CENTRO DE CIENCIAS BASICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ANÁLISIS INSTRUMENTAL

TAREA No. 6 CROMATOGRAFÍA PLANA Y DE COLUMNA

ALUMNOS:
Sandra Jocelyn Martínez Acevedo
José Antonio Ramírez Ruiz
Fabiola Reynoso Rodríguez
Leiby Diana Velázquez Montoya

INGENIERO BIOQUÍMICO
Semestre: 4° Grupo: “A”
PROFESOR:
Dra. Janett Cecilia Sánchez Arana

Lunes 22 de mayo de 2023

Aguascalientes, Ags.
INTRODUCCIÓN:
Es característico de todo sistema químico que, si tiene la posibilidad de existir en dos o más
estados o entornos, dando suficiente tiempo al sistema llegará invariablemente al equilibrio.
Esto significa que todas las fuerzas que operan en el sistema de cualquier modo posible llegarán
eventualmente al equilibrio.
En las diversas técnicas cromatográficas, la separación de mezclas (algunas veces mezclas muy
complejas de multicomponentes) se logra por exposición de la mezcla a un sistema bifásico
que se deja llegar a equilibrio. Las dos fases que intervienen en la separación pueden ser dos
líquidos inmiscibles (extracción, cromatografía líquido-líquido), un gas y una fase líquida
(cromatografía gas-líquido), un gas y una fase sólida (cromatografía gas-sólido) o un líquido y
una fase sólida (cromatografía líquido-sólido).
La cromatografía de capa fina y la de columna son esencialmente similares y utilizan la
adsorción como medio principal de purificación, pero tienen algo de extracción líquido-líquido.
La extensión en que esta última característica tiene lugar depende de la extensión en que el
agua está presente sobre la superficie adsorbente. Cuanta menos agua haya, más activado se
considera el adsorbente. En las cromatografías gas-líquido (CGL) o en fase vapor (CFV), el
fraccionamiento se debe a la extracción, destilación y en pequeño grado a la adsorción.
La cromatografía en columna y en capa fina (CCF) sólo difieren en el medio de soportar el
adsorbente. En ambas técnicas se emplea alúmina o gel de sílice ácido silícico, como fase
estacionaria, y una fase móvil orgánica. Los principios que se aplican a una variante de la
técnica cromatográfica se aplican también a las demás variantes. La principal diferencia entre
la cromatografía en columna y en capa fina es que en la cromatografía en columna el adsorbente
se introduce en un tubo o columna (generalmente de vidrio), mientras que, en la cromatografía
en capa fina, el adsorbente se deposita en forma de capa delgada sobre una placa de vidrio o de
plástico. Debemos hacer notar de paso que el uso corriente del vidrio como medio de soporte,
viene determinado por sus propiedades mecánicas, bajo coste y que aventaja a cualquier otro
material inerte. Otra diferencia entre la cromatografía en columna y en capa fina consiste en
que en la primera la fase móvil se hace caer a través de la columna, es decir, la fuerza motriz
es la gravedad, mientras que, en la CCF, la acción capilar del adsorbente hace subir el
disolvente desde un depósito situado en la parte inferior de la placa. No obstante, esta
diferencia, el proceso fundamental de separación permanece el mismo en ambos casos: la
distribución de un compuesto desconocido entre la fase líquida móvil y una fase inmiscible.
Debe destacarse que, en cualquier clase de procedimiento cromatográfico, la separación de dos
o más componentes se logra en último término por un equilibrio relativamente sutil de todas
las fuerzas interesadas. En la cromatografía, una de las fases del sistema binario es casi siempre
estacionaria con respecto a la otra. Por consiguiente, al explicar la cromatografía hablamos con
frecuencia de una fase estacionaria y de otra móvil. (Durst, 2021)
CUESTIONARIO
• Realice una clasificación general de los diferentes mecanismos de separación
cromatográficos, indique la naturaleza de las fases y el tipo de interacción que
tiene lugar en cada caso.
Cromatografía de Adsorción: Gases o líquidos contenidos en la fase móvil son retenidos por
una adsorción selectiva en la superficie del sólido (sílice o de alúmina) que constituye la fase
estacionaria. Este mecanismo controla la cromatografía gas-sólido y líquido-sólido.
Cromatografía de Reparto: Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase
estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un
proceso de extracción en continuo. En una cromatografía en donde ambas fases son liquidas,
la separación de compuestos es en función de su reparto entre una fase liquida móvil y una fase
estacionaria liquida adherida a la superficie interna de un soporte solido (ambas fases
inmiscibles entre sí). Aquí se incluyen la cromatografía liquida de fase normal, que usa un
líquido polar como fase estacionaria y la cromatografía liquida de fase invertida, que usa una
fase estacionaria apolar.
Cromatografía de Intercambio Iónico: Se basa en el equilibrio del soluto entre el solvente o
fase móvil, y los sitios cargados fijados en la fase estacionaria. El intercambio de iones sólido-
solución está regulado por la afinidad química de los iones con ambas fases y por sus
respectivas concentraciones. La cromatografía de intercambio iónico usa columnas
empaquetadas que poseen grupos funcionales cargados unidos a un polímero que funciona
como matriz. Existen interacciones electroestáticas entre los grupos ionizables de las sustancias
que quieren separarse y los grupos cargados unidos al soporte solido de la matriz. La
cromatografía de intercambio iónico se aplica para la separación de aminoácidos, péptidos,
proteínas y ácidos nucleicos.
Cromatografía de Exclusión Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser
separadas en virtud de su tamaño donde la fase estacionaria es un gel hidrofílico altamente
poroso que retiene las moléculas de menor tamaño al de los poros. Las moléculas de mayor
tamaño son retardadas en su paso por pequeñas fuerzas de adsorción de la superficie externa
del gel que luego son excluidas de la fase estacionaria. La columna está compuesta de perlas
porosas fabricadas a partir de poliacrilamida, dextran o agarosa. Aunque las moléculas a
separar fluyen alrededor de las perlas esféricas en la cromatografía por filtración en gel, están
pasan cierto tiempo dentro de los grandes oficios que perforan la superficie de las esferas
Cromatografía por Afinidad: Se basa en las interacciones específicas que ocurren entre agentes
bioquímicos de reconocimiento y sus ligando. Aquí se utilizan columnas cortas y de alta
selectividad para separar un número pequeño de componentes (generalmente 1) de centenares
de solutos que no son retenidos. Los ligando de afinidad son aquellas especies que están ligadas
a un soporte sólido, formando la fase estacionaria, los cuales pueden ser específicos que se une
a un soluto (ej.: anticuerpo) o generales (análogos de nucleótidos) que se unen a ciertos grupos
de solutos.
Cromatografía en papel: En esta cromatografía se utiliza el fenómeno de partición en donde la
fase estacionaria se halla sobre un soporte activo (el papel) que en realidad forma parte de la
fase estacionaria que es el agua. Las fases móvil y estacionaria estarán en contacto en una gran
interfase, lo que permite una rápida obtención de una distribución de equilibrio del soluto entre
ellas. Si la muestra problema está formada por más de un soluto, éstos se separan por sus
diferentes coeficientes de partición. (Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco
Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud., 2017).

• Dado el Rf = 0.5 para una sustancia, ¿cuál es la posición de esta sobre la placa
que se muestra a continuación?

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
Despejar para distancia de la solución:
𝐷𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑅𝑓 ∙ 𝐷𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

𝐷𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = (0.5)(9 𝑐𝑚)

𝐷𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝟒. 𝟓 𝒄𝒎

• Para la separación de dos analitos (una acetona alifática de un alcohol alifático)

en silicagel, discuta porque el Rf del alcohol debería ser menor que el de la
cetona. ¿Podría esperarse una retención por quimio sorción?
La acetona y el alcohol alifático son dos compuestos diferentes con propiedades químicas
distintas. Por lo tanto, el Rf del alcohol alifático debería ser mayor que el de la acetona alifática
en la cromatografía en capa fina en silicagel debido a la mayor polaridad y afinidad de la
acetona alifática hacia la silicagel. La quimiosorción implica una interacción más fuerte y
específica entre el adsorbente y el analito debido a reacciones químicas, como enlaces
covalentes. En el caso de la silicagel, la adsorción es predominantemente física, por lo que no
se esperaría una retención significativa por quimiosorción en esta matriz.
• Dos componentes A y B en una mezcla tienen un Rf muy similar de 0.02 y 0.03
en sílica gel con fase móvil de 2- cloropropano : pentano (8:92). Cuál de las
siguientes fases móviles usaría para la separación de los componentes A y B: 6
pentano c- acetonitrilo-pentano (20:80) b- metanol d- metanol-diclorometano
(1.5:98.5).
Como podemos la fase móvil actual tiene una polaridad muy baja, ya que se trata de una
muestra que se compone en un 92% de pentano (apolar) y sólo un 8% de 2-cloropropano (el
cual, sólo tiene la polaridad que le otorga el cloro). Por tanto, jugando con las polaridades, la
mejor opción a usar es el metanol-diclorometano (1.5:98.5), que contiene tanto la polaridad
otorgada por el oxígeno en el metanol, como la otorgada por ambos cloros en el diclorometano.
La Fig. 1 muestra la separación de acetofenona y bifenilo.
b- Discuta cómo se podría mejorar la resolución entre dos compuestos que tienen un
valor de Rf aceptable pero que no están bien separados.
 Se podría cambiar la fase móvil, probando entre diferentes mezclas con distintas
proporciones de cada componente hasta encontrar la que permita obtener una mejor
separación. Otra manera podría ser modificar la fase estacionaria, ya que es un factor
importante a la hora de influir en la selectividad de los componentes de la muestra.
• A continuación, se clasifican y dan algunos ejemplos de los diferentes métodos
de revelado que se utilizan en cromatografía planar:

A partir de la observación del cuadro discuta por qué de las siguientes aseveraciones:
✓ a1- Cuando se visualizan aminoácidos rociando con un espray de ninhidrina se está
usando una técnica química destructiva.
o Debido a que la ninhidrina reacciona con los aminoácidos para generar el color
característico de la identificación.
✓ a2- El agua podría actuar como agente destructivo en el caso de algunos ésteres.
o Debido a el agua puede llegar a hidrolizar algunos ésteres.
✓ a3- Los compuestos inorgánicos no pueden detectarse utilizando ácido sulfúrico.
o Debido a que como los compuestos inorgánicos no tienen cadenas de carbono,
estos no dejan la mancha característica que si dejan los compuestos orgánicos
al carbonizarse.
✓ a4- La radiación ultravioleta podría ser una técnica de visualización destructiva. Debido
a que como lo hemos visto a lo largo de las primeras unidades de la materia, existen
algunos compuestos que se desnaturalizan al aplicarse la luz ultravioleta.
b- En una cromatografía preparativa justifique qué método usaría para visualizar:
destructivo o no destructivo.
Debido a que la cromatografía preparativa o de purificación se define como el proceso de
utilizar cromatografía para aislar un compuesto en una cantidad y con un nivel de pureza
suficientes para experimentos o procesos posteriores, el método ideal para la misma sería
un método no destructivo.
• Disponemos de microesferas de polietileno con grupos sulfónicos unidos
covalentemente. ¿Para qué tipo de cromatografía podremos utilizarlas (como
fase estacionaria)?
de exclusión; (b) de intercambio aniónico; (c) de intercambio catiónico; (d) de
reparto.
La respuesta correcta para este tipo de fase estacionaria es la cromatografía de intercambio
catiónico, ya que esta necesita de polímeros polares cargados negativamente (como lo
tienen los grupos sulfónicos presentes en el polímero), siendo las microesferas de
polietileno con grupos sulfónicos unidos covalentemente la mejor opción.
• Si el tiempo de retención de un componente A es mucho mayor que el de un
componente B, ¿qué indica esto acerca de los analitos en una cromatografía de
permeación en gel?
Los componentes más grandes o de mayor masa molecular encuentran más resistencia para
moverse a través de los poros y, por lo tanto, tardan más tiempo en atravesar la columna, lo
que resulta en un mayor tiempo de retención.
Por lo tanto, si el tiempo de retención de un componente A es mucho mayor que el de un
componente B en una cromatografía de permeación en gel, se puede inferir que el
componente A es de mayor tamaño o tiene una masa molecular más alta en comparación
con el componente B. Esto puede ser útil para identificar y caracterizar los analitos presentes
en la muestra.
• Realice una clasificación de tipos de resinas de intercambio iónico, indicando
grupo iónico fijo y contraión (ion intercambiado). b- Indicar los efectos de
aumentar el entrecruzamiento en las columnas de intercambio iónico.

Tipos Ión fijo y contraión

Catiónica fuerte (CF) Están compuestas por una matriz de

Catiónica débil (CB)
poliestireno con un grupo funcional
sulfonato (SO3–) que está cargado con
iones de sodio (Na2 +) para remoción de
dureza, o iones de hidrógeno (H +) para
desmineralización.
Están compuestas por un polímero
acrílico que ha sido hidrolizado con ácido
sulfúrico o soda cáustica para producir
grupos funcionales de ácido carboxílico.
Debido a su alta afinidad por los iones de
hidrógeno (H +), se usan típicamente
para eliminar selectivamente los cationes
asociados con la alcalinidad.
 Aniónica fuerte (AF)
Aniónica débil (AD)
Se componen típicamente de una matriz
de poliestireno que se ha sometido a
clorometilación y aminación para fijar
los aniones en los sitios de intercambio.
Las resinas SBA tipo 1 se producen
mediante la aplicación de trimetilamina,
que produce iones de cloruro (Cl–),
mientras que las resinas SBA tipo 2 se
producen mediante la aplicación de
dimetiletanolamina, que produce iones
hidróxido (OH–).
Se componen típicamente de una matriz
de poliestireno que se ha sometido a
clorometilación, seguida de aminación
con dimetilamina. Son únicas porque no
tienen iones intercambiables y, por lo
tanto, se utilizan como absorbentes de
ácido para eliminar los aniones asociados
con ácidos minerales fuertes.

• Definir:
Elusión: se refiere al proceso mediante el cual los componentes de una muestra son
desplazados o "eluidos" desde una fase estacionaria hacia una fase móvil en un sistema
cromatográfico. La fase estacionaria puede ser un material sólido o líquido que retiene
selectivamente los componentes de la muestra, mientras que la fase móvil es un solvente que
fluye a través del sistema
Fase móvil: la fase móvil es un componente esencial del sistema cromatográfico. Se refiere a
la fase en movimiento que fluye a través de la columna o matriz de la fase estacionaria,
arrastrando consigo los componentes de la muestra y terminando su separación. La fase móvil
puede ser un líquido o un gas, dependiendo del tipo de cromatografía que se esté utilizando.
Fase estacionaria: Se refiere a una matriz o material que permanece fijo en su lugar y que
interactúa selectivamente con los componentes de la muestra que se están separando
Constante de distribución: La constante de distribución, también conocida como coeficiente
de distribución o coeficiente de reparto, es un parámetro utilizado en cromatografía y otras
técnicas de separación para describir la afinidad relativa de un compuesto entre dos fases
diferentes, como la fase estacionaria y la fase móvil.
La constante de distribución (K) se define como la relación de las concentraciones del
compuesto en las dos fases en equilibrio.
Tiempo de retención: El tiempo de retención, también conocido como tiempo de retención o
tiempo de retención relativo, es un parámetro utilizado en cromatografía para describir el
tiempo que tarda un componente de una muestra en pasar a través de un sistema cromatográfico
desde la inyección hasta la detección.
Factor de capacidad: El factor de capacidad, también conocido como factor de retención o
capacidad de retención, es un parámetro utilizado en cromatografía para describir la capacidad
de retención de un componente de una muestra en relación con el sistema cromatográfico.
• ¿Qué es la elución con gradiente?
La elución con gradiente es una técnica utilizada habitualmente en cromatografía para mejorar
la separación de componentes en una muestra. Se refiere al proceso de cambiar gradualmente
las condiciones de la fase móvil durante la corrida cromatográfica.

CONCLUSIÓN:
En conclusión, la cromatografía es un método altamente efectivo y ampliamente utilizado para
lograr una separación precisa de componentes en una muestra. Su conjunto de técnicas de
separación ha revolucionado el campo del análisis químico al permitir el monitoreo continuo
de las especies químicas a medida que se separan.
A lo largo de esta investigación, hemos explorado el funcionamiento del intercambio iónico,
uno de los principales procesos involucrados en la cromatografía, que contribuye a su
clasificación en diferentes variantes. La presencia de una fase estacionaria asociada a iones, así
como la aplicación y el lavado adecuados, son fundamentales para lograr una separación
selectiva en la cromatografía de columna.
En general, la cromatografía se ha convertido en un método analítico de primer orden para la
separación, identificación y cuantificación de compuestos presentes en muestras líquidas o
gaseosas. Su capacidad para proporcionar resultados precisos y su amplia aplicabilidad en
diversas áreas de investigación hacen de la cromatografía una herramienta invaluable en el
campo de la química analítica.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Durst, H. P. (2021). Química orgánica experimental. España: Reverte.
2. Robert J., Caserio M. (1977) Basic Principles of Organic Chemistry, Segunda Ed.,
Menlo Park : W. A. Benjamin, Inc.
3. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales
y Ciencias de la Salud. (2017). Métodos de separación cromatográficos. UNP.
http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2010/08/T.P.-
cromatografia-2017.pdf