Cátedra de Inmunología- Departamento de Bioquímica.

FCNyCS.
 Es una rama de la inmunología que se encarga de
diseñar las distintas estrategias que se utilizan
para la separación y purificación de sustancias
(Ag o Ac) a partir de mezclas complejas (suero,
lisado bacteriano, sobrenadantes de cultivos, etc.)
 El método de elección dependerá de las características de
la muestra:
 Complejidad
 Masa proteica total
 Concentración efectiva de la sustancia a purificar
 Grado de purificación requerida
 Escala de trabajo (g, mg, ug)
 Materiales disponibles
Métodos Inespecíficos

Métodos Específicos
● Utilizan las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos para
separar las inmunoglobulinas de las restantes proteínas.
● Precipitación de gamma globulinas totales (inmunes y no
inmunes).
● Ventajas: preservan la estructura de las proteínas, por las
condiciones en que se llevan a cabo, y en consecuencia los
anticuerpos conservan su actividad biológica.

Precipitación Salina

Precipitación alcohólica
 Sulfato de amonio Sulfato de sodio

• A la muestra se agrega una • Primero dialización contra

solución saturada de iones fosfato de sodio.
pequeños cargados (sulfato de • Segundo: precipitación con
amonio) bajo condiciones sulfato de sodio.
adecuadas de temperatura y • Paso final: dialización contra
pH. NaCl
• Competencia por las moléculas
de agua de solvatación entre
las inmunoglobulinas y la sal.
• Aumentan las interacciones
proteína-proteínas
precipitándolas.
• Paso final: dialización contra
NaCl.
Filtrado de moléculas= separación de moléculas según su tamaño.
Uso de membranas semipermeables Poro menor a macromolécula.
Moléculas pequeñas difunden a través de la membrana al exterior
hasta que se alcanza el equilibrio
 Precipitación alcohólica en frío.

• Concentración de etanol: modifica la constante

dieléctrica de las distintas proteínas provocando
la precipitación de las menos solubles hasta las
más solubles en forma secuencial.
• pH.
• Fuerza iónica.
• Temperatura.
• Concentración proteica.
• Obtención de IgG en el sobrenadante e IgM e IgA
en el precipitado.
 Precipitación Alcohólica en frio

Alcohol 50º (-20ºC) Precipitación de Igs totales

Disolver precipitado NaCl (0,02M) pH=5,1

Precipitado: IgM + IgA Sobrenadante: IgG

Purificación: Purificación con Alcohol

Disolver en agua destilada 50º
(-20ºC)
Sobrenadante
Purificar con Alcohol 50º (-20ºC)
Métodos Inespecíficos

Métodos Específicos
 ¿Qué es una cromatografía?

Método de separación que utiliza 2 fases (móvil y estacionaria).

Los componentes de una mezcla se disuelven en una fase móvil y
son desplazados a diferente velocidad a través de una fase
estacionaria según su afinidad con esta última.
Se obtienen eluciones diferenciales de los componentes.

Adsortivas Intercambio iónico, afinidad.

Según características de
fase estacionaria y su
No adsortivas Exclusión molecular.
relación con la muestra
Cromatografía exclusión molecular

Cromatografía intercambio iónico

Cromatografía de afinidad
 Tener en cuenta:  Aplicaciones
 Tipo de columna. • Purificación de gamma globulinas
 Interacción para purificación • Purificación de Ac Mo/policlonales
muestra. • Purificación de distintos antígenos
 Solventes utilizados.
 Posibles contaminantes.
 Utilización posterior de la
sustancia purificada.
 Método de control de pureza.
 Actividad biológica obtenida.
 PM Concentración sérica
Albúmina 60.000 3-4 gr%
IgG 150.000 800 -1300 mg%
IgM 970.000 125-160 mg%
IgA 160.000 90-450 mg%
IgD 180.000 3 mg%
IgE 190.000 0.05 mg%
Fc (IgG) 55.000
Fab (IgG) 55.000
F(ab`)2 90.000
l (IgG) 25.000
H (IgG) 52.000
 Tener en cuenta:
• Diámetro de los poros de las esferas.
• Volumen interno de las esferas.
• Volumen que presenta una proteína en solución.

 Aplicaciones:
• Desalado de solutos  uso de poros muy pequeños.
• Caracterización de PM  usando proteínas de PM conocidos (estándar).
• Separación de solutos de distintos PM
Fundamento: la biomolécula con una carga determinada se une a una
matriz estacionaria de carga opuesta. La unión se puede modificar
variando la concentración salina y el pH del buffer usado como eluyente.

¿Propiedad ácido-base de las proteínas (AA)?

● Grupo amino (báse) y carboxilo (ácido).

● Anfotéricas Ionizadas (o no) según pH del medio.

pH bajo pI= pH pH alto

 Características:
• Mecanismo de adsorción reversible  unión electrostática reversible
• 2 tipos de RII: aniónicas (+) y catiónicas (-)
• En la separación de mezclas de proteínas que no difieren mucho de su
carga neta, el uso combinado de variaciones de pH y fuerza iónica
permite obtener una mejor resolución.
 Factores que contribuyen al éxito en la purificación por
afinidad:
a) Concentración relativa inicial de la sustancia a purificar
b) La afinidad del ligando por el ligante (ej: Ac por el Ag)
c) La facilidad con que la interacción puede ser desplazada
 Se inocula a un animal de experimentación la proteína S del
SARS-CoV2. Luego de un plan de inmunización convencional
se quiere purificar el/los anticuerpo/s específico/s.
 Esquematice cómo purifica dicho/s anticuerpo/s.
 S Plan de
Suero IgM e IgG
inmunización

Coágulo

Método
inespecífico
Cromatografía IgG a-S
IgGs afinidad
(Sobrenad IgGs no específicas
ante)

Precipitación
alcohólica Cromatografía IgM a-S
IgMs afinidad
IgMs no específicas
Cromatografía
IgMs + IgAs exclusión
(Precipitado)
IgAs