Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

hindú
International Journal of Analytical Chemistry
Volumen 2020, artículo ID 2187646, 9 páginas
https://doi.org/10.1155/2020/2187646

Artículo de investigación

Desarrollo del Método de Alta Sensibilidad y Selectividad para la

Determinación de Histamina en Pescado y Salsa de Pescado de Vietnam
por UPLC-MS/MS

Quang Hieu Tran,1Thanh Tan Nguyen,2y Kim Phuong Pham2

1División de Química, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Tecnológica de Saigón, 180 Cao Lo, Distrito 4, Distrito 8,
Ciudad Ho Chi Minh 700000, Vietnam
2Centro analítico de alta tecnología Saigon STC, Ciudad Ho Chi Minh 700000, Vietnam

La correspondencia debe dirigirse a Quang Hieu Tran; hieu.tranquang@stu.edu.vn

Recibido el 20 de febrero de 2020; Revisado el 19 de abril de 2020; Aceptado el 29 de mayo de 2020; Publicado 17 junio 2020

Editor académico: Kevin Honeychurch

Copyright © 2020 Quang Hieu Tran et al. (Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia Creative Commons Attribution
License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite correctamente el
trabajo original.

Se desarrolló un método selectivo, sensible y rápido mediante cromatografía líquida de ultrarendimiento-espectrometría de masas en tándem (UPLC-
MS/MS) para la determinación de histamina en pescado y salsa de pescado. (También se han investigado las condiciones óptimas de separación por
cromatografía líquida y espectroscopia de masas de histamina. (Los rangos lineales del método fueron 20,0÷1000 ng/mL, y el coeficiente de correlación
correspondiente fue 0,9993. Las recuperaciones medias del analito en tres niveles de aumento (bajo, medio y alto) estuvieron dentro del rango del 98,5
%.÷102,5% (norte�7). (Los valores de límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) fueron 3,83 y 11,50 ng/mL para la muestra de salsa de
pescado y 4,71 y 14,12 ng/mL para la muestra de pescado, respectivamente. (e influencia del efecto matriz en la precisión, la repetibilidad y la
recuperación del método fueron insignificantes (se aplicó el método recomendado para determinar el contenido de esta sustancia en 21 muestras de
salsa de pescado y 4 tipos de muestras de pescado, que se recolectaron en Ciudad Ho Chi Minh, Vietnam, en 2019.

1. Introducción el envenenamiento por histamina generalmente se parece a

Durante mucho tiempo, el contenido de histamina en el pescado y
los productos pesqueros, así como su envenenamiento, ha llamado
mucho la atención de científicos de todo el mundo. Este compuesto
se forma durante la descomposición del aminoácido histidina, que
sigue dos vías. (La ruta principal del catabolismo de la histidina pasa
por su conversión en ácido glutámico, que comienza con la
degradación de la histidina en ácido urocánico por la acción de la
enzima histidasa. (El producto glutamato se convierte en alfa-
cetoglutarato, que es un intermediario en el ciclo del ácido cítrico
(ciclo de Krebs). (La segunda vía es la descarboxilación (pérdida de
COO-) por la acción de la enzima histidina descarboxilasa para
formar histamina [1, 2] El síndrome escombroide/envenenamiento
por histamina ocurre en todo el mundo, y el número de casos está
aumentando, a pesar de la mejora del conocimiento sobre la
seguridad de los productos del mar [3].
los síntomas que se encuentran con las alergias alimentarias
mediadas por IgE. (Los síntomas incluyen náuseas, vómitos,
diarrea, sensación de ardor oral o sabor a pimienta,
urticaria, picazón, sarpullido rojo e hipotensión [4]. (La
aparición de los síntomas generalmente ocurre unos
minutos después de la ingestión del alimento implicado). , y
la duración de los síntomas oscila entre unas pocas horas y
24 h [1]. Debido a la toxicidad de la histamina, el contenido
de esta sustancia se ha controlado estrictamente. Según
Codex 302-2011, la histamina se considera un peligro en
salsa de pescado, y el contenido de este compuesto no debe
superar los 400 mg/kg [5, 6]. (El Reglamento de la Comisión
(CE), n.º 1019/2013, recomienda que el nivel de histamina no
supere los 400 mg/kg). kg en salsa de pescado y 200–400
mg/kg en los productos pesqueros [7].
2 Revista Internacional de Química Analítica
y 50 mg/kg para el nivel máximo de histamina en pescado y
productos pesqueros, respectivamente [8, 9].
La salsa de pescado, un ingrediente fundamental
utilizado en muchos platos del sudeste asiático, un
condimento para mojar, está ganando popularidad en
todo el mundo [10]. La salsa de pescado es un líquido
marrón claro producido por la fermentación
espontánea de diversos pescados como las anchoas,
las sardinas y la lacha [11]. (Estos pescados
normalmente poseen altos niveles de histidina libre y
otros aminoácidos. (La cantidad de histamina
producida en la salsa de pescado tradicional está
relacionada con el contenido de histidina libre en las
materias primas. Durante la fermentación, la
hidrólisis de proteínas es causada por proteinasas
endógenas en el pescado). músculo y tracto digestivo,
así como proteinasas producidas por bacterias
halófilas [2, 12]. (La especie más comúnmente
utilizada para la producción de salsa de pescado es la
anchoa india (estoléforospp.). Las anchoas
normalmente se capturan y se mantienen a bordo.
Los productores con buenas prácticas de fabricación
mezclarían el pescado con sal después de la captura,
lo que retarda la formación de histamina. Sin
embargo, algunos conservan el pescado sin sal hasta
8 horas antes de desembarcarlo y transportarlo a una
fábrica en un contenedor abierto sin un sistema de
refrigeración adecuado [13]. Debido a la naturaleza
de las materias primas y los métodos de producción
de la salsa de pescado tradicional, se encuentran altos
niveles de histamina en muchas muestras [14, 15].
(Hay más de 2800 instalaciones de producción de
salsa de pescado en Vietnam, que han estado
produciendo más de 200 millones de litros por año,
con un valor de más de VND 4800 mil millones. Sin
embargo, las exportaciones de salsa de pescado de
Vietnam representan solo alrededor del 3-5% de la
producción. hemos desarrollado el método de análisis
para acortar el tiempo de análisis y aumentar la
sensibilidad y selectividad basado en UPLC-MS/MS.
(Por lo tanto, esperamos proporcionar un método
analítico novedoso para probar la presencia de
histamina en salsa de pescado y productos pesqueros
en Vietnam.
2. Materiales y métodos
2.1. Sustancias químicas y reactivos.Todos los reactivos fueron
de grado analítico. (El estándar de referencia de histamina se
adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania); el acetonitrilo (ACN) y
el ácido fórmico (FA) se suministraron de Sigma-Aldrich
(Alemania). El metanol era de grado HPLC y se adquirió de JT
Baker (Phillipsburg, EE. UU.) .
2.2. Instrumentación.(El desarrollo y la validación del método se
realizaron en un sistema de cromatografía líquida de
rendimiento ultraalto (UPLC) que incluye el horno de columna y
el muestreador automático con termostato (Ultimate 3000,
(ermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) en combinación con
Waters.
Para la adquisición de datos se utilizó un espectrómetro de masas de
cuadrupolo en tándem TQD, operado en el modo de iones positivos de
electropulverización con monitorización de reacción seleccionada (SRM).
2.3. Soluciones estándar.(e solución estándar madre de
Se prepararon 1,0 mg/mL de histamina en ACN a una concentración
de 1,0 mg/mL cada uno. Inmediatamente antes de su uso, se
preparó una solución de trabajo diluyendo 0,1 ml de la solución
estándar madre en 10 ml de ACN para obtener una solución con una
concentración conocida de 0,01 mg/ml. Todas las soluciones madre
se mantuvieron refrigeradas (2–8°C) cuando no esté en uso.
2.4. Preparación de la muestra
2.4.1. Muestras de pescado.Se recolectaron muestras de pescado de
varios mercados comerciales de pescado en la ciudad de Ho Chi
Minh. Cada muestra se colocó individualmente en una bolsa de
plástico, se guardó en una nevera y se llevó al laboratorio del centro
analítico de alta tecnología Saigon STC, Ciudad Ho Chi Minh. Para el
examen, una muestra representativa de pescado (50 g) se cortó en
rodajas pequeñas y se molió finamente con una licuadora para
homogeneizarla antes de la extracción. (es, 5.0±Se transfirieron 0,1
g de la muestra de pescado a un tubo de centrífuga de 50 ml, se
añadieron exactamente 25 ml de MeOH, se agitó con vórtex durante
2,0 minutos y se sonicó en un baño ultrasónico durante 20 minutos.
(La solución se transfirió a un matraz aforado de 50 mL y se
completó el volumen con MeOH. (Es decir, esta solución se filtró a
través de un 0,45mMembrana de Whatman. (La solución de la
muestra se diluyó en agua DI (el factor de dilución depende de la
cantidad de histamina en la muestra) y se filtró a través de un filtro
de 0,22mm filtre en un vial LC ámbar de 1,5 ml. (e volumen de 5.0mL
de la solución de muestra se inyectó en el sistema UPLC-MS/MS a
través del muestreador automático en las condiciones
experimentales óptimas.
2.4.2. Muestras de salsa de pescado.Se recolectaron muestras
de salsa de pescado, incluidas 10 salsa de pescado industrial
(IFS) y 10 salsa de pescado tradicional (TFS), de los mercados y
supermercados locales en la ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam. (El
procedimiento para la preparación de la muestra es el
siguiente: se extrajo con precisión 1,0 ml de salsa de pescado en
el matraz aforado de 50 ml, se disolvió y se enrasó con MeOH.
(es decir, se transfirieron 0,5 ml de esta solución a un matraz
volumétrico de 10 ml). matraz aforado, disuelto y enrasado con
agua desionizada, y filtrado a través de un 0,45µfiltro m. (La
solución de la muestra se diluyó en agua DI (el factor de dilución
depende de la cantidad de histamina en la muestra) y se filtró a
través de un filtro de 0,22µm filtre en un vial ámbar LC de 1,5
ml. (El análisis se realizó en UPLC-MS/MS, como se describe en
la Sección 2.4.1.
Revista Internacional de Química Analítica
2.5. Para Condiciones de Cromatografía Líquida.Para la separación
por cromatografía líquida, el HILIC Silica 3µmetro, 2,1×50 mm, se
aplicó la columna Atlantis para la separación de los analitos objetivo
a la temperatura de 40°C. (las fases móviles binarias fueron ACN 100
mM+HCOOH (A) y DI+0,5% HCOOH (B). (El programa de fase móvil
para las bombas de carga se muestra en la Tabla 1. (La tasa de flujo
se mantuvo constantemente a 0,3 ml/min durante todo el proceso
de análisis cromatográfico. Tanto las muestras como las soluciones
estándar se mantuvieron a°C en la bandeja de muestras. Un 5.0µL
del estándar o las muestras se inyectaron en el sistema UPLC-MS/
MS a través de un muestreador automático. (La aguja y el bucle de
muestra en el muestreador automático se lavaron por triplicado,
usando la mezcla de ACN y agua desionizada (1 : 1, v : v).
2.6. Condiciones de EM.Para encontrar las condiciones óptimas de MS, se
aplicaron espectros de monitoreo de reacción seleccionados (SRM) obtenidos
en el modo de iones positivos para reconocer el analito especificado. (Los
parámetros de la fuente de iones se optimizaron de la siguiente manera:
fuente de ionización: H-ESI (+), voltaje de pulverización: 3500 V, temperatura
del vaporizador: 300°C, temperatura del tubo de transferencia de iones: 300°C,
gas envolvente: 40 arb, gas auxiliar: 5 arb y gas CID: 2 mTorr. Se usó el
software TraceFinder 3.3 para calcular las áreas de los picos y las proporciones
de las áreas de los picos.
2.7. Validación del método
2.7.1. Linealidad.Para evaluar la linealidad, se prepararon una serie
de soluciones estándar de referencia de histamina en el rango de
concentraciones de 20,0, 50,0, 150,0, 200,0, 500,0 y 1000,0 (ng/mL).
En cada nivel, las soluciones estándar se midieron por triplicado.
Basándose en el trazado de la relación del área del pico con el
estándar interno frente a la concentración enriquecida, se calculó la
ecuación de la curva de calibración.
2.7.2. Determinación de LOD y LOQ.El límite de detección (LOD)
y el límite de cuantificación (LOQ) son dos características de
rendimiento importantes en la validación de métodos. LOD y
LOQ, estrictamente relacionados con la magnitud de los ruidos
en el sistema de medición, podrían determinarse de diferentes
maneras. En este trabajo, estos valores se calcularon mediante
la fórmula LOD�3SD y LOQ�3LOD según [28, 29].
2.7.3. Efecto Matriz (ME).(La evaluación del efecto matriz se
realizó utilizando un modelo experimental de Matuszewski et al.
[30]. (El efecto de la matriz durante la validación del método
desarrollado se examinó midiendo la señal analítica de la
histamina en la solución enriquecida posterior a la extracción y
la del estándar de histamina en una solución pura. (El
experimento se llevó a cabo con dos grupos de muestras
agrupadas. ( El primer grupo se preparó mezclando cinco
muestras de salsa de pescado, y el segundo grupo se formó
mezclando cuatro muestras de pescado (sardinas, anchoveta,
menhaden y caballa) (la preparación de la muestra se realizó en
la Sección 2.4.1. (la solución final (después de la extracción de la
muestra) se añadió en tres niveles de 50, 200 y 1000 ppb de
histamina estándar (el efecto de la matriz de la muestra se
determinó mediante la siguiente ecuación:
3
Mesa1: (e programa de gradiente de fase móvil.
Tiempo (min) Caudal (ml/min) A(%) B(%)
0 0.3 90 10
4.2 0.3 40 60
4.3 0.3 90 10
9.5 0.3 90 10
B
YO(%)×100, (1)
A
dóndeAes el área del pico cromatográfico del estándar en solución
pura,Bes el área del pico del estándar añadido a la solución de
muestra después de la extracción con metanol.
2.7.4. Recuperación y Precisión.Para examinar la
recuperación y la precisión, el experimento se llevó a cabo
con dos tipos de muestras (pescado y salsa de pescado). A
una serie del ejemplo se agregaron muestras de histamina a
214, 428 y 856 mg/L. (La solución se diluyó 20 veces en agua
DI. (El análisis se realizó en UPLC-MS/MS, como se describe
en la Sección 2.4.1. En cada nivel, la prueba se midió siete
veces para calcular SD,R% y RSD%.
3. Resultados y discusión
3.1. Condiciones cromatográficas y de MS
3.1.1. Condiciones cromatográficas.(mi condiciones por
La cromatografía UPLC se ha establecido con HILIC Silica 3µ
metro, 2,1×50 mm, columna Atlantis, fases móviles A (MeOH 5
mM HCOONH4+ 0.1% FA) y B (H2O 5mM HCOONH4+ 0,1% FA), y
5,0µL volumen de inyección. (El cromatograma de las soluciones
estándar en condiciones seleccionadas indica un tiempo de
retención de 3,69 minutos para el solvente puro y 3,68 para las
soluciones de muestra de pescado y salsa de pescado. La figura
1 indica que no hay una diferencia significativa en el
cromatógrafo del solvente estándar de histamina pura y en la
solución de muestra de salsa de pescado a la misma
concentración. El tiempo de retención y la intensidad del analito
en ambas muestras están relacionados. Este fenómeno implica
que el efecto del fondo de la muestra en el tiempo de retención
no es notable.
3.1.2. Parámetros MS.La Tabla 2 y la Figura 2 describen los parámetros
de espectrometría de masas de la histamina y sus iones fragmentados. (e
ion precursor muestra 112.2 demetro/z; los iones producto son 68 de
metro/z, 83 demetro/z, y 95 demetro/z, respectivamente. (La energía de
colisión de los iones es de 23,0 V (metro/z68), 16,0 V (metro/z
83) y 15,0 V (metro/z95), respectivamente. (mimetro/zSe selecciona el ion
95 para el análisis de cuantificación. (Este resultado es bastante similar a
estudios de investigación anteriores [14, 24].
3.2. Validación del método
3.2.1. Linealidad.Como se presenta en la Sección 3.1, los efectos de la
matriz en dos muestras (pescado y salsa de pescado) no son
significativos en el tiempo de retención y la intensidad del método. Para
4 Revista Internacional de Química Analítica

RT: 3.69
histamina
100
90
80
70
ensidad
60
50
40
30
20
10
0.17 0,67 1,11 1,51 1,73 1,97 2,18 2,72 3,22 3,45 4,78 5,34 5,76 6,13 6,57 7,13 7,27 7,54 8,00 8,30 8,60 8,88 9,20
0
0.5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
TR (mín.)

(a)
RT: 3.68
histamina
100
90
80
70
ensidad

60
50
40
30
20
10
0,52 0,70 0,98 1,45 1,91 2,43 2,79 3.46 4,65 4,97 5,26 5,63 5,82 6,43 6,91 7,19 7,73 7,97 8,22 8,55 8,87 9.47
0
0.5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
TR (mín.)

(b)
RT: 3.68
histamina
100
90
80
70
Intensidad relativa

60
50
40
30
20
10
0.14 0,68 1.01 1,64 1,88 2,43 2,78 3.29 4,81 5,04 5.46 5.79 6,31 6,56 6,89 7,20 7,71 7,99 8,31 8,78 9,06 9,27
0
0.5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
TR (mín.)

(C)

Figura1: Cromatogramas UPLC-MS/MS representativos de histamina a 50,0 ng/ml de concentración: (a) en blanco de ACN, (b) en solución de muestra de salsa de
pescado y (c) en solución de muestra de pescado.

Mesa2: Parámetros de masa de histamina y sus productos en el modo SRM.

nombre compuesto Polaridad precursor (metro/z) Producto (metro/z) Energía de colisión (V)
histamina Positivo 112.2 68.222 23,0
histamina Positivo 112.2 83.169 16.0
histamina Positivo 112.2 95.111∗ 15.0
∗Ion cuantitativo.

simplificando el proceso, hemos construido la curva de 3.2.2. LOD y LOQ.Como puede verse en la Tabla 3, el LOD y el
calibración en el disolvente puro. (La curva de calibración en la LOQ del método validado para muestras de salsa de pescado y
Figura 3 es lineal en el rango de 20,0 a 1000,0 ng/mL. (La muestras de pescado son 3,83 y 11,52 y 4,71 y 14,12 ng/mL,
ecuación de calibración obtenida del método propuesto fue y� respectivamente. (Por lo tanto, el método desarrollado era
35536X+692240. (La regresión de mínimos cuadrados exhibió adecuado para el análisis directo de esta sustancia en muestras
un excelente coeficiente de correlación de 0.9993. (La desviación de pescado y salsa de pescado según la CE [7] y la USFDA [8].
estándar relativa de cada punto (norte�3) fue inferior al 3,0%.
Revista Internacional de Química Analítica 5

Escaneo de productos de energía de colisión múltiple parametro/z=112.20 metro/z=95.11

600000

500000

Intensidad máxima 400000

300000

200000
metro/z=68.22
100000 metro/z=83.10

20 30 40 50 60 70 80 90 100
metro/z

Figura2: (e intensidad máxima de exploración del producto para histamina en el modo SRM.

40000000 3.2.5. Recuperación y Precisión.En esta prueba, los niveles de 214,

428 y 856 mg/L, aproximadamente al nivel de 0,5, 1,0 y
35000000 y=35536X+692240,R2= 0.9993
2,0 veces en comparación con el umbral de CE prescrito para los
30000000 estándares de histamina en salsa de pescado, se eligieron para
enriquecer. De manera similar, se seleccionaron los niveles de 25, 50 y
25000000
100 mg/kg equivalentes a 0,5, 1,0 y 2,0 veces con el umbral
Área

20000000 reglamentario de la CE para los estándares de histamina en muestras de

15000000
10000000
5000000
0
0 200 400 600
Concentración de histamina (ng/mL)
Figura3: (e gráfico del área del pico frente a la concentración de histamina.
3.2.3. Selectividad.No se observaron fuentes endógenas de
interferencia en el tiempo de retención del analito en la Figura
1. (Este fenómeno indica que el efecto del fondo de la muestra
en el tiempo de retención no es significativo en comparación
con el blanco de la muestra. (Estos valores sugieren que hay un
efecto mínimo del fondo de la muestra sobre la supresión de
iones, la mejora de iones y el tiempo de retención de los
analitos (estos datos también prueban que la selectividad del
método para la determinación de histamina en muestras reales
es excelente).
3.2.4. Efecto Matriz.Como puede verse, en la Tabla 4, en tres fondos
de muestra con diferentes contenidos de grasa, los valores de EM
en el rango de 98.23% a 104.01% estuvieron en un rango aceptable
[30] (de 80 a 120%). (e las desviaciones estándar relativas a
diferentes concentraciones son valores adecuados. (ese
Los valores muestran que la influencia de la muestra
en la selectividad y la recuperación de la medida (estela entrada es insignificante.
fenómeno podría explicarse por la capacidad de y el excelente
separación de la sensibilidad HILIC Silica colu de la mn y el alto
sonda MS/MS. Compa métodos para la determinaciónrojo con otros
de la extracción de histamina, este método es
significativamente más corto tiempo, así como reduce ns el análisis
el costo de análisis y un solvente liberado después della cantidad de
proceso de muestreo.
pescado y productos pesqueros para la determinación de la
recuperación, la precisión y la repetibilidad. Como se presenta en la Tabla
5, la recuperación del método de detección de histamina a tres
concentraciones es de 100,86 % a 116,43 % (para la muestra de salsa de
pescado) y de 95,14 % a 107,21 % (para la muestra de pescado). (Estos
valores son consistentes con los requisitos de la AOAC [31] y similares a
800 1000
estudios de investigación previos [26, 32, 33]. (Nosotros, el método en
este trabajo tiene una alta eficiencia de recuperación y se puede aplicar
al análisis de muestras reales. (e repetibilidad intradía estaba dentro del
rango aceptable, oscilando entre 1,61 y 2,52 % de RSD, mientras que la
repetibilidad entre días oscila entre 2,34 y 10,21 % de RSD. Se encuentran
valores de RSD similares en el fondo de la muestra de pescado. (Los
valores de RSD observados para el estudio de precisión indican que este
método es lo suficientemente preciso para el análisis de rutina.
A modo de ilustración, la sensibilidad del método desarrollado
por UPLC-MS/MS, una comparación con los métodos publicados
anteriormente para la determinación de histamina se proporciona
en la Tabla 6. (El método desarrollado proporciona una mayor
sensibilidad en comparación con los métodos publicados. (La
sensibilidad de este El método es similar a la selectividad del
método cITP-CZE-COND.
3.3. Aplicación a Muestras Reales.(El método propuesto se ha aplicado
para analizar 21 muestras de salsa de pescado. Como se muestra en la
Tabla 7 y la Figura 4, el grupo de salsa de pescado industrial (IFS 00 a IFS
fondo en 10) contiene histamina con un contenido de 8,0 a 80,9 mg/L. En general,
el contenido de histamina en 11 tipos de salsa de pescado industrial
analizados estaba en el umbral permisible igualmente bajo de la FDA [8]
y por debajo de la CE [7]. (La causa puede deberse al proceso cerrado de
producción de salsa de pescado industrial y al pescado crudo que ha sido
e con complejo salado o congelado inmediatamente después de la captura. (Por lo tanto,
la tasa de conversión de histidina a histamina es menor. Además, es
posible que, en productos, el contenido de salsa de pescado puro es
bajo, y
6 Revista Internacional de Química Analítica

Mesa3: (e límite de detección y límite de cuantificación del método UPLC-MS/MS.

Muestras de salsa de pescado Muestras de pescado

Réplica (norte�7)
Adicionado (ng/mL) Encontrado (ng/mL) Adicionado (ng/mL) Encontrado (ng/mL)

1 20.00 19.21 20.00 18.12

2 20.00 21.32 20.00 22.13
3 20.00 21.20 20.00 21.40
4 20.00 18.70 20.00 18.36
5 20.00 20.15 20.00 21.14
6 20.00 21.10 20.00 21.20
7 20.00 22.31 20.00 20.90
Significar 20.57 20.46
Dakota del Sur 1.28 1.57
LOD�3 DE (ng/mL) 3.83 4.71
LOQ�3 LOD (ng/mL) 11.50 14.12

Mesa4: ME (%) del método en diferentes muestras de matriz; la cantidad estándar de histamina se añadió en tres niveles de 50, 200 y 1000 ppb después
de la preparación de la muestra.

Muestras Concentración de histamina en la solución de muestra final (ng/mL) Adicionado (ng/mL) (norte�3) YO (%) RSD (%)
50 100.87 2.31
Salsa de pescado en charco 531.4 200 104.01 1.67
1000 101.34 2.24
50 101.42 2.44
Pescado en piscina 55,8 200 102.07 0.74
1000 98.23 1.21

Mesa5: Ensayo de recuperación, repetibilidad intradía (día 1) y repetibilidad interdía (día 3, día 5 y día 7) medido como % RSD de salsa de pescado enriquecida y
muestras de pescado (1,0 ml de salsa de pescado o 1,0 g de la muestra de pescado , 50 ml de volumen de muestra y 20 veces el factor de dilución).

Repetibilidad (intradía),
Concentración de histamina en la muestra Concentración enriquecida Recuperación,R
Muestras RSD (%)
(ng/mL) (mg/L) (%)
Día 1 Día 3 Día 5 Día 7
214 109.21 1,83 2,34 3,51 6,71
Salsa de pescado, TFS
385.6 428 100.86 2,55 3,22 8,34 4,29
18
856 116.43 1,81 2,44 6,65 10,21
25 105.32 2,35 3,12 3,59 6,71
pescado caballa 64.5 50 95.14 3,49 3,67 6,15 6,91
100 107.21 2,92 3,13 7,14 11,52

Mesa6: (e comparación del método UPLC-MS/MS desarrollado con métodos publicados anteriormente para el análisis de histamina.

Métodos LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL) Recuperación (%) Referencias

UHPLC-HR-MS 100 300 — [34]
cITP-CZE-COND 4.0 12.0 91±9 [17]
IRP-HPLC 1000 3000 86.00 [35]
colorimétrico 5000 > 91 [21]
UPLC-FLD 5.5 15.6 — [34]
HPLC-UV 130 450 91÷115 [15]
UHPLC-MS/MS 3.38 11.5 100.1÷116 (es trabajo

el fabricante ha añadido especias y aromas para crear una salsa de
pescado industrial. (Por lo tanto, el contenido de histamina puede ser
mucho menor que el de la salsa de pescado tradicional. Mientras tanto,
en el grupo de salsa de pescado tradicional (TFS 10 a TFS 20), el
contenido de histamina oscila entre 385,6 y 1436,4 mg/L. (Estos valores
son más altos que el umbral permitido por la FDA (el contenido de
histamina en la salsa de pescado tradicional en Vietnam es
bastante similar a otros países de la región, como (ailand [12, 14],
Malasia [15] y China [11]. De hecho, en el pasado, las personas en
los países asiáticos han usado salsa de pescado tradicional con altos
niveles de contenido de histamina. Sin embargo, la intoxicación por
histamina de la salsa de pescado es muy rara, porque la cantidad de
salsa de pescado en la comida diaria no es mucha. Sin embargo,
para que la salsa de pescado tradicional penetre en el mercado de
Revista Internacional de Química Analítica 7

Mesa7: (e concentración de histamina en muestras de salsa de pescado.

Método desarrollado (UPLC-MS/MS) Método comparado (HPLC-PDA)1

Significar±DE (mg/L) Significar±DE (mg/L)
IFS00 Extraviado Extraviado
EFI 01 15.1±1.1 16.2±1.2
EFI 02 12.4±0.8 13.5±1.6
EFI 03 8.0±0.5 7.2±0.6
EFI 04 45.2±2.2 48.3±3.1
EFI 05 32,0±1.3 35.2±1.8
EFI 06 21.5±1.2 24.3±1.9
EFI 07 31.2±1.4 28.1±2.3
EFI 08 63.1±3.2 66.3±2.9
EFI 09 35.2±2.4 38.6±2.7
IFS 10 80,9±5.0 87.4±6.0
TFS 11 458.0±18.3 432.0±31.3
TFS 12 773.4±50.5 761.4±46.2
TFS 13 410.3±30.5 391.6±31.7
TFS 14 561.5±41.6 589.3±34.2
TFS 15 463.6±33.2 432.4±26,8
TFS 16 1130.1±60,9 1093.4±72.6
TFS 17 397.3±17.6 410.4±16.9
TFS 18 385.6±25.4 374.3±22.7
TFS 19 1436.4±86.5 1501.3±79.6
TFS 20 418.6±18.3 424.8±21.2
Nota.1El método comparado se llevó a cabo utilizando el instrumento Waters 2996 HPLC-PDA con columna C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18, 5 mm×4,6 mm
×250 mm, Agilent) y siguió el protocolo estándar del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Vietnam [22] y AOAC [36]. Cada valor se expresa como media
±DAKOTA DEL SUR (norte�3).

1600

1400

1200
concentración de histamina en

1000
salsa de pescado (mg/L)

800

600

400

200

0
EFI 01
EFI 02
EFI 03
EFI 04
EFI 05
EFI 06
EFI 07
EFI 08
EFI 09
IFS 10
TFS 11
TFS 12
TFS 13
TFS 14
TFS 15
TFS 16
TFS 17
TFS 18
TFS 19
TFS 20

Figura4: Concentración de histamina de la salsa de pescado; los valores se expresan como la media±DAKOTA DEL SUR (norte�3). Las barras de error representan la desviación estándar de tres
réplicas.

Mesa8: (e concentración de histamina en muestras de pescado.

Desarrollar método operado (UPLC-MS/MS) (mg/kg) Método comparado (HPLC-PDA) (mg/kg)

sardinas congeladas(sardinela tawilis) anchoa 16.4±0.8 18.3±1.2
congelada(Engraulidae) Lacha congelada( 13.5±0.9 12.1±0.8
Brevoortia tyrannus) caballa congelada ( 6.3±0.7 7.5±0.6
Rastrelliger canagurta) 64.5±1.6 58.5±3.2
Nota.Cada valor se expresa como media±DAKOTA DEL SUR (norte�3).

Los países europeos o los EE. UU., los fabricantes y los científicos, y Se analizaron cuatro muestras de pescado crudo comúnmente utilizadas
gerentes deben encontrar una explicación para el contenido él histamina para producir salsa de pescado. La Tabla 8 indica que el contenido de
de t. histamina en estas muestras oscila entre un rango bastante amplio
8 Revista Internacional de Química Analítica
rango, con el más alto en la caballa, alcanzando los 65,4 mg/kg. (El
contenido de histamina depende del tipo y la frescura del pescado.
(Cuanto más se eche a perder el pescado, mayor será el contenido
de histamina [37]). (El contenido de histamina de las muestras de
pescado analizadas fue bastante similar a los resultados del estudio
anterior). informe en Vietnam [38] y otros países [20, 26]. También
hemos aplicado el procedimiento estándar de la AOAC con equipo
HPLC-FDA para determinar el nivel de histamina en salsa de pescado
y muestras de pescado. (Resultados ilustrados en las Tablas 7 y 8
también mostró que ambos métodos realizan resultados
armoniosos.
4. Conclusiones
En este trabajo, hemos desarrollado y evaluado un nuevo método
analítico que tiene una excelente sensibilidad, selectividad y
recuperación. (El método descrito aquí muestra la promesa de una
cuantificación altamente selectiva y sensible de histamina en salsa de
pescado y muestras de pescado. (El método HPLC-FDA también se ha
utilizado para el análisis comparativo, lo que demuestra que el método
propuesto tiene resultados similares pero con menor tiempo y
procesamiento de muestras más sencillo (el estudio de muestras reales
también ha demostrado que el contenido de histamina en la salsa de
pescado tradicional, producida por establecimientos individuales, es
mucho más alto que el de los estándares de la CE y la FDA. Con suerte,
hemos contribuido con una nueva técnica analítica para evaluar y
controlar el contenido de histamina en pescado, productos pesqueros,
alimentos y productos farmacéuticos.
Disponibilidad de datos
(Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio
están disponibles a pedido del autor correspondiente. (La
optimización de MS, algunos cromatógrafos de muestra, los cálculos
de rendimiento de recuperación y las curvas de calibración se
presentan en Información complementaria (disponible aquí).
Conflictos de interés
(Los autores declaran que no existen conflictos de interés con
respecto a la publicación de este trabajo.
Contribuciones de los autores
Todos los autores han contribuido por igual a este trabajo.
Expresiones de gratitud
(Este proyecto fue financiado por la Universidad Tecnológica de
Saigón con la subvención n.º DTCS-02, 2019.
Materiales complementarios
S1: informe de optimización de compuestos. S2: Cromatogramas
UPLC-MS/MS de histamina en algunas muestras de pescado y salsa
de pescado. S3: datos para la determinación deR% y repetibilidad
(salsa de pescado). S4: informe de calibración compuesto. (
Materiales complementarios)
Referencias
[1] SL Taylor, JE Stratton y JA Nordlee, "Intoxicación por histamina
(intoxicación por pescado escombroide): una intoxicación similar a
una alergia"Revista de toxicología: toxicología clínica, vol. 27, núm.
4 y 5, págs. 225 a 240, 1989.
[2] P. Visciano, M. Schirone, R. Tofalo y G. Suzzi, “Intoxicación por
histamina y medidas de control en pescado y productos pesqueros”
Fronteras en Microbiología, vol. 5, núm. 1–3, 2014.
[3] FM Colombo, P. Cattaneo, E. Confalonieri y C. Bernardi,
“Intoxicaciones alimentarias por histamina: una revisión sistemática
y metaanálisis”Reseñas críticas en ciencia de los alimentos y
nutrición, vol. 58, núm. 7, págs. 1131–1151, 2018.
[4] V. Tortorella, P. Masciari, M. Pezzi et al., “Envenenamiento por histamina
por ingestión de pescado o síndrome escombroide”Reportes de Casos
en Medicina de Emergencia, vol. 2014, artículo ID 482531, 4 páginas,
2014.
[5] C. Stan,Estándar para Salsa de Pescado, Organización para la Agricultura y la
Alimentación, Roma, Italia, 2012.
[6] KB Biji, CN Ravishankar, R. Venkateswarlu, CO Mohan y TKS
Gopal, "Aminas biogénicas en mariscos: una revisión" Revista
de ciencia y tecnología de los alimentos, vol. 53, núm. 5, págs.
2210–2218, 2016.
[7] CE: Reglamento (UE) n.º 1019/2013 de la Comisión, de 23 de octubre de 2013,
por el que se modifica el anexo I del Reglamento (CE) n.º 2073/2005 en lo que
respecta a la histamina en los productos pesqueros Texto con relevancia para
el EEE. https://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2013/1019/oj.
[8] FDA,Orientación sobre peligros y controles de pescado y productos
pesqueros, formación de escombrotoxina (histamina), FDA, Silver
Spring, MD, EE. UU., 2020, https://www.fda.gov/media/80288/
descargue el Capítulo 7, 4.ª edición.
[9] CE, Reglamento de la Comisión (CE) nº 1441/2007, Diario
Oficial de la Unión Europea. 322, 2007.
[10] A. Gildberg, J. Wichaphon, S. Lertsiri, A. Assavanig,
NK Sørensen, y C. (ongthai, “Comparación química y organoléptica de
salsa de pescado elaborada con especies de agua fría y típica (salsa de
pescado ai,”Revista de tecnología de productos alimentarios acuáticos,
vol. 16, núm. 3, págs. 31–42, 2007.
[11] Y. Wang, C. Li, L. Li et al., “Aplicación de metabolómica basada en UHPLC-
Q/TOF-MS en la evaluación de metabolitos y calidad del sabor de la salsa
de pescado china (Yu-lu) durante la fermentación ,”Química de Alimentos
, vol. 296, págs. 132 y 141, 2019.
[12] FAO,Estimación del riesgo de desarrollar intoxicación por histamina
a partir del consumo de salsas de pescado Bai, FAO, Roma, Italia,
2011.
[13] J. Yongsawatdigul, YJ Choi y S. Udomporn, "Formación de aminas
biogénicas en salsa de pescado preparada a partir de anchoa india
fresca y abusada por la temperatura (Stolephorus indicus),” Revista
de ciencia de los alimentos, vol. 69, págs. 312–319, 2004.
[14] S. Brillantes y W. Samosorn, “Determination of histamine in fish
sauce from (ailand using a solid phase extract and high-
performance liquid chromatography,”Ciencias Pesqueras, vol.
67, núm. 6, págs. 1163–1168, 2001.
[15] B. Padilah, S. Bahruddin, A. Fazilah y RRA Gulam, "Análisis de aminas
biogénicas en pastas de camarones belacan obtenidas de los
estados del norte de Malasia peninsular"Revista internacional de
investigación alimentaria, vol. 25, págs. 1893–1899, 2018.
[16] YLT Dang, THT Tran, LDT Nguyen, AH Nguyen y TTT Nguyen,
"Aislamiento y detección de bacterias productoras de histamina de
los primeros seis meses del proceso de fermentación de la salsa de
pescado cat hai".Revista de Ciencias Agrícolas de Vietnam, vol. 1,
no. 3, págs. 220–229, 2019.
Revista Internacional de Química Analítica 9

[17] F. Kvasnička, S. Kavková y A. Honzlová, “Determinación tecnología de flujo”, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.
electroforética de histamina”,Revista de cromatografía A, vol. UU., 2013.
1588, págs. 180–184, 2019. [33] Y. Ohtsubo, H. Kurooka, H. Tada y N. Manabe, "Método para la
[18] Z. Bajc y K. Š. Gačnik, “Análisis TLC densitométrico de histamina determinación de histamina en alimentos mediante LC-MS/MS"Ciencias
en pescado y productos pesqueros,”Revista de cromatografía de la higiene y la seguridad alimentaria (Shokuhin Eiseigaku Zasshi), vol.
planar: TLC moderna, vol. 22, núm. 1, págs. 15 a 17, 2009. 55, núm. 2, págs. 103–109, 2014.
[34] S. Sentellas, Ó. Núñez, y J. Saurina, “Recientes avances en la
[19] E. López-Rituerto, A. Avenoza, JH Busto, and determinación de aminas biogénicas en muestras de alimentos por
JM Peregrina, “Estudio RMN del metabolismo de la histidina (U) HPLC,”Diario de la química agrícola y alimentaria, vol. 64, núm.
durante las fermentaciones alcohólica y maloláctica del vino y su 41, págs. 7667–7678, 2016.
influencia en la producción de histamina,”Diario de la química [35] M. Nadeem, T. Naveed, F. Rehman y Z. Xu, "Determinación de
agrícola y alimentaria, vol. 61, núm. 39, págs. 9464–9469, 2013. histamina en pescado sin derivatización mediante el método
[20] S. Khan, LSA Carneiro, MS Vianna, EC Romani y de HPLC de fase inversa indirecta"Revista microquímica, vol.
RQ Aucelio, “Determinación de histamina en atún mediante 144, págs. 209–214, 2019.
detección de fotoluminiscencia utilizando puntos cuánticos de CdTe [36] Método oficial de la AOAC 977.13, “Método fluorométrico de
modificado con ácido tioglicólico y extracción en fase sólida histamina en mariscos”,Métodos Oficiales de Análisis de AOAC
catiónica” Diario de luminiscencia, vol. 182, págs. 71 a 78, 2018. Internacional, vol. 35, págs. 17 a 19, 2002.
[21] SB Patange, MK Mukundan y K. Ashok Kumar, "Un método simple y [37] E. Peralta y A. Serrano Jr, “Formación de histamina y calidad microbiológica
rápido para la determinación colorimétrica de histamina en la del chano deshuesado (chanos chanos) durante el almacenamiento a
carne de pescado".control de alimentos, vol. 16, núm. 5, págs. 465– temperatura ambiente,”Bioflujo ELBA, vol. 7, págs. 1 a 8, 2015.
472, 2005. [38] NA estiércol,Encuesta Regional de Histamina en Pescado y Productos
[22] TCVN 8352 : 2010, Pescado y productos pesqueros: Pesqueros, SEAFDEC, HCM City, Vietnam, 2008, http://
determinación del contenido de histamina: método mediante repository.seafdec.org/handle/20.500.12066/4410http://repository.
cromatografía líquida de alta resolución, 2010. seafdec.org/handle/20.500.12066/4410.
[23] T. Janči, D. Valinger, J. Gajdoš Kljusurić, L. Mikac, S. Vidaček y M. Ivanda,
"Determinación de histamina en peces mediante espectroscopia Raman
mejorada en superficie utilizando sustratos SERS coloidales de plata"
Química de Alimentos, vol. 224, págs. 48–54, 2017.
[24] A. Veseli, M. Vasjari, T. Arbneshi et al., “Determinación electroquímica
de histamina en salsa de pescado usando electrodos de carbono
heterogéneos modificados con óxido de renio (IV),”Sensores y
Actuadores B: Químico, vol. 228, págs. 774–781, 2016.
[25] C. Huang, S. Wang, W. Zhao et al., "Determinación visual y
fotométrica de histamina utilizando nanopartículas de oro no
modificadas"Microquímica Acta, vol. 184, núm. 7, págs. 2249–2254,
2017.
[26] A. Ali, KN Waheed, A. Hadaiyt e I. Begum, "Determinación de los
niveles de histamina por LC-MS/MS en varias especies de peces
disponibles en los mercados locales de Punjab, Pakistán"
Revista Internacional de Pesca y Estudios Acuáticos, vol. 4,
págs. 128–132, 2016.
[27] ME Lame, EE Chambers y KJ Fountain, “Desarrollo de un ensayo
UPLC/MS/MS cuantitativo para la cuantificación simultánea de
acetilcolina, histamina y sus metabolitos en líquido
cefalorraquídeo (LCR) humano utilizando una columna
CORTECS UPLC HILIC para mejorar la resolución máxima, la
sensibilidad y la velocidad O”, 2013, https://www.waters.com/
webassets/cms/library/docs/720004722en.pdf.
[28] AOC,Directrices de la AOAC para la validación en un solo laboratorio de
métodos químicos para suplementos dietéticos y productos botánicos,
AOAC, Rockville, MD, EE. UU., 2002.
[29] A. Kruve, R. Rebane, K. Kipper et al., "Revisión del tutorial sobre la
validación de métodos de espectrometría de masas y
cromatografía líquida: parte I"Analítica Química Acta, vol. 870, págs.
29 a 44, 2015.
[30] BK Matuszewski, ML Constanzer y CM Chavez-Eng, "Estrategias
para la evaluación del efecto de matriz en métodos
bioanalíticos cuantitativos basados en HPLC-MS/MS"Química
analítica, vol. 75, núm. 13, págs. 3019–3030, 2003.
[31] AOAC, “Directrices internacionales de la AOAC para la validación de
métodos de identificación botánica”,Revista de AOAC Internacional,
vol. 95, págs. 268–272, 2012.
[32] N. Byrd, “Detección rápida, sencilla y fiable de histamina en los
alimentos con el LC/MS de triple cuadrupolo agilent 6490 con jet