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MARTHA C. LOZANO T.
LUISA F. CLAVIJO.
A Dios por guiarnos siempre y brindarnos su fortaleza y su paciencia que nos permitieron culminar
otra meta.
A nuestros padres que nos apoyaron y nos llenaron de ánimo para no rendirnos en el camino.
A nuestros compañeros y amigos que compartieron con nosotras y nos brindaron su alegría en
cada momento.
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TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción 9
2. Marco teórico 10
2.1 Preservación 11
2.1.5 Costos: 13
2.1.7 Pureza: 14
2.2.4.2 Congelación a –20ºc con discos de gelatina y desecación con silica gel. 18
2.5.2.3 shigella sp 26
3. Justificación 27
4. Objetivos 29
4.1. General 29
4.2. Específicos 29
5. Materiales y métodos 30
5.2 Hipótesis 30
5.10.1.1 cocos 36
5.10.1.2 bacilos 37
5.10.2.1 bacilos 37
6. Resultados 38
6.3.2 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de caldo triptona soya con adición de
glicerol al 3%: 48
7. Discusión 53
7.3 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los grupos bacterianos (Gram positivos y Gram
negativos) 57
8.Conclusiones
14
RESUMEN
Se realizó este estudio con el fin de encontrar el método más eficaz para dicho propósito y de esta
Por medio de la estadística _______________ se determinó que existe relación entre los métodos
1. INTRODUCCIÓN
de investigación.
microorganismos; una gran variedad de técnicas están disponibles para estos fines y
no es fácil escoger el método más adecuado ya que estos se eligen teniendo en cuenta
Algunos de estos métodos son, subcultivos, congelación, liofilización, desecación etc., y como se mencionó anteriormente
cada método se emplea según las conveniencias de una necesidad en particular, no obstante, a veces se hace necesaria la
conjugación de varios métodos para lograr los fines deseados (Alexander, 1980).
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2. MARCO TEÓRICO
estandarización de equipos, ya que numerosos estudios han fracasado por la pérdida y la variación en
Algunos métodos de preservación han sido aplicados solo a un grupo estricto de microorganismos con
excelentes resultados, pero esto no quiere decir que no se pueda ampliar la posibilidad de aplicarlos a
otros grupos (Gherma, 1981); algunos de estos métodos son: Subcultivos en medios apropiados
discos de gelatina y silica gel, como crioprotector congelación –20ºC con el uso de leche descremada y
glicerol (Stamp , 1947; Gherna, 1981; Kirsop et al, 1984; Gao et al, 1995).
Es importante tener en cuenta para asegurar el éxito en la preservación y mantenimiento de las cepas
la edad del cultivo, la correcta identificación de estas y por supuesto trabajar bajo condiciones de
esterilidad para evitar contratiempos de contaminación que perjudiquen el estudio (Gherna, 1991).
2.1 PRESERVACIÓN
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condiciones óptimas para que el microorganismo aislado sea igual a la cepa original
No todas las especies responden igual a los métodos de conservación y preservación, por esta razón diferentes laboratorios e
instituciones, incluido el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana también varían los
requerimientos necesarios para la conservación de las diferentes cepas bacterianas, empleando técnicas diferentes que pueda
conservar el microorganismo de la mejor manera posible.
Todos los métodos ofrecen ventajas y desventajas, la elección del método para un uso particular debe
ser compatible a las necesidades del usuario. Los rasgos a considerar se describen a continuación:
la preservación de una cepa bacteriana. El mantenimiento de una cepa bacteriana significa que el
cultivo debe permanecer vivo y puro en el procedimiento, mientras que la preservación significa
mantener la cepa bacteriana con un potencial biológico constante por un periodo de tiempo
prolongado. Para que esto pueda llevarse a cabo, las instalaciones, el material empleado en el
laboratorio y su manipulación durante este proceso deben cumplir las normas de esterilidad;
especialmente cuando se trabaja con un amplio stock de microorganismo s (Weiss, F.A, 1957).
Durante el almacenamiento, los cambios genéticos pueden ocurrir como resultado de mutaciones por
perdida de plásmidos. Por esta razón es importante que las cepas preservadas no pierdan sus
características que las hacen importantes. Así que las técnicas de preservación deben evitar la
selectivos, para mantener la presión selectiva uniforme en estado preservado (Weiss, F.A, 1957).
18
Una proporción de las células en una población puede morir durante el proceso de preservación inicial
y esto puede ser de poca importancia para el investigador si se usan inicialmente concentraciones altas
en el número de células. Sin embargo, la reducción en el número de células viables puede producir la
mayor número de células viables para que la población sobreviviente se asemeje lo mas
aconsejable, ya que asegura la duración por muchos años y evita costos elevados, y las perdidas serán
2.1.5 COSTOS:
Algunos métodos requieren inicialmente un gasto elevado generado por equipos, facilidades de
almacenamiento, materiales y gasto en personal. El elevado costo de capital en equipos para algunos
métodos como el liofilizador, pueden compensarse con los reducidos costos de personal, ya que la
estabilidad por largo plazo de los cultivos disminuye la necesidad de una intervención por parte del
preservación inicial y por consiguiente la manipulación, si se requiere una o más copias; encontrar un
método apropiado para la preservación de cepas puede ser un proceso excesivo cuando el número de
19
cepas es elevado. El método para un gran stock debe estar relacionado con la cantidad de espacio
2.1.7 PUREZA:
Los cultivos conservados para todas las aplicaciones deben permanecer puros, y el método de
preservación debe minimizar el riesgo de contaminación, este evento perjudica cualquier estudio y
Los métodos de conservación más utilizados se clasifican en métodos de corta y larga duración:
CORTA DURACIÓN: Los métodos de corta duración son: Método de Subcultivo, Mantenimiento de
ordinaria, -20°C con Discos de Gelatina y Desecación sobre Silica Gel, -20°C con el uso de Leche
CORTA DURACIÓN
Consiste en la inoculación de cepas puras en medios de cultivo específicos seguido de una incubación
a una temperatura conveniente, generalmente a 37ºC, para obtener el crecimiento del microorganismo,
repite a intervalos cortos de tiempo que aseguren la preservación de un cultivo fresco antes de que el
viejo muera. El tiempo que puede permitirse pasar entre los subcultivos sin riesgo de perder las cepas
depende del microorganismo en particular, los aislamientos deben realizarse por duplicado para evitar
la perdida de las cepas y por supuesto verificar la pureza de las cepas antes de realizar el aislamiento
Mediante este método se ha logrado preservar gran variedad de cepas bacterianas a mediano plazo
(Perkins, 1962). El microorganismo se siembra en un medio adecuado, ya sea en caldo, agar inclinado
o medio semisólido, y una vez el microorganismo se halle en fase de crecimiento (18-20 horas), se
adiciona 2ml del aceite mineral estéril, se sella o se almacena en refrigeración ó al medio ambiente
(Perkins, 1962). El aceite se esteriliza por calor seco (horno) a 180ºC por dos horas, en tubos tapa
rosca colocando 5ml por tubo; generalmente la contaminación de los cultivos se debe a la mala
esterilización del aceite por esta razón es necesario hacer un control de esterilidad al aceite, sembrando
en agar nutritivo (Perkins, 1962). Este método es económico y se emplea con frecuencia, sin
En la preservación por congelación, se forman cristales de agua, que por esta razón perjudican la integridad de los
microorganismos. Los microorganismos deben ser deshidratados para ser almacenados a bajas temperaturas. El daño puede
causarse durante la fase refrescante y el deshelar subsecuente, esto puede ser causado por la concentración de electrolitos a
través del levantamiento de agua como hielo o por la formación de los cristales de hielo que pueden dañar la integridad y la
morfología del microorganismo (Snell, J.J.S, 1984).
Los esfuerzos por limitar este daño pueden lograrse por el ajuste del proceso de descongelar y la
adición de crioprotectores como el glicerol o leche descremada a la suspención celular (Gao et al,
1995).
Los métodos descritos anteriormente presentan algunas ventajas y desventajas, sin embargo, siempre
debe buscarse y emplearse el método que se ajuste a las necesidades del microorganismo o
microorganismos en estudio, por estas razones no se descarta la posibilidad de conjugar dos o más
Los métodos de conservación por congelación pueden ser extensos y son clasificados de acuerdo a la
temperatura de almacenaje, estos son: -20ºC, -30ºC, -40ºC, -70ºC, -140ºC, y –196ºC; en general la
temperatura sobre los –30ºC genera mejores resultados, la conversión a –70ºC ha sido empleada para
a –140ºC (Vapor de nitrógeno) y –196ºC (nitrógeno líquido) son empleados para microorganismos que
Este proceso no es muy recomendado para la preservación de cepas debido a que la congelación daña
las células. Cuando la temperatura de cualquier suspensión celular se halla bajo 0ºC, el agua del
concentración del soluto y el agua intracelular migra al exterior por diferencia en la presión osmótica,
al removerse el agua del interior se produce daños celulares y por consiguiente la perdida de las
SILICA GEL.
En este método originalmente descrito por Stamp (1974), los microorganismos son suspendidos en una
gelatina nutritiva, esta se sirve en cajas de Petri hasta que se solidifiquen, luego de esto se sacan los
discos los cuales son puestos a desecación almacenados sobre silica-gel y congelados a –20ºC.
El propósito de este, es lograr que pare el metabolismo celular lo cual se logra con la congelación,
requisito para la preservación y almacenamiento a largo plazo de las cepas bacterianas en un estado
esencialmente natural sin variantes morfológicas ni fisiológicas (Reusser, 1963). La función que
para que los cristales junto con la acumulación de electrolitos no causen daños celulares irremediables
La contaminación por este método es menor en comparación con el uso de subcultivos en serie; la
viabilidad a largo plazo parece ligeramente buena, por otra parte es un método donde se puede
preservar las cepas bacterianas sin que sufran cambios genéticos aparentes que modifiquen la cepa
La desecación en silica gel es un procedimiento fácil, rápido y económico, los tubos con silica son
esterilizados a 180ºC por 2 horas ; se agrega la suspención bacteriana en leche descremada al 10% o
los discos de gelatina con una concentración bacteriana conocida. Se cubre y se llevan a refrigeración.
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La silica es un absorbente que tiene la capacidad de resistir altas y bajas temperaturas y controlar la
crioprotector tiene la capacidad de actuar como un radical hidroxilo, lo cual le permite estabilizar la
estructura de la membrana celular, penetrar a la célula y también actúa como nutriente, tiene una baja
toxicidad biológica para la célula y la capacidad de atrapar los fragmentos de agua descongelada a
cualquier temperatura baja (Miura, 1994). La leche descremada funciona disminuyendo la tensión
termal causada principalmente por la expansión del volumen del agua durante la formación del hielo
En este proceso se hace el mantenimiento de las cepas a –70ºC, este involucra la congelación
membrana celular y producen una protección intra y extra celular contra la congelación (Gao et al,
1995).
Una vez las bacterias han crecido en un medio apropiado, se hace una suspensión de estas en un caldo
con el crioprotector y se dispensan en los viales para llevarlos a congelación, para la recuperación se
debe realizar una recuperación rápida colocando las suspensiones a 37ºC (Gherna, 1991).
Este método de almacenamiento en pequeñas perlas de vidrio en glicerol ha sido empleado exitosamente para gran variedad de
bacterias, el método es muy fácil y rápido y no requiere de una subsecuente manipulación durante el almacenaje. La desventaja
que presenta este método de conservación es el elevado costo del congelador a –70ºC (Jones et al, 1978).
El almacenaje en líquido o vapor de nitrógeno es el método universal más aplicable de todos los
métodos de conservación. Es utilizado para hongos, bacterias, virus, algas, protozoos y cultivos
celulares que son preservados exitosamente mediante este método. El método tiene como principal
desventaja que el nitrógeno líquido se evapora y requiere ser reemplazado regularmente, por
consiguiente, los costos de equipos y materiales son elevados (Straws; Kirsop; James, 1984).
entrapa en un condensador refrigerado o con pentóxido de fósforo, después del secado los
microorganismos son almacenados al vacío o en gas inerte en viales individuales o ampollas (kirsop et
al, 1984).
Para este proceso los microorganismos se suspenden en un medio apropiado que le sirva de soporte,
convertida en vapor, sin pasar por el estado líquido. El resultado es un producto soluble en agua que
Este sistema se ha empleado por muchos años para preservar una gran variedad de materiales
biológicos que son sensibles al calor. La naturaleza no destructiva de este proceso se ha demostrado
por la viabilidad observada en estudios realizados en virus y otros microorganismos (Bank, 1995).
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Generalmente todas las cepas bacterianas se pueden someter a este proceso utilizando como medio de
soporte leche descremada al 20%. Para este proceso las cepas deben ser puras de un cultivo de 18-24
horas, y debe hacerse control de viabilidad y esterilidad para poder determinar la efectividad del
proceso, para ello se toman más o menos del 10% de los viales, y se reconstituyen en caldo nutritivo
estéril y se siembra en un medio adecuado de acuerdo a la cepa e incuban por 18 horas, transcurrido
ese tiempo se espera observar crecimiento de las cepas con las mis mas características de las que se
Las desventajas que se pueden presentar en este tipo de conservación bacteriana son los altos costos
por la adquisición de equipos comerciales y los cambios que pueden sufrir algunas cepas bacterianas
La función principal de los crioprotectores es prevenir el daño ocasionado a las células por la
criopreservación, tienen la capacidad de actuar como radical hidroxilo y estabilizar la estructura de las
membranas de las células, presentan habilidades de penetrar las memb ranas de las células y producen
Los agentes crioprotectores funcionan disminuyendo la “Tensión termal” fuerza que causa el
rompimiento de células y fractura de órganos helados, causada principalmente por la expansión del
y la leche descremada respectivamente. Sin emb argo, se emplean para estos procesos otras sustancias
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como el dextran, la gelatina, la glucosa, lactosa, el manitol, el sorbitol y la sacarosa que también
Las bacterias Gram positivas poseen varias características que ayudan a diferenciarlas de los
microorganismos Gram negativos, estas son el elevado contenido de glucopéptidos y bajo contenido
lipídico de sus paredes celulares, lo cual les permite retener el colorante de cristal violeta de la tinción
de Gram (Desarrollada por el médico Danés Hans, Cristian Gram; de aquí su nombre) debido a que los
alcoholes y otros solventes orgánicos no penetran en las paredes celulares, deficientes en lípidos. Son
en general más resistentes a los efectos de la desecación, el calor y la luz solar, así como la acción de
sustancias químicas (Mattar y Melo, 1998). Las paredes celulares son las capas más externas de estos
60% de péptido glicano, extensivamente entrecruzado en tres dimensiones, para formar una red
lipopolisacáridos en bajas proporciones. Todas las células Gram positivas poseen un polímero lineal
de ácido N- acetilmurámico que cruza hacia el polímero adyacente. Los ácidos teicóicos, están unidos
al ácido murámico de la cepa de peptidoglicano y se presentan en dos formas principales: ácido ribitol
teicóico y ácido glicerol teicóico. En general hay polímeros largos ya sea de ribitol (Un alcohol azúcar
de cinco carbonos) o un glicerol (alcohol azúcar de tres carbonos) unidos entre sí a través de puentes
fosfodiester. Sin embargo, los grupos hidroxil de ribitol o subunidades de glicerol están unidos a
diferentes azucares o aminoácidos. Debido a que estos ácidos teicóicos son altamente antigénicos
(Inducen en el huésped la producción de anticuerpos que reaccionan contra estos) parece que se
(Howard, 1983; Wesley, 1993). Para la mayor parte de las proteínas no se encuentran como
constituyentes de la pared celular de este grupo, una excepción es la proteína M del Streptococcus del
grupo A.
2.5.1.1 Staphylococcus aureus: Aerobio facultativo, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua
por poseer la enzima catalasa, fermenta azucares, a las pruebas de manitol y coagulasa positivo (Brock,
1982).
2.5.1.3 Streptococcus mutans: Coco que se adhiere a los dientes, catalasa negativa, hemólisis alfa,
2.5.1.4 Enterococcus faecium: Cocos en cadena que se caracterizan por la producción de ácido
2.5.1.5 Bacillus subtilis: Bacilos con endosporas que principalmente ocupan posición central,
2.5.1.6 Listeria monocytogenes: Catalasa positivo, motilidad positiva de 20-25ºC por 48-72 horas,
La pared celular de las bacterias Gram negativas es más compleja desde el punto de vista químico,
estructuralmente poseen una membrana citoplasmática fosfolipídica, rodeada por una capa de
peptidoglicano que delimitan el espacio periplasmático, así como una pared externa que contiene
elementos intercalados como lipopolisacáridos (LPS), moléculas construidas sobre la región core y una
glucosamina) un polisacárido, de extrema importancia por su toxicidad para los animales, recibiendo el
nombre de endotoxina; aunque esta se encuentra asociada principalmente con el lípido A, mientras que
28
porinas y otras proteínas las cuales son bastante complejas e irradian los flagelos, las fimbrias o pilis.
Al microscopio con la tinción de Gram estos microorganismos se observan rosados por tomar el
colorante de fucsina de la técnica debido a que el colorante en estas bacterias actúa como un solvente
de los lípidos presentes, los poros de la pared se aumentan de tamaño y el complejo cristal violeta
2.5.2.1 Pseudomonas aeruginosa: Bacilos con flagelos polares, no forman gas a partir de glucosa,
2.5.2.2 Escherichia coli: Habitante de vía intestinal, sintetiza vitamina K en el intestino, aerobio
facultativo, produce ácido a partir de glucosa, catalasa positivo, oxidasa negativa (Brock, 1982).
2.5.2.3 Shigella sp: Bacilo, oxidasa negativa, catalasa positiva, muy relacionado con E. coli (Brock,
1982).
2.5.2.4 Salmonella sp: Son mótiles, forman gas a partir de glucosa, son bacilos Gram negativos
(Brock, 1982).
2.5.2.5 Klebsiella sp: Bacilos con cápsula, forma gas a partir de glucosa, oxidasa negativo (Brock,
1982).
2.5.2.6 Pasteurella multocida: Son bacilos pleomórficos presentan gránulos bipolares, oxidasa
3. JUSTIFICACIÓN
preservación de estas.
Para el estudio hay que tener en cuenta que las bacterias poseen diversas
En los ensayos de los diversos métodos de preservación ocurren varios eventos como
niveles de viabilidad, para evitar pérdidas, la cepa debe ser sometida a un proceso que
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
4.2. ESPECÍFICOS
los repiques.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio fue realizado en el laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana, como modelo
experimental de tipo comparativo, en el que se evaluó el uso de Caldo Tripticasa Soya con adición de glicerol al 3%, leche
descremada al 10% y Discos de Gelatina al 10% sobre Silica-Gel como métodos de mantenimiento a mediano plazo y de
preservación de cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas.
5.2 HIPÓTESIS
Ø Hipótesis nula (Hn): No existe relación entre las variables concentración bacteriana recuperada, el
Ø Hipótesis alterna (Ha): Plantea que existe una relación entre la concentración de cada cepa
El manejo de datos se realizo por medio del programa Start View 4.0. En el que se evaluaron las
cada técnica vs. Tiempo, Viabilidad vs Tiempo, y evaluación de recuperación de cepas bacterianas en
Las cepas usadas en este estudio proceden del Cepario de Microbiología Especializada de la Pontificia
Streptococcus mutans.
Ø Bacilos Gram negativos: Escherichia coli, Shigella sp, Salmonella sp, Klebsiella sp, Pseudomonas
Las cepas se preservaron por un periodo de tres meses y las evaluaciones de viabilidad y
Para el ensayo se tomó una colonia de cada una de las cepas bacterianas a partir de cultivos jóvenes
previamente incubados a 37ºC durante 24 horas, y se suspendieron en Caldo Eugebion, estas fueron
Posteriormente se procedió a montar cada uno de los métodos de preservación para evaluar viabilidad
bacteriana:
MILK)
El polvo de leche desnatada se emplea como aditivo que mejora las condiciones de crecimiento de los
microorganismos presentes, y el uso de esta ofrece un soporte sólido para la congelación (Gibson y
Khoury, 1986), por la presencia de sustancias conocidas como osmoprotectoras, osmolitos o solutos
compatibles. Los osmolitos son acumulados usualmente en las células durante periodos de estrés
34
estructuras bajo estas condiciones (Ryser y Marth, 1999). El medio fue basado en la fórmula descrita
por Gibson y Khoury (1986) y Gherna (1994) con las siguientes modificaciones.
Ø El ensayo se montó por duplicado para cada cepa, dispensando 9ml de Leche Descremada al 10%
(Anexo No 1) en tubos tapa rosca (16x150 mm) y 1ml de cada una de las suspensiones
GICEROL AL 3%
El caldo Tripticasa Soya es un medio altamente nutritivo que se emplea para cultivar gran variedad de
cepas bacterianas; el glicerol se adiciona como crioprotector que pasa a través de la membrana celular
y produce una protección intra y extracelular contra la congelación (Gao et al, 1995).
Ø Al igual que con la Leche Descremada, cada cepa bacteriana se montó por duplicado dispensando
9ml de Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% (Anexo No 2) en tubos tapa rosca
(16x150mm) y 1ml de las suspensiones para llevar a diluciones de 1/10 y se alicuotó de 1ml en
SILICA-GEL
El método originalmente descrito por Stamp (1947), se basa en que los microorganismos son
suspendidos en una Gelatina nutritiva, esta se pone en cajas de Petri hasta que solidifique, luego de
esto se sacan los discos los cuales son puestos a des ecación almacenados sobre Silica-Gel, cuya
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función es atrapar la mayor cantidad de moléculas de agua para evitar la formación de cristales de
Ø El ensayo se montó por duplicado para cada cepa dispensando 9ml de gelatina líquida (Anexo
No 3) en tubos tapa rosca (16x150mm) y 1ml de cada suspensión bacteriana llevando a diluciones
Ø Posteriormente se perforaron los medios con una pipeta Paster estéril para extraer discos de 6mm
de diámetro, para una concentración final de 7,408x10^6 UFC por disco, que se colocaron sobre el
algodón en los tubos con Silica-Gel previamente activados a 180º C durante dos horas en calor
seco; por último los tubos fueron sellados con parafilm y se llevaron a congelación a –20ºC.
Cuando las cepas bacterianas van a ser recuperaradas, debe realizarse una descongelación rápida,
colocando las suspensiones a 37ºC en baño María o incubadora durante media hora (Gerhardt,
1994); en nustro ensayo, después de transcurrido cada mes de preservación para cada cepa
bacteriana en las técnicas de Leche Descremada al 10% y Caldo Tripticasa Soya con adición de
Glicerol al 3%, se retiraron dos viales de cada cepa y se sometieron a descongelación rápida en
incubadora en el tiempo y la temperatura ya mencionadas; en el caso de los tubos con los Discos de
gelatina sobre Silica – Gel, primero se retiraron los discos y se suspendieron en 9ml de Caldo
Después de la descongelación, las cepas dispuestas en los viales con Leche Descremada al 10% y
Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% se resuspendieron en 9ml de Caldo Eugebion y se
obtuvo nuevas diluciones de 1/100 para cada cepa en los distintos métodos; de estas suspensiones se
36
MultiSkan (Ref 340 Labsystem) a 540nm, con el fin de comparar la viabilidad de cada cepa bacteriana
en los métodos ya mencionados en intervalos mensuales durante tres meses; se continuo la incubación
durante 24 horas y se realizó una segunda lectura de la manera descrita anteriormente, para establecer
la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica y de igual forma se realizaron lecturas mensuales
Con los datos arrojados de las lecturas se realizaron una serie de promedios con el propósito de
comparar el comportamiento de las cepas bacterianas en estudio, separadas por grupos con respecto a
su pared en Cocos Gram Positivos, Bacilos Gram Positivos y Bacilos Gram negativos en los métodos
En este proceso, después de montar las últimas diluciones de 1/100 para cada una de las cepas en los
distintos métodos y antes de montar las placas donde se evalúo la viabilidad, se tomaron 10λ de cada
suspensión y se sembraron en Agar Columbia las cepas Gram positivas y en Agar MacConkey las
cepas Gram negativas excepto la cepa de Pasteurella multocida que se sembró en Agar Columbia
porque en MacConkey no crece. Se incubaron a 37ºC durante 24 horas con el fin de obtener el
crecimiento típico para cada cepa bacteriana, en donde se estableció la integridad celular, la capacidad
En esta etapa, la pureza se verificó sobre las cajas mediante la realización de pruebas
(1999), así:
37
Oxidasa, TSI, H2S/Gas, LIA, Citrato, Urea, Indol, Motilidad, RM, VP.
6. RESULTADOS
700000000
600000000
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
500000000
400000000
Leche 10%
Glicerol 3%
Gelatina 10%
300000000
200000000
100000000
0
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
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FIGURA 2.
600000000
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
500000000
400000000
Leche 10%
300000000 Glicerol 3%
Gelatina 10%
200000000
100000000
0
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
FIGURA 3.
700000000
600000000
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
500000000
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Leche 10%
Glicerol 3%
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FIGURA 4.
700000000
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CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
500000000
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Leche 10%
Glicerol 3%
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CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
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Leche 10%
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FIGURA 6.
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CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
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Leche 10%
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CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
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Leche 10%
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FIGURA 8.
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500000000
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
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Leche 10%
300000000 Glicerol 3%
Gelatina 10%
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FIGURA 9.
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CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
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Leche 10%
300000000 Glicerol 3%
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FIGURA 10.
700000000
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CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
500000000
400000000
Leche 10%
Glicerol 3%
Gelatina 10%
300000000
200000000
100000000
0
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
FIGURA 11.
600000000
500000000
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
400000000
Leche 10%
300000000 Glicerol 3%
Gelatina 10%
200000000
100000000
0
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
44
FIGURA 12.
600000000
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
500000000
400000000
Leche 10%
300000000 Glicerol 3%
Gelatina 10%
200000000
100000000
0
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
45
FIGURA 13.
600000000
Promedio de Concentración de Bacterias Recuperadas (6x10^8/UFC/cc)
500000000
400000000
Cocos G+
300000000 Bacilos G+
Bacilos G-
200000000
100000000
0
1 2 3
TIEMPO EN MESES
46
FIGURA 14.
700000000
Promedio de Concentración de Bacterias Recuperadas (6x10^8 UFC/cc)
600000000
500000000
400000000
Cocos G+
Bacilos G+
Bacilos G-
300000000
200000000
100000000
0
1 2 3
TIEMPO EN MESES
FIGURA 15.
500000000
450000000
Promedio de Concentración de Bacterias Recuperadas (7.408x10^8 UFC/Disco)
400000000
350000000
300000000
Cocos G+
250000000 Bacilos G+
Bacilos G-
200000000
150000000
100000000
50000000
0
1 2 3
TIEMPO EN MESES
47
.
6.3 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A CADA TÉCNICA
FIGURA 16.
9000000000
8000000000
CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS (6 * 10^8 UFC/cc)
7000000000
6000000000
3000000000
2000000000
1000000000
0
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Ps
CEPAS BACTERIANAS
48
FIGURA 17.
8000000000
CONCENTRACION DE BACTERIAS RECUPERADAS (6 * 10^8 UFC/cc)
7000000000
6000000000
5000000000
Promedios 30min
24 h mes 01
4000000000
24 h mes 02
24 h mes 03
3000000000
2000000000
1000000000
0
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Ps
CEPAS BACTERIANAS
bacterias posterior a una incubación de 24 horas a 37º C en intervalos mensuales durante 3 meses,
después de aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas bacterianas
Gram+ y Gram- (fig.18).
FIGURA 18.
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Discos de Gelatina al 10% Desecados sobre Silica Gel
CONCENTRACION DE BACTERIAS RECUPERADAS (7.408 * 10 ^6 UFC/Disco)
5000000000
4500000000
4000000000
3500000000
3000000000
Promedios 30min
24 h mes 01
2500000000
24 h mes 02
24 h mes 03
2000000000
1500000000
1000000000
500000000
0
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Ps
CEPAS BACTERIANAS
50
lo largo del estudio, demostrando así la pureza de cada una de las cepas en los
bilis
Bilis esculina NR NR Positiva Positiva
Crecimiento en NR NR Positivo Positivo
NaCl 6.5%
NR: No se realizó
No.5.
7. DISCUSIÓN
55
La preservación de cepas bacterianas tiene por objetivo mantener por un largo periodo
similar cuando son sometidas al mismo proceso, por esta razón se hace necesario probar
varias técnicas para poder establecer la mejor para los distintos géneros bacterianos
afecte la integridad celular que conducen a la muerte de las bacterias; para evitar la
la Leche Descremada (Gao et al, 1994) y desecantes como el Silica Gel (Perkins, 1962);
para prevenir este riesgo, se debe verificar la pureza de los cultivos bacterianos antes de
empleado debe ser previamente esterilizado, la manipulación debe ser adecuada y las
fue para B.subtilis y Klebsiella sp. En la preservación a -20ºC en Caldo Tripticasa Soya
para: B. subtillis y Klebsiella sp, y transcurridos los tres meses continuó igual. Como se
satisfactoriamente a las tres técnicas empleadas en este estudio y estas bacterias tienen
formar una red polimérica gruesa (mosaico) que rodea a la célula completamente;
ácidos teicóicos, que son polímeros de ribitol fosfato o glicerol fosfato que se unen entre
lipopolisacáridos en baja proporción, que confieren una capa gruesa y rígida que le
otorga a las células protección frente al proceso de congelación (Moat, A.G. y Foster,
J.W., 1988).
57
y tercer mes, aclarando que para las cuatro primeras cepas St.aureus, St.epidermidis,
B.subtilis y Klebsiella sp es del 27 %. Para las cepas de Shigella sp, Salmonella sp,
50,9 % entre el segundo y tercer mes. Se resalta que las cepas de Listeria
preservación (Fig.1-12).
al 3%, podemos ver que las doce cepas bacterianas mueren a un ritmo constante entre el
multocida, en la que disminuye la pérdida entre el segundo y tercer mes, ya que pasa de
un 17,4 % entre el primero y segundo mes, a un 8,4 % entre el segundo y tercer mes.
También podemos resaltar, que para la cepa de St.aureus, el porcentaje de muerte entre
el primer y el tercer mes de preservación es tan solo de 4,9 %, mientras que para
Klebsiella sp, el porcentaje de muerte entre el primer y tercer mes es de 21,7 %, y para
58
Silica Gel encontramos que para St.aureus, E.faecium, St.mutans y B.subtilis, se acelera
tercer mes es similar al de la pérdida entre el primero y segundo mes que corresponde a
Se concluye, que las doce cepas bacterianas estudiadas, mueren a medida que va
mayor en gelatina al 10% y menor en Glicerol al 3%. El efecto de glicerol se debe a que
congelación y las moléculas de agua que demoran esta misma; atribuyéndosele su gran
10% y discos de gelatina al 10% sobre silica gel, se puede determinar que estos métodos
fueron eficaces para el mantenimiento de las doce cepas bacterianas estudiadas en esta
investigación.
59
Al comparar los grupos bacterianos: Cocos Gram Positivos, Bacilos Gram Positivos y
Bacilos Gram negativos en cada una de las técnic as evaluadas (fig. 13,14 y 15), se
observa una mayor recuperación para el grupo de Cocos Gram Positivos en la técnica de
del proceso.
segundo y tercer mes la recuperación para este grupo fue disminuyendo, siendo
se obtuvo una mayor recuperación en el grupo de los Bacilos Gram Positivos a lo largo
del estudio, seguido por el grupo de los Cocos Gram positivos; como se mencionó
DE 24h A 37ºC.
a una incubación de 24 horas a 37ºC en intervalos mensuales durante tres meses, los
10% sobre Silica Gel la recuperación fue de 7.10 %, 8.23 % y 14.54 % (Tabla No 4),
a las 24 horas de incubación a 37ºC; podemos concluir que tanto en Le che como en
Gelatina los porcentajes de recuperación fueron aumentando mes a mes indicando que
las cepas fueron adquiriendo una mayor capacidad de recuperación a medida que el
tiempo fue pasando, lo contrario que sucedió en el medio de glicerol que a me dida que
fenómeno presumimos que se deba a que el Glicerol tiene efecto sobre las células para
impedir este proceso, en el ejemplo solo se menciona la cepa de St.aureus, pero este
fenómeno sucedió en la mayoría de las cepas, excepto con la cepa de B.subtilis donde
los porcentajes de recuperación en Glicerol fueron aumentando mes a mes 6,91 %, 7,40
% y 8,88 % respectivamente, este hecho sugiere que tal vez se deba a la producción de
61
esporas de las cepas que se forman en condiciones adversas como la congelación que
evitan que el Glicerol penetre las células; ver (fig. 16, 17 y 18) y (tabla No 4).
En esta etapa la pureza se verificó sobre las cajas de cultivo mediante la realización de
resultados obtenidos son presentados en las tablas 1,2 y 3 y fueron constantes a lo largo
de nuestro estudio , demostrando así la pureza de cada una de las cepas en los tres
métodos empleados, ya que los datos arrojados no fueron falseados por la presencia de
colonias contaminantes, por otra parte al terminar nuestro estudio pudimos recuperar las
cepas inicialmente preservadas, esto quiere decir que los métodos son confiables, que la
Finalmente se puede establecer una relación entre las variables planteadas en este
trabajo dados los valores p<.0001 obtenidos en el análisis estadístico por el test de
8. CONCLUSIONES
preservación, por esta razón es necesario emplear altas concentraciones iniciales de las
suspensiones bacterianas.
Las cepas Gram positivas respondieron satisfactoriamente a las tres técnicas empleadas en este estudio sugiriendo que su
sobrevivencia se debe a la composición de su pared.
al 3%.
Los métodos estudiados se pueden implementar en el Laboratorio de Microbiología Especial de la Pontificia Universidad Javeriana,
ya que son económicos y se evita la necesidad de hacer repiques cada 15 días para mantener las cepas puras y viables para fines
docentes y de investigación.
La pureza de las cepas bacterianas conservadas en los distintos métodos se logró cumpliendo las normas de esterilidad en el
laboratorio.
9. RECOMENDACIONES
Las cepas bacterianas estudiadas fueron recuperadas vivas y puras en las tres técnicas
durante el tiempo de evaluación, sin embargo, los datos arrojados sugieren que el mejor
Se deben evaluar otros grupos bacterianos en estos métodos para verificar la eficacia y
Este estudio d ebe realizarse por un tiempo mayor a tres meses, para determinar cual es el tiempo máximo
BIBLIOGRAFÍA
Brock, T.D. et al, Microbiología. Sexta edición, Prentice hall, INC. México, 1991.
D.Y Gao, P.F Watson. Fracture Phenomena in an Isotonic Salt Solution During
Freezing and their Elimination Using Glycerol. Criobiology Research Institute, 1995:
(32), 270-84.
Gerhardt, P. Methods for General and Molecular Bacteriology. Noel R. Krieg editors.
Washington DC, 1994: (12) 278-92.
Gerhardt. American Society for Microbiology. Washington DC, 1981: Pp, 208-17.
J.F, Jackson. Microbial Culture Preservation with Silica Gel. Journal General Microbiology. 1969: (8),
423-25.
64
Manual of Laboratory Methods. Academic Press, INC. Londres, 1984: Pp, 1-41.
Moat, A. G Y Foster, J. W. Microbial Physiology. Second edition John Willey & Sons.
Reinhardt, D.J. Silica Gel as a Preserving Agent for the Cellular Slime Mold Acrasis
1992.
65
Microbiological Reagentes and Quality Control. Academic Press. 1984: Pp, 11-22.
Methods. In American Society of Bacteriologist (ed). McGraw – Hill Book Co Inc New