Criopreservación en Monocapa
Paso 1
Atemperar
 Medio suplementado
 PBS
 Tripsina
 SFB
 DMSO
Paso 8
*Observar al microscopio
invertido.
*Inactivar la tripsina con 3 ml
de Medio suplementado.
*Añadir el medio suplementado
por donde se encuentran las
células adheridas.
Paso 9
*Recoger la suspensión celular.
*Vaciar en un tubo de 15 ml
estéril.
*Eliminar la pipeta.
*Centrifugar el tubo por 10 min
1600 r.p.m.
Paso 2 Paso 3 Paso 4
*Encender la luz UV en la cabina *Limpiar el área y todo el material *Retirar de la incubadora el frasco
de flujo laminar 30 min y luego que ingrese a la cabina con alcohol ROUX.
15 min de flujo de aire. potable al 70 %. *Cerrar la tapa del frasco ROUX.
*Observar al microscopio invertido:
*Retirar el parafilm de los
Morfología, confluencia al 60% y
reactivos a utilizar siempre dentro
de la cabina. libre de contaminación.
Paso 7 Paso 6 Paso 5
*Tomar 750 μL de tripsina al
*Eliminarla pipeta. *Cada pipeta o punta no deberá
0,25%.
*Homogenizar tocar ningún objeto o lugar.
*Añadir la tripsina por todo el
*Aspirar el PBS. *Aspirar el medio del frasco ROUX.
frasco ROUX y dejar actuar por 2
*Lavar las células con 5 ml de PBS
min.
estéril.
*Homogenizar
*Colocar el PBS por el lado
*Llevar el frasco ROUX con la
contrario de las células adheridas.
tripsina a la incubadora por 2 min.
Paso 10
*Aspirar el sobrenadante sin
dañar el pellet.
*Tomar 1 ml de medio
suplementado.
*Resuspender el pellet
suavemente 30 veces en 1 ml de
medio suplementado.

Paso 1
*Tomar 980ul de solución azul
tripán.
*Colocar en un microtubo
estéril.
*Tomar 20ul de la suspensión
celular.
*Resuspender 30 veces.
Paso 8
*Resuspendemos 30 veces
*Colocamos 900ul de la
suspensión celular en cada vial.
*Colocamos 100ul de DMSO en
cada vial.
*Colocamos el agente
crioprotector gota a gota por las
paredes del vial.
Paso 9
*Cerrar herméticamente los
viales.
*Etiquetar:
-Nombre de la línea celular
-Concentración de células
-Fecha
Viabilidad celular
Paso 2
*Tomar 20ul y cargamos la
cámara de Neubauer.
*Ir al microscopio invertido.
*Contar las células vivas en los 5
cuadrantes de la cámara
Neubauer.
Paso 7
Colocar en la gradilla los viales
estériles.
Cada vial se coloca:
= >90% SFB
= >10% DMSO
Resuspender el pellet celular en
90% de suero fetal bobino
5 viales = 4.5 ml SFB
Paso 10
*Colocar los viales en posición
vertical en un recipiente
destinado para cripreservar.
*Congelar paulatinamente en
un congelador de -80oC por 24
horas.
Paso 3 Paso 4
*Cálculos
*Porcentaje de viabilidad *Porcentaje de viabilidad =
celular. (células viables/nº células
*Volumen de células necesarias totales) x 100.
para llenar cada vial con *Número de células vivas/ml=
aproximadamente 2x106 cell/ml. células contadas vivas x el factor
de dilución x 10000.
Paso 6
Criopreservación cálculos. Paso 5
90% SFB
1vial----------900ul *Suspensión celular
*Centrifugar 5min/1600 rpm.
5viales-------x
X=4.5 ml *Eliminar el sobrenadante.
*PBS
10% DMSO
1vial----------100ul *Resuspender
*Alícuota 90% SFB y 10% DMSO.
5viales-------x
X=500 ml
Paso 12
Paso 11
*Almacenar los reactivos a -4oC
*Almacenamos en el tanque
*Desechamos los objetos
nitrógeno líquido -196oC.
cortopunsantes.
*Limpiar el área de trabajo.