ADAPTACIÓN DEL Bacillus subtilis PARA EL DESARROLLO DE

UN CONCRETO AUTORREPARABLE
ADAPTATION OF THE Bacillus subtilis FOR THE DEVELOPMENT OF
A SELF-REPAIRING CONCRETE
Juan Andrés Cuadros Portales*, Elia Martha Múzquiz Ramos*, Gerardo de Jesús Sosa Santillán.
j.cuadros@uadec.edu.mx; emuzquiz@uadec.edu.mx
Recibido 18/08/2019 Aceptado 25/11/2019
Resumen
En esta propuesta se busca desarrollar un concreto autorreparable, el cual incorpora agentes microbianos que sellan los
agrietamientos que sufre el concreto mediante la producción de CaCO3. Para lograr el sellado se requiere un microorganismo
con la capacidad de formar endoesporas, así como un vehículo inmovilizador para resistir las características de producción
y uso del concreto, así que en este estudio se utilizó una cepa de Bacillus subtilis. En esta etapa se reportan las mejores
condiciones para generar la esporulación de la bacteria, y así permitir evaluar su aplicación en una etapa posterior,
primeramente se cultivó y aisló, después se inocularon diferentes caldos de cultivo los cuales se colocaron en una incubadora
tipo shaker por 7 días, con la finalidad de conocer las mejores condiciones de medio cultivo y tiempo de incubación para
obtener el mayor número de endoesporas bacterianas. Finalmente se determinó que el mejor medio está compuesto por: caldo
nutritivo (extracto de carne de res y peptona), sacarosa, levadura y malta, con 96 horas de incubación, obteniendo una
concentración de 1.63 X 109 ± 930 endoesporas/mL, así mismo se decidió usar alginato de sodio como vehículo inmovilizador,
debido a su afinidad inerte con las endoesporas bacterianas.
Palabras clave: Grieta, Bacillus subtilis, Endoesporas.
Abstract
This proposal seeks to develop a self-repairing concrete, which is composed of microbial agents that seal the cracks that
the concrete undergoes through the production of CaCO3. To achieve sealing, a microorganism with the capacity to form
endospores is required, as well as an immobilizing vehicle to resist the characteristics of production and use of the concrete,
as well as in this study to use Bacillus subtilis. In this stage the best conditions to generate the sporulation of the bacteria are
reported, and thus allow to evaluate its application in a later stage, it was primitively cultivated and isolated, then different
culture broths were inoculated which were placed in a shaker type incubator for 7 days, in order to obtain the largest number
of bacterial endospores. Finally it was determined that the best medium is composed of: nutritious broth, sucrose, yeast and
malt, with 96 hours of incubation, obtaining a concentration of 1.63 X 109 ± 930 endospores / mL, likewise it was decided to
use alginate as an immobilizing vehicle, due to its inert affinity with bacterial endospores.
Keywords: Crack, Bacillus subtilis, Endoespores.

Introducción Schlangen, 2010). Las microgrietas además pueden llegar

Deterioro del concreto
El concreto es un material que sufre deterioros de
muchas maneras, pero cabe destacar que se pueden dividir
generalmente en 3 tipos: fallas debido a errores de diseño,
fallas por sometimiento de fuerzas excedentes y fallas por
falta de mantenimiento. En todos estos tipos de fallas se
manifiesta como un primer aviso la aparición de una grieta.
Esta investigación está enfocada en erradicar fallas por
falta de mantenimiento, a causa de la aparición de grietas y
microgrietas, ya que las microgrietas conectadas entre sí,
pueden dar paso a humedad u otros agentes oxidantes, que
son perjudiciales tanto para la matriz del concreto como
para el acero de refuerzo, que incorpora el concreto
armado. (Jonkers, Thijssen, Muyzer, Copuroglu,
a formar grietas de mayor tamaño y causar daños mayores
como: desconchamiento, fallas por esfuerzos cortantes,
fallas por tensión debido a la corrosión del acero, o incluso,
en casos extremos la desintegración constante de la matriz
del concreto hasta lograr una deficiencia total o parcial de
la estructura de un bien inmueble, poniendo en riesgo vidas
humanas. (Jonkers, 2007)
Biorreparación
Hay que tomar en cuenta que para conseguir sellar los
agrietamientos de una manera autónoma en el concreto, se
debe incorporar un microorganismo dotado con el nutriente
adecuado para conseguir ser un catalizador de minerales,
así mismo debe poseer la capacidad de resistir las
condiciones altamente alcalinas que se generan en el
mezclado del concreto y por consiguiente las fuerzas

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mecánicas del mezclado, como también los esfuerzos a los
que está sometido en su vida útil. Una forma de vida muy
resistente se puede encontrar en las endoesporas
bacterianas de los géneros Bacillus y Clostridium ya que
son altamente resistentes a condiciones ambientales
adversas, a través de una intrincada red de interacciones
ADN-proteína y proteína-proteína. (Pérez, Montoya,
2013). Entonces una vez incorporadas las endoesporas en
la matriz del concreto, así como los nutrientes precursores
de minerales el sellado de las grietas se desarrolla cuando
el concreto sufre un agrietamiento, el cual da paso a
humedad, que al mezclarse con los nutrientes forman un
medio viable para la vida del microorganismo, el cual
producirá CaCO3; este mineral producto del metabolismo
de la bacteria va rellenando la grieta poco a poco hasta
lograr un sellado total, deteniendo la entrada de humedad o
gentes dañinos para la estructura de concreto. (Seifan,
Khajeh, Berenjian, 2016).
Endoespora bacteriana
La idea principal es obtener el mayor número de
endoesporas bacterianas, ya que así aumenta la
probabilidad de germinación de las endoesporas, para
poder desarrollarse y consiguientemente producir el
CaCO3. Algunos géneros de microorganismos procariotas
poseen la capacidad de producir endoesporas, la cual es un
estado latente de la célula, que utiliza como mecanismo de
defensa cuando se encuentra en ambientes hostiles, lo que
le brinda esta característica de supervivencia son una gran
cantidad de diminutas proteínas especiales localizadas en
el núcleo, llamadas SASPs, (del inglés "small acid-soluble
proteins"). Su función inicia cuando se logra la
germinación de la endoespora, entonces estas proteínas se
hidrolizan rápidamente, y en consecuencia los aminoácidos
resultantes auxilian en la síntesis de nuevas proteínas
necesarias en la germinación y crecimiento ulterior. (Pérez,
Montoya, 2013). Además, las SASPs condensan el ADN y
le brindan resistencia a los rayos de luz ultravioleta, y así
mismo cada parte de la endoespora cumple una función
específica, como se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Partes de la endoespora bacteriana y sus
funciones. Fuente: Propia.
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A causa de las características estudiadas en los
microorganismos, para realizar esta etapa de la
investigación se eligió el bacilo Bacillus subtilis, un
microorganismo gram-positivo aerobio, que posee la
característica de formar endoesporas y además no es
nocivo para el ser humano, esta bacteria saprófita vive en
la tierra, aire, agua y en la mayor parte de vegetación, por
lo cual es un microorganismo que toma nutrientes
fácilmente del medio ambiente, por lo que logra
desarrollarse en casi cualquier entorno natural, alcanzando
una mayoría de usos para el concreto. (Falcone, Romano,
1971).
Inmovilización de endoesporas
A pesar de que se lograra obtener endoesporas
bacterianas, las cuales ya son muy resistentes a diferencia
de las células bacterianas vivas, su traslado y
almacenamiento antes de usarse podría complicar la alta
demanda que tiene en el mundo la producción de concreto,
en cuanto a tiempos de operación y logística de
movimientos, por lo tanto se debe buscar un vehículo
inmovilizador que la proteja de poder germinar o
contaminarse antes de su uso primordial, el cual es dentro
de la matriz del concreto, pero fundamentalmente debe
protegerse de las fuerzas a compresión de alto desempeño
que está sometido el concreto. (Wang, Belie, Verstraete,
2011). Afortunadamente se ha estudiado ampliamente el
uso de medios para la inmovilización de microorganismos
que cumplen estas necesidades en materia de vehículo
protector, en diversos usos como: médicos, industriales o
de investigación avanzada. (Wang, Mignon, Snoeck,
Wiktor, Vliergerghe, Boon, Belie, 2015).
Materiales y Métodos
Producción de endoesporas de Bacillus subtilis
Se realizaron curvas de esporulación bacteriana por el
método de conteo en cámara de neubauer, en relación a
tiempo y número de endoesporas/mL, para esto se
realizaron diferentes medios de cultivo por duplicado (a &
b), con una duración total de 168 horas de incubación,
tomando muestras para cuantificar endoesporas cada 12
horas, a una temperatura constante de 35°C, dentro de una
incubadora tipo shaker, a una velocidad de agitación
constante de 100 rpm, solamente teniendo como variables:
nutrientes y agentes de estrés, en conjunto los diferentes
medios de cultivo se muestran en la Tabla 1.
Hay que tomar en cuenta que al retirar los medios de
cultivo y después de someterlos al agente de estrés indicado
en la Tabla 1, estos se volvieron a introducir a la incubadora
para continuar con su proceso de 168 horas de incubación.
Almacenamiento de endoesporas obtenidas
Una vez terminado el proceso de incubación es
necesario almacenar las endoesporas en una solución
fisiológica libre de nutrientes que puedan causar la en la que se ha desarrollado el microorganismo, ya que al
germinación de las mismas, por lo tanto primero se agotarse los nutrientes deja de haber un crecimiento
recolectaron por medio de centrifugación a 3000 rpm bacteriano y comienza la formación de endoesporas.
durante 5 minutos, una vez eliminado el sobrenadante, el
En la Figura 3, se pueden observar las endoesporas de
asentado de endoesporas se disolvió en una solución
Bacillus subtilis inmovilizadas dentro de la matriz de
fisiológica con una concentración de 8 g de NaCl por litro
alginato de sodio, de la misma manera, se puede percibir la
de agua destilada, y se almacenaron a 4°C hasta el
capa proteica externa de las endoesporas, por lo que el resto
momento de integrarse al agente inmovilizador.
de sus demás capas interiores se deben encontrar en buen
Inmovilización de endoesporas en alginato de sodio estado, por lo tanto la matriz de alginato de sodio funciona
bien como agente inmovilizador.
Para proteger las endoesporas bacterianas de las fuerzas
a las que está sometido el concreto, además de
inmovilizarlas para evitar una germinación temprana, se
Tabla 1. Medios de cultivo para formar endoesporas.
utilizó alginato de sodio como agente inmovilizador. La
preparación del medio para las endoesporas se realizó con Identificación Nutrientes Agente de estrés
una proporción de 19 g de alginato de sodio en un litro de
BS1 (a & b) Caldo nutritivo Ninguno
agua destilada, con ayuda de un agitador magnético con
calentamiento a 60°C durante 5 minutos. BS2 (a & b) Caldo nutritivo Baño de agua a
80°C durante 15
Para constatar que la matriz de alginato de sodio como
min, con 72 horas
agente inmovilizador no fuese a dañar las endoesporas
bacterianas, mediante MEB se analizaron las muestras de de incubación
endoesporas del Bacillus subtilis. BS3 (a & b) Caldo nutritivo, Ninguno
sacarosa, malta
Resultados y levadura
En la Figura 2 se presentan las curvas de esporulación BS4 (a & b) Caldo nutritivo, Baño de agua a
bacteriana de los diferentes medios de cultivo descritos en sacarosa, malta 80°C durante 15
la Tabla 1, graficando promedio de duplicados (a & b). y levadura min, con 72 horas
Analizando las curvas de las medios BS2 y BS4 se de incubación
puede deducir que al exponer los bacilos a una mayor Fuente: Propia.
temperatura para crear un ambiente más hostil y así forzar
a la bacteria a formar la endoespora, este procedimiento en
realidad no es del todo favorecedor para esa finalidad, ya
que, si bien después de someterlas a calentamiento en baño
de agua, sí crece un poco el número de endoesporas, esta
cantidad se vuelve relativamente constante hasta el final
del periodo de incubación, a diferencia de los medios BS1
y BS3 los cuales no se sometieron a este tratamiento y por
lo que se puede observar en la Figura 2, el número de
endoesporas va en aumento conforme transcurre el tiempo
de incubación, esto podría ser porque al someter las
muestras BS2 y BS4 a calentamiento el resto de bacilos
vivos que no han formado endoesporas o no alcanzan a
formar endoesporas durante el periodo que aumenta la
temperatura, al estar en un ambiente demasiado hostil estos
bacilos mueren, por lo tanto el número de endoesporas en
el medio se mantiene constante hasta el final del periodo de
incubación.
Caso contrario en las muestras BS1 y BS3, ya que el
número de endoesporas va en constante aumento hasta el
final del periodo de incubación, por lo que se puede deducir Figura 2. Conteo de endoesporas/mL. Fuente:
que la esporulación del Bacillus subtilis, es más alta cuando Propia.
hay un medio enriquecido con mayor variedad de
nutrientes y además es más conveniente que la temperatura
para producir una mayor esporulación sea constante e igual

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 Seifan, M., Samani, A., Berenjian, A. Bioconcrete: next
generation of self-healing concrete. Applied Microbiology
and Biotechnology, 100(6), 2591–2602. (2016).
Wang, J., De Belie, N., Verstraete. W. Diatomaceous
earth as a protective vehicle for bacteria applied for self-
healing concrete. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology, 39(4), 567–577. (2012).
Jonkers H.M. Self Healing Concrete: A Biological
Approach. In: van der Zwaag S. (eds) Self Healing
Materials. Springer Series in Materials Science, vol 100.
Springer, Dordrecht. 195-204. (2007)

Figura 3. Microfotografía de endoesporas del

Bacillus subtilis, dentro de la matriz de alginato de
sodio. Fuente: Propia.
Conclusiones
En suma de los resultados obtenidos en esta
investigación, se determinó que el mejor medio de cultivo
para producir la mayor cantidad de endoesporas del
Bacillus subtilis, en su relación al tiempo, está compuesto
de: caldo nutritivo (extracto de carne de res y peptona),
sacarosa, levadura y malta, con 96 horas de incubación,
obteniendo una concentración de 1.63 X 109 ± 930
endoesporas/mL, cabe destacar que hay mayor
concentración de endoesporas/mL a 168 horas de
incubación, pero se prefiere acotar el tiempo a 96 horas de
incubación ya que no es muy significativa la diferencia de
endoesporas, además es más conveniente un periodo menor
de incubación, para fines de producción del concreto, así
mismo se decidió usar alginato de sodio como vehículo
inmovilizador, debido a su afinidad inerte con las
endoesporas bacterianas.
Referencias
Wang, j., Mignon, A., Snoeck, D., Wiktor, V., Van
Vliergerghe, S., Boon, N., De Belie, N. Application of
modified-alginate encapsulated carbonate producing
bacteria in concrete : a promising strategy for crack self-
healing. Front. Microbiol, 6, 1–14. (2015).
Falcone, G., Romano, H. Sugar uptake by germinating
bacillus subtilis spores. Febs Letters, 16(I), 56-59. (1971).
Jonkers, H. M., Thijssen, A., Muyzer, G., Copuroglu,
O., Schlangen, E. Application of bacteria as self-healing
agent for the development of sustainable concrete.
Ecological Engineering, 36(2), 230-235. (2010).
Pérez Mancilla, X., Montoya Castaño, D. Formación de
endosporas en Clostridium y su interacción con el proceso
de solventogénesis. Revista Colombiana de Biotecnología,
XV(1), 180-188. (2013).

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