Introducción

La biotecnología es definida como la modificación de las propiedades innatas de

microorganismos, plantas, animales o partes de estos, con el fin de obtener un
producto de interés que beneficie al humano directa o indirectamente.
Dichas bases datan de hace muchos siglos, cuando se empezó a seleccionar mediante
cruza selectiva las mejores especies de plantas y animales, así como la utilización de sus
productos para obtener alimentos o productos medicinales.
Sin embargo, la biotecnología moderna hace referencia a la era de la invención de la
tecnología del ADN recombinante o ingeniería genética, cuyo tema es el cetro de este
trabajo para así poder explicar la técnica.
La manipulación del ADN y los estudios de Hamilton Smith sobre las enzimas de
restricción dieron lugar a la tecnología recombinante, en la cual segmentos de ADN de
distintos orígenes son insertados en plásmidos para formar moléculas de ADN
recombinante capaces de una replicación autónoma (Smith y Wilcox 1970).
Luego se aprendió a expresar ese inserto lo que permitió sobre producir en forma
controlada proteínas heterólogas de interés en diversos organismos, dando paso al
inicio de la biotecnología moderna (Crommelin y cols, 2008).
En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de
interés (tal vez el gen de una proteína humana médicamente importante) se inserta
primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con
enzimas que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante,
ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.
El procedimiento consta de los siguientes pasos: preparación del vector para clonación,
preparación del inserto de ADN a clonar, ligación del inserto de ADN con el vector, la
transformación de bacterias y la identificación de las colonias que contienen el vector
recombinante. Una vez que se obtiene el vector recombinante, puede utilizarse para
producir proteínas recombinantes o para almacenar el ADN.

Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

Involucra la digestión con enzimas de restricción para liberar el fragmento de interés de
la molécula de ADN completa. La selección de la(s) enzima(s) que corten el ADN es un
punto crítico que determina la facilidad y la eficiencia de la metodología. Para facilitar la
clonación se prefiere el uso de enzimas de restricción cuyos sitios de corte estén
presentes en el sitio de clonación múltiple del vector, con lo que se evita la necesidad
de una posible modificación posrestricción del inserto. Asimismo, el inserto deberá
cortarse con la(s) misma(s) enzima(s) o con unas que dejen los mismos extremos, de
manera tal que la complementariedad de los extremos generados en el inserto coincida
con los extremos del vector (Un vector se define como una molécula de ADN de doble
cadena con capacidad de albergar un fragmento de ADN de otro origen). Debe tomarse
en cuenta que la incorporación de un inserto con extremos romos implica una
eficiencia de 50% en la clonación, ya que en la mitad de las ocasiones el inserto va en el
sentido apropiado (5’-3’), pero en el otro 50% de las ocasiones la inserción será en el
sentido opuesto (3’-5’). El inserto, producto de la digestión enzimática, se purifica y
separa de la molécula de ADN de donde proviene, mediante una electroforesis en gel
de agarosa. La banda correspondiente al inserto (que se verifica por el tamaño que
presenta) se escinde del gel y se extrae y purifica mediante técnicas convencionales.

Preparación de un vector de clonación

Un vector de clonación contiene elementos como el origen de replicación, un sitio
múltiple de clonación (SMC), que es una secuencia específica reconocida por diversas
enzimas de restricción para poder insertar el ADNc del gen de interés y un marcador de
selección.
Consiste en:
a. Corte con la(s) misma(s) enzima(s) de restricción con que se digirió el inserto y
obtener un ADN lineal. La estrategia de clonación debe diseñarse para que el
corte genere extremos con secuencias complementarias a los extremos del
inserto a clonar.
b. Desfosforilación del vector con la finalidad de impedir la autoligación del vector.
Se realiza usando la fosfatasa alcalina bovina de origen intestinal (CIP) o la
fosfatasa bacteriana (BAP) que elimina los grupos fosfato 5’ de una cadena de
ADN.
c. Purificación del vector. Consiste en eliminar las partículas de agarosa, los restos
de enzimas inactivadas y las sales provenientes de la reacción de digestión. En
general, se realiza empleando columnas de resinas con alta afinidad al ADN en
presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas. Esto permite una
elución de la muestra en volúmenes pequeños de agua o buffer con baja
concentración de sales. También existe la posibilidad de purificar por la técnica
fenol: cloroformo modificada, para obtener ADN plasmídico (evitando la
extracción del ADN genómico); sin embargo, presenta el inconveniente de que
para su realización consume mucho tiempo y que en general se obtiene un ADN
plasmídico de menor calidad (véase el capítulo de métodos de extracción de
ácidos nucleicos).
Otra estrategia de ligación consiste en el uso del fragmento largo de la polimerasa
(fragmento Klenow), que “rellena” los extremos cohesivos generados por cualquier
enzima y los convierte en romos. Sin embargo, los extremos romos en el vector no
dirigen la inserción, por lo que la eficiencia de clonación disminuye, como se mencionó
previamente.

Formación del ADN recombinante

La ligación de un segmento de ADN exógeno a un vector involucra la formación de
enlaces fosfodiéster entre los residuos fosfato que se localizan en los extremos 5’ de la
cadena de ADN y los residuos hidroxilo 3’. Esta unión la cataliza in vitro una enzima
denominada ligasa. Las más utilizadas son la ligasa de E. coli y la T4 ligasa de
bacteriófagos. Para la reacción de ligación existen diferentes protocolos, que
dependen del tipo de extremos generados por las enzimas de restricción.
Requerimientos para la ligación del ADN

Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona

Para su replicación, los vectores requieren encontrarse dentro de una célula, que debe
prepararse para hacerla permeable a la entrada del vector recombinante, proceso
denominado generación de células competentes. Las células competentes generalmente
son células procariotas.
El estado de competencia puede inducirse por diferentes métodos de laboratorio, y la
elección del método dependerá del procedimiento de transformación seleccionado.
Con independencia del procedimiento empleado para inducir el estado de
competencia, las células pueden almacenarse de forma indefinida sin perder su
competencia en una solución acuosa con glicerol a 10%, para impedir que al
descongelarse se lisen.
Propagación del cultivo
Esta se puede dar a través de la micropropagación a través de tejidos invitro, o a través
de injertos dependiendo del tipo de tejido a utilizar es la complejidad de la técnica y de
la tecnología necesaria para llevarla a cabo.

Detección y Selección de clones recombinantes

Para identificar las bacterias transformadas se utilizan marcadores de selección
proporcionados por los vectores. Los más utilizados son los genes de resistencia a
antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina.
Después de la transformación, las bacterias se siembran en cajas petri con agar
suplementado con el antibiótico, para el cual el plásmido es resistente. Si la
transformación ha sido exitosa las bacterias serán capaces de metabolizar el antibiótico
y vivirán, lo que indicará que incorporaron el vector; cada colonia representa un solo
evento de transformación. Otros marcadores de selección se basan en la producción de
moléculas fluorescentes o bien en la producción de enzimas que, al reaccionar con un
sustrato, producen coloración en la colonia de células transformadas.
Conclusión
La técnica del ADN recombinante permite obtener determinadas características
deseables en ciertos organismos mediante la inserción de pedazos de ADN dentro de
plásmidos, que permitirán después ser introducidos en organismos que le permitan al
AND recombinado multiplicarse, esta técnica biotecnológica representa uno de los más
grandes avances para la biotecnología en distintas áreas, no sólo la alimenticia, puesto
que permite obtener alimentos más nutritivos, más duraderos, aumenta su producción,
así como la de fármacos mediante por ejemplo la modificación de bacterias que
produzcan algún compuesto de interés farmacéutico, y brinda una alternativa a
problemas que tal vez desde otro punto de vista no se pueden solucionar, moviendo la
economía y llegando con el objetivo de la biotecnología: el de satisfacer las
necesidades humanas con ayuda de la ingeniería genética y por medio de organismos
vivos.

Referencias
 Berger  S.L., Kimmel  A.R. Guide to molecular cloning techniques. methods in
enzymology, Vol. 152. Londres: Academic Press, 1987:161 –522.
 Orozco  G. Genética y biomedicina molecular. Noriega Limusa, Colección de
Textos Politécnicos, Serie Biotecnologías.
 Sambrook  J., Fritsch  E.F., Maniatis  T. Molecular cloning: a laboratory manual,
3a ed. Vol 1. Nueva York: CSHL Press, 2001.
 Surzycki  S. Basic techniques in molecular biology. DNA Cloning general
considerations, Capítulo 13; DNA cloning experimental procedures, Capítulo 14.
Berlín, Heidelberg: Springer-Verlag, 2000:298 –319, 339-347, 352-373.