UNIVERSIDAD NACIONAL DE

CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

GUIA DE PRACTICA DEL LABORATORIO

PERIODO ACADEMICO 2022 – 2S

ASIGNATURA HEMATOLOGIA SEMESTRE PARALELO

I Tercero A

NOMBRE DEL DOCENTE Mgs. ANA CAROLINA GONZALES

FECHA 20 de abril de 2023

NUMERO DE PRACTICA 1y2 HORA DURACION

10:00 – 13:00 3 horas

ARMIJOS GUILLEN VICTOR ENQRIQUE

LLOMITOA GUARANDA BRAYAN MAURICIO

NOMBRE DE LOS
ESTUDIANTES
JIMENEZ VERDEZOTO SAUL EDUARDO

JAYA GUILCAPI VANI YADIRA

LUGAR DE LA PRACTICA Laboratorio Clínico de Docencia E 302

TITULO DE LA UNIDAD IDENTIFICACION BACTERIANA

TEMA DE LA PRACTICA Metabolismo de los carbohidratos

RESULTADO DE APRENDIZAJE.
 Analiza la importancia y fundamentos de las pruebas bioquímicas utilizadas
para evaluar el metabolismo de carbohidratos, proteínas y otras reacciones de uso
común en el laboratorio de microbiología.
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OBJETIVO GENERAL Comprender la importancia de las pruebas bioquímicas

utilizadas para evaluar el metabolismo de carbohidratos de las
bacterias
OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Reconocer la importancia de las pruebas bioquímicas en la identificación de las
bacterias.
 Mencionar las pruebas bioquímicas utilizadas para evaluar el metabolismo de
carbohidratos.
 Explicar los principios bioquímicos en los que se basan las reacciones observadas
en fermentación de carbohidratos, agar Kligler, rojo de metilo y Vorges-Proskauer.
 Leer e interpretar cada una de las pruebas.
FUNDAMENTO TEORICO
Las bacterias son organismos unicelulares muy pequeños y relativamente sencillos,
cuyo material genético no está rodeado por una membrana nuclear especial, por ello se llaman
procariotas. Estos microorganismos se encuentran en todas partes. Son transportados por
corrientes de aire desde la superficie de la tierra a las partes más altas de la atmósfera,
abundan en donde encuentran alimento, humedad y una temperatura adecuada para su
desarrollo y multiplicación. Se encuentran en el aire que respiramos y en el alimento
que comemos; así mismo, sobre la superficie de nuestro cuerpo, en el conducto digestivo, en la
boca, en la nariz y en otros orificios corporales. Aunque algunas producen enfermedades
muchas bacterias desempeñan papeles beneficiosos, participando en los ciclos de los
elementos de la biosfera, la degradación de materia muerta animal y vegetal, y la producción
de vitaminas. (1)
Para cultivar bacterias ambientales es fundamental contar con un medio de cultivo
básico, ya que permitirá obtener un ecosistema bacteriano mixto. Por otro lado, para aislar o
purificar una colonia de bacterias específica, se realiza la siembra indirecta, inoculando una
parte de esa colonia en un nuevo medio de cultivo estéril que podrá ser enriquecido,
selectivo y/o diferencial donde sólo se desarrollará1 la bacteria seleccionada, a excepción de
cuando el medio se contamine en el momento de la siembra la identificación bacteriana se
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realiza por medio de métodos convencionales, basados en las características fenotípicas.

Los métodos genotípicos suelen reservarse para las bacterias que no se pueden identificar
con métodos convencionales. (1) Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica
bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como su morfología,
desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas. En el cultivo es esencial la
correcta elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación. Los antibióticos
son sustancias que destruyen los microorganismos de una infección producida por
bacterias. Cada antibiótico es específico y generalmente es efectivo, aunque existen
casos donde la bacteria desarrolla resistencia neutralizando su efecto. (1)
Identificación bacteriana

Imagen 1. Identificación bacteriana

Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos convencionales,

basados en las características fenotípicas, puesto que su realización y coste los hace más
asequibles. Los métodos genotípicos suelen reservarse para las bacterias que no se pueden
identificar con métodos convencionales. (2)Los esquemas tradicionales de identificación
fenotípica bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como su
morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas.
El cultivo, cuando es factible, continúa siendo el método diagnóstico de elección; permite el
aislamiento del microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los
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antimicrobianos y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. En el cultivo es

esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación. (2)
En el proceso de identificación bacteriana tradicional, la experiencia del microbiólogo es
fundamental para la elección de una prueba o una batería de pruebas de forma secuencial, en
función de la fiabilidad de las mismas, del género o de la especie bacteriana que se pretende
identificar, del origen del aislado bacteriano, así como del coste de las mismas. Los
laboratorios deben elaborar y realizar un proceso de identificación normalizado en su actividad
diaria, que utilice de forma secuencial o simultánea un conjunto de pruebas cuyo propósito
final sea la identificación del microorganismo a nivel de género y especie y que incluya la
mayoría de las bacterias desde el punto de vista infeccioso. (2)
FUNDAMENTOS DE LA IDENTIFICACION FENOTIPICA
La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente en la comparación de las
características fenotípicas de bacterias desconocidas con aquellas de cultivos tipo. La
fiabilidad de la identificación está• en proporción directa al número de características
similares. En Microbiología Clínica, la experiencia y asociación entre el microorganismo y el
sitio y tipo de infección es de gran ayuda en la identificación preliminar. (3)
En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres niveles de
procesamiento:
a) Todas las características fenotípicas conocidas son importantes y hay que tenerlas en cuenta
cuando se inicia el proceso de identificación, pero en principio se seleccionan aquellas que se
consideran pruebas primarias, que son rápidas y sencillas de realizar, como la morfología en la
tinción de Gram u otras tinciones, crecimiento en diferentes atmósferas de incubación,
crecimiento en varios tipos de medios de cultivo, oxidasa y catalasa. Utilizando estas pocas
pruebas generalmente es posible situar a las bacterias, de manera provisional, en uno de los
principales grupos de importancia médica. A continuación se pueden seleccionar otros
métodos con mayor poder de discriminación, ya que muchos microorganismos pueden
presentar un aspecto muy similar en el examen macro y microscópico. (3)
b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que pertenece el
microorganismo. Tanto en este nivel como en el anterior, la hipótesis sobre la probable
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identidad de un microorganismo se apoya en las características del cultivo (por ejemplo

atmósfera) y en pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de
géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son:
Gram, morfología, catalasa, oxidasa, oxidación-fermentación, fermentación de glucosa,
producción de esporas, crecimiento anaerobiosis y anaerobiosis y movilidad. También deben
tenerse en cuenta los datos clínicos. Esto depender•, en gran medida, de un patrón estable de
características fenotípicas y en la experiencia del microbiólogo. (3)
c) Por ˙último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie. El empleo
de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto grado de precisión la mayoría de
las bacterias clínicamente significativas. Si la identificación no pudiera hacerse usando este
primer esquema, puede utilizarse una batería de pruebas más amplia como las que se encuentra
en diferentes sistemas comerciales. El resultado se coteja y compara con pruebas
estandarizadas o en base a perfiles numéricos de identificación. (4)
El inconveniente de este proceso es que resultados erróneos en las pruebas primarias pueden
conducir a una identificación equivocada, perdiendo tiempo y recursos, y llevar también a un
resultado erróneo. (4)
Métodos fenotípicos

Imagen 2.Metodos fenotípicos

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En el proceso de identificación bacteriana tradicional la del microbiólogo es fundamental para

la elección de una o varias pruebas de forma secuencial en fiabilidad de las mismas del género
de la especie bacteriana (4)
• Morfología celular y características de las colonias
• Pruebas inmediatas
• Pruebas rápidas (hasta 4-6 horas)
• Pruebas lentas
• Pruebas de inhibición o sensibilidad
Pruebas Bioquímicas

Imagen 3. Pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias
de objeto de identificación. Algunas son rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima
preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. (5)
Catalasa: es una enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen
citocromos. Las bacterias que sintetizan la catalasa hidrolizan el Hidrogeno en agua y el
oxígeno gaseoso que se libera produce burbujas. (5)
Oxidasa: sirve para determinar la presencia se enzimas oxidantes. La reacción de la oxidasa se
debe a la presencia de un sistema citromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual
es reducido por el oxígeno molecular produciendo agua o peróxido de hidrogeno según la
especie Moraxella Helicobacter y Brucella. (5)
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Indol mediante esta prueba se detecta la liberación de Indol en un cultivo bacteriano. Dicha
liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante la enzima triptófanos.
Óxido-fermentación: mediante esta prueba se va a determinar si la utilización de los hidratos
de Carbono por parte de un microorganismo se realiza vía oxidativa o por vía fermentativa. (5)
Rojo de metilo: Es un indicador de pH. Actúa entre un pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo hasta
amarillo respectivamente. Mediante esta prueba se comprueba la capacidad de un
microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la
fermentación ácidomixta. Se utiliza como parte de la identificación a nivel especie de los
bacilos entéricos Gram negativos. (5)
Voges-Proskauer: permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía
butanodiólica. Se usa en la identificación de bacilos entéricos Gram negativos.
Agar de Hierro Kligler: mediante esta prueba se puede determinar la capacidad de un
microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de
crecimiento básico; la producción o no de gases CO2 e H2 como productos finales del
metabolismo de los hidratos de carbono. Y la producción de ácido sulfhídrico. (5)
Factores para los medios de cultivo
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una
serie de factores de gran importancia que son:
Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la
investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre,
fósforo y sales inorgánicas. (6)
Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su
consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos
medios en estado semisólido o sólido. (6)
Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer
en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno
directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. (6)
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Condiciones adecuadas de humedad: Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones

mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque
el medio. (6)
Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos. (6)
pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. (6)
Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre
15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores. (6)
Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo deben de estar perfectamente estériles
para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el
autoclave. (6)
Medios de cultivo semisólidos
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una
proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es para ver la movilidad
de las bacterias y se emplean según su utilización: (6)
Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pue
crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido
de agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros
repres grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. (6)
Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales
son indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este en
hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis,
dichos factores. (6)
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Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente de una población microbiana específica. (6)
Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden tot
de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores se consiguen
habitualmente de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el
desarrollo. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes
impide el crecimiento de los Gram positivos. (6)
Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia característica diferenciar géneros o
especies. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los
gérmenes lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa
hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. (6)
MATERIALES Y METODOS
Equipos Materiales Reactivos
Mechero Asas de platino, tubos con la Reactivo de rojo metilo
Estufa batería bioquímica
gradilla
PROCEDIMIENTO / TECNICA
Kliger
Procedimiento:
1. Rotular e inocular cada tubo con cada una de las cepas.
2. Incubar los tubos a 37 ºC durante 24 h.
RM:
Materiales:
• Caldo glucosado a pH 6,9
• Microorganismos: - Escherichia coli
- Klebsiella pneumoniae
Procedimiento:
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1. Rotular e inocular un tubo de caldo glucosado con Eschetichia coli y otro con Klebsiella
pneumoniae.
2. Incubar a 3 7 ºC por 48 h.
VP:
Materiales:
• Caldo glucosado a pH 6,9
• Microorganismos: - Escherichia coli
- Klebsiella pneumoniae
Procedimiento:
1. Rotular e inocular un tubo de caldo glucosado con Eschetichia coli y otro con Klebsiella
pneumoniae.
2. Incubar a 3 7 ºC por 48 h.
RESULTADOS
Lisina Hierro Agar (LIA)

INSTRUCCIONES
1. Suspender 5,19 g del polvo en 150ml litro de agua purificada.
2. Reposar 5 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta
la disolución completa.
3. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
4. Enfriar y dejar solidificar en posición inclinada (pico de flauta profundo).
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
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Decarboxilación de la lisina:
Resultado Positivo: superficie alcalina / profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta).
Resultado negativo: superficie alcalina /profundidad ácida (pico violeta / fondo amarillo).
Desaminación de la lisina:
Resultado positivo: superficie rojiza / profundidad ácida. Esto sucede con cepas del género
Proteus, Providencia y algunas de Morganella spp.
Producción de SH2
Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo (especialmente en el límite entre la
superficie y profundidad).
Resultado negativo: el medio de cultivo permanece sin cambio de color.
Kliger

Procedimiento
1. Suspender 5.2 g del polvo en 1 litro de agua purificada.
2. Dejar reposar 5 minutos. Calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta
disolución total.
3. Distribuir en tubos, en volumen que ocupe hasta la tercera parte de los mismos.
4. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.
5. Enfriar y dejar solidificar en posición inclinada (pico de flauta profundo)
Resultados
Amarillo=acidez
Rosa= alcalinidad
Negro = SH2
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Fractura o desplazamiento del medio = gases

1. Producción de ácidos de la glucosa (no de la lactosa) En la superficie del medio las
enterobacterias respiran consumiendo la glucosa: Cuando la agotan (solo tiene 0.1%)
consumen los péptidos y se alcaliniza el medio (lsuperficie rosa). En el fondo las
enterobacterias fermentan la glucosa produciendo ácidos (fondo amarillo).
2. Producción de ácidos de la lactosa (y de la glucosa): En la superficie del medio las
enterobacterias respiran utilizando la glucosa y luego la lactosa. En el fondo producen
una elevada cantidad de ácidos y difunden hasta la superficie (todo el medio amarillo).
3. Producción de SH2 (color negro): la bacteria ha realizado una respiración anaerobia
utilizando el tiosulfato como aceptor de electrones; el tiosulfato se convierte en SH2
que con el Fe3+ origina S3Fe2 (color negro).
Cultivo de Klebsiella
A/A +-
El microorganismo fermenta glucosa y lactosa además produce
gas y no produce SH2.

Cultivo de Salmonella

K/K +
El microorganismo no fermenta la lactosa ni glucosa y produce
gas de SH2
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OBSERVACIONES
 De acorde al medio en el cual se siembre se obtendrá posibles resultados al igual que
este influye de gran manera del microrganismo que se desee su identificación mediante
pruebas diferenciales. En esta ocasión se utilizó el medio Kliger en el cual se sembró la
especie Kleibsella y Salmonella afirmando que estos poseen resultados muy específicos.
CONCLUSIONES
 En el área de microbiología clínica la principal herramientas que usan son las diferentes
pruebas bioquímicas que ayudan a la diferenciación de especies los cuales pueden ser o
no de interés clínico, por lo que su diferenciación en la salud humando puede mejorar el
estado de salud del paciente, siempre actuando bajo medidas de responsabilidad y
calidad de los diferentes procedimientos.
 La prueba bioquímica que se utilizó para evaluar el metabolismo de los carbohidratos
fue el Kliger ya que presenta propiedades como un indicador de pH, compuesto por
carbohidratos como la glucosa y lactosa, al igual que el Tiosulfato de Sodio es decir las
sales de hierro los cuales le dan el color característico si se produce H2S.
 La interpretación de los posibles resultados que estos puedan brindar se debe tomar en
cuenta el viraje de color rojo fenol hacia un color amarillo si este se convierte en un
medio además analizando la producción tanto de gas como el H2S esto con el fin de
evaluar el metabolismo de la bacteria a investigar y dependiendo de esto los posibles
exámenes complementarios que se realizaran posteriormente.
RECOMENDACIONES
1. Se debe ingresar al laboratorio de microbiología con todos los implementos de
bioseguridad, ya que estamos trabajando con material biológico infeccioso
2. Después de cada práctica se debe ordenar y hacer una asepsia del área de trabajo
BIBLIOGRAFIA
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(n.d.). Ma Concepción Casado González Gertrudis Torrico Cabezas María Medina
Anguita. Wordpress.com. Retrieved April 25, 2023, from
https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-un-
laboratorio-de-microbiologc3ada.pdf