

estos compuestos en tejidos de Lupinus angustifolius inoculados con C. lupini.
 Por otra parte, Bednarek et al. (2001) señalan que se producen cambios
cualitativos y cuantitativos en el contenido de isoflavonoides al estimular tejidos
de L. albus con elicitores fúngicos (YE). Estos autores detectaron un aumento en
las concentraciones de isoflavonoides modificados, principalmente derivados
prenilados (wighteona y luteína).

Figura 1. Vía metabólica de biosíntesis de compuestos fenilpropanoides, entre los que se

encuentran los isoflavonoides (Zabala et al., 2006). Flechas rojas indican enzimas
codificadas por los genes estudiados en el presente trabajo. Abreviaciones: PAL
(Fenilalanina Amonio Liasa), CHS (Chalcona sintasa), CHI (Chalcona isomerasa), CHR
(Chalcona reductasa), IFS (Isoflavona sintasa), IFR (Isoflavona reductasa). Resto de las
abreviaturas ver en artículo citado.

REFERENCIAS:
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biosíntesis de isoflavonoides y su asociación con la resistencia a antracnosis en
Lupinus albus L (Doctoral dissertation, Universidad Austral de Chile).

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Hashagen, U. (2006). Isoflavones in Lupinus albus and Lupinus angustifolius:
Quantitative determination by capillary zone electrophoresis, evolution of their
concentration during plant development and effect on anthracnose causing
 fungus Colletotrichum lupini. Journal of the Chilean Chemical Society, 51(4),
1025-1029.

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