Tema 7.

- DISEÑO Y EVALUACIÓN DE LOS ESTUDIOS DE BIOEQUIVALENCIA

1. Bioequivalencia

a. Fundamento de los ensayos de bioequivalencia

Los ensayos de bioequivalencia se basan en el principio de que dos formulaciones que no difieren
demasiado en la velocidad y cantidad con que el principio activo llega a la circulación general,
tampoco diferirán en su eficacia y seguridad terapéutica.

b. Criterios de bioequivalencia
La bioequivalencia in vivo de un medicamento se demuestra si la velocidad y extensión de la
absorción, determinada por comparación de los parámetros medidos, no indican una diferencia
sustancial de la velocidad y extensión de la absorción con el producto de referencia.

Una formulación que difiere del producto de referencia en la velocidad de absorción pero no en
la cantidad absorbida, puede considerarse bioequivalente si:
- La diferencia en la velocidad de absorción es intencionada y está debidamente reflejada
en el etiquetado, y/o
- La velocidad de absorción no reduce la seguridad y eficacia del medicamento.

Habitualmente se considera que dos formulaciones de un mismo principio activo son

bioequivalentes si la diferencia en biodisponiblidad es menor al 20%.
No obstante, dependiendo de las diferentes agencias reguladoras (EMA, FDA), se podría aceptar
la bioequivalencia con una diferencia en biodisponibilidad mayor (30%) en determinados casos
de fármacos con elevada variabilidad intra-individual (>30%) o fijarse en un valor menor (10%) si
se trata de fármacos con margen terapéutico estrecho.

c. Criterios para la realización de un ensayo de bioequivalencia

Las circunstancias en las que se recomienda llevar a cabo ensayos de bioequivalencia son:
- En las solicitudes de autorización de nuevos fármacos en fase de investigación clínica,
cuando la formulación para su comercialización no es la misma que la usada en el ensayo
clínico.
- Cuando se realicen cambios importantes en los componentes, la composición y/o el
método de fabricación de un medicamento después de su aprobación.
- Para demostrar la bioequivalencia entre un medicamento equivalente (genérico) o
alternativa farmacéutica y el fármaco autorizado de referencia correspondiente.

En determinadas circunstancias, se puede documentar la Bioequivalencia de un medicamento

utilizando ensayos in vitro (estudios de disolución). Basándose en el sistema de clasificación
biofarmacéutica, esto es de aplicación a fármacos de la Clase I (FDA y EMA) y de la clase III (sólo
EMA) formulados en formas farmacéuticas sólidas de liberación inmediata para administración
oral, siempre que presenten una velocidad de disolución in vitro muy rápida (85% o más, disuelto

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en 15 min) y los excipientes no alteren el proceso de absorción. Esta exención no es aplicable a
fármacos con margen terapéutico estrecho.
También se pueden obviar los estudios de bioequivalencia en el caso de disoluciones (acuosas
u oleosas), cualquiera que sea la vía de administración, siempre que presenten la misma
composición cuantitativa y cualitativa que el medicamento de referencia.

2. Diseño de ensayos de bioequivalencia

Los puntos básicos que deben contemplarse en la planificación y desarrollo de un ensayo de
bioequivalencia son los siguientes:
a) Protocolo
- Objetivos del ensayo.
- Diseño experimental
- Criterios para la inclusión y exclusión de individuos.
- Tipo de muestras biológicas: tiempos de muestreo y procedimiento para la obtención y
conservación de muestras.
- Criterios para la inclusión y exclusión de muestras.
- Consideraciones éticas: consentimiento de los individuos y procedimientos de
emergencia.
b) Método analítico
- Datos analíticos para la validación del método de valoración.
- Datos analíticos de muestras biológicas.
c) Resultados y evaluación estadística
- Resumen de los datos obtenidos por individuos.
- Estadística descriptiva de los parámetros utilizados para la evaluación de la
biodisponibilidad.
- Resultados de las pruebas estadísticas utilizadas para evaluar la bioequivalencia.

Los ensayos de biodisponibilidad y bioequivalencia están regulados en los distintos países por la
legislación relativa a ensayos clínicos. Generalmente se realizan en voluntarios sanos y en dosis
única, salvo que por motivos de seguridad sea más ético realizarlos en pacientes y, en ese caso,
se harán en dosis repetidas. Se incluirán individuos de ambos sexos, con índice de masa corporal
normal y edades comprendidas entre 18-55 años.
Los ensayos de bioequivalencia se llevan a cabo a través de un estudio farmacocinético. No
obstante, en casos justificados, se podría utilizar un estudio farmacodinámico o un estudio clínico
comparativo.
En los estudios farmacocinéticos en dosis única, los parámetros básicos que se analizan son
fundamentalmente, parámetros de exposición (ABC, Cmax) y también tmax. Si de lo que se dispone
es de la curva de excreción urinaria se puede analizar Xu∞ y la curva de velocidad de excreción
urinaria-tiempo. Como información adicional deben aportarse los valores de otros parámetros
como la constante de velocidad asociada a la fase terminal de eliminación, t1/2 y MRT.

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3. Fundamentos del diseño experimental.
El uso de diseños experimentales nos permite:
a) evaluar la influencia de los factores que se consideran de interés.
b) Separar o aislar la variabilidad de los resultados experimentales que tienen un origen
conocido con el fin, más que de evaluar su propia influencia, de incrementar la precisión
en el análisis estadístico de estos resultados.

4. Orígenes de variabilidad en los estudios de bioequivalencia.

El hecho de que los ensayos de bioequivalencia se desarrollen en humanos condiciona la
estructura de los diseños a utilizar debido a los numerosos orígenes de variabilidad, algunos de
los cuales son controlables mientras que otros son inevitables.

- Principales causas controlables de variabilidad:

o Variables fisiológicas:
 Ingestión de alimentos
 Administración de otros medicamentos
 Funciones renal y hepática
 Características anatómicas: altura, peso, etc
o Obtención y análisis de muestras
 Tiempos de muestreo
 Almacenamiento de las muestras
o efectos residuales
 Restos del medicamento o sus metabolitos
 Inducción
 Inhibición
 Irritación

- Principales causas inevitables de variabilidad:

o Diferencias Inter e intra individuales
o Diferencias entre unidades de una misma formulación
o Interacciones individuo x formulación
o Error aleatorio

En función de los objetivos del estudio interesará eliminar o no la variabilidad originada por causas
controlables.
Las fuentes de variabilidad inevitables forman parte de los resultados experimentales, sin
embargo, pueden ser estimados mediante la formación de bloques en diseños experimentales
adecuados, lo cual también se puede hacer con causas de variabilidad controlables que no se
quieren eliminar para estudiar su influencia.
Entre las causas controlables de variabilidad, la ingesta de alimentos produce retraso en el
vaciamiento gástrico y puede interferir con la disolución del medicamento, por ello se recomienda

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hacer los estudios de bioequivalencia en ayunas, salvo que específicamente esté indicada la
administración del fármaco con la comida, en ese caso, se realizará con la ingesta de alimentos.
No obstante, si los alimentos pudiesen interferir en la biodisponibilidad del medicamento (ej.
comprimidos gastro-resistentes o de liberación prolongada) se tendrían que realizar los dos tipos
de estudios, con y sin alimentos.

Entre los orígenes inevitables de variabilidad más importantes tenemos la variabilidad Inter e intra
individual :
- variabilidad Inter-individual, responsable de las diferencias sistemáticas que se presentan
entre individuos
- variabilidad Intra-individual, por la que un mismo individuo responde de forma distinta en
diferentes ocasiones.

Para cuantificar las variabilidades Inter e intra individuales se utilizan las respectivas varianzas;
lógicamente, la variabilidad Inter-individual depende de la amplitud del grupo de población
seleccionado. Debido a las diferencias previsibles entre los individuos, estos deben considerarse
como un factor más a tener en cuenta en el ensayo de bioequivalencia.

Según esto la construcción de diseños experimentales se debe realizar siguiendo dos estrategias:
a) Aleatorizar para evitar que los datos se vean afectados por sesgos de origen conocido o
desconocido
b) Formación de bloques para aislar en lo posible los orígenes de variabilidad ajenos al que
se pretende evaluar (diferencia entre formulaciones) con el fin de aumentar la precisión
de los resultados.

En resumen, la construcción de todo diseño experimental se basa en la formación de bloques con

lo que se pueda y aleatorizar lo que no se pueda.

Diseños experimentales usados en ensayos de bioequivalencia

Los diseños experimentales usados para este fin difieren principalmente en el número de
orígenes de variabilidad que permiten aislar. En orden creciente de complejidad tenemos:

1.- Diseños completamente aleatorizados o diseños paralelos: en los que cada individuo recibe
sólo una de las formulaciones a ensayar y la asignación del tratamiento se ha realizado de forma
aleatoria. Aunque no es el diseño más apropiado para los ensayos de bioequivalencia, podría
utilizarse en aquellos casos en los que la variabilidad Inter-individual es relativamente pequeña
comparada con la intra-individual o cuando el fármaco es potencialmente tóxico o posee una vida
media muy larga. Se pueden construir con cualquier número de individuos. Su principal
inconveniente es la falta de precisión ya que toda la variabilidad existente entre las unidades
(excepto la debida a tratamientos) pasa a formar parte del error experimental.

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2.- Diseños cruzados. Basados en la suposición de que la variabilidad Inter-individual es superior
a la variabilidad intra-individual y en los que cada individuo recibe más de una formulación y se
asimila a un bloque. La administración de las diferentes formulaciones deben espaciarse de tal
manera que entre una administración y la siguiente deben transcurrir al menos 5 t1/2 (lo habitual
es dejar pasar entre 7-10 t1/2). Si todos los individuos reciben todas las formulaciones en estudio
se habla de diseños cruzados completos y dentro de éstos, según que las formulaciones las
reciban de forma aleatoria o siguiendo un diseño establecido, tenemos:
a) Diseños en bloques aleatorios. Agrupamiento simple. Se forman bloques con cada uno de los
individuos y se aleatoriza el orden de recepción de las formulaciones, sin embargo debido al bajo
número de individuos que suelen intervenir en estos estudios puede que dicha aleatorización no
sea efectiva (Ej: la formulación C se administra la primera en 5 de las 7 veces posibles).

Individuo Secuencia temporal

1 2 3 4
1 B C A D
2 C D B A
3 C B A D
4 C A D B
5 C D A B
6 C A B D
7 A B C D

Tabla 1 . Diseño en bloques aleatorios. Agrupamiento simple

b) Diseño en cuadrado latino. Agrupamiento doble. Es el diseño experimental recomendado tanto

por la FDA como por la administración europea (EMA) en los ensayos de bioequivalencia.
En el cuadrado latino, cada individuo es su propio control y las formulaciones a ensayar se
agrupan de forma simultánea según individuo y periodo de ensayo, esto permite separar el efecto
debido a los individuos de la variabilidad atribuible al periodo de administración (segunda en
importancia en estos estudios).

Individuo Períodos de administración

I II III IV
1 A B C D
2 D C A B
3 C D B A
4 B A D C

Tabla 2 . Diseño en cuadrado latino. Agrupamiento doble

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En la práctica, como es poco probable alcanzar la precisión suficiente con un número de
individuos igual al número de formulaciones a ensayar, el estudio se realiza con grupos de
individuos (tabla 3). Esto presenta la restricción de que el número de individuos que participen en
el ensayo tienen que ser múltiplo del número de formulaciones a ensayar.
También, en los últimos años, se ha ido abandonando estudios con un número elevado de
formulaciones y actualmente se considera preferible comparar las formulaciones 2 a 2 (tabla 3).

Individuos Periodos de administración

I II
Grupo I
A B
(individuo 1,2,3,4,5)
Grupo II
B A
(individuo 6,7,8,9,10)

Tabla 3. Diseño en cuadrado latino 2 x 2.

5. Análisis estadístico
La técnica estadística habitualmente utilizada para la evaluación de los ensayos de
bioequivalencia es el análisis de la varianza, basada en un modelo teórico que incorpora los
distintos orígenes de variación o factores que presumiblemente van a afectar a las observaciones
experimentales. En el caso de un ensayo de bioequivalencia, éstos son:
a) Formulaciones ensayadas: que se supone dan origen a respuestas diferentes cuando se
administran a un mismo individuo
b) Individuos: que se espera respondan de forma distinta según la variabilidad Inter-individual.
c) Ensayos o periodos: si existieran diferencias sistemáticas entre las observaciones realizadas
en los diferentes períodos en que se divide el ensayo de bioequivalencia.

El modelo estadístico para el análisis de la varianza toma la siguiente forma:

y(ijk) =  + I(i) + P(j) + F(k) + e (ijk)

Donde:
Y(ijk) : es la transformada logarítmica de la observación realizada sobre el individuo i, durante el
periodo j en el que se le administró la formulación k.
 : media general
I(i): efecto debido al individuo i-ésimo
P(j): efecto debido al período j-ésimo
F(k): efecto debido a la formulación k-ésima
e (ijk): error asociado a la observación Y (ijk); se supone una variable aleatoria normalmente
distribuida con media cero y varianza 2.

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Nótese que si los efectos debidos a individuos, ensayos y formulaciones son nulos, es decir, las
diferencias no son estadísticamente significativas, las respuestas observadas corresponderán al
modelo:
y(ijk) =  + e (ijk)

es decir, las observaciones tendrían el comportamiento de una variable distribuida normalmente

(, 2).

De acuerdo con el modelo presentado, el parámetro que se vaya a utilizar como medida de la
biodisponibilidad debe tener una magnitud que sea el resultado de incorporar a su valor, de forma
aditiva, las cantidades debidas a los efectos de las formulaciones, los individuos, los periodos y
el error aleatorio.

Si tomamos como ejemplo el ABC, supone asumir que:

ABC =  + efecto individuo + efecto período + efecto formulación + error

F Xo
Sabiendo que: ABC 
Clp

Desde el punto de vista teórico, la transformación logarítmica del ABC es la que muestra un
comportamiento aditivo frente al efecto de la formulación (FXo) y del individuo (Clp).

ln( ABC )  ln( F Xo)  ln(Clp)

Análogos razonamientos son aplicables a otros parámetros como Xu o incluso Cmax o tmax ya que
en este caso incorporan el Vd en el denominador de las ecuaciones que los definen.
La transformación logarítmica de las observaciones realizadas sobre el parámetro utilizado como
medida de la biodisponibilidad se debe realizar antes de proceder al análisis de la varianza.

La tabla 4 recoge el análisis de la varianza usado habitualmente en los ensayos de

bioequivalencia cuando se utiliza el cuadrado latino como diseño experimental. En dicha tabla se
asume que se utilizan “q” individuos, cada uno de los cuales recibe las “r” formulaciones
ensayadas a lo largo de los “r” períodos en los que se divide el ensayo.

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 Origen de Suma de Grados de Cuadrado
variación Cuadrados libertad medio

T 2
( i ...) 2
T(...
Individuos q

) q-1 SC/gl
r qr

T 2
(. j .) 2
T(...
Periodos  r-1 SC/gl
r )

q qr

T 2
(..k ) 2
T(...
Formulaciones  r-1 SC/gl
r )

q qr

Error Por diferencia Por diferencia SC/gl = s2

2
T(...
Total Y 2
( ijk ) 
qr
)
qr-1 SC/gl

Tabla 4. Análisis de la varianza para ensayos cruzados de tres vías.

Donde:
T2(i..) = suma de todas las observaciones correspondientes al i-ésimo individuo elevada al
cuadrado
T2(.j.) = suma de todas las observaciones correspondientes al j-ésimo período elevada al cuadrado
T2(..k) = suma de todas las observaciones correspondientes a la k-ésima formulación elevada al
cuadrado
T2(...) = suma de todas las observaciones elevada al cuadrado
Y2(ijk) = sumatoria de los cuadrados de cada una de las observaciones.

6. Pruebas estadísticas para establecer la bioequivalencia

Existen distintas pruebas estadísticas que se pueden utilizar para la toma de decisión en los
ensayos de bioequivalencia. La FDA recomienda utilizar la siguiente:
Prueba del intervalo de bioequivalencia: Procedimiento de Schuirmann
Esta prueba consiste en probar la bioequivalencia de dos tratamientos basándose, no en la
igualdad de los mismos, sino en que la diferencia entre ellas sea lo suficientemente baja como
para considerarla irrelevante (menor de un 20%). Estadísticamente podemos definir la
hipótesis nula de bioequivalencia y su alternativa de no bioequivalencia de la siguiente forma:

H0:  (prb) -  (ref)  < 

H1:  (prb) -  (ref)   

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Donde  (prb) y  (ref) son los valores medios del tratamiento Nuevo o problema y del
tratamiento de referencia respectivamente y  la diferencia máxima admisible entre ellos.
Sin embargo, Anderson y Hauck (1983, 1984) pusieron de manifiesto que de esta manera, al
concluirse la bioequivalencia a partir de la aceptación de la hipótesis ensayada y no de su
rechazo, el riesgo del paciente no se encuentra controlado de forma directa, tal y como se
deduce de la comparación de la información recogida en las tablas 5 y 6.

HIPÓTESIS NULA H0 HIPÓTESIS NULA H0

VERDADERA FALSA
H0 ACEPTADA NO HAY ERROR
ERROR TIPO II (error )
Los tratamientos son La equivalencia ha sido
Riesgo del paciente
equivalentes aceptada

H0 RECHAZADA ERROR TIPO I (error ) NO HAY ERROR

Los tratamientos NO Riesgo del productor La equivalencia ha sido
son equivalentes rechazada

Tabla 5. Tabla de decisión en los ensayos para probar la equivalencia de dos tratamientos
utilizando una prueba de hipótesis nula de bioequivalencia

HIPÓTESIS NULA H0 HIPÓTESIS NULA H0

VERDADERA FALSA
H0 ACEPTADA NO HAY ERROR
ERROR TIPO II (error )
Los tratamientos NO La NO equivalencia ha sido
Riesgo del productor
son equivalentes aceptada

H0 RECHAZADA ERROR TIPO I (error ) NO HAY ERROR

Los tratamientos son Riesgo del paciente La No equivalencia ha sido
equivalentes rechazada

Tabla 6. Tabla de decisión en los ensayos para probar la equivalencia de dos tratamientos
utilizando una prueba de hipótesis nula de NO bioequivalencia

Estos autores llegan a la conclusión de que los ensayos de bioequivalencia deben evaluarse
probando la hipótesis de no bioequivalencia.
Teniendo esto en cuenta, Schuirmann (1987) propone como alternativa la prueba consistente
en un doble ensayo de una cola donde se plantean las siguientes hipótesis de no
bioequivalencia:

H01:  (prb) -  (ref)  R1 y H02:  (prb) -  (ref)  R2

H11:  (prb) -  (ref) > R1 H12:  (prb) -  (ref) < R2

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Las formulaciones serán bioequivalentes si ambas hipótesis (H01 y H02) se rechazan.
Estas hipótesis pueden verificarse, asumiendo una distribución normal, utilizando la prueba t-
student para un nivel de significatividad de =0,05 de forma que se concluiría la bioequivalencia
(o no) de las formulaciones ensayadas con un valor de  = 0,1.

Las pruebas de hipótesis nula H01 y H02 se verifican por tanto mediante los estadísticos:

[ X ( prb )  X ( ref )]  R1
T1 
2 s2
n

[ X ( prb )  X ( ref )]  R2
T2 
2 s2
n

Donde :
X(prb) y X(ref) son los valores medios de las transformadas logarítmicas de las observaciones
correspondientes al tratamiento Nuevo o problema y al tratamiento de referencia
respectivamente.
R1 = Ln 0,8 (transformada logarítmica del límite inferior del intervalo de bioequivalencia)
R2 = Ln 1,25 (transformada logarítmica del límite superior del intervalo de bioequivalencia)
s2 = varianza del error del correspondiente análisis de varianza
n= número de individuos

Si se cumple, para los valores de T1 y T2 hallados, que: T1 > t (, n-2) y T2 > t (, n-2), siendo
t el valor tabulado, se rechazarán las hipótesis nulas planteadas (H01 y H02), lo que implica
aceptar las hipótesis alternativas y, por tanto, ambas formulaciones serán bioequivalentes.

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