E Coli Español

Machine Translated by Google
17.4.06
Método Oficial AOAC 2000.13
Sistema de prueba Reveal para E. coli 0157:H7 en alimentos seleccionados Método de 8 horas
Primera Acción 2000 Acción Final 2005 Revisado 2008
(Aplicable solo a la detección de E. coli 0157:H7 en carne de res molida cruda, cubos de carne de res cruda y enjuague de lechuga
iceberg). regulaciones locales. Consulte las Tablas 2000.13A (estudio de 2000) y B (estudio de 2008) para conocer los resultados
de los estudios comparativos y entre laboratorios que respaldan la aceptación del método.
A. Principio
Reveal utiliza un medio de enriquecimiento patentado (medio de 8 horas) y un dispositivo de prueba de
inmunoprecipitado de flujo lateral rápido para producir un resultado en poco más de 8 h de tiempo total de prueba. El medio de 8
horas proporciona a E. coli 0157:H7 nutrientes fácilmente disponibles y otros factores necesarios para su supervivencia y crecimiento
rápido hasta un nivel de detección por parte del dispositivo en solo 8 h. El dispositivo contiene anticuerpos con alta especificidad para
los antígenos de E. coli 0157:H7. Estos anticuerpos se unen al oro coloidal y, por separado, a una matriz de soporte sólida. Una parte
del enriquecimiento de prueba se coloca en el puerto de muestra del dispositivo que inicia el flujo. Cualquier antígeno de E. coli
0157:H7 presente se unirá a los anticuerpos conjugados con oro formando un complejo antígenoanticuerpocromógeno. Este
complejo fluye a través de la membrana de flujo lateral y posteriormente se une al anticuerpo inmovilizado en la membrana, lo que
hace que el conjugado de oro se precipite formando una línea visible que indica una reacción positiva. La finalización y el flujo
correctos de la prueba se indican mediante una línea de control que se forma más arriba en la ventana de prueba, lo que verifica una
ejecución de prueba válida. La ausencia de una línea de control invalida la prueba.
B. Medios y reactivos
(a) Medio de 8 horas para E. coli O157:H7, esterilizado (una prueba por botella). —Disponible de Neogen Corp.
(Lansing, MI www.neogen.com). Vacíe el contenido de una botella en un recipiente estéril. Agregar 225 mL de agua estéril a
439C. Mezcla. Para medios a granel, agregue 39,6 g/1 L de agua estéril y mezcle.
(b) Dispositivo de prueba Reveal E. coli 0157:1H7. Disponible en Neogen Corp. Una prueba por dispositivo.
(c) Diluyente de tampón de fosfato de Butterfield (BPB). Mezcle 34,0 g de fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada.
Ajuste el pH a 7,2 usando NaOH 1 M (40 g/L). Diluir a 1 L con agua destilada. Autoclave durante 15 min a 121*C. Agregue 1,25 mL
al matraz estéril de 1 L y diluya a 1 L con agua estéril.
(d) Reactivos de diagnóstico.—Necesarios para la confirmación por cultivo de pruebas presuntamente positivas. Consulte el
capítulo sobre E. coli y bacterias coliformes en el Manual analítico bacteriológico (BAM; www.cfsan.fda.gov/ebam/
bam4a.html) o en la Guía de laboratorio de microbiología del USDA/FSIS (www.fsis.usda.gov/ PDF MLG_5_04.pdf).
(e) Agar coli hemorrágico (HC). Preparar como sigue: triptona, 20,0 g; sales biliares nº 3, 1,12 g; NaCl, 5,0 g; sorbitol, 20,0 g:
reactivo de 4metilumbeliferilPDglucurónido (MUG), 0,1 g de bromocresol
violeta, 0,015 g; agar, 15,0 g; y agua destilada, 1,0 L. Disolver los ingredientes en agua destilada calentando con
agitación. Autoclave 15 min a 121*C. pH final 7,2 + 0,2.
(1) Medio cromogénico Biosynth (BCM) 0157:H7(+) agar. Disponible comercialmente de Biosynth International, Inc. (Naperville,
IL, EE. UU.; www.biosynth.com). Preparar como sigue: BCM 0157:H7(+), 80,0 g; N,Ndimetilformamida (DMF; Cat. No.
D4254; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), 5,0 ml; novobiocina sódica (solución al 0,2 %; Sigma, Cat. No. N1628), 5,0 ml; telurito
de potasio (solución al 0,1 %; Sigma, Cat. No. P0677), 0,2 ml; y agua destilada, 1 L. Añadir DMF al agua destilada seguido de
BCM en polvo y calentar hasta que hierva para disolver. Ajuste el pH a 6,8 + 0,1. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 5055%C
en un baño de agua. Filtreesterilice por separado la novobiocina y el telurito de potasio y agréguelos asépticamente a los medios.
(g) Medio CHROMagar'" 0157. Disponible en CHROMagar Microbiology (París, Francia; www.chromagar. com).
Preparar de la siguiente manera: CHROMagar 0157, 29,2 g; agua destilada o desionizada, 1 L. Dispersar el polvo lentamente
en agua por rotación. Calentar y llevar a ebullición (100°C) mientras se gira o revuelve regularmente. Si se utiliza un autoclave,
utilizar sin presión. No calentar a más de 100*C. Enfriar a 4550°C en un baño de agua.
C. Aparato
(a) Incubadoras.—Mantener 3537*C y 4243*C.
(b) Baño de agua.Mantenimiento 100 + 5*C,
(c) Jeringa.—Equipada con un filtro de porosidad de 0,45 um o menor.
(d) Tubos de ensayo. Vidrio de borosilicato de 16 x 100 mm.
(e) Pipeta.—Dispensando con precisión 0,12 ml.
(f) Cilindro graduado.—250 mL de capacidad con graduaciones de 5 mL.
(8) Bolsa estomacal.
D. Preparación de suspensiones de prueba
Para la lechuga iceberg, triture asépticamente la lechuga y transfiera 50 g a una bolsa estéril. Agregue 50 mL de diluyente BPB,
B(c), cierre la bolsa y agite a mano durante 15 min. Decantar asépticamente 25 ml en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con
tapa roscada (o equivalente) que contenga 225 ml de medio de 8 horas, B(a). Tape sin apretar, mezcle agitando ligeramente e
incube 8 h a 4243 °C. Retire 5 ml de cultivo y colóquelo en el tubo de ensayo, C(d). Coloque el tubo en un baño de agua, C(b),
a 100 %C durante 10 minutos Enfriar a temperatura ambiente.
Para cubos de carne de res cruda y carne de res molida cruda, pese asépticamente una porción de prueba de 25,0 g en una
bolsa Stomacher, C(g), que contenga 225 ml de medio de 8 horas, B(a). Mezcle bien amasando a mano e incube 8 h a
4243"C. Retire 5 ml y colóquelos en el tubo de ensayo, C(d). Coloque el tubo en un baño de agua, C(b), a 100 %C durante 10 min.
Enfriar a temperatura ambiente.
Para 375 muestras de cubos de carne de res molida y carne de res cruda, pese asépticamente una porción de prueba de
375 g en un recipiente estéril de tamaño adecuado. Agregue 3.375 L de medio de 8 horas que haya sido precalentado a 42 + 1*C.
Mezclar bien amasando a mano e incubar 12 ha 42 + 19C. Retire 5 ml y colóquelos en el tubo de ensayo, C(d).
Coloque el tubo en un baño de agua, C(b), a 100*C durante 10 min. Enfriar a temperatura ambiente.
E. Procedimiento de prueba
Bolsa abierta que contiene un dispositivo, B(b). Utilice un dispositivo por prueba. Transfiera 0,12 ml de cultivo muerto por calor del tubo
de ensayo, preparado como en D, al puerto de muestra del dispositivo. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
F. Resultados de lectura
Examine el dispositivo, B(b), inmediatamente después de 15 min de desarrollo. Un resultado positivo se indica mediante dos líneas
distintas presentes en la ventana de visualización del dispositivo: una línea en la zona inferior cerca de la "T" (línea de prueba) y una
línea en la zona superior cerca de la "C" (línea de control). Las líneas son oscuras cuando se contrastan con el fondo blanco. Un
resultado negativo se indica por una sola línea presente en la zona superior (control) de la ventana de visualización. Un resultado no
válido se indica cuando no hay una línea en la zona superior (control) de la ventana de visualización, independientemente de si hay una
línea en la zona inferior (prueba).
G. Confirmación de resultados
Las pruebas presuntamente positivas deben ser confirmadas. Realice las diluciones apropiadas a partir de un cultivo de
enriquecimiento medio de 8 horas y extiéndalas en agares “HC, B(e) y BCM, B(f) (todos los tipos de muestras que no sean 375 g de
carne picada cruda y cubos de carne cruda). Confirme cualquier colonia sospechosa bioquímica y serológicamente mediante las pruebas
descritas en BAM (www.cfsan.fda.gov/ebam/bam4a.html).
Para muestras de 375 g de carne picada cruda y cubos de carne cruda, coloque en un plato . cultivos de enriquecimiento a
CHROMagar, B(g), e incubar a 37 + 19C durante 24+ 1 h. Las colonias de E. coli0157:H7 tendrán una apariencia malva a diferencia
de otros coliformes que aparecerán incoloros, grises o azules. Continúe con las pruebas de confirmación de acuerdo con los
procedimientos descritos en el método de cultivo de referencia del Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria del Departamento
de Agricultura de EE. UU. (USDAFSIS) (www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_5_04.pdf).
Se recomienda el uso de separación inmunomagnética antes de la siembra.
Referencias: J. AOAC Int. 84, 719 (2001); 92, 428 (2009)
17.4.06A
Genes de la toxina Shiga, de Escherichia coli 0157:H7, en alimentos seleccionados
Garantía GDSO Toxina Shiga Genes (0157) Primera acción 2005 Acción final 2008
Primera Acción Revisada 2011 Primera Acción Revisada 2012
[Aplicable a la detección de genes de toxina Shiga (stx1 y stx2) de carne de res molida cruda, recortes de carne de res, jugo de
naranja, jugo de manzana, verduras frescas y agua de proceso de brotes. ]
El uso de la separación inmunomagnética (IMS) por adelantado hace que esta prueba sea específica para E. coli 0157:H7 y E.
coli0157:H7 inmóvil. Precaución: E. coli 0157:H7 son bacterias patógenas. Los síntomas de infección incluyen diarrea con
sangre y calambres, poca o ninguna fiebre y síndrome urémico hemolítico.
Descontamine todos los medios gastados y el equipo utilizado en la prueba antes de desechar los medios o reutilizar el
equipo.
Nota: Tome las precauciones ambientales y de procedimiento adecuadas para el manejo de reactivos y equipos al
realizar ensayos genéticos.
Consulte la Tabla 2005.05 (estudio original, 2005) para conocer los resultados del estudio entre laboratorios que
respaldan la aceptación del método.
A. Principio
El método Assurance GDS Shiga Toxin Genes (0157) es un ensayo basado en genes que utiliza cebadores específicos y sondas
patentadas dirigidas contra la secuencia de ADN altamente conservada en el organismo objetivo. El método detecta los genes stx/
amd stx2 simultáneamente y por separado, y utiliza el enriquecimiento en caldo mEHEC. Después del enriquecimiento, las
poblaciones de microorganismos diana se concentran utilizando un dispositivo de concentración patentado y reactivos o un
instrumento de concentración automatizado. El concentrado se transfiere a un recipiente de reacción cónico que contiene reactivos
de amplificación. El recipiente se sella y se coloca en un instrumento que permite la amplificación y detección simultáneas. Todas
las pruebas, positivas y negativas, se indican al final del análisis, así como los resultados de un control de procedimiento que se
encuentra en cada recipiente de reacción.
B. Aparato
Los elementos (a) 41) están disponibles en BioControl Systems (Bellevue, WA, EE. UU.; www.biocontrolsys.com).
Los artículos (m) y (n) están disponibles comercialmente.
(a) Instrumento de amplificación y detección—¿Assurance GDS RotorGene?, o equivalente,
(b) Computadora y software.
(c) Dispositivo de concentración de muestras.—PickPenTM.
(d) Mezclador de vórtice:
(e) Pozos de muestra y base de pozos de muestra.
(1) Placa de resuspensión.
(8) Bloque de enfriamiento de gel.
(h) Puntas de PickPen en la caja.
(i) Película de sellado con respaldo adhesivo.
(j) Pipetas dedicadas. Pipeta de ocho canales, capaz de dispensar 30 yL; pipeta de repetición; y micropipetas capaces de dispensar con
precisión 20 y 45 uL.
(k) Repita las puntas de pipeta: 0,5 y 10 ml.
(l) Puntas de micropipetas.—Filtrobarrera; volúmenes 20200 y 2001000 pL.
(m) Incubadora.—Mantener 42 + 1%C.
(n) Masticador.—Seward 400 (Seward Ltd., Worthington, Reino Unido: www.seward.co.uk), o equivalente.
C. Medios y reactivos
El elemento (a) está disponible en BioControl Systems. Los elementos (b)Xe) están disponibles en el kit de prueba Assurance GDS Shiga Toxin
Genes (0157) de BioControl Systems. El artículo (£) está disponible comercialmente.
(a) Caldo BioControl mEHEC. Precalentar 1 L de agua desionizada estéril a 42 + 19C durante la noche. El día del uso transfiera asépticamente
31,6 g de mEHEC en agua estéril precalentada. Mezcle suavemente para disolver el polvo.
Utilice el medio preparado dentro de las 6 h. Alternativamente, mEHEC se puede preparar y esterilizar en autoclave a 121*C durante 15 min. Los
medios esterilizados en autoclave deben precalentarse a 42 + 1*C durante la noche antes de agregar la muestra.
(b) Reactivo de concentración.
(c) Amortiguador de resuspensión
( d ) Tubos de amplificación que contienen reactivos liofilizados para genes de toxina Shiga.
(e) Solución de lavado.
(f) Medios y reactivos de diagnóstico. Necesarios para la confirmación cultural de muestras GDS de garantía positivas. Los reactivos (b) y (d)
deben almacenarse entre 2 y 89 °C cuando no se utilicen.
D. Enriquecimiento de muestras
(a) Pese asépticamente 25 g de muestra en 225 ml precalentados (42 + 19C) mEHEC, C(a). Homogeneice bien las muestras con el
masticador, B(n). Incube las muestras durante 818 h a 42 + 1*C. Para agua de riego de brotes, incubar durante 1018 h.
(b) Pesar asépticamente 375 g de muestra en 1500 ml precalentados (42 + 1*C) mEHEC. Homogeneice bien las muestras con el masticador.
Incubar las muestras durante 1018 h a 42 + 19C.
(c) Cuando utilice el método Assurance GDS Shiga Toxin Genes (0157) en conjunto para confirmar Assurance GDS E. col¡0157:H7, retire la
suspensión enriquecida de Assurance GDS E. coli 0157:H7 de la incubadora, después del período mínimo de incubación anterior.
E. Protocolo de preparación de muestras
Nota: Use guantes nuevos antes de manipular los reactivos.
(a) Mezcle el reactivo de concentración, C(b), en un mezclador vórtex. Transfiera 20 yL a cada uno de los pocillos de muestra de Assurance GDS
requeridos (un pocillo/muestra), B(e), utilizando una pipeta de repetición, B(j), y una punta de pipeta de 0,5 ml, B(k). Cubra los pocillos de muestra
con tiras de película adhesiva, B(i).
(b) Transfiera 1,0 ml de solución de lavado, C(e), a pocillos de muestra adicionales (un pocillo/muestra), utilizando una pipeta de repetición y
una punta de pipeta de 10 ml. Cubra los pocillos de muestra con tiras de película adhesiva.
(c) Transfiera 45 uL de tampón de resuspensión, C(c), a los pozos de muestra en la placa de resuspensión, B(f), utilizando una pipeta de
repetición y una punta de pipeta de 0,5 mL. Cubra la placa de resuspensión con tiras de película adhesiva.
(d) De una tira de pocillos de muestra, (a), retire con cuidado la película adhesiva. Con una micropipeta, agregue 1 ml de muestra incubada
a cada pocillo de muestra que contenga reactivo de concentración. Evite transferir partículas de alimentos. Se debe utilizar una punta de
pipeta nueva para cada muestra. Cubra cada tira de pozos de muestra con una nueva tira de película adhesiva antes de agregar muestras a
una nueva fila. Inmediatamente devuelva las muestras a la incubadora.
(e) Coloque los pocillos de muestra sellados que se encuentran en la base de los pocillos de muestra encima del mezclador vorticial, B(d), y
agite en el vórtex a aproximadamente 900 rpm durante 515 min. Si es necesario, ajuste la velocidad del vórtice para evitar el contacto del
líquido con la película adhesiva. Después de completar el vórtex, retire la base de los pocillos de muestra del mezclador vórtex.
(f) Retire con cuidado y deseche una tira de película adhesiva de una fila de muestras. Retire la tira de película correspondiente
de la tira de pocillos de muestra que contienen solución de lavado, (e) o (b).
(g) Cargue las puntas del PickPen, B(h), en la herramienta PickPen, B(c), asegurándose de que las puntas estén firmemente en su lugar
en la herramienta PickPen. Extienda los imanes del PickPen e insértelos en la primera tira de pocillos de muestra que contenga muestra
con reactivo de concentración. Revuelva suavemente durante 30 s mientras mueve continuamente las puntas hacia arriba y hacia abajo
desde la superficie hasta el fondo del pocillo. Golpee suavemente las puntas del PickPen contra el costado de los pocillos de muestra para
eliminar el exceso de gotas de medios.
(h) Transfiera las puntas del PickPen a los pocillos de muestra correspondientes que contengan la solución de lavado y agite suavemente
durante 5 s (no libere partículas en la solución). Transfiera las puntas de PickPen a la fila correspondiente de los pocillos de la placa de
resuspensión preparados, (e). Con las puntas sumergidas, retraiga los imanes del PickPen y golpee suavemente para liberar las partículas en
el tampón de resuspensión. Cubra la placa de resuspensión con tiras adhesivas.
(i) Repita los pasos en (£) (h) para todas las muestras usando puntas nuevas para cada fila de muestras.
F. Amplificación y Detección
Nota: Use guantes nuevos antes de manipular los reactivos.
(a) Antes del uso inicial, enfríe el bloque de enfriamiento de gel, B(g), en el congelador (25 a 15 % C) durante 6 h. Cuando no esté en uso,
el bloque de enfriamiento de gel debe almacenarse entre 25 y 15 %C. Entre cada uso, devuelva el bloque de enfriamiento de gel al
congelador hasta que se haya vuelto completamente morado, lo que indica que está listo para usar. Esto puede tardar hasta 2 h.
(b) Retire los tubos de amplificación, C(d), de la bolsa de aluminio y colóquelos en el bloque de enfriamiento de gel. Vuelva a sellar la
bolsa.
(c) Abra las tapas de los tubos de amplificación en el bloque de enfriamiento de gel. Transfiera 30 HL de muestra de los pocillos
de la placa de resuspensión al tubo de amplificación dach utilizando la pipeta de 8 canales y la punta con barrera de filtro, B(j). Presione
firmemente hacia abajo la tapa de cada tubo de amplificación para cerrar. Inspeccione visualmente cada tubo para asegurarse de que la tapa
esté bien sellada.
(d) Invierta el bloque de enfriamiento de gel que sostiene los tubos de amplificación y agítelo con un movimiento rápido para mezclar
completamente el contenido del tubo.
(e) Coloque los tubos de amplificación en Assurance RotorGene, B(a), en orden secuencial, comenzando con la posición No. 1. Inicie el ciclo de
RotorGene, B(b). Consulte el manual del usuario de Assurance GDS para obtener instrucciones detalladas sobre el funcionamiento del Rotor
Gene.
Nota: El Assurance GDS RotorGene debe iniciarse dentro de los 15 minutos posteriores a la adición de las muestras a los tubos de amplificación.
G. Resultados del ensayo
Una vez finalizada la ejecución, el programa Assurance RotorGene proporcionará una tabla de resultados. Cada muestra de prueba se
identificará como “positiva”, lo que indica que la muestra de prueba es positiva para E. coli toxigénica Shiga 0157:H7, “negativa”, lo que indica
que la muestra de prueba es negativa para E. coli toxigénica Shiga 0157:H7, o “no amp”, lo que indica que no se produjo amplificación. En el caso
de un resultado "sin amperio", del caldo de enriquecimiento de muestras que se ha devuelto a la incubadora, E(d), retire 1 ml de caldo y comience
en E(a). Si el resultado continúa mostrando "sin amplificador", comuníquese con el servicio técnico de BioControl Systems (8002450113).
(Precaución: cuando se complete el ensayo, maneje y deseche todos los desechos como un riesgo biológico. Nunca, bajo ninguna circunstancia, abra
los tubos de amplificación después de que haya comenzado el proceso de amplificación para evitar la descarga de materiales amplificados en el
laboratorio, lo que podría causar la contaminación de la prueba. ambiente.)
H. Confirmación de resultados positivos
Asegúrese de que las muestras positivas para GDS se confirmen mediante cultivo, C(f), como se describe en el Manual analítico
bacteriológico actual, Capítulo 4A, “Escherichia coli diarreica”, http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/
BacteriologicalAnalyticalManualBAM/defa ult.htm o USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook, Capítulo MLG 5.05, “Detección, aislamiento e
identificación de Escherichia coli 0157:H7 de productos cárnicos”, http://www.fsis.usda.gov/Science/ Microbiological_Lab_Guidebook/index.asp.
1. Precauciones
(a) Si es posible, mantenga zonas de trabajo separadas y equipos y suministros exclusivos para la preparación, amplificación y detección de
muestras.
(b) Se recomienda el uso de muestras de control positivo y negativo.
(c) No utilice el kit de prueba más allá de la fecha de vencimiento que figura en la etiqueta de la caja del producto.
(d) Descontamine y deseche los materiales de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio y de acuerdo con las reglamentaciones locales,
estatales y federales.
(e) No abra los tubos de amplificación usados. No esterilice en autoclave los tubos de amplificación usados. Antes de desecharlos, sumerja
los tubos de amplificación usados en un recipiente sellado con lejía al 20 % o solución de hipoclorito de sodio al 1,2 %.
(f) Los desechos pueden estar contaminados con E. coli 0157:H7, que es potencialmente peligroso para la salud humana.
Todos los desechos de riesgo biológico deben eliminarse de manera adecuada (1).
Reveal para prueba de E. coli 0157:H7 en alimentos seleccionados e hisopos ambientales
Método de 20 horas Primera acción 2000 Acción final 2005 Revisado 2008
(Aplicable solo a la detección de E. coli 0157:H7 en carne de res molida cruda, cubos de carne de res cruda, sidra de manzana,
enjuague de lechuga iceberg e hisopos ambientales de acero inoxidable). Precaución: los medios de cultivo usados y los dispositivos
Reveal deben tratarse como material biopeligroso y manipulado y eliminado de acuerdo con las normas locales.
Consulte las Tablas 2000.14A (estudio de 2000) y B (estudio de 2008) para obtener los resultados de los estudios
comparativos y entre laboratorios que respaldan la aceptación del método.
A. Principio.
El sistema Reveal contiene anticuerpos con alta especificidad para los antígenos de E. coli 0157:H7. Estos anticuerpos se
unen al oro coloidal y, por separado, a una matriz de soporte sólida. Una parte del enriquecimiento de prueba se coloca en el puerto
de muestra del flujo de inicio del sistema Reveal. Cualquier antígeno de E. coli 0157:H7 presente se unirá a los anticuerpos conjugados
con oro formando un complejo antígenoanticuerpooro. Este complejo fluye a través de una membrana de flujo lateral y posteriormente
se une al anticuerpo inmovilizado en la membrana. Esto hace que el conjugado de oro se acumule, formando una línea visible e
indicando una reacción positiva. La finalización y el flujo correctos del ensayo se indican mediante una línea de control que se forma
en una segunda área de la ventana de prueba, lo que verifica un ensayo válido. La ausencia de una línea de control invalida el ensayo.
B. Medios y reactivos
(a) Dispositivo de prueba Reveal E. coli O157:H7.—Un ensayo por dispositivo Reveal (Neogen Corp., Lansing, MI, EE. UU.;
WWW.neogen.com).
(b) Diluyente de tampón de fosfato de Butterfield (BPB). Mezcle 34,0 g de fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada. Ajuste
el pH a 7,2 usando NaOH 1 M (40 g/L). Diluir a 1 L con agua destilada. Autoclave durante 15 min a 121*C. Añadir 1,25 mL a 1 Lílask
estéril y diluir a 1 L con agua estéril. ¡
(c) Solución de novobiocina, 100 mg/mL.—Disolver 100,0 mg de novobiocina en 1,0 mL de agua. Esterilizar por filtración a través
de un filtro de 0,45 um conectado a una jeringa. Esta solución es estable durante 60 días cuando se almacena en un frasco oscuro a
28 %C.
(d) Caldo de soja Trypticase modificado con novobiocina (mISB+n). Mezcle 30,0 g de caldo de soja Trypticase (BD Biosciences,
Cockeysville, MD, EE. ; Cat. Codificado No. 213010), y 1,5 g de fosfato dipotásico en 1 L de agua desionizada. Esterilice en autoclave
la mezcla durante 15 min a 121*C y deje enfriar a temperatura ambiente. Agregue 0,2 ml de solución de novobiocina, (e), justo antes
de agregar la suspensión de prueba.
(e) Broih de E. coli modificado con novobiocina (mEC+n). Mezcle 20,0 g de triptona (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.; N.° de
catálogo codificado 211703), 1,5 g de sal biliar N.° 3 (BD Biosciences) , 5,0 g de lactosa, 4 g de fosfato dipotásico, 1,5 g de fosfato
monopotásico y 5 g de NaCl en 1 L de agua desionizada.
Esterilice en autoclave la mezcla durante 15 min a 1219C y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Agregue 0,2 ml de solución
de novobiocina, (c), justo antes de agregar la suspensión de prueba.
(f) Medio Reveal de 20 horas para E. coli 0157:H7. Disponible en Neogen Corp. Pese 37,0 g en un recipiente estéril. Agregar
1 L de agua estéril precalentada a 3537°C y mezclar.
(g) Reactivos de diagnóstico.—Necesarios para la confirmación por cultivo de resultados Reveal presuntamente positivos, tal
como se describe en el Manual Analítico Bacteriológico (BAM; www.cfsan.fda.gov/ebam/bamáa.html) o en la Guía del Laboratorio
de Microbiología (www.fsis .usda.gov/PDF/MLG_5_04.pdf).
(h) Agar coli hemorrágico (HC). Preparar como sigue: triptona, 20,0 g; sales biliares nº 3, 1,12 g; NaCl, 5,0 g; sorbitol, 20,0 g;
reactivo de 4metilumbeliferilPDglucurónido (MUG), 0,1 g; púrpura de bromocresol, 0,015 g; agar, 15,0 g; y agua destilada, 1,0
L. Disolver los ingredientes en agua destilada calentando con agitación. Autoclave 15 min a 121*C. pH final 7,2 + 0,2.
(i) Agar de medio cromogénico Biosynth (BCM). Disponible de Biosynth International, Inc.
(Naperville, IL, EE. UU.).
(j) Medio CHROMagar"* 0157. Disponible en CHROMagar Microbiology (París, Francia; www.chromagar. com).
Preparar de la siguiente manera: CHROMagar 0157, 29,2 g; agua destilada o desionizada, 1 L. Dispersar el polvo lentamente en
agua por rotación. Calentar y llevar a ebullición (100°C) mientras se gira o revuelve regularmente. Si usa un autoclave, úselo sin
presión. No calentar a más de 100*C. Enfriar a 4550°C en un baño de agua.
C. Aparato
(a) Incubadoras Mantenimiento 3537*C y 43 + 0,5%C.
(b) Jeringa.—Con filtro de porosidad de 0,45 um o menor.
(c) Pipeta.—Dispensando con precisión 0,12 mL.
(d) Cilindro graduado.—250 mL de capacidad con graduaciones de 5 mL.
(e) Bolsa de estómago.
D. Preparación de la Suspensión de Prueba
Enriquecimiento.—Para hisopos ambientales de acero inoxidable, transfiera asépticamente un hisopo a una bolsa
Stomacher, C(e), que contenga 225 ml de mTSB+n, B(d). Mezclar amasando a mano e incubar 20 ha 3537°C. Enfriar a
temperatura ambiente.
Para la sidra de manzana, transfiera asépticamente 25 ml a un matraz Erlenmeyer de 500 ml con tapa roscada (o equivalente) que
contenga 225 ml de mTSB+n, B(d). Tapar sin apretar, mezclar agitando ligeramente e incubar 20 h a 3537°C.
Enfriar a temperatura ambiente.
Para la lechuga iceberg, triture asépticamente la lechuga y transfiera 50 g a una bolsa estéril. Agregar 50 ml de diluyente BPB,
B(b), cerrar la bolsa y agitar a mano durante 15 min. Decantar asépticamente 25 ml en un matraz Erlenmeyer con tapón de rosca
de 500 ml (o equivalente) que contenga 225 ml de mTSB+n, B(d). Tape sin apretar, mezcle agitando ligeramente e incube 20 h en
una incubadora de aire a 43+ 0,5 % C, enfríe a temperatura ambiente.
Para cubos de carne cruda y carne molida cruda, pesar asépticamente 25,0 g en una bolsa Stomacher, C(e), que
contenga 225 ml de mEC+n, B(e). Mezclar bien amasando a mano e incubar 20 ha 3537°C. Enfriar a temperatura ambiente.
Para muestras de 375 g de carne cruda molida y cubos de carne cruda, pese asépticamente 375 g
porción de prueba en un recipiente estéril de tamaño apropiado. Agregue 3,375 l de medio Reveal de 20 horas, B(f), que se haya
precalentado a 3537 °C. Mezcle bien amasando a mano e incube 2022 h a 3537 °C.
E. Procedimiento de ensayo
Bolsa abierta que contiene un dispositivo Reveal, B(a). Utilice un dispositivo por prueba. Transfiera 0,12 ml de cultivo enriquecido al
puerto de muestra del dispositivo. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
F. Resultados de lectura
Examine el dispositivo Reveal inmediatamente después de 15 min de incubación. Un resultado positivo se indica mediante dos
líneas distintas presentes en la ventana de visualización del dispositivo: una línea en la zona inferior cerca de la "T" (línea de prueba) y
una línea en la zona superior cerca de la "C" (línea de control). Las líneas son oscuras cuando se contrastan con el fondo blanco. Un
resultado negativo se indica por una sola línea presente en la zona superior (control) de la ventana de visualización. Un resultado no
válido se indica cuando no hay una línea en la zona superior (control) de la ventana de visualización, independientemente de si hay una
línea en la zona inferior (prueba).
G. Confirmación de resultados
Las pruebas presuntamente positivas deben ser confirmadas. Realice las diluciones apropiadas a partir del enriquecimiento y
extiéndalas en agares HC y BCM (todos los tipos de muestras que no sean 375 g de carne picada cruda y cubos de carne cruda).
Para muestras de 375 g de carne de res cruda molida y cubos de carne de res cruda, enriquezca la placa de cultivo en CHROMagar,
B(j), e incube a 37 + 19C durante 24+1 h. Las colonias de E. coliO157:H7 tendrán una apariencia malva a diferencia de otros
coliformes que aparecerán incoloros, grises o azules. Continúe con las pruebas de confirmación de acuerdo con los procedimientos
descritos en el método de cultivo de referencia del Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria del Departamento de Agricultura
de EE. UU. (USDAFSIS) (www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_5_04.pdf).
Se recomienda el uso de separación inmunomagnética antes de la siembra.
Referencias: J. AOAC Int. 84, 737 (2001); 92, 433 (2009)
Enumeración automatizada de Escherichia coli en alimentos
Método CE Primera Acción 2009
(Aplicable a la enumeración de Escherichia coli en carne de res molida cruda, lechuga en bolsas, pollo cocido, carne
de cangrejo pasteurizada, judías verdes congeladas y leche entera pasteurizada). Capítulo 17, p. 91
A. Principio
La prueba TEMPO EC utiliza un vial de medio de cultivo y una tarjeta con tubo de transferencia específico para esta
prueba. El medio de cultivo se inocula con la muestra y el medio inoculado se transfiere a una tarjeta que contiene 48
pocillos de tres volúmenes diferentes: 2,25, 22,5 y 225 uL. La tarjeta se sella herméticamente y se incuba durante 2227
h. Según la actividad de la enzima Pglucuronidasa (GUD), la E. coli presente en la tarjeta reduce el sustrato en el medio
de cultivo durante la incubación y provoca la aparición de una señal fluorescente, que es detectada por el TEMPO
Reader. Dependiendo del número y tipo de pocillos positivos, el Sistema TEMPO calcula el número de E. coli presentes
en la muestra original según un cálculo similar al utilizado en el método del número más probable (NMP).
B. Aparatos y reactivos
(a) Sistema TEMPO. Incluye TEMPO Filler, TEMPO Reader, lector de código de barras, software y
accesorios (bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, EE. UU.).
(b) Kit TEMPO E. coli (EC). Contiene 48 tarjetas desechables TEMPO EC listas para usar con tubos de
transferencia, 48 viales TEMPO EC de medio de cultivo (contiene nutrientes, suplementos de crecimiento, sistema
tampón, sustratos y antiespumante). agente) y el prospecto de TEMPO EC (bioMérieux, Inc.).
(c) Bolsas TEMPO.
(d) Pipeta. Pipeta serológica de 1,0 ml con graduaciones de 0,1 ml.
(e) Dispensador estéril.
(f) Saldo.
(g) Mezclador de vórtice.
(h) Stomacher: Stomacher Lab Blender 400 (Seward Medical, Londres, Reino Unido) o equivalente.
(i) Incubadoras.—Capaces de mantener 35 + 1*C.
(j) Diluyente primario.—Tampón de dilución, solución madre tamponada con fosfato de Butterfield (BPD). Prepárelo de
la siguiente manera: disuelva 34 g de KH,PO en 500 ml de agua, ajuste a pH 7,2 con NaOH 1 N (aprox. 175 ml) y
diluya a 1 litro con agua. Prepare agua tamponada para diluciones diluyendo 1,23 mL de solución madre en 1 L con
agua hervida y enfriada. Autoclave 15 min a 121*C,
(k) Diluyente secundario. Agua destilada estéril o agua purificada equivalente de un sistema de purificación
validado. Preparar como sigue: Autoclave 15 min a 121”C.
C. Instrucciones generales
(a) Guarde el kit TEMPO EC a 225*C.
(b) No utilice reactivos o desechables después de la fecha de caducidad indicada en su etiqueta.
(e) No deje las tarjetas expuestas a la luz (en la mesa de trabajo o soporte de medios) por más de 15 días.
(d) Consulte las precauciones de seguridad en el prospecto de TEMPO EC
(Consulte las siguientes secciones en el prospecto: Advertencias y precauciones y Eliminación de desechos).
D. Preparación de muestras
Prepare asépticamente una dilución 1:10 de cada porción de prueba:
(a) Productos lácteos. —Pipe 11 ml o pese 11 g de muestra en una botella BPD de 99 ml; agitar 25 veces para homogeneizar.
(b) Todos los demás alimentos. —Pese 25 g de muestra de la porción de prueba en la bolsa TEMPO y diluya con 225 ml de
BPD; estómago 2 min a alta velocidad para homogeneizar.
Nota: El intervalo entre la homogeneización de la dilución primaria y su transferencia al medio TEMPO no debe exceder
los 45 min.
E.Análisis
(a) Retire la cantidad requerida de viales de medio de cultivo (un vial por muestra de prueba) y deje que alcance la temperatura
ambiente.
(b) Ajuste el dispensador que contiene el diluyente secundario a 3,0 ml y cebe la bomba eliminando los dos primeros volúmenes
distribuidos.
(c) Reconstituya el medio de cultivo TEMPO EC dispensando 3,0 ml de diluyentes secundarios por vial con el dispensador.
(d) Usando una pipeta estéril, agregue 1,0 mL de la porción de prueba diluida 1:10 del compartimiento filtrado de la bolsa TEMPO
al medio TEMPO reconstituido.
(e) Homogeneizar durante aproximadamente 3 s utilizando un mezclador de vórtice.
(f) Los 4 mL de medio inoculado obtenidos corresponden a una dilución 1:40 de la muestra.
(g) Inicie sesión en la estación de preparación TEMPO.
(h) Identifique la muestra que se analizará y escanee un vial del medio EC utilizando el lector de código de barras de la
estación de preparación.
(i) Extraiga una tarjeta por cada vial de medio inoculado y asocie el identificador de la muestra de prueba con los códigos
de barras del medio inoculado y la tarjeta correspondiente escaneando la tarjeta con el lector de códigos de barras de la
estación de preparación.
(j) Coloque el vial que contiene el medio inoculado en la gradilla de llenado e inserte la tarjeta en la ranura opuesta al vial,
colocando el tubo de transferencia de la tarjeta dentro del vial.
(k) Coloque la parrilla en el TEMPO Filler y presione START.
(D) Transfiera las tarjetas selladas a las rejillas de incubación e incube durante 2227 h a 35 + 1*C.
F. Resultados e Interpretación
(a) Inicie sesión en la estación de lectura.
(b) Introducir en el lector la gradilla de incubación que contiene las tarjetas a leer. El lector escanea los códigos de barras de
cada tarjeta e interpreta los resultados de fluorescencia en los pocillos.
(c) El resultado de CFU/g o mL aparecerá en la pantalla de la estación de lectura.
(d) La interfaz de usuario de la estación de lectura permite imprimir o transmitir los resultados al sistema de gestión
de información del laboratorio.
(e) Al final del análisis, retire las tarjetas del estante y deséchelas en un receptáculo apropiado.
Referencia: J AOAC Int. 93, 576 (2010)
17.4.09
Escherichia coli 0157:H7 en alimentos seleccionados 3M” Ensayo de detección molecular (MDA) 2 E. coli 0157
(Incluyendo H7) Method First Action 2017 [Aplicable a la detección de Escherichia coli 0157 (incluyendo
H7) en carne de res molida cruda (73 % magra), arándanos congelados, brotes de ternera frescos y espinacas tiernas frescas.]
Consulte la Tabla 2017.01A para obtener un resumen de los resultados del estudio entre laboratorios. Consulte la Tabla 2017.01B para
ver los resultados detallados del estudio entre laboratorios.
A. Principio
El método 3M”" MDA 2 — E. coli 0157 (incluyendo H7) se usa con el Sistema de Detección Molecular (MDS) de 3M” para la detección
rápida y específica de E. coli 0157 (incluyendo H7) en muestras de alimentos enriquecidos. MDA 2: E. coli 0157 (incluido H7) utiliza
amplificación isotérmica mediada por bucle de secuencias diana de ADN únicas con alta especificidad y sensibilidad, combinada con
bioluminiscencia para detectar la amplificación. Los presuntos resultados positivos se informan en tiempo real mientras que los resultados
negativos se muestran. después de completar el ensayo, 60 minutos Las muestras se enriquecen en agua de peptona tamponada 3M”* (BPW;
formulación ISO).
B. Aparatos y reactivos
Los artículos (a) Ag) están disponibles como kit 3M” MDA 2 E. coli 0157 (incluido H7) de 3M Food Safety (St. Paul, MN, EE. UU.).
(a) MDS de 3M. MDS100.
(b) 3M MDA 2 E. coli 0157 (incluyendo H7). Gato. No. MDA2ECOS6, tubos reactivos: 12 tiras de ocho tubos.
(c) Tubos de solución de lisis (LS).—Doce tiras de ocho tubos.
(d) Tapas adicionales.—Doce tiras de ocho tapas.
(e) Control de reactivos. Ocho tubos de reactivo.
(f) Guía de inicio rápido.
(g) Bandeja de carga de velocidad de detección molecular de 3M.
(h) Inserto de bloque de enfriamiento para detección molecular 3M—Disponible . de 3M Seguridad Alimentaria.
(i) Inserto de bloque térmico de detección molecular de 3M. Disponible en 3M Food Safety.
(j) Herramienta para tapar/des tapar de detección molecular de 3M para tubos de reactivos. Disponible en 3M Food Safety.
(k) Herramienta de destapado/tapado de Detección Molecular 3M para tubos de lisis.— Disponible a través de 3M Food Safety.
(l) Gradilla vacía para tubos de lisis. Disponible en 3M Food Safety.
(m) Gradilla vacía para tubos de reactivos. Disponible en 3M Food Safety.
(n) BPW (formulación ISO).—Formulación equivalente a ISO 6579:2002 Anexo B o equivalente 3M.
(o) Pipeta desechable.—Capaz de 20 uL.
(p) Pipeta multicanal (8 canales).—Capaz de 20 pL.
(q) Puntas de pipeta.—Punta de filtro estéril, capaz de 20 yL.
(1) Bolsas de filtro StomacherQ).—Seward (Islandia, NY, EE. UU.) o equivalente.
(s) Bolsas SmasherY) XL.—Disponible en bioMérieux Industry (Hazelwood, MO, EE. UU.).
(t) Stomacher:—Seward o equivalente.
(u) Termómetro de inmersión parcial: rango calibrado para incluir 100 + 1*C.
(v) Unidad de calentador de bloque seco. Capaz de mantener 100 +1C,
(w) Incubadoras.—Capaces de mantener 37 + 1%C o 41.5 + 1*C.
(x) Refrigerador: capaz de mantener de 2 a 8 °C, para almacenar los componentes de 3M MDA.
(y) Computadora—Compatible con el Instrumento de Detección Molecular de 3M”.
(Z) TSB modificado. Disponible en MediaboxTM ActeroTM (Calgary, Alberta, Canadá).
(aa) OctoMACSM: Milteny Biotec (Gaithersburg, MD, EE. UU.).
(bb) Soporte múltiple para soportar OctoMACS.—Milteny Biotec.
(cc) MACS? columnas de separación de células grandes.—Milteny Biotec.
(dd) Dynabeads* antiE. coli O157,—Dynal Inc. (Lake Success, NY, EE. UU.).

E Coli Español

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

E Coli Español

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Machine Translated by Google

También podría gustarte