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REDVET.

Revista Electrónica de
Veterinaria
E-ISSN: 1695-7504
redvet@veterinaria.org
Veterinaria Organización
España

Guatemal Sánchez, Adriana; Jáuregui Sierra, Diego; Arteaga Cadena, Vicente;


Arciniegas Aguirre, Stalin Marcelo
Determinación de las condiciones óptimas de un equipo extractor de apitoxina en abejas
(A pis mell ifera)
REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria, vol. 18, núm. 12, diciembre, 2017, pp. 1-11
Veterinaria Organización
Málaga, España

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REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504

Determinación de las condiciones óptimas de un equipo


extractor de apitoxina en abejas (Apis mellifera)

Guatemal Sánchez, Adriana: Pontificia Universidad Católica del


Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y
Ambientales (ECAA) | Jáuregui Sierra, Diego: Pontificia Universidad
Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas
y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Arteaga Cadena,
Vicente: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra
(PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA),
Laboratorio de Biotecnología. | Stalin Marcelo Arciniegas Aguirre:
Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela
de Ingeniería Laboratorio de Sistemas.

Contacto: djauregui@pucesi.edu.ec

Resumen

La Apitoxina es una fuente rica en enzimas, péptidos y aminas que tienen


diversidad de propiedades farmacéuticas. Esta investigación se realizó para
determinar las condiciones adecuadas de uso del prototipo extractor de
apitoxina en abejas Apis mellifera, en la Granja de la Pontificia Universidad
Católica del Ecuador sede Ibarra y así comprobar si los tratamientos difieren
en los resultados en cuanto a los mg de apitonan, mg/uL de melitina y
número de abejas muertas por jornada de “cosecha”; para esto, se empleó un
diseño estadístico crossover con 6 tratamientos: C1 (alambre de cobre 0,1
mA – 29 V), C2 (alambre de cobre 0,3 mA – 87 V), C3 (alambre de cobre 0,5
mA – 144 V), P1 (alambre de plata 0,1 mA – 29 V), P2 (alambre de plata 0,3
mA – 87 V), P3 (alambre de plata 0,5 mA – 144 V), cada uno de ellos con 6
observaciones, cada 20 días. Se buscó que las abejas se posen en la malla
metálica del equipo y sientan un pequeño estimulo eléctrico, para que las
estimule a depositar el veneno sobre un vidrio recolector, para luego
recolectar, mediante rasparlo, almacenarlo y realizar el respectivo análisis
mediante HPLC. El mejor tratamiento C3 con 33,02 mg de apitoxina y pocas
abejas muertas; determinándose la presencia de melitina mediante HPLC.
Concluyéndose que la intensidad eléctrica (voltaje y amperaje) son factores
que influyen en la agresión de la abeja ya que a mayor intensidad eléctrica las
abejas incrementan su agresividad y producción de apitoxina.

Palabras clave: Apitoxina, Extractor de apitoxina, Apiario, Melitina, HPLC

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Abstract

Apitoxin is a source rich in enzymes, peptides and amines that have diverse
pharmaceutical properties. This research was carried out to determine the
proper conditions of use of the apitoxin extractor prototype in Apis mellifera
bees at the Granja de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Ibarra,
and to verify if the treatments differed in the results regarding the mg of
apitonan , mg / uL of melittin and number of dead bees per "harvest" day; For
this, a statistical crossover design was used with 6 treatments: C1 (copper
wire 0.1 mA - 29 V), C2 (copper wire 0.3 mA - 87 V), C3 (copper wire 0.5 mA
- 144 V), P1 (silver wire 0.1 mA - 29 V), P2 (silver wire 0.3 mA - 87 V), P3
(silver wire 0.5 mA - 144 V), each of with 6 observations, every 20 days. It
was hoped that the bees will be placed in the wire mesh of the equipment and
feel a small electrical stimulation, so that it stimulates them to deposit the
poison on a glass collector, later to collect, by scraping, to store it and to
realize the respective analysis by HPLC. The best C3 treatment with 33.02 mg
of apitoxin and few dead bees; the presence of melittin being determined by
HPLC. It is concluded that the electric current (voltage and amperage) are
factors that influence the aggression of the bee because at higher electric
intensity the bees increase their aggressiveness and production of apitoxin.

Keywords: Apitoxin, Apitoxin Extractor, Apiary, Melittin, HPLC

INTRODUCCIÓN

El veneno de abeja es secretado por dos tipos de glándulas: una glándula


acida y otra básica que se encuentran en el abdomen del insecto. La glándula
principal es la acida, està estructurada por un par de tubos largos y finos,
situados en la parte posterior de la cavidad abdominal. Estos tubos se unen
formando un conducto común que se abre en el saco de veneno, un órgano de
reserva de la sustancia segregada hasta el momento de ser utilizada por la
abeja en el acto de picar. Este saco se une a la base del aguijón por un tubo
similar al resto de la glándula (Lema, 2013).

Las glándulas del veneno tienen una formación asíncrona es decir hay células
en todos los estados, unas más nuevas y otras más viejas, esto permite que
la abeja produzca veneno hasta los 20 a 15 días de edad que es cuando tiene
el saco lleno, si en este tiempo la abeja aguijonea a algún insecto y gasta
alguna cantidad del veneno puede ser repuesto, cuando las abejas ya están
muy viejas las células se mueren y no hay producción de veneno (Roldan,
2014).

El aguijón de una abeja está formado por dos estiletes encerrados en un


estuche que se comunican con la glándula encargada de elaborar el veneno;
una vez elaborado, se acumula en la base del aguijón hasta su exteriorización,

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siendo las hembras las que tienen el aparato picador y glándula de veneno, y
dentro de éstas, las más eficientes desde el punto de vista del veneno son las
pecoreadoras, abejas obreras que trabajan fuera de la colmena (Lema, 2013).
De acuerdo con Feldman (2001), existen cuatro componentes principales en la
composición de la apitoxina. Dos son péptidos de bajo peso molecular y los
dos restantes tienen acción enzimática; es decir que, los péptidos son de
menor peso molecular que las enzimas. En el veneno de abejas el principal
péptido es la melitina, que es también el principal componente
biológicamente activo.

La melitina integra cerca del 50 – 55% peso seco del veneno de abejas, este
péptido se encarga de activa la membrana de las células, disminuyendo la
tensión superficial, en dosis muy pequeñas es un poderoso antiinflamatorio,
estimula los músculos lisos, aumenta la permeabilidad capilar y con ello
incrementa la circulación sanguínea, por tanto baja la presión de la misma,
mejora su coagulación, además es un poderoso inmunoestimulante e
inmunosupresor, tiene acción anticancerígena, es un excelente antibacteriano,
antifúngico y antiviral (Feldman, 2001; Bogdanov, 2015).

La apamina, forma parte entre el 2 al 3 % del peso seco del veneno de


abejas. Es un excelente antiinflamatorio, estimulante de la liberación de
cortisona, acción antiserotonina, aumenta la capacidad de defensa,
inmunosupresor y estimula el sistema nervioso central en dosis muy pequeñas
(Roldan, 2014).

Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones específicas, tal es el caso
de fosfolipasa A 10-12%. Destruye los fosfolípidos y disuelve la membrana
celular de los organismos de sangre; disminuye la presión arterial y la
coagulación de la sangre; en cambio la fosfolipasa B cumple con la actividad
de desintoxicación (Bogdanov, 2015).

La hialuronidasa, cataliza la hidrólisis de proteínas, por lo tanto la penetración


en el tejido; dilata los vasos sanguíneos y aumenta su permeabilidad,
provocando un aumento de circulación de la sangre (Bogdanov, 2015).

La información que se recibe las abejas del medio es gracias a los sistemas
sensoriales, que es analizada por el centro coordinador del sistema nervioso,
produciendo una determinada respuesta (Padilla & Flores, 2012), compuesto
por feromonas.

Estas feromonas se producen en unas glándulas denominadas exocrinas o de


secreción, agrupándolas en dos categorías:

1. Feromonas liberadoras.

2. Feromonas iniciadoras

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Las feromonas liberadoras estimulan en el animal receptor la ejecución de un


comportamiento inmediato y reversible, en el mismo momento en el que son
percibidas. Además, el comportamiento desarrollado por el receptor esta
mediado por el sistema nervioso. La posibilidad de modular esta respuesta
depende de los atributos peculiares de las feromonas de alarma asociadas al
sistema defensivo (aguijón) de las obreras cuya liberación desencadena el
reclutamiento de otras obreras frente a la agresión, las feromonas de alarma
son representadas por una mezcla multi componente y multi fuente
feromonales identificando más de 40 compuestos (incluyendo precursor,
productos intermedios y finales biosintético) de los extractos del aguijón de la
abeja, entre los cuales unos 15 componentes estimulan uno o más
comportamientos (vuelo del nido para localizar la fuente de perturbación,
perseguir, morder y picadura) pero dos son las sustancias que provocan el
comportamiento defensivo contra los intrusos en la entrada de la colmena, y
estos son (Padilla & Flores, 2012):

• Acetato de isopentilo (IPA, o acetato de isoamilo) es el principal


componente activo de la mezcla de feromonas de alarma responsable de
alertar y suscitar respuestas defensivas en la entrada de la colmena.

• 2-heptanona.- feromona de alarma de la glándula mandibular.

Las feromonas de alarma son producidas principalmente en abejas obreras


por la glándula de Koschevnikov y por las áreas glandulares de las vainas de
la picadura; las secreciones son rápidamente volatilizadas en los pelos de la
membrana setosa en la base de la bombilla de la picadura (Bortolotti & Costa,
2014). Además, estas se generan en un radio máximo de transmisión de 10
cm, en el cual persisten las señas de advertencia durante aproximadamente 8
minutos (Palencia, 2012).

En el medio natural existen campos electromagnéticos oscilantes en varios


órdenes de magnitud, con un rango de frecuencias que cubre un espectro casi
ilimitado abarcando infinidad de frecuencias (Alvarez, P. 2009), las mismas
que son seleccionadas por ciertos órganos de los sentidos, que las analizan y
las convierten en fuerzas generadas por energías que controlan la membrana
de las células nerviosas y la estructura de proteínas, como las enzimas,
creando patrones, imágenes e impresiones que llamamos experiencia,
criterios que son respaldados también por Garcia & Pérez, (2011) .

Existe un aspecto destacable en numerosos insectos. Las moscas, abejas y


otros tienen unas almohadillas glandulares adhesivas (arolium) entre los
dedos de sus patas. Esta almohadilla adhesiva puede ser plegada o
desplegada cuando caminan. Cuando el arolium está plegado, los animales
caminan sobre sus uñas, aislándoles eléctricamente del ambiente provocando
en ellos una alta carga estática. Si el arolium se despliega y toca la superficie
sobre la que camina, instantáneamente el insecto se descarga adquiriendo el
potencial eléctrico de la superficie (Andriach, et al. 2013).

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De acuerdo a García (2012) el extractor de apitoxina es una tecnología


electrónica que consta de una bandeja de vidrio atravesada por hilos
metálicos, los cuales se conectan a una fuente de energía que emite pulsos
eléctricos periódicamente. El flujo de corriente genera un campo
electromagnético que causa una gran alteración dentro de las abejas haciendo
que ataquen a la bandeja de vidrio, inoculando en esta acción una gota de su
veneno; a este proceso se le llama “ordeñar” a las abejas. La ubicación del
extractor de veneno debe ser en la entrada de la colmena (piquera).

La cantidad de veneno que se obtenga varía significativamente de acuerdo al


clima, al estado de salud de la colmena, al aparato colector y a la técnica de
extracción. Una ventaja de este procedimiento, es que la tasa de mortalidad
de las abejas es muy baja, ya que no pueden incrustar su aguijón en el vidrio,
anulando el riesgo de que se desprenda de su cuerpo, como usualmente
sucede cuando pican directamente a un mamífero. En el proceso de extracción
es indispensable aislar el veneno de abejas del aire para evitar que se oxide y
se deteriore. El veneno en micro- cristales es retirado con una fina cuchilla de
la superficie del vidrio y se almacena en frascos ámbar que lo protegen de la
luz mientras espera para ser procesado en el laboratorio (Dussart, 2007).

MATERIALES Y MÉTODOS

El experimento se realizó en el Apiario de la Granja Experimental ECAA de la


Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra, ubicado en la
provincia de Imbabura, Cantón Ibarra en la ciudad de Ibarra.

Para el experimento se utilizaron seis colmenas de A. mellifera por cada


tratamiento C1 (alambre de cobre 0,1 mA – 29 V), C2 (alambre de cobre 0,3
mA – 87 V), C3 (alambre de cobre 0,5 mA – 144 V), P1 (alambre de plata 0,1
mA – 29 V), P2 (alambre de plata 0,3 mA – 87 V), P3 (alambre de plata 0,5
mA – 144 V). Las variables analizadas fueron: mg de apitoxina, mg/uL de
melitina y mortalidad de abejas.

Para el análisis estadístico se utilizó un Diseño Cross Over o Diseño de


Intercambio, con 6 unidades experimentales de A. mellifera donde cada
unidad experimental recibió 6 observaciones en diferentes tiempos, durante
30 minutos cada 20 días.

Los métodos de evaluación de las variables fueron las siguientes:

Mortalidad de abejas

Finalizada la cosecha de apitoxina en cada colmena se contabilizó el número


de abejas muertas.

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Cantidad de apitoxina extraída

El veneno se obtuvo en láminas de vidrio color ambar las que fueron llevadas
posteriormente al laboratorio donde se removió, pesó, envasó y almacenó
cada una de las muestras de los tratamientos. La apitoxina se recolectó en
forma de cristales blancos de todas las colmenas que fueron objeto de
estudio.

Calidad de la apitoxina

En laboratorio de Bioquímica, los cristales blancos de apitoxina obtenidos en


las láminas de vidrio y de cada apiario, fueron analizados en el equipo HPLC y
se comparó con un patrón de melitina obtenido de los labopratorios MERCK,
mediante el concurso de un software se indicó la cantidad de melitina (mg/ul)
presente en cada una de las muestras de los tratamientos.

Para la extracción de la apitoxina se utilizó el extractor que funcionan a través


de electro estimulación regulando la duración del pulso eléctrico a través de
un arduino con intervalos de cuatro segundos entre cada golpe, entregando
pequeñas descargas eléctricas. Esta práctica se llevó a cabo por un periodo de
30 minutos, en días soleados y secos. Las mediciones según se realizaron al
mediodía por ser este según la mejor hora para recolectar veneno, para cuyo
propósito se tomaron en cuenta los criterios dados por Romano, C. (2010).

Los vidrios de los extractores que contenían veneno fueron almacenados a la


sombra (in situ) para que la apitoxina se secara a temperatura ambiente y no
perdiera sus propiedades. La recolección de la apitoxina desde los vidrios se
realizó en el Laboratorio de la Escuela de Ciencias Agrìcolas y Ambientales
(ECAA), bajo normas de seguridad. Una vez concluido el proceso de
extracción de apitoxina por colmena, se procedió al conteo de abejas muertas,
las cuales fueron tomadas desde el extractor y almacenadas en bolsas
plásticas.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN

a. Cantidad de apitoxina (mg)

La cantidad de apitoxina recolectada fue significativa de acuerdo a las


colmenas que se usaron y a los tratamientos que se desarrollaron aplicó
aceptando la hipótesis alternativa de que existe diferencia entre tratamientos.
Deduciendo que el tamaño de población de la colmena, así como la intensidad
del voltaje fueron factores que intervinieron en la cantidad del veneno que se
obtuvo. Sin embargo, resulto no significativo entre los periodos que se realizó
la investigación. Con un CV de 19,77% entra en el rango de aceptabilidad
que viene a ser menor al 20%, de acuerdo a investigaciones en animales
(Urbina, 2008).

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Con la prueba de Tukey al 5% se obtuvieron seis grupos (a, b, bc, cd, de, e)
el promedio más alto se registra en la colmena No. 1 con 25,63 mg
correspondiente al grupo a, mientras que el menor promedio se registra en la
colmena No. 4 con 18,12 mg correspondiente al grupo e. Valores muy
similares a los obtenidos por Araneda, Leichtle y Morales (2011), quienes en
su estudio con similares condiciones lograron obtener de tres colmenas
79,90 mg de apitoxina, por lo tanto por colmena seria de 26,63mg.

Seis fueron los tratamientos que se aplicaron para el desarrollo de esta


investigación, el rendimiento fue diferente entre cada uno de ellos debido a
que los parámetros fueron diferentes. Con la prueba de Tukey al 5% se
obtuvo seis grupos (a, b, bc, cd, de, e), identificando el tratamiento con el
mayor rendimiento, así como el de menor rendimiento. En este caso el
tratamiento C3 con 33, 02 mg correspondiente al grupo a registró el mayor
promedio de apitoxina, mientras que el tratamiento P2 con 15,76 mg
correspondiente al grupo e fue el que registro menor cantidad de apitoxina.
Valores muy similares a los obtenidos por Araneda, Leichtle y Morales (2011),
quienes en su estudio con similares condiciones lograron obtener de tres
colmenas 79,90 mg de apitoxina, por lo tanto, por colmena serían de
26,63mg.

Fuente: Datos obtenidos en campo

Grafico N° 1. Miligramos de apitoxina y por cada colmena

b. Cantidad de melitina mg/uL

No existió efecto significativo (ns) e relación a la presencia de melitina sobre


los tratamientos, el período, así como de las colmenas. Debido a que la
composición química del veneno de abeja se generaliza en cada una de ellas,
la melitina no depende del voltaje que reciba, ni del tipo de conductor (plata o
cobre) que se utilice, así como de las colmenas, razón por la cual se rechazó
la hipótesis alternativa en cuanto al enunciado de que existe diferencia entre
los tratamientos en relación a esta variable.

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Obteniéndose un CV de 1,95%, valor que se encuentra dentro del rango de


aceptabilidad, esto es menor al 20% (Urbina, 2008).
De manera analógica como el porcentaje de grasa de la leche varía entre una
raza y otra, así mismo la cantidad de melitina es diferente entre las abejas. El
contenido del veneno también varía entre temporadas (invierno y verano) y
con la edad de las abejas. (Araneda, Leichtle, & Morales, 2011).
Estadísticamente no hubo diferencia significativa, pero se pudo apreciar que la
colmena No. 5 con 0,68 presento más mg/uL de melitina.

Fuente: Datos obtenidos en campo

Grafico N° 2. Medias de mg/uL de melitina por colmena

c. Cantidad de abejas muertas

La cantidad de abejas muertas que se obtuvo entre las colmenas y los


diferentes periodos no fue significativa. Sin embargo, hubo significancia en
cuanto a los tratamientos que recibieron aceptando la hipótesis alternativa de
que existe diferencia entre tratamientos. Con un CV de 18,27% entra en el
rango de aceptabilidad que viene a ser menor al 20% (Urbina, 2008).

Seis fueron los tratamientos que se aplicaron para el desarrollo de la


investigación, del cual de cada uno de ellos se registraron diferentes
resultados debido a que los parámetros fueron diferentes. Con la prueba de
Tukey al 5% se obtuvieron seis grupos (a, b, bc, cd, de, e) que nos
permitieron identificar los tratamientos con la mayor y menor cantidad de
abejas muertas. En este caso el tratamiento P3 con 49 abejas muertas
correspondiente al grupo a registró el mayor promedio, mientras que el
tratamiento P1 con 23 abejas muertas correspondiente al grupo se registró la
menor cantidad.

De acuerdo a la investigación de Araneda, Leichtle y Morales (2011), en un


rango de 11,5 a 13,5 voltios se registró 16,25 abejas muertas. Entonces, si en

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ese que equivale aproximadamente a la décima parte del 144 V se registraron


16 abejas muertas, 49 abejas muertas se considera que la forma de
extracción cuida la integridad de las abejas.

Fuente: Datos obtenidos en campo

Grafico N° 4. Cantidad de abejas muertas por tratamientos

CONCLUCIONES Y RECOMENDACIONES

La cantidad de apitoxina que se obtuvo por cada colmena es diferente una de


otra, por lo tanto, estadísticamente la diferencia fue significativa, esto se debe
a que el tamaño de la población fue mayor en una colmena y menor en otra
colmena ya que a mayor numero abeja mayor apitoxina, obteniendo una
relación proporcional a mas abejas más apitoxina, en este caso la colmena
No. 1 con 25,63 mg fue la que tuvo el mayor rendimiento.

La cantidad de apitoxina que se obtuvo durante los 6 diferentes periodos


fueron diferentes entre ellos. La temperatura del ambiente, la hora y la
actividad polinizadora de las abejas son factores que influyeron en los días de
cosecha. Sin embargo, estadísticamente las diferencias no son significativas.
La cantidad de apitoxina que se obtuvo aplicando los diferentes tratamientos
(C1, C2, C3, P1, P2, P3) fue diferente entre ellos. Deduciendo que la
intensidad eléctrica (voltaje y amperaje) son factores que influyen en la
agresión de la abeja ya que a mayor intensidad eléctrica las abejas tienden a
incrementar su agresividad, mientras que a menor intensidad la agresividad
es menor, por lo cual la diferencia fue significativa, destacándose en todas las
colmenas el tratamiento C3 (144 V – 0,5A) con 33,02 mg.

La cantidad de melitina que se obtuvo durante los 6 diferentes periodos


fueron diferente entre ellos. Las condiciones del ambiente (radiación solar,
velocidad del viento y presencia de nubes) afectan a la volatilización de los
compuestos de la apitoxina, provocando las diferencias que se registran. Sin
embargo, estas diferencias estadísticamente no son significativas.

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La intensidad eléctrica (voltaje y amperaje) que circula por el cableado


eléctrico ya sea de cobre o de plata no es significativo en la cantidad de
melitina presente en las muestras de apitoxina.

La cantidad de abejas muertas que se registró aplicando los diferentes


tratamientos (C1, C2, C3, P1, P, P3) fue diferente entre ellos. Deduciendo que
la intensidad eléctrica (voltaje y amperaje) son factores que influyeron en el
nivel de agresión de las abejas, ya que a mayor intensidad eléctrica las abejas
tienden a incrementar su agresividad. Como se muestra en el cuadro No. 10
el tratamiento P3 (144 V – 0,5 A) el de mayor intensidad eléctrica registró la
mayor cantidad de abejas muertas (49) mientras que el tratamiento P1 (29 V
- 0,1 A) registro la menor cantidad de abeja muertas (29), es decir a mayor
intensidad eléctrica mayor e la cantidad de abeja muerta mientras que a
menor intensidad eléctrica menor número de abeja muertas. Por lo tanto, la
diferencia fue significativa.

El tiempo adecuado para la extracción de apitoxina no debe sobrepasar los 30


minutos ya que existe la volatilización de los compuestos de la apitoxina.
De acuerdo a la fisiología de la abeja la frecuencia adecuada para la
extracción de apitoxina es de 20 días, ya que en este tiempo la abeja renueva
su veneno para su exteriorización.

Para la extracción de apitoxina se debe mantener intervalos eléctricos, ya que


las abejas sufren daños al ser impactadas en forma permanente con corriente
eléctrica. En esta investigación los intervalos eléctricos fueron de 4 segundos
apagados y 4 segundos encendidos durante 30 min.

BIBLIOGRAFÍA

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REDVET: 2017, Vol. 18 Nº 12


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