Guía 7

1- Defina cada uno de los siguientes conceptos:

2- • Antimicrobiano o antibiótico: Sustancia con suficiente actividad antimicrobiana que se puede emplear para
el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
3- • Espectro de acción: rango de microorganismos contra el cual un antimicrobiano es activo
4- • Prueba de sensibilidad antimicrobiana (PSA): La finalidad primordial de una PSA, es la de predecir
cómo se comportará una cepa bacteriana al ser confrontada a un antibiótico en el paciente.
5- • Concentración Mínima Inhibitoria: mínima concentración de antibióticos que inhibe el crecimiento
bacteriano.
6- • Resistencia antimicrobiana: proceso el cual microorganismos desarrollan resistencias a los fármacos que
se utilizan para tratarlos.
7- • Sensibilidad antimicrobiana: susceptibilidad de un microorganismo frente a los
medicamentos antimicrobianos (bacterias, hongos o virus)
8- • Antibacteriano: sustancia que destruye las bacterias o les impide que crezcan y causen enfermedad.
9- • Antiviral: tipo de fármaco usado para el tratamiento de infecciones producidas por virus
10- • Antimicótico: sustancia utilizada para combatir las infecciones por hongos
11- • Profilaxis: acción preventiva de la aparición de las enfermedades infectocontagiosas, y en el caso de que
suceda su manifestación, la profilaxis busca contrarrestar su propagación en la población
12- • Resistencia intrínseca: son características innatas del microorganismo transmitidas verticalmente. Está en
el genoma, son resistentes.
13- • Resistencia adquirida: cambios en el material genético (mutación, adquisición de material genético
exterior). Transmisión horizontal. Mutación, plásmidos. Captación de material genético

2. Realice una breve reseña del desarrollo histórico de la quimioterapia antimicrobiana.

¿Qué es un antibiótico? Es una molécula natural, semisintética o sintética, capaz de inducir la muerte o la
detección del crecimiento de bacterias.
En la literatura hace referencia que los antibióticos funcionan solo para el tratamiento de bacterias.
La penicilina fue descubierta en 1896 por un joven francés de 21 años llamado Ernest Duchesne.
La historia de la quimioterapia comenzó en 1904, cuando Ehrlich descubrió que el tinte rojo tripán era activo
contra el tripanosoma que causa la enfermedad del sueño africano.
Posteriormente a inicios del siglo XX (20), (Se crean las arsenaminas para la sifilis que fue el primer régimen
quimioterapéutico planeado) Ehrlich y un joven científico japonés
En la década de 1920, Alexander Fleming, un médico escocés, encontró que las lágrimas humanas contenían un
antibacteriano natural sustancia que él denominó "lisozima”. Desafortunadamente, esta sustancia tenía poco
valor terapéutico porque no podía aislarse en grandes cantidades y no fue eficaz contra muchos microorganismos.
En 1927, el gigante de la industria química alemana, I. G. Farbenindustrie, inició una búsqueda a largo plazo de
agentes quimioterapéuticos bajo la dirección de Gerhard Domagk. Domagk descubrió que Prontosil Rojo, un
nuevo tinte para teñir el cuero protegía completamente a ratones contra estreptococos patógenos y
estafilococos sin toxicidad aparente.
En 1928, Fleming notó que una placa de Petri de Staphylococcus también tenía un moho creciendo en él y, como
la lisozima que había descubierto años antes, no había colonias de Staphylococcus alrededor. Fleming dedujo
correctamente que el contaminante del moho produjo una sustancia difusible, a la que llamó penicilina. En
posteriores estudios demostró que esta sustancia podía difundirse a través del agar de modo que incluso pequeñas
cantidades extraídas de cultivos de caldo podría matar varias bacterias patógenas, incluida Staphylococcus aureus.
Penicilina: Alexander Fleming descubrió los antibióticos con la penicilina en 1929. Un hongo contaminó su placa
de cultivo con Staphylococcus aureus, ese hongo era Penicillium y mató a los microorganismos.
La era actual de la quimioterapia antimicrobiana empezó en 1935 con el descubrimiento de las sulfonamidas
En 1939 Howard Florey, estaba probando la actividad bactericida de muchas sustancias, incluidas la lisozima y
las sulfonamidas. Después de leer el artículo de Fleming sobre la penicilina, con uno de los compañeros de
trabajo, Ernst Chain, obtuvieron el cultivo de Penicillium de Fleming y se dedicó a cultivarlo y purificar la
penicilina. Florey y Chain fueron muy ayudados en esto por el bioquímico Norman Heatley. Heatley ideó el
ensayo, cultivo técnicas de purificación necesarias para producir penicilina cruda para más experimentación.
Cuando se inyectó penicilina purificada en ratones infectados con estreptococos o estafilococos,
prácticamente todos los ratones sobrevivieron.
Un grupo de científicos E. Chain y H. Florey en 1940 demostraron que la penicilina era una sustancia terapéutica
efectiva. Después del 1940 fue la era dorada de los antibióticos
Selman Waksman en 1944 junto con sus socios habían encontrado un nuevo antibiótico, estreptomicina,
producido por el actinomiceto Streptomyces griseus. Este descubrimiento surgió del examen cuidadoso de unas
10.000 cepas de bacterias del suelo y hongos. La importancia de la estreptomicina no puede subestimarse, ya que
fue el primer fármaco que pudo tratar con éxito la tuberculosis.
Microorganismos productores de cloranfenicol, neomicina, terramicina y tetraciclina se aislaron en 1953.
3. Describa las características fundamentales de un fármaco antimicrobiano.

 No debe ser toxico para las personas.

 Tiene que ser solubles en agua y lípidos.
 Eficaz a bajas concentraciones y ser capaz de funcionar en presencia de materia orgánica.
 Barato.
Toxicidad selectiva: El agente debe tener toxicidad selectiva: debe matar o inhibir el patógeno microbiano
mientras daña al huésped lo menos posible.
El índice terapéutico: Relación entre la dosis tóxica y la dosis terapéutica. A mayor es el índice terapéutico,
mejor es el agente para quimioterapia (en igualdad de condiciones).
Los fármacos pueden ser producidos de varias formas:

Antibióticos no sintéticos; producidos por microorganismos ejemplo penicilina

Antibióticos sintéticos: fármacos totalmente de síntesis creados en el laboratorio ej; sulfamidas
Antibióticos semisintéticos: disponen de un esqueleto producido por microorganismos y modificados por
médicos químicos ej; ampicilina.
Los fármacos varían considerablemente en su rango de eficacia. Muchos son fármacos de:

Espectro estrecho: Son eficaces contra una variedad limitada de patógenos.

Amplio espectro: Que atacan a diferentes tipos de patógenos.
Los fármacos también pueden clasificarse según el grupo de microbios contra el que actúan: antibacteriano,
antifúngico, antiprotozoario y antivírico.
4. Describa los siguientes mecanismos de acción de los antimicrobianos:

Inhibición de la síntesis de pared celular: causan alteraciones en la pared celular que terminan
matando al organismo. Inhibe la reacción de transpeptidación y se bloquea la síntesis de
peptidoglucano. El siguiente paso quizá comprende la eliminación o inactivación de un inhibidor de
las enzimas autolíticas en la pared celular. De esta manera, se activa la enzima lítica, con lo que
empieza la lisis.
Inhibición de la síntesis de proteínas: las sustancias se unen a las subunidades de los ribosomas
causando que se copie mal una proteína, produciendo una ruptura de esta y una degradación del
ribosoma.
Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos: los compuestas se unen a moléculas importantes para
síntesis, ADN girasa y polimerasa, impidiendo que estas funcionen.
Inhibición de biosíntesis de folatos: evitan la síntesis de ácido fólico en las bacterias, evitando la
formación de folatos, transporte de compuestos de un carbono en la síntesis de purinas, timidina y
algunos aminoácidos y, por ende, de los ácidos nucleicos y proteínas en forma indirecta.
Afectación de la integridad de la membrana celular: algunas sustancian inhiben la producción de
ácidos teitoicos, otros simplemente destruyen la membrana y otros crean agujeros permitiendo el paso
descontrolado de sustancias externas.
5. Elabore un cuadro o esquema mediante el cual clasifique las diferentes familias de antimicrobianos con
base en su mecanismo de acción.
a. Inhibición de la síntesis de pared celular: beta-lactámicos, glucopéptidos actúan sobre el entrecruzamiento de
péptidos la pared celular
b. Inhibición de la síntesis de proteínas: aminoglucósidos, macrólidos (muy utilizados), tatraciclina (los
aminoglucósidos bloquean los ribosomas 30s y 50s y tetraciclina a los 30s)
c. Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos: quinolonas, rifampicina (permite el control de Mycobacterium
tuberculosis), sulfonamidas. (las quinolonas atacan al ADN girasa y la rifampicina no deja que se forme ARNm)
d. Inhibición de biosíntesis de folatos: sulfametaxazol y Sulfonamidas (sulfonamidas evita que se forme al ácido
fólico)
e. Afectación de la integridad de la membrana celular: Polimixinas, Ácido nalidíxico (muy utilizado a nivel
clínico) Novobiocina y Ionóforos (polimixinas destruye la membrana celular y de esa manera ingresan sustancias)
6. Cite dos fármacos pertenecientes a cada familia de antimicrobianos.
Beta-lactámicos: penicilina y cefalosporinas
Glicopéptidos: vancomicina y teicoplanina.
Aminoglucósidos: estreptomicina y neomicina.
Macrólidos: eritromicina y azitromicina.
Quinolonas: ácido nalidíxico y ciprofloxacino
Sulfonamidas: cotrimacina y cotrimoxazol
7. Mediante un dibujo describa los distintos mecanismos de resistencia de las bacterias a los antibióticos.
Los plásmidos crean una enzima trasportadora que saca el antibiótico de la bacteria
Algunas enzimas destruyen el antibiótico antes de que ingrese a la bacteria
Una enzima que altera los antibióticos para que ya no pueda atacar
La bacteria puede alterar el blanco y de esa manera el antibiótico no sabrá que atacar
Barreras de exclusión Blancos alterados Desactivación enzimática
Por medio de procesos de transformación, transducción, transposición y conjugación las bacterias pueden adquirir
esas resistencias por medio de plásmidos para hacer los mecanismos de defensa.

8. ¿Cuál es la situación mundial actual de la resistencia de antibióticos? ¿Cuáles son las fuentes u orígenes
de esta resistencia a antibióticos?

Un número, 700 mil, notable de personas mueren al año debido a enfermedades provocadas por
bacterias resistentes. Se espera que si no se realiza cambios en la manera en la que se manipulan los
antibióticos la cifra cambie a 10 millones para 2050. Señalaron que la falta de regulación, el uso de
antibióticos como promotores del crecimiento en animales y la venta libre y por internet han
provocado un auge de los antimicrobianos falsificados o de mala calidad. También consideraron
imperativo que los actores involucrados en la producción y procesamiento de alimentos, la cría de
animales y la agricultura estén presentes en los debates sobre la resistencia a los antimicrobianos
puesto que el sector alimentario es el mayor consumidor de antimicrobianos.
9- Mediante dibujos describa brevemente el método de difusión conocido como técnica de Kirby Bauer.

Método de Kirby-Bauer: método más utilizado para determinar la sensibilidad de un agente bacteriano frente a
un antibiótico.
1. Se prepara el inóculo (inicia con cultivo bacteriano puro, previamente caracterizado con un asa bacteriana se
toca una colonia aislada y se inocula en un tubo con solución salina estéril) es importante el uso del mechero
para flamear el asa y la boca del tubo de ensayo.
Se debe agitar vigorosamente el inoculo en el tubo de ensayo, hasta obtener una solución homogénea de
aproximadamente 1.5x10^8 UFC/mL eso se logra con el estándar de turbidez de Macfarlan de 0,5. Simplemente
se compara el grado de turbidez de inoculo con el estándar. Si la turbidez está por debajo del estándar se debe de
tomar una o más colonias del cultivo hasta igualar la turbidez. Si la turbidez es mayor, se recomienda iniciar
nuevamente con el inoculo.
2. Siembra de inoculo en el medio de cultivo MuMueller-Hinton: se debe de rotular debidamente la placa que
tiene el cultivo MuMueller Hinton. Seguidamente se introduce un isopo de algodón estéril al tubo. Con el inoculo
estandarizado del paso anterior. El exceso de líquido se eliminará haciendo rotar el inoculo suavemente por las
paredes del tubo. Con el inoculo debidamente humedecido se inoculará en 3 o 4 direcciones en toda la placa con
el agar. (descartar el inoculo en solución de hipoclorito)
3. Aplicación de los sensidiscos: con una pinza estéril, se toma los sensidiscos previamente seleccionados. (Los
sensidiscos contienen los antibióticos a evaluar) se ubican simétricamente en la superficie del agar MuMuellen
Hinton (para algunos microorganismos se puede utilizar agar sangre) también puede ser utilizado el dispensador
de sensidiscos lo cual facilita el trabajo. Ya que permite ubicar simétricamente en el agar varios sensidiscos al
mismo tiempo. Se debe de ubicar el dispensador sobre el agar y dispensar los sensidiscos con presión
cuidadosamente. Se retira el dispensador y se verifica la disposición de los sensidiscos. Se lleva los medios a la
incubadora durante 12-24h a 37 grados Celsius
4. Lectura e interpretación: se retiran los medios de la incubación para realizar la lectura la que se hace
mediante la observación de la presencia del halo de inhibición alrededor de los sensidiscos (el halo de inhibición
indica que no hay crecimiento de microorganismos, ya que el microorganismo es sensible al respectivo
antibiótico) sin embargo es necesario verificar la sensibilidad o la resistencia del microorganismo frente al
antibiótico. Esto se hace midiendo el halo de inhibición resultado que debe de ser consultado en la base de datos y
literatura y de esa manera poder recomendar un antibiótico para el tratamiento.
.

10. Describa brevemente el fundamento o principio de la prueba de e-test.

-Técnica para determinar la CIM
-Fácil aplicación
-En una placa de Petri con Mueller-Hinton se siembra el microorganismo previamente aislado e identificado
-Se coloca la tira E-test que tiene distintas concentraciones de este ATB (de más a menos concentrado)
-Se incuba de 18-24h a 37 grados Celsius
¿Cómo se lee? Concentraciones elevadas de ATB: se observa un claro halo de inhibición. Punto donde se
encuentra la CIM. Concentraciones menores de ATB: se observa que a esas concentraciones el antibiótico es
incapaz de inhibir el crecimiento microbiano.
Esta técnica se realiza en pxs con infecciones severas, para determinar susceptibilidad de Streptococcus
pneumoniae a la penicilina, entre otras.
11 ¿Cuál es el principio de la prueba de susceptibilidad a antibióticos mediante dilución en caldo?
Las pruebas de dilución en caldo (generalmente Caldo Mueller-Hinton) determinan en forma directa la
concentración inhibitoria mínima (CIM) utilizando diluciones en serie de la sustancia antimicrobiana en caldo
que abarcan un rango clínicamente significativo de concentraciones. Las diluciones se preparan en tubos o pozos
para micro dilución y, por convención, se duplican utilizando una base de 1 μg/mL (0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 y así
sucesivamente). El inóculo bacteriano del aislado del paciente se ajusta a un estándar (10^5 a 10^6 bacterias/mL)
y se añade al caldo. Después de incubar por un tiempo definido se examina la turbiedad de los tubos producida
por el cultivo bacteriano. El primer tubo en el que no existe crecimiento visible (claro) es la CIM para ese
organismo.
Medir las concentraciones en tubos de dilución poniendo diferentes concentraciones del antibiótico y se pone un
inóculo bacteriano para ver cuál concentración es capaz de controlar a la bacteria

12. Cite 6 ejemplos de antivirales.

 Adefovir
Cidofovir
Lamivudina (3TC)
Aciclovir
Entecavir
Tenofovir

13. Mediante dibujos representa el resultado positivo y negativo de las siguientes pruebas bioquímicas:
Oxidasa

Catalasa

Indol

Voges Proskauer
Rojo metilo

Positiva Negativa
Movilidad

Descarboxilación de ornitina

Citrato
14- Elabore dibujos con los diferentes posibles resultados al utilizar un agar TSI.

Fermentación exclusiva de glucosa (K/A) = rojo en la parte superior y amarillo en el fondo

Fermentación de glucosa y 1 o los otros 2 azúcares (A/A) = totalmente amarillo

Bacteria que no fermenta ningún carbohidrato (K/NC) = rojo en el fondo

Producción de gas (G) = burbujas o cortado

Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) precipitado negro

15- ¿Cómo funciona el sistema semiautomatizado de identificación bioquímica API®? Descríbalo.

Galería API 20E
Permite la identificación de microorganismos pertenecientes a la familia de las enterobacterias y de otros bacilos
Gram negativos.
Consta de 21 tests bioquímicos estandarizados. Cada tira API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos
sustratos deshidratados; la prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.
A partir de una colonia bien aislada del microorganismo, se hace una suspensión en 5 mL de solución salina
(1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril.
o Si no tiene ningún señalamiento debajo del nombre de la prueba se llena solo el posillo, no la cúpula
o Si tiene __ bajo el nombre, se llena todo el posillo, pero la cúpula se llena con parafina.
o Si tiene └┘bajo el nombre se llena el posillo y la cúpula.
 Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en los alvéolos de la cámara
para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.
Incubar a 37 °C durante 18-24 h.

Tras la incubación hay resultados inmediatos y hay otros que necesitan reactivos como:

o TDA: añadir 1 gota (FeCl3 10 %.). Es positivo si se vuelve marrón rojizo.

o IND: 1 gota de reactive James o Kovacs
o VP: 1 gota de VP1 (KOH al 40%) y 1 gota de VP2 (C2 H5 OH). Si luego de 10 min es rosadito o no
cambia es (-), si es rosado intenso antes de los 10 min es (+)

Galería API 20 NE
Permite la identificación de bacilos Gram negativos no pertenecientes al grupo de las enterobacterias como por
ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas, entre otros.
Se toman de 2 a 4 colonias y se hace una suspensión en 2ml de NaCl 0,85%. Una parte de esta disolución se
utiliza para llenar solo los posillos de las pruebas del NO al PNPG. Y las pruebas GLU, ADH y URL
(tienen el __ bajo sus nombres) se llenan las cúpulas con parafina.
La otra parte de la suspensión en 2ml de NaCl 0,85% se toman 200 µL y se colocan en una suspensión
auxiliar de API. Luego de esta segunda suspensión se llenan todo el resto de posillos y cúpulas (de GLU a
PAC o sea los que tienen el └┘bajo el nombre: tienen 3 rayas naranjas).
Tras la incubación hay resultados inmediatos y hay otros que necesitan reactivos como:

o NO3: 1 gota de NIT1 + 1 gota de NIT2. Si luego de 5 min no cambia se le agrega una punta de espátula
 o de Zn y si luego de otros 5 min no cambia la prueba es (+)
o TRP: 1 gota de reactivo James.

16- ¿Cómo funciona el sistema automatizado convencional Vitek® para la identificación bioquímica de
microorganismos? Descríbalo.

El sistema VITEK es un sistema automatizado de identificación bacteriana y estudio de sensibilidad

antimicrobiana. La identificación de las bacterias se basa en la inoculación de una suspensión de
microorganismos en tarjetas con determinados paneles de reacciones bioquímicas. La sensibilidad
antimicrobiana se lleva a cabo en forma similar a través de tarjetas que contienen diluciones
estandarizadas de distintos antibióticos correspondientes a los puntos de corte de sensibilidad
establecidos por NCCLS1. Este sistema se ha empleado para el estudio de cepas clínicamente
significativas aisladas de muestras clínicas u otras fuentes como alimentos y agua.
Existen 4 tipos de tarjetas reactivas disponibles para la identificación de diferentes clases de organismos:
GN – Bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores.
GP - Cocos y bacilos no formadores de esporas Gram positivos
YST – Levaduras y organismos levaduriformes
BCL – Bacilos formadores de esporas Gram positivos

17- ¿Cuál es el fundamento de la espectrofotometría de masas MALDI-TOF? ¿Cuál es su relación con la

identificación bacteriana?
La espectrometría de masas se ha empleado en los laboratorios clínicos como una herramienta de
análisis en química clínica para el diagnóstico de algunos tipos de cáncer, trastornos hereditarios y
nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades. El uso de la espectrometría de masas para
identificar bacterias a través de la detección de biomarcadores fue propuesta en 1975 por Anhalt y
Fenselau, mediante un estudio que combinó métodos de pirólisis y espectrometría de masas para la
caracterización de especies bacterianas patógenas; en el que, al analizar pequeñas moléculas
 derivadas de bacterias liofilizadas, los autores lograron diferenciar organismos taxonómicamente
distintos, pero no lograron diferenciar entre aquellos estrechamente relacionados.

18- Complete adecuadamente el cuadro a continuación:

Especie Oxidasa Catalasa Crecimiento Crecimiento Crecimiento en TSI Otras

en Manitol en Agar Agar Sangre pruebas
Sal McConkey

Escherichia coli 0 + NA ++++, UFC ++++ A/A, Indol +

rosadas, +G VP+
umbilicadas,
lactosa +
Pseudomonas ++++ +/++ NA ++++, sin ++++ K/NC Gram
aeruginosa viraje del negativo
medio, UFC
incoloras
Staphylococcus 0 ++++ ++++, viraje NA ++++, beta NA Gram
aureus en el medio, hemólisis positivo
manitol + Coagulasa+
Resistencia
a la nafcilina
Staphylococcus 0 ++++ UFC´s NA Colonias NA Coagulasa -
epidermidis pequeñas, blanco/grisáceo, Resistencia
manitol sin a la nafcilina
0 hemólisis
Klebsiella 0 2+ NA Colonias Colonias A/A Indol +
oxytoca rosadas blancas VP +
redondas, mucosas
mucosas

Salmonella sp. 0 2+ NA Colonias Colonias K/A Flagelos

traslucidas blancas H2S peritricos
puntiformes puntiformes

Serratia sp 0 2+ NA Colonias Colonias rojas A/A VP+

rosadas redondas planas
rojizas,
redondas,
mucosas

Streptococcus 0 0 NA NA Colonias NA Resistencia a

agalactiae blancas con Bacitracina
beta hemolisis
DILUCIONES
¿Cuál es el ámbito válido para el conteo?
-30 a 300 UFC
Placas no válidas para el conteo
-Microcolonias (lo más común en conteo de diluciones por vaciado)
Fuentes de error en el procedimiento
-Utilizar una misma pipeta
- Destapar distintos elementos (genera aerosoles)
-Poca práctica de pipeteo
Fuentes de contaminación en el procedimiento
-Una misma pipeta (punta)
-No flamear la punta de la pipeta
-No limpiar la punta de la pipeta
Cálculo para establecer el recuento presente en la solución madre
D= Volumen transferido/volumen total
UFC/ ml = #UFC x FD / V (ml)
Aplicaciones de las diluciones en el campo de la MQC
-Alimentos y farmacéutica
-Dispositivos médicos
CONSIDERACIONES
-Rotulación
-Homogenización de diluciones
-Uso correcto de pipeta
-Temperatura del medio a chorrear
-Dispersión del inoculo