UNIVERSIDAD DE SEVILLA

FACULTAD DE BIOLOGÍA

Programa de doctorado de Biología integrada

Departamento de Biología vegetal y Ecología
TESIS DOCTORAL

BIOTECNOLOGÍA APLICADA AL RICINO (Ricinus communis L.)

PARA SU USO COMO BIOFACTORÍA.

Doctorando:
Alfonso Jesús Sánchez Álvarez

Tutor:
Dr. José Antonio Monreal Hermoso

Directores:
Dr. Joaquín J. Salas Liñán
Dra. Noemí Ruiz López
 Trabajo presentado para optar al grado de Doctor por el Graduado
Alfonso Jesús Sánchez Álvarez

Fdo. Alfonso Jesús Sánchez Álvarez

V˚B˚

El tutor:
Dr. José Antonio Monreal Hermoso
Profesor Titutarde Universidad de Sevilla

Fdo. Dr. José Antonio Monreal Hermoso

Los Directores

Dr. Joaquín J. Salas Liñán Dra. Noemí Ruíz López

Científico titular Investigadora Ramón y Cajal
Instituto de la Grasa (CSIC) Universidad de Málaga

Fdo. Dr. Joaquín J. Salas Liñán. Fdo. Dra Noemí Ruíz López

Sevilla, Marzo de 2019

A mis hermanos, a mis padres y a Inma.
 Si soy sincero, nunca pensé que llegaría el final de este trabajo. Si finalmente lo he logrado
ha sido gracias a todas las personas que nombraré a continuación, a quienes les debo la tesis y
muchísimo más.
Para empezar, me gustaría agradecer a mis directores de tesis, Joaquín Salas y Noemí Ruiz,
todo el empeño, interés, el trabajo y el entusiasmo en el proyecto. A Joaquín le agradezco su
forma de ser, el respeto mostrado día a día, el apoyo, las palabras de afecto y ánimo y el
enorme interés por el proyecto. A Noemí, le doy las gracias por sentar las bases del proyecto,
por seguir apoyándome desde Málaga, por sus sabias palabras en los momentos más críticos y,
sobre todo, por los ánimos que nunca se ha cansado de dar.
Gracias también a Rafael Garcés por la extraordinaria oportunidad que me brindó y por
aportar los medios necesarios en todo momento, gracias a él hoy estoy concluyendo esta etapa
de mi vida. Siempre, le estaré agradecido.
Por supuesto, gracias a Enrique Martínez, enorme persona y mayor corazón. Gracias por
enseñarme y por guiarme cuando estaba perdido, gracias por tu apoyo y tus consejos, gracias
también por tus ideas y también gracias por esas excursiones, charlas, conferencias etc… que
me has dado la oportunidad de hacer durante mi tesis.
Gracias a los doctores Jonathan Napier y Vladimir Nekrasov, quienes permitieron el
desarrollo de mi actividad en Inglaterra y, por tanto, son partes esenciales de este trabajo.
A Eva Guzmán por aportar los conocimientos y la técnica necesaria para este trabajo y por
sean tan amable y gentil. Gracias, también a la empresa Dupont-Pioneer por poner a nuestra
disposición lo necesarios.
Gracias a José Monreal a quien ya conozco de hace tiempo, quién ha sido mucho más que
un tutor. Gracias por implicarte e interesarte, gracias por ayudarme en muchos momentos,
gracias por tu tiempo, te debo un millón de tarrinas de menudo.
A la Dra. Irene González, sin la cual, el proyecto no sería el mismo. Gracias Irene, por
tratarme de la forma en que lo hiciste en Rothamsted, eres una persona extraordinaria,
siempre estaré en deuda contigo.
Al Dr. Antonio Moreno, Antoñito de Heré, un tío válido donde los haya, una persona noble y
legal que no ha dudado en aportar sus conocimientos y sus habilidades a este proyecto.
Gracias a Mónica por ser una luchadora nata y hacerme ver cómo, al final, todos
conseguimos lo que nos proponemos.
A Arantxa y Marisol que son más grandes que la giralda, de ellas he aprendido a
manejarme en un laboratorio sin que explote y a intentar mantener el orden, gracias por los
consejos y, sobre todo, gracias por la ayuda prestada.
 A Lupe e Iván, por su diligencia a la hora de trabajar. Lupe, gracias por ser como eres de
respetuosa y educada. Gracias Iván por enseñarme los videos del Broncano y otras cosas…
Gracias a la Dra. Rosario Sánchez, por sus conocimientos en el laboratorio, por la
perfección en su trabajo y por enseñar lo que es, verdaderamente, el trabajo en ciencia.
Gracias a la Mape, Ana Mapelli Brahm, un pedazo de compañera. Perdón también por la
caña que te doy, sabes que es desde el cariño. Gracias por ser la doctoranda grande (que no
vieja) y guiarnos a mí y a Raquel por estas sendas. Sigue siendo como eres Mape, no cambies.
Como no, infinitas gracias Raquel Martins Noguerol. Raquel, eres extraordinaria, sabes
escuchar y aprender, sabes enseñar, eres correcta en el trabajo y en lo personal. Si fueras
niñera serías Mary Poppins. Gracias, porque sin ti, estos años hubiesen sido muy diferentes.
Ojalá toda persona pudiera experimentar lo que es tener una compañera como tú. Froishna.
Gracias a todo el grupo GGBLS, por formar una piña, por estar siempre dispuestos a
colaborar unos con otros. Gracias también a Lola y Mª Luisa, aunque sean de Mairena, se les
quiere.
Tengo que agradecer también, y mucho, a todo el Instituto de la Grasa. A Puri, por
ayudarnos a todos, por quererme como quiere y por ser como es conmigo y con todos. A los
conserjes, sobre todo a Ramón, por ser estupendas personas, por recibirte siempre con cariño y
tratarnos con respeto. A todos los encargados de mantenimiento que son unos cracks, y a Javi,
que siempre está ahí para echarte un cable. A Fran y Alberto, por ser tan trabajadores y por
tener tan buenas manos, sin ellos hubiese sido imposible el desarrollo del proyecto.
Gracias, como no, a mi Maribel y Mi María, los duendes del laboratorio. Gracias infinitas
por quererme de la forma en que lo hacéis, por levantar los ánimos de la planta entera, por
esos momentitos de conversación mientras pongo el cacharro. Os merecéis todo.
Gracias a mis compañeros de Fisiología Vegetal. A Cristina Echevarría por los consejos y por
tratarme siempre desde el mejor de los cariños. Gracias a Rosario Sánchez, a quien debo tanto.
A Ana Belén, por ser como es conmigo, a quien tengo tanto aprecio. A Jacinto, alcalde del Viso.
A mi compañero Guille, sin el cual sería incapaz de rellenar un papel ni hacer nada. Gracias a
Sofía, Clara, Alfredo, Alfonso… Gracias al Área de fisio vegetal, en general, por darme la
oportunidad de ser docente en la Universidad.
A todos mis compañeros de Rothamsted. Laura, Ondrej, Florian, Yoann, Richard, Mark,
Macarena, etc.…por estar a mi lado y ayudarme en todo.
A todos y cada uno de los profesores que he tenido durante toda mi formación. A aquellos
que pusieron las bases de toda mi formación y que aún sigo admirando, Asunción, Rosario,
Rafael, Alejandro, Herminia etc…Y a aquellos que supieron inculcarme la pasión por la ciencia,
a los que estaré siempre agradecido, Sonia Domenech, Sandra Lera, Pepe Jiménez, Natividad,
Maria Jesús y Encarnación.
A todos los alumnos que he tenido durante estos años, por enseñarme a enseñar y a
divulgar. Gracias a los alumnos de prácticas, sobre todo al gran Antonio Cordero, que además
de amigo, ha colaborado en gran medida al desarrollo del proyecto.
Gracias a todo el pueblo de el Viso del Alcor, por valorarme, apoyarme y quererme, ¡Viva el
Viso!
A mis amigos, Luis, Sara, Alfonso, Villa, Juanmi, Edu, Javi, Juanrri, Juanjo, Vladi, Ale, Dani,
Elena, Capote, Juampe, María, Mariola, Rosi, Mariajo, Pili etc… porque los quiero a morir.
A Miguel Ángel Gago Rico y familia, siempre, en deje shiquetito ahí.
A Jose Antonio Román, de quien he aprendido que nada es un problema en la vida.
Gracias a Rosario, Jesús y Mercedes, que me han acogido como uno más de su familia y me
han apoyado y aconsejado siempre.
Al Dr. Fco. Manuel Ocaña, por ser la primera persona que me enseñó un laboratorio. Por
estar siempre a mi lado.
A mis tías, Pura, Alfonsa, Chica y Manoli porque a ellas siempre les debo todo.
A mis primos, Mari, Antonio, Joche, Prima, Marichi, Grego, Ana y Mori. Gracias por estar
tan orgullosos de su primo pequeño, os quiero.
Gracias a mi hermano Antonio, a quien admiro y quiero. Gracias por enseñarme y guiarme
como el hermano mayor que eres, gracias a ti y a Victoria, a quien quiero, por darme a mis
Sobrinos, Mario, Uriel y Victoria.
Gracias a mi hermano Francisco, a quien debo tanto. Gracias por dejarme la bata de
laboratorio que uso, gracias por regalarme el maletín que llevo y por mil cosas más gracias a ti
y a Desi.
Gracias a mi Hermana Ana, por su amor incondicional. Gracias porque no hubiese sido
capaz de desarrollar este trabajo sin ti, sabes que por ti daría hasta mi vida. Gracias.
A mi padre, gracias por cada tostada, por cada tupper, por cada palabra, por cada euro,
por cada gesto, por cada lágrima y cada sonrisa, por estar orgulloso de sus hijos. Eres el mejor
Papá.
A mi madre, por darme la vida, por enseñarme a cribar entre lo importante y lo trivial. Por
enseñarme que todo tiene solución. Gracias por cada sabia palabra, gracias por el amor que
me has dado.
A Inma, gracias porque sin ti esta tesis no hubiese sido posible. Gracias por compartir la
carga, literalmente. Gracias por tirar cuando yo no he tirado, por confiar en mi cuando hasta ni
yo he confiado, por ser mi fuerza y mi constancia. A ti te debo el tiempo, las fuerzas y el amor.
Te quiero.

El aceite de ricino
ya no es malo de tomar.
Se administra en pildoritas
y el efecto es siempre igual.

Hoy las ciencias adelantan

que es una barbaridad
¡Es una brutalidad!
¡Es una bestialidad!

La Verbena de la Paloma, (1894)

Ricardo de la Vega.
 Este trabajo se ha realizado en el Grupo de Genética y Bioquímica y de Lípidos de semillas
del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de Productos Vegetales del Instituto de
la Grasa (CSIC). Se ha redactado en inglés un resumen de la introducción, una versión de cada
capítulo y las conclusiones, cumpliendo con los requisitos para la mención de Doctorado
Internacional.
Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto CASBIO-543
concedido dentro de la convocatoria de proyectos de excelencia del año 2012. Desde aquí se
agradece todo el apoyo y los medios proporcionados por la mencionada institución.
Además, la financiación de la estancia en el extranjero fue complementada con las ayudas
del programa europeo ERASMUS+.

Durante la tesis doctoral, el doctorando ha llevado a cabo las siguientes actividades:

Estancia en el extranjero.
Estancia de 90 días (10 de enero 2018 – 6 de abril de 2018) en el departamento de Plant
Sciences de Rothamsted Research, Harpenden, Reino Unido. Diseño y ensamblaje de
estructuras genéticas que permitan aplicar la técnica de edición genética CRISPR/Cas9 en
ricino. Directores: Dr. Jonathan Napier y Dr. Vladimir Nekrasov.

Publicaciones en revistas.
Alfonso Sánchez-Álvarez, Noemí Ruíz-López, Enrique Martínez-Force, Rafael
Garcés, Joaquín J. Salas. Agrobacterium-mediated transient gene expression in Ricinus
communis developing seeds. A first approach to make castor a chemical biofactory. Enviado
a revista.

Comunicaciones a congresos.

1. Sánchez-Álvarez, A.J. Moreno-Pérez, R. Garcés, E. Martínez-Force, Noemí Ruiz López, J.

J. Salas (2019). Genetic engineering of castor bean (Ricinus communis). Póster
presentado a la Gordon Research Conference; Texas, Estados Unidos.
 2. Alfonso Sánchez, Enrique Martínez-Force, Rafael Garcés, Guzmán E., Noemí Ruíz
López, Joaquín J. Salas (2017). Agroinfiltration in castor (Ricinus communis) fruits: a
new method for gene transient expression in castor seed. Comunicación oral en la XXII
Reunión de la sociedad española de fisiología vegetal/XV Congreso Hispano-Luso de
fisiología vegetal; Barcelona, España.

3. Alfonso Sánchez, Enrique Martínez-Force, Rafael Garcés, Noemí Ruíz López, Joaquín J.
Salas (2016). Castor plant (Ricinus communis): A biological model for production of
unusual and added-valued industrial oils. Póster presentado a la XIII Reunión de
biología molecular de plantas; Oviedo, España.

4. Ruiz-López N., Sánchez-AlvarezA.J., Martínez-Force E., Garcés R., Salas J.J (2015).
Production of Epoxy and Hydroxy Oils in Castor (Ricinus communisl Seeds: A
Sustainable Source of Added Value lndustrial Oils. Póster presentado en 7th European
Symposium on Plant Lipids

Colaboración con empresa.

Colaboración de 90 días con la empresa Dupont-Pioneer de San José de la Rinconada,
Sevilla. Colaboración para la puesta a punto del protocolo de regeneración en ricino con la Dra.
Eva Guzmán.

Docencia.
Actividad docente desarrollada en el Área de Fisiología Vegetal del departamento de
Biología Vegetal y Ecología de la Universidad de Sevilla:
1. 30 horas de docencia impartida en la asignatura Fisiología Vegetal I del Grado en
Biología. Prácticas de laboratorio. 2018
2. 30 horas de docencia impartida en la asignatura de Principios de Instrumentación y
Metodologías en Botánica y Fisiología Vegetal del Grado en Biología. Prácticas de
laboratorio. 2017
3. 10 horas de docencia impartida en las asignaturas Fisiología Vegetal I del Grado en
Biología y Fisiología Molecular de Plantas del Grado en Bioquímica. Prácticas de
laboratorio. 2016.
Divulgación científica.
1. Ponente en Café Conciencia (Fundación Desqbre): Año 2018 “Mitos y verdades sobre
los transgénicos”, Año 2017 “Transgénicos: como obtener una planta transgénica y
obtener beneficios de ella”. Año 2016 “Mitos y verdades sobre los transgénicos”.
2. Ponente en el festival Pint of Science (Fundación Desqbre): Año 2018 “Transgénicos
bajo debate científico: mitos y verdades”.
3. Entrevistas en televisión: Canal DoceTV, programa “Maullidos”, Capítulo “Tomates,
verdes, fritos”. https://www.youtube.com/watch?v=f9yqH-nuy8E&t=2268s
4. Charlas y visitas guiadas al Instituto de la Grasa, Sevilla. Entre 2015-2019
5. Charlas de divulgación científica y orientación en centros de Educación Secundaria y
Bachillerato: “Importancia de la investigación en biología vegetal: orientaciones
académicas para futuros científicos” entre 2015-2019.
 ÍNDICE
ÍNDICE GENERAL……………………………………………………..……………………………………………………………….i
ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................................... vii
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................ xi
ABREVIATURAS........................................................................................................... xiii
RESUMEN .................................................................................................................... xix
INFORME DE LOS INVESTIGADORES EXTRANJEROS. ...................................................... xxi
ÍNDICE GENERAL
I.INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1
1. RICINO. .................................................................................................................. 3
1.1. Descripción, botánica e historia. ................................................................................ 3
1.2. Descripción morfológica de la semilla de ricino. ......................................................... 4
1.3. El ricino como cultivo. ................................................................................................ 5
1.4. Componentes tóxicos del ricino. ................................................................................ 6
1.4.1. Proteínas inactivadoras de ribosomas: ricina y aglutinina. .................................. 6
1.4.2. Proteínas alergénicas: albúmina 2S. ................................................................... 7
1.4.3. Otros compuestos: ricinina. ............................................................................... 7
2. Lípidos de plantas: estructura y distribución. .......................................................... 9
2.1. Naturaleza y función de los lípidos. ............................................................................ 9
2.2. Ácidos grasos ........................................................................................................... 10
2.2.1. Definición y clasificación .................................................................................. 10
2.2.2. Nomenclatura .................................................................................................. 10
2.2.3. Estructura tridimensional ................................................................................. 11
2.2.4. Ácidos grasos más frecuentes en la naturaleza. ................................................ 11
2.2.5. Ácidos grasos inusuales con interés industrial. ................................................. 12
2.3. Acilgliceroles............................................................................................................ 15
2.1. Fosfolípidos. ............................................................................................................ 15
2.2. Glucolípidos. ............................................................................................................ 17
2.3. Esfingolípidos. ......................................................................................................... 17
2.4. Ceras. ...................................................................................................................... 17
3. Biosíntesis, modificación y almacenamiento de ácidos grasos y glicerolípidos en
plantas. ....................................................................................................................... 18
3.1. Ruta biosintética de ácidos grasos en plantas. ......................................................... 18
3.2. Modificaciones de ácidos grasos. ............................................................................. 20
3.3. Biosíntesis de ácido ricinoleico................................................................................. 21
3.4. Biosíntesis de ácido lesquerólico. ............................................................................. 22
3.5. Biosíntesis de ácidos dimorfecólico y coriólico. ........................................................ 23
3.6. Biosíntesis de ácido vernólico. ................................................................................. 24

i
 3.7. Síntesis y almacenaje triacilgliceroles en plantas. ..................................................... 24
3.7.1. Biosíntesis intraplastidial de glicerolípidos. ...................................................... 24
3.7.2. Biosíntesis extraplastidial de glicerolípidos. ...................................................... 25
3.7.3. Formación y acumulación de TAG en ricino. ..................................................... 26
4. Domesticación y mejora genética en plantas. ....................................................... 27
4.1. Domesticación por selección clásica......................................................................... 28
4.2. Obtención de variedades por mutagénesis inducida al azar. .................................... 29
4.3. OLE-1, la variedad de ricino alto oleico. ................................................................... 30
4.4. Ingeniería genética en plantas. ................................................................................ 30
4.4.1. Transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens. .................. 31
4.4.2. Silenciamiento génico en plantas. .................................................................... 35
4.4.3. Herramientas de edición genética. ................................................................... 36
5. Importancia del proyecto. .................................................................................... 41
II. OBJETIVOS ............................................................................................................... 43
III. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................ 47
1. Materiales. ........................................................................................................... 49
1.1. Material biológico y condiciones de cultivo. ............................................................. 49
1.1.1. Ricinus communis L. ......................................................................................... 49
1.1.2. Escherichia coli. ................................................................................................ 49
1.1.3. Agrobacterium tumefaciens. ............................................................................ 49
1.2. Antibióticos. ............................................................................................................ 50
1.3. Tampones y soluciones empleados. ......................................................................... 51
1.3.1. Biología molecular ........................................................................................... 51
1.3.2. Bioquímica ....................................................................................................... 53
2. Métodos. ............................................................................................................. 53
2.1. Biología molecular ................................................................................................... 53
2.1.1. Obtención de ácidos nucleicos. ........................................................................ 53
2.1.2. Estimación de la concentración de ácidos nucleicos. ........................................ 54
2.1.3. Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). ................................................. 54
2.1.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa. ...................................................... 57
2.1.5. Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa y productos de PCR.... 57
2.1.6. Tratamientos enzimáticos del ADN................................................................... 58
2.1.7. Diseño y ensamblaje de construcciones genéticas. ........................................... 59
2.2.7. Transformación de bacterias. ........................................................................... 68
2.2.8. Transformación génica de ricino mediante A. tumefaciens. .............................. 71
2.2.9. Ensayo de actividad GUS histoquímico. ............................................................ 75
2.2.10. Ensayo de actividad GUS fluorimétrico. ............................................................ 75
2.3. Técnicas bioquímicas. .............................................................................................. 76
2.3.7. Extracción de lípidos totales. ............................................................................ 76
ii
 2.3.8. Metilación de muestras.................................................................................... 76
2.3.9. Silanización de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxilados. ....................... 76
2.3.10. Análisis de la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases
(GC). 77
2.3.11. Análisis de acil-CoAs. ........................................................................................ 77
2.3.12. Producción de sustratos radioactivos ............................................................... 78
2.3.13. Metilación con diazometano ............................................................................ 83
2.3.14. Preparación de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ...................... 84
2.3.15. Experimentos de marcaje con ácidos grasos radioactivos ................................. 84
2.3.16. Fraccionamiento de los glicerolípidos en TLC y estudio de la distribución de la
radioactividad. ................................................................................................................ 85
IV. RESULTADOS .......................................................................................................... 87
Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación transitoria en ricino. .............. 89
1. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vitro de la semilla de
ricino........................................................................................................................... 89
2. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vivo de la semilla de
ricino........................................................................................................................... 90
2.1. Resultados de las pruebas preliminares. ............................................................... 90
2.2. Puesta a punto del método de agroinfiltración in vivo de la semilla de ricino. .......... 91
2.2.1. Elección del momento de infiltración y tasa de transformación. ....................... 91
2.2.2. Influencia del promotor en el nivel de expresión del marcador GUS en ricino.
Ensayo histoquímico. ...................................................................................................... 93
2.1.1. Influencia de distintos promotores en el nivel de expresión de transgenes en
ricino. Estudios estudios cuantitativos. ............................................................................ 95
Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos de la semilla de ricino vía
expresión transitoria in vivo. ....................................................................................... 97
1. Reducción del contenido en ácido ricinoleico........................................................ 97
1.1. Reducción del contenido de ácido ricinoleico mediante silenciamiento génico:
hpFAH12. ............................................................................................................................ 97
1.2. Reducción del contenido en ácido ricinoleico vía CRISPR/Cas9. .............................. 100
2. Producción de ácidos grasos hidroxilados de cadena larga: síntesis de ácido
lesquerólico. ............................................................................................................. 103
3. Producción de ácidos grasos epoxidados en semillas de ricino. ........................... 105
Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación
estable. Generación de plantas transgénicas. ............................................................ 109
1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. ... 109
1.1. Ensayo de eficiencia de transformación de embriones mediante SAAT. ................. 109
1.2. Puesta a punto de un protocolo de regeneración estable....................................... 110
1.2.1. Imbibición de la semilla de ricino: un aspecto fundamental en la germinación del
embrión. 110
1.2.2. Protocolo de transformación-regeneración directa. ....................................... 111
1.2.3. Protocolo de transformación-regeneración adventicia. .................................. 115
iii
 1.3. Evaluación del protocolo del protocolo de transformación-regeneración directa. .. 117
2. Análisis de los transformantes. ........................................................................... 118
2.1. Análisis de plantas transformadas con pCambia 1305.1. ........................................ 118
2.1.1. Análisis genético mediante PCR...................................................................... 119
2.1.2. Análisis de composición, peso y rendimiento de las semillas. ......................... 120
2.2. Análisis de las plantas estables transformadas con pCambia::hpFAH12. ................. 121
2.2.1. Análisis genético mediante PCR...................................................................... 122
2.2.2. Peso y distribución de las semillas. ................................................................. 123
2.2.3. Análisis genético de las semillas. .................................................................... 124
2.2.4. Composición de ácidos grasos y rendimiento. ................................................ 124
2.2.5. Obtención de la primera generación (T1). ...................................................... 127
2.3. Análisis de plantas modificadas con CRISPR/Cas9................................................... 127
2.3.1. Plantas con el gen de la hidroxilasa de ricino como diana para CRISPR/Cas9. . 127
2.4. Plantas con el gen de la ricina como diana para CRISPR/Cas9. ................................ 133
2.4.1. Análisis genético. ........................................................................................... 134
Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a glicerolípidos en
microsomas de ricino................................................................................................. 137
1. Metabolismo de ácido oleico .............................................................................. 137
2. Metabolismo de ácido ricinoleico ....................................................................... 139
3. Metabolismo del ácido lesquerólico. .................................................................. 140
4. Metabolismo del ácido coriólico. ........................................................................ 142
5. Incorporación en triglicéridos con los distintos precursores. ............................... 143
V. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 145
Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación transitoria en ricino. ............ 147
1. Transformación del fruto de ricino mediante agroinfiltración. ............................ 147
2. Elección de momento de infiltración para la transformación transitoria in vivo de
las semillas de ricino y tasa de transformación. ......................................................... 148
4. Estudio cuantitativo de la expresión inducida por distintos promotores en
endospermo de ricino. ............................................................................................... 150
Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos de la semilla de ricino vía
expresión transitoria in vivo. ..................................................................................... 153
1. Reducción del contenido de ácido ricinoleico...................................................... 153
1.1. Aplicación de la técnica de ADN antisentido mediante la expresión de hpFAH12. .. 153
1.2. Silenciamiento de FAH12 mediante la técnica CRISPR/Cas9. .................................. 154
2. Producción de ácido lesquerólico. ...................................................................... 156
3. Expresión de la epoxigenasa de Stokesia laevis. .................................................. 157
Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación
estable. Generación de plantas transgénicas. ............................................................ 159
1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable. ... 159
1.1. Transformación del embrión de ricino. .................................................................. 159

iv
 1.2. Selección de transformantes mediante la selección con higromicina...................... 159
1.3. Presencia de cefotaxima e higromicina en el medio de cultivo. .............................. 160
1.4. Comparación con otros protocolos de transformación estable en ricino. ............... 161
2. Obtención de transformantes. ............................................................................ 163
2.1. Ensayo de control. transformación del ricino con pCambia 1305.1. ........................ 163
2.2. Supresión de la hidroxilasa mediante tecnología antisentido. Transformación con
pCambia::hpFAH12 y obtención de la primera generación................................................. 163
2.2.1. Características de la planta............................................................................. 163
2.2.2. Características de las semillas ........................................................................ 164
2.2.3. Obtención de la primera generación (T1) de plantas transgénicas para hpFAH12.
165
2.3. Supresión de la hidroxilasa mediante la técnica CRISPR/Cas9. ................................ 166
2.3.1. Características de la planta obtenida. ............................................................. 166
2.3.2. Características de la semilla. .......................................................................... 166
2.4. Planta modificada vía CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina y homólogos como diana.
167
Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a glicerolípidos en
microsomas de ricino................................................................................................. 169
1. Incorporación de ácido oleico. ............................................................................ 170
2. Incorporación de ácido grasos hidroxilados. ....................................................... 170
2.1. Incorporación de ácido ricinoleico. ........................................................................ 170
2.2. Incorporación de ácido lesquerólico. ..................................................................... 171
2.3. Incorporación de ácido coriólico. ........................................................................... 171
2.4. Incorporación en TAG de los diferentes precursores .............................................. 172
VI. CONCLUSIONES .................................................................................................... 173
VII. ENGLISH VERSION ............................................................................................... 179
Brief Introduction. ..................................................................................................... 181
Chapter 1 summary: Development of a transient transformation method in castor bean.
181
1. Transformation of developing castor endosperm. ............................................... 181
2. Optimization of the agroinfiltration timing. ........................................................ 182
3. Studies of transformation rate. .......................................................................... 182
4. Testing promoters via qPCR and fluorimetric GUS assay. .................................... 183
Chapter 2 summary: Changes in castor bean fatty acid composition vía transient
expression in vivo. ..................................................................................................... 184
1. Ricinoleic acid decrease through FAH12 hydroxylase silencing. ........................... 184
2. Ricinoleic acid decrease through CRISPR/Cas9 technology. ................................. 184
3. Transient transformation with the condensing enzyme elongase from Lesquerela
fedleri. ...................................................................................................................... 185
4. Transient transformation with Stokesia laevis epoxigenase ................................ 186

v
Chapter 3 summary: Development of a transformation/regeneration method for castor
plant. Production of stable transgenic plants. ............................................................ 187
1. Development of a transformation/regeneration method for castor plant. .......... 187
1.1. Castor embryo transformation and use of antibiotics............................................. 187
1.2. Transformation and regeneration of transformed embryos. .................................. 187
1.3. Generated stable transgenic lines. ......................................................................... 189
1.3.1. Transgenic pCambia 1305.1 plant................................................................... 189
1.3.2. Transgenic pCambia 1305.1::hpFAH12 plant. ................................................. 189
1.3.3. Transgenic pCambia 1305.1::Cas9 FAH12 plant. ............................................. 190
1.1.1. Modified CRISPR/Cas9 ricin gen plant............................................................. 191
Chapter 4 summary: Studies of metabolism of hydroxylated fatty acids different to
ricinoleic ................................................................................................................... 193
Conclusions. .............................................................................................................. 194
Figures & Tables. ....................................................................................................... 198
VIII. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 229
VIX. ANEXOS.............................................................................................................. 235
Anexo I.............................................................................................................................. 237
Anexo II............................................................................................................................. 239

vi
 ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Dibujo de las partes de la planta de ricino................................................................... 3
Figura 2. Corte dorsal (A) y lateral (B) de la semilla de ricino ..................................................... 4
Figura 3. Estadios de desarrollo de la semilla de ricino. ............................................................. 4
Figura 4. Distribución mundial de cultivo de ricino. ................................................................... 5
Figura 5. Producción de semilla de ricino. ................................................................................. 6
Figura 6. Estructura química de la ricinina. ................................................................................ 8
Figura 7. Ejemplos de estructura de distintos tipos de ácidos grasos ....................................... 11
Figura 8. Estructura del ácido ricinoleico. ................................................................................ 13
Figura 9. Estructura química del ácido lesquerólico. ................................................................ 13
Figura 10. Estructura química del ácido vernólico ................................................................... 14
Figura 11. Estructura química del ácido dimorfecólico ............................................................ 14
Figura 12. Estructura química del ácido coriólico. .................................................................... 15
Figura 13. Ejemplos de las estructurasde distintos acilgliceroles ............................................. 16
Figura 14. Ejemplo de la estructura química de la parte gliceroacílica de un fosfolípido. ......... 17
Figura 15. Reacciones de la sintasa de ácidos grasos. En el proceso existen tres puntos clave. 19
Figura 16. Síntesis de linoleato (A) y ricinoleato (B). ................................................................ 21
Figura 17. Cambios en la composición de ácidos grasos en la semilla de ricino durante su
desarrollo.. ............................................................................................................................. 22
Figura 18. Esquema general de síntesis de ácidos grasos inusuales. ........................................ 23
Figura 19. Esquema de la síntesis y almacenamiento de triacilgliceroles. ............................... 26
Figura 20. Metabolismo de diferentes acil-PC marcados radiactivamente en microsomas de
girasol, ricino y Crepis palaestina. ........................................................................................... 27
Figura 21. Fases de la domesticación en maíz.......................................................................... 29
Figura 22. Esquema del sistema d edición genética CRISPR/Cas9............................................. 40
Figura 23. Comparación de las secuencias nucleotídicas que codifican para la Δ12 hidroxilasa y
la Δ12 desaturasa de ricino. .................................................................................................... 59
Figura 24. Esquema de la secuencia genética hpFAH12 insertada en el plásmido pMBLT. ....... 60
Figura 25. Estructura final del plásmido pCambia1305.1::hpFAH12 ......................................... 61
Figura 26. Esquema del plásmido final pCambia1305.1::LfKCS3............................................... 61
Figura 27. Ensamble del gen SlEPX mediante Loop Assembly. ................................................. 65
Figura 28. Ensamblaje del promotor U6 junto con la guía 1 para Cas9 mediante la técnica de
Loop Asembly.. ........................................................................................................................ 67
Figura 29. Ensamblaje del promotor U6 junto con la guía 2 para Cas9 mediante Loop Assembly.
............................................................................................................................................... 68
Figura 30. Ensamblaje final del gen Cas9 junto con el promotor, el terminador y las dos guías
bajo el promotor U6 utilizando la técnica de Loop Asembly. ................................................... 69
Figura 31. Fotografía del momento de infiltración en el fruto de ricino. .................................. 72
Figura 32. Ciclo de reacciones aplicado para la elongación en un carbono de un ácido graso. . 80
Figura 33. Preparación de ácido coriólico a partir de ácido linoleico. ....................................... 83
Figura 34. Semillas transformadas in vitro mediante A. tumefaciens asistido por sonicación. .. 90
Figura 35. Resultado preliminar de la infiltración in vivo del fruto de ricino. ............................ 91
Figura 36. Tasa de abortos de la semilla en función del momento de infiltración. ................... 92
Figura 37. Tasa de transformación en semillas no abortadas utilizando el método de
agroinfiltración in vivo............................................................................................................. 93
Figura 38. Resultado del ensayo GUS histoquímico para semillas infiltradas mediante
agroinfiltración in vivo. ........................................................................................................... 94
Figura 39. Resultados actividad de la β-glucuronidasa (GUS) y expresión de RNA medidos en la
semilla. ................................................................................................................................... 96
Figura 40. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::hpFAH12 ............................... 98
Figura 41. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1.................................... 98

vii
Figura 42. Composición del aceite de las semillas transformadas transitoriamente con pCambia
1305.1 y pCambia::hpFAH12 .................................................................................................. 99
Figura 43. Semillas transformadas con la construcción pCambia::CRISPR FAH12 ................... 100
Figura 44. Gel de agarosa que muestra los resultados de la reacción de PCR para la
amplificación del gen que codifica para la proteína Cas9. ...................................................... 101
Figura 45. Ensayo GUS histoquímico de las semillas transformadas con pCambia::CRISPR
FAH12. .................................................................................................................................. 101
Figura 46. Resultado del análisis de composición de ácidos grasos para las semillas
transformadas con pCambia 1305.1, pCambia::hpFAH12 y pCambia::CRISPR FAH12. ............ 102
Figura 47. Expresión de los genes que codifican la enzima LfKCS3 y GUS en semillas de ricino
transformadas. ..................................................................................................................... 103
Figura 48. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::LfKCS3. ................................ 104
Figura 49. Composición de ácidos grasos en semillas transformadas con pCambia::LfKCS3 y
pCambia 1305.1.. .................................................................................................................. 104
Figura 50. Composición del conjunto de acil-CoAs durante el desarrollo de la semilla de ricino.
............................................................................................................................................. 105
Figura 51. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1::SlEPX::hpFAH12. ...... 106
Figura 52. Análisis de composición de ácidos grasos para semillas transformadas con
pCambia::SlEPX::hpFAH12 y pCambia 1305.1. ....................................................................... 107
Figura 53. Resultado del ensayo GUS histoquímico en embriones de ricino transformados
empleando el método de transformación con agrobacterium asistida por ultrasonidos (SAAT).
............................................................................................................................................. 110
Figura 54. Esquema del método de transformación-regeneración directa para ricino............ 112
Figura 55. Necrosis producida por exceso de higromicina. .................................................... 114
Figura 56. Explantos supervivientes hasta la etapa de enraizamiento tras la exposición a
higromicina durante 2 o 4 semanas en la fase de propagación .............................................. 115
Figura 57. Esquema del método de transformación-regeneración adventicia. ....................... 116
Figura 58. Media de supervivientes en cada etapa. ............................................................... 118
Figura 59. Evolución de las plantas transformadas con pCambia1305.1 obtenidas mediante
transformación-regeneración directa. ................................................................................... 119
Figura 60. Producto de PCR de cada planta transformada con pCambia1305.1. .................... 120
Figura 61. Resultados de composición y rendimiento para las plantas transgénicas
transformadas con pCambia1305.1. ...................................................................................... 120
Figura 62. Distribución del peso de las semillas de plantas WT y transgénicas transformadas
con pCambia 1305.1 ............................................................................................................. 121
Figura 63. Medias del peso de las semillas de plantas WT y transformadas con pCambia 1305.1.
............................................................................................................................................. 121
Figura 64. Evolución de la planta transformada con pCambia::hpFAH12. .............................. 122
Figura 65. Análisis PCR para determinar la presencia de hpFAH12 en la planta estable.......... 122
Figura 66. Distribución del peso de las semillas obtenidas de la planta transformada con
pCambia::hpFAH12.. ............................................................................................................. 123
Figura 67. Diferencias entre las medias de los grupos de semillas G1 y G2 procedentes de la
planta transgénica para pCambia1305.1::hpFAH12. .............................................................. 124
Figura 68. Prueba de PCR para determinar si las semillas obtenidas son transgénicas. .......... 124
Figura 69. Análisis de composición y rendimiento en las semillas obtenidas a partir de la planta
transformada con pCambia::hpFAH12. .................................................................................. 125
Figura 70. Correlaciones encontradas en las semillas transgénicascon pCambia::hpFAH12.... 126
Figura 71. Evolución de las plantas transformadas con pCambia::hpFAH12 obtenidas de la
planta transgénica madre. .................................................................................................... 127
Figura 72. Test de PCR para confirmar la presencia de pCambia::hpFAH12 en la primera
generación de de la progenie del transformante. ................................................................. 127
Figura 73. Planta modifica con CRISPR/Cas9 con la hidroxilasa de ricino como diana. ............ 128

viii
Figura 74. Esquema de los sitios de restricción para las dianas Cas9 del gen de la hidroxilasa de
ricino. ................................................................................................................................... 129
Figura 75. Productos de PCR obtenidos en la planta modificada con CRIPSR/Cas9 para el gen de
la hidroxilasa de ricino. ......................................................................................................... 129
Figura 76. Mutaciones generadas en el gen de la hidroxilasa de la planta de ricino mediante
CRISPR/Cas9. ........................................................................................................................ 130
Figura 77. Distribución del peso de las semillas obtenidas de la planta transformada con
pCambia::CRISPR FAH12. ...................................................................................................... 131
Figura 78. Medias de los grupos G1 y G2 de la planta transgénica con la estructura génica
hpFAH12 y para la planta modificada con CRISPR/Cas9 contra el gen de la hidroxilasa………..132
Figura 79 Datos de composición de las semillas obtenidas de plantas transgénicas para
pCambia1305.1, pCambia::hpFAH12, y pCambia::CRISPR FAH12 (A). ..................................... 133
Figura 80. Plantas modificadas mediante CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina como diana. ... 134
Figura 81. Esquema del sitio de corte para Cas9 en el gen de la ricina. .................................. 135
Figura 82. Productos de PCR obtenidos en las plantas con el gen de la ricina modificado
mediante CRISPR/Cas9.. ........................................................................................................ 135
Figura 83. Mutación generada en la planta 2 modificada con CRISPR/Cas9 en el gen de la ricina.
............................................................................................................................................. 136
Figura 84. Incorporación de ácido oleico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de
microsomas de semillas de ricino en desarrollo..................................................................... 138
Figura 85 Incorporación de ácido ricinoleico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte
de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ............................................................... 140
Figura 86. Incorporación de ácido lesquerólico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por
parte de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ...................................................... 141
Figura 87. Incorporación de ácido coriólico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte
de microsomas de semillas de ricino en desarrollo. ............................................................... 143
Figura 88. Incorporación de diferentes ácidos grasos a la fracción de triacilglicéridos por
microsomas de ricino. ........................................................................................................... 144

ix
x
 ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Ácidos grasos más comunes en los lípidos de reserva de las plantas. ......................... 12
Tabla 2. Ejemplos de genes mutados mediante selección clásica............................................. 28
Tabla 3. Genotipo de la estirpe XL1-Blue MRF´. ....................................................................... 49
Tabla 4. Genotipo de A. tumefaciens. ...................................................................................... 50
Tabla 5. Sencuencias de los brazos de hpFAH12. ..................................................................... 60
Tabla 6. Dianas de Cas9 seleccionadas para el gen de la hidroxilasa de ricino y la ricina. ......... 66
Tabla 7. Perfil del gradiente utilizado para el análisis de acil-CoA. ........................................... 78
Tabla 8. N° de embriones germinados in vitro ....................................................................... 110
Tabla 9. Presencia de contaminación por Agrobacterium en función de la concentración de
cefotaxima. ........................................................................................................................... 113
Tabla 10. Supervivencia de embriones de ricino en función de la concentración de higromicina.
............................................................................................................................................. 114
Tabla 11. N° de explantos supervivientes en cada etapa siguiendo el protocolo de
transformación-regeneración directa optimizado.................................................................. 117
Tabla 12. Velocidades iniciales de incorporación de distintos ácidos grasos en triacilglicéridos
(TAG) por parte de microsomas de semillas de ricino. ........................................................... 144

xi
xii
 ABREVIATURAS
A. UNIDADES

Unidades de Concentración
M, Molar
g/L, Gramos por litro
mg/mL, Miligramos por mililitro
v/v, Volumen/volumen
p/v, Peso/volumen
Bq/mmol, GigaBéquerel por milimol
Kat, katal mol/L
mM, Milimolar (10-3M)
μM, Micromolar (10-6M)

Unidades de Longitud
cm, Centímetro
m, Metro
MHa, Millones de hectáreas
mm, Milímetro
nm, Nanómetro
μm, Micrómetro

Unidades de Volumen
L, Litro
mL, Mililitro
μL, Microlitro

Unidades de Peso
g, Gramo
mg, Miligramo
MT, Millones de toneladas
μg, Microgramo

Unidades de tiempo
h, Hora
min, Minuto
s, Segundo

Otras Unidades
%, Porcentaje
˚C, Grado centígrado
Da, Daltons
DO, Densidad óptica
E, Einstein (1 mol de fotones)
g, Aceleración de la gravedad
Hz, Hercios
Kb, Kilobase (1000 pb)
mEq, miliequivalentes
Pa, Pascales
pb, Pares de bases de nucleótidos

xiii
rpm, Revoluciones por minuto
V, Voltios
W, Vatios
gFW, grams fresh weight, gramos de peso fresco
pkat, picokatal

B. OTRAS ABREVIATURAS

ACCasa, Acetil-CoA carboxilasa

ACP, Proteína trasportadora de acilos
ADP, Adenosina difosfato
Amp, Ampicilina
ATP, Adenosina-5’-trifosfato
BA, bencilaminopurina
CaMV 35S, promotor 35S del virus del mosaico del tabaco
Cas9, CRISPR associated protein 9
cDNA, DNA complementario
CoA, Coenzima A
CoASH, Coenzima A mostrando el grupo funcional sulfhidrilo
CPT, Colina fosfato transferasa
CRISPR, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
Ct, Ciclo umbral (en Q-PCR)
DAI, Days after injection: días después de la inyección
DAP, Days after polination; días después de la polinización
DGAT, Diacilglicerol acil-CoA aciltransferasa
DNA, Ácido desoxirribonucleico
dNTPs, Desoxinucleótidos trifosfato
DTT, Ditiotreitol
EDTA, Ácido etilendiaminotetraacético
FAS I, Complejo ácido graso sintetasa I
FAS II, Complejo ácido graso sintetasa II
FATA, Tioesterasa de ácidos grasos A
GA, ácido giberélico
GC, Cromatografía gaseosa
gDNA, DNA genómico
GPAT, Glicerol-3-fosfato acil-CoA transferasa
GUS, β-glucuronidasa
HPLC, Cromatografía líquida de alta presión
Hyg, Higromicina
IAA, ácido indolacético
IBA, ácido indolbutírico
IPTG, Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
IUPAC, International Union of Pure and Applied Chemistry
Kan, Kanamicina
KAR, β-cetoacil-ACP reductasa
KAS, β-cetoacil-ACP sintasa
Km, Constante de Michaelis-Menten (Afinidad por sustrato)
LACS, Lisofosfatidilcolina acil-coA sintetasa
LB, Medio de Luria Bertani
LPAAT, Lisofosfatidato acil-CoA aciltransferasa
LPC, Lisofosfatidilcolina
LPCAT, Lisofosfatidilcolina acil-coA transferasa
MCAT, Malonil-CoA:ACP transacilasa
xiv
MES, Ácido 2-(N-morfolin)etanosulfónico
Mili-Q, Agua ultrapura de tipo 1
mRNA, RNA mensajero
NAD, Nicotinamida adenina dinucleótido oxidado
NADH, Nicotinamida adenina dinucleótido reducido
NADP, Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado
NADPH, Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido
NOS-t, nopaline synthase gene terminator
ODS, Oleato desaturasa
PA, Ácido fosfatídico
PAGE, Electroforesis en gel de poliacrilamida
PAP, Fosfatidato fosfatasa
PC, Fosfatidilcolina
PCR, Reacción en cadena de la polimerasa
PDAT, Fosfolípido diacilglicerol aciltransferasa
PDCT, Fosfatidil colina diacilglicerol fosfocolina transferasa
pGly, Promotor de la glicinina de soja
pH, Potencial de hidrógeno
PLD/PLC, Fosfolipasas D ó C
Q-PCR, PCR cuantitativa
RNA, Ácido ribonucleico
SAD, Estearato desaturasa o estearil-ACP desaturasa
SD, Desviación estándar
SDS, Dodecil sulfato sódico
T0, generación de plantas transgénicas obtenidas por transformación del embrión
T1, plantas transgénicas obtenidas a través de la autofecundación de T0
TAG, Triacilglicerol
TDZ, thidiazuron
TE ,Acil-ACP tioesterasas
TEMED, N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina
Tet, Tetraciclina
Tm ,Temperatura de hibridación
TRIS, (hidroximetil)aminometano
U, Unidades
USDA, United States Department of Agriculture
UV, Ultravioleta
X-Gal, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
X-GlcA, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronido

C. ORGANISMOS
A. thaliana, At Arabidopsis thaliana
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
C. melo, Cucumis melo
C. palaestina, Crespis palaestina
C. purpurea, Claviceps purpurea
D. sinuata, Dimorphoteca sinuata
E. coli, Escherichia coli
E. lagascae, Euphorbia lagascae
F. vesca, Fragaria vesca
G. max, Glycine max
H. annuus, Ha Helianthus annuus
H. benghalensis, Hiptage benghalensis
N. benthamina, Nicotiana benthamina
xv
O. sativa, Oryza sativa
P. fendlerei, Physaria fendelerei
R. communis Ricinus communis
S. laevis, Stokesia laevis
S. lycopersicum, Solanum lycopersicum
T. aestivum, Triticum aestivum
V. galamensis, Vernonia galamensis
Z. mays, Zm Zea mays

D. AMINOÁCIDOS
Código (1 letra) Código (3 letras) Aminoácido
A Ala Alanina
R Arg Arginina
N Asn Asparagina
D Asp Aspartato
C Cys Cisteína
Q Gln Glutamina
E Glu Ácido glutámico
G Gly Glicina
H His Histidina
I Ile Isoleucina
L Leu Leucina
K Lys Lisina
M Met Metionina
F Phe Fenilalanina
P Pro Prolina
S Ser Serina
T Thr Treonina
W Trp Triptófano
Y Tyr Tirosina
V Val Valina

E. MARCADORES GENÉTICOS USADOS EN LAS CEPAS DE A. tumefaciens

Abreviatura Descripción
RecA Mutación en un gen responsable para la recombinación general de
DNA.
rifR Marcador de resistencia a rifampicina
carbR Marcador de resistencia a carbonicilina
pTiBo542DT Tipo de plásmido Ti
Mop+ Uso de manopina como señal para la infección de la célula vegetal.

F. MARCADORES GENÉTICOS USADOS EN E. coli

Abreviatura Descripción
mcrA, mcrCB o mrr Mutaciones que permiten la metilación del DNA que no ha sido
reconocido como foráneo;
xvi
 hsd Nombre genérico de endonucleasas de E. coli
hsdSB (rB-mB-) Permite la clonacion de DNA sin la necesidad de escisión, mediante
endonucleasas endógenas.
endA Mutación en la endonucleasa no específica I, elimina la actividad
endonucleasa no específica. .
supE Supresor del RNA transferente de glutamina de ámbar (supE) (UAG)
thi-1 Requiere tiamina para crecer en medio mínimo
recA Mutación en un gen responsable para la recombinación general de
DNA.
gyrA96 Mutante de la DNA girasa produce resistencia al ácido nalidíxico
relA1 relA (ATP:GTP 3'-pyrophosphotransferase).
El locus relA regula el acoplamiento entre la transcripción y la
traducción.
lacI Codifica el represor lac que controla la expresión de promotores que
llevan un operador lac; el IPTG se une al represor lac y quita al
represor del promotor.
proAB Requiere prolina para crecer en un medio mínimo
Tn10 Confiere resistencia a tetraciclina por medio de un trasposón
TetR Marcador de resistencia a tetraciclina
F’ Plásmido auto trasmisivo y de baja copia usado para generación de
ADN monocatenario cuando se infectó con el fago M13; puede
contener un marcador de resistencia que permita el mantenimiento
y normalmente llevará los genotipos lacI y LacZΔM15

xvii
xviii
 RESUMEN
El ricino (Ricinus communis L.) es una planta que produce un aceite único, enriquecido en más
del 90% en ácido ricinoleico (12-hidroxioleato). Esta composición convierte al aceite de ricino en un
aceite apto para diversos usos industriales. Además, el aceite de ricino comprende hasta el 50-60%
del peso de la semilla, siendo uno de los cultivos de semilla oleaginosa de mayor rendimiento. El
cultivo de ricino puede llegar a tener productividades de hasta 3000 kg/ha. Sin embargo, es
necesario reducir al mínimo el contenido de proteínas tóxicas como la ricina. Este proyecto de
doctorado pretende demostrar que la semilla de ricino es una excelente plataforma para la síntesis
de otros ácidos grasos especiales, como los ácidos grasos epoxi o ácidos grasos hidroxi de cadena
larga. Para este propósito, hemos desarrollado métodos para transformar (de forma estable y
transitoria) las semillas de ricino. Estos métodos nos han permitido transformar las semillas de ricino
para producir ácido lesquerólico, silenciar su gen de hidroxilasa (FAH12) y producir algunas líneas
que podrían tener cantidades menores de ricina y otras toxinas.
Se ha desarrollado un método de transformación transitoria de la semilla de ricino in vivo a
través de agroinfiltración del fruto de ricino. Mediante este método se ha podido evaluar la
expresión del marcador GUS regulado por distintos promotores. Además, esta técnica ha permitido
probar diferentes construcciones genéticas en las semillas de ricino.
Así, mediante agroinfiltración transitoria se comprobó una reducción de la cantidad de ácido
ricinoleico en la semilla de ricino mediante el uso de dos técnicas diferentes. La reducción de ácido
ricinoleico sirvió como prueba para demostrar la modificación genética en ricino, además, la
reducción de este compuesto es necesaria para la síntesis posterior de otros ácidos grasos de
interés. Las técnicas usadas para la reducción del ácido ricinoleico fueron el silenciamiento génico
de la hidroxilasa mediante el uso de una estrucutra en hairpin, hpFAH12, y mediante el uso de la
tecnología CRISPR/Cas9 de edición genética. El descenso de ácido ricinoleico vino acompañado de
un aumento de ácido linoleico, hecho no observado en la variedad de ricino alto oleico, OLE-1. Los
niveles de ácido ricinoleico fueron del 50% para hpFAH12 y del 40% para CRISPR/Cas9.
Por otra parte, se consiguió un aumento significativo de la cantidad de ácido lesquerólico en la
semilla de ricino mediante la sobreexpresión de la enzima elongasa de Lesquerella fendelerei,
LfKCS3, de manera transitoria. A pesar de que el aumento fue significativo, la cantidad de ácido
lesquerólico no superó el 0.6% de la composición de la semilla. Este hecho se atribuyó a la baja
disponibilidad de ricinoleic-CoA, sutrato de LfKCS3, en el conjunto de acil-CoA de la semilla.
También se transformó transitoriamente la semilla con la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis,
aunque en ningún momento se detectó la formación de ácidos grasos epoxidados.
Además de la transformación transitoria, se optimizaron métodos de transformación estable
mediante los cuales se han llegado a obtener plantas de ricino transgénicas.

xix
 Se han producido plantas transformadas nuclearmente con el plásmido pCambia1305.1 que se
usaron como control. La composición del aceite de las semillas de estas plantas no reveleron
cambios, algo lógico, ya que pCambia1305.1 no portaba ningún gen que pueda afectar la
composición de ácidos grasos de la semilla.
También se obtuvieron plantas transgénicas transformadas con hpFAH12, construcción para el
silenciamiento del gen de la hidroxilasa (FAH12). Algunas de las semillas obtenidas (T0) mostraron
unos niveles de ácidos ricinoleico del 50% aproximadamente, una reducción importante si tenemos
en cuenta que una planta salvaje cuenta con un 90% de este compuesto. Además, las semillas se
dividieron en dos grupos en función de su peso y se observó una correlación lineal entre el peso de
la semilla el contenido en ácido ricinoleico. Esta correlación fue exponencial entre la cantidad de
aceite de la semilla y el contenido en ácido ricinoleico. La cantidad de aceite de las semillas fue baja.
Los embriones de las semillas analizadas se germinaron in vitro para obtener la siguiente
generación de plantas transgénicas (T1).
Además de la estructura hpFAH12, se usó la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr una reducción
de este ácido graso en plantas modificadas de manera estable. Las plantas modificadas mediante
CRISPR/Cas9, mostraron una serie de mutaciones en el gen FAH12 que repercutieron en una caída
de la cantidad de ácido ricinoleico. Estas semillas mostaron un 40% de ácido ricinoleico, una
reducción aún mayor que con hpFAH12. Al igual que con hpFAH12, la reducción de ácido ricinoleico
vino acompañada de un aumento de ácido linoleico. La cantidad de aceite de las semillas también
fue baja.
Para reducir la cantidad de toxinas en la semilla, se usó la técnica CRISPR/Cas9 para generar
mutaciones en la toxina ricinica y en toxinas homólogas. Se obtuvo una planta con el gen de la
ricina mutado. En cuanto se obtengan semillas de esta planta, se analizarán para verificar una
disminución de la toxicidad de la misma.
Finalmente, se llevaron a cabo estudios bioquímicos de asimilación de precursores por parte de
la semilla de ricino. Se comprobó la capacidad de incorporación de la semilla de ácidos grasos
hidroxilados al cuerpo de triacilgliceroles (TAG). El ácido ricinoleico, como ya se esperaba, tuvo una
velocidad mayor de incorporación directa a TAG seguido del ácido lesquerólico. El ácido oleico, no
hidroxilado, mostró una cinética menor y una incorporación a lípidos polares precedida de la
incorporación a TAG.

xx
 INFORME DE LOS INVESTIGADORES EXTRANJEROS.

Con el fin de obtener la mención de doctorado internacional, se realizó una parte del proyecto
durante 3 meses en Rothamsted Research, Reino Unido. Durante la estancia, se diseñaron y
ensamblaron las estructuras génicas para la apliación de la herramienta CRISPR/Cas9 para la edición
genética.
El Dr. Jonathan Napier, llevó a cabo la tutorización del proyecto durante la estancia. El Dr.
Vladimir Nekrasov aportó todas las estructuras génicas necesarias. La ayuda de ambos
investigadores fue esencial para el desarrollo del proyecto.
Los informenes de ambos investigadores se adjuntan a continuación.

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xxii
xxiii
xxiv
20th March 2019

To whom it may concern

The doctoral thesis entitled “BIOTECHNOLOGY APPLIED TO CASTOR BEAN PLANT (Ricinus
communis) TO BE USED AS A BIOFACTORY” by Alfonso J. Sánchez Álvarez is a proof‐of‐
concept study, which is testing the potential of castor bean as a biotechnological platform for
producing special fatty acids, such as epoxy or long hydroxy fatty acids.
Over the course of the project, the author has successfully developed a novel efficient
transient expression method for castor bean that enabled him to quickly express various
transgenes in castor bean seeds. As a result, he managed to demonstrate that it was possible
to bring down the levels of ricinoleic acid by silencing the FAH12 gene as well as to increase
levels of lesquerolic acid via ectopic expression of LfKCS3.
Another great novel element in the study is application of the CRISPR/Cas system for the
purpose of targeted mutagenesis in castor bean. The author successfully assembled
CRISPR/Cas‐expressing constructs using the Golden Gate cloning method. He then
expressed the constructs in castor bean using the transient and stable transformation
procedures he had developed during the project. The author successfully demonstrated
presence of CRISPR/Cas‐induced mutations in FAH12 and the gene encoding the ricin
toxin. Importantly, the significantly lower levels of ricinoleic acid in the fah12 CRISPR/Cas
mutant line, as compared to the wild type, were consistent with the similar phenotype the
author observed in transgenic lines expressing the hpFAH12 construct.

Overall, the author presents significantly novel methodological developments, particularly in

terms of tools for gene function studies and reverse genetics, in castor bean. These findings
will certainly facilitate adoption of this crop as a biosynthesis platform.

Sincerely yours,

Vladimir Nekrasov, PhD

Research Scientist
Plant Sciences Dept.

Rothamsted Research
E‐mail: vladimir.nekrasov@rothamsted.ac.uk

Office tel.: +44 (0) 1582 938 292

xxv
 I.INTRODUCCIÓN

1
 Introducción

1. RICINO.

1.1. Descripción, botánica e historia.

El ricino (Ricinus communis L.) es una planta perteneciente a la familia Euphorbiaceae. Los
nombres vernáculos más comunes en español son Higuerilla, Higuereta y Tártago. El nombre
del género Ricinus ya fue usado por Plinio en su obra Naturalis Historia y se debe al parecido
físico entre la semilla de la planta y la garrapata de la oveja mediterránea (Weiss, 1983). Fue
Linneo quien lo clasificó y describió en su obra Species plantarum (1753).
El primer registro del uso de esta especie se remonta al antiguo Egipto dónde se empleaba
como combustible para lámparas. Tradicionalmente el aceite de ricino se ha usado como
laxante, purgante y para el tratamiento de la piel. Las hojas de ricino también se pueden
utilizar como alimento para gusanos de seda (Weiss, 1983; Bonjean, 1991).
El ricino es un arbusto monoico con hojas palmatilobadas, el color del arbusto puede variar
de tonos verdes a rojizos según la variedad. Las inflorescencias de tipo panícula pueden ser
terminales o axilares con las flores femeninas en la zona superior y las masculinas en la
inferior. El fruto es una cápsula ligeramente
surcada, rojiza antes de la maduración con
tubérculos dorsales, cada fruto contiene tres
semillas, en ocasiones, cuatro (Figura 1)
(Valdés, 1987).

El genoma del ricino es 2n=20 y está

secuenciado a partir de la unión de 28500
segmentos que conforman una secuencia
total con un tamaño de 350Mb. El tamaño
del genoma diploide estimado es de 420Mb,
lo que indica que aún existen zonas sin
secuenciar. (Chan et al., 2010) (KEW, 2011)
.

Figura 1. Dibujo de las partes de la planta de ricino.

3
 Introducción

1.2. Descripción morfológica de la semilla de ricino.

Las semillas de ricino son lisas, pardas, con manchas blancas-grisáceas, carúncula cónica
verdosa al principio del desarrollo y amarilla al final. El peso de la semilla de ricino puede variar
entre 350-500mg en la variedad IN-15, usada en este proyecto (Figura 2). El ricino puede
acumular en su semilla alrededor de un 60% en peso de aceite, cuya composición de ácidos
grasos muestra que el 85-90% aproximadamente es ácido ricinoleico si bien se ha desarrollado
anteriormente un mutante de ricino con alto contenido en ácido oleico (>75 % de oleico y
menos del 20 % de ricinoleico) (Rojas et al., 2004).

A B

Figura 2. Corte dorsal (A) y lateral (B) de la semilla de ricino adaptado de Sachs, 1882.

La descripción de los estadios en la maduración del fruto y la semilla varían en la

bibliografía, no obstante, podemos definir al menos ocho etapas después de la polinización
(DAP) (Greenwood & Bewley, 1982; Baldoni et al., 2010; Venegas et al., 2016). En estos ocho
estadios la semilla aumenta su tamaño y el endospermo se va desarrollando en su interior, a
medida que se va formando este último la semilla va acumulando aceite y proteínas de reserva
(Figura 3).

Figura 3. Estadios de desarrollo de la semilla de ricino. Adaptado de Venegas et al., 2016.

4
 Introducción

1.3. El ricino como cultivo.

El ricino posee una serie de características que la convierten en una planta de especial
interés agronómico. Su cosecha resulta fácil dado que su inflorescencia aparece pronto y en el
eje apical cuando la planta tiene una altura de no más de un metro y es una planta de ciclo
corto, algo de interés desde el punto de vista de la producción. Presenta una gran resistencia a
la desecación y posee una elevada productividad. Además puede cultivarse como planta anual
o como cultivo arbóreo (Scholz & Nogueira, 2008).
El ricino es una especie originaria de Etiopía (Reed, 1976), las precipitaciones anuales en su
lugar de origen rondan entre los 200 a 4290 mm y la temperatura media anual es 7 a 27.8°C,
además, cuenta con una gran capacidad de adaptación y crece en climas tropicales y
subtropicales con una resistencia importante a periodos de aridez. No obstante, tiene especial
sensibilidad a heladas fuertes sobre todo en los primeros estadios de desarrollo.
El cultivo de ricino se reparte principalmente entre Asia, Sudamérica y África. En Europa
apenas se cultiva, a excepción de una pequeña producción en Italia y Europa del Este
(Rumanía, Hungría y Bulgaria) (FAOSTAT, 2018) (Figura 4).

Figura 4. Distribución mundial de cultivo de ricino. La gran mayoría del cultivo de ricino se concentra
en India. (Fuente: FAOSTAT, 2018)

En la India, ricinopaís con la máxima producción de ricino, ésta alcanzó un pico máximo en
2004 de 1.964.000 toneladas (Figura 5). Actualmente este país posee una aventajada
producción de 1.554.000 toneladas seguida por Mozambique, China y Brasil (Figura 5).

5
 Introducción

Figura 5. Producción de semilla de ricino. FAOSTAT.

El aceite de ricino es de gran interés por sus propiedades físico-químicas, siendo

demandado por las industrias farmacéutica y cosmética. Además, ricinopuede emplearse
como materia prima para la síntesis de polímeros, la producción de bioplásticos, biodiesel ,
base para lubricantes industriales y para la fabricación de pinturas y recubrimientos (Patel et
al., 2016).

1.4. Componentes tóxicos del ricino.

1.4.1. Proteínas inactivadoras de ribosomas: ricina y aglutinina.
Sin duda, una desventaja en el cultivo y el procesado de esta planta es la presencia de
proteínas tóxicas en su semilla, las más conocidas son la ricina y la aglutinina, que pertenecen
a una familia mayor denominadas proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP). En esta especie
existen 28 genes diferentes que codifican a estas proteínas, incluyendo el gen de la ricina, la
aglutinina y otros posibles pseudogenes (Chan et al., 2010). De esos 28 genes, 6 codifican
proteínas con actividad inactivadora de ribosomas de los cuales el gen de la ricina
(XM_002534603) seguido del gen de la aglutinina (XM_002534174) son los que mayor nivel de
expresión presentan en la semilla a partir de los 20-30 DAP. La homología entre los 6 genes
citados puede variar entre el 51% y el 93%, siendo la más alta la existente entre la ricina y la
aglutinina. Estas dos proteínas presentan un tamaño aproximado de 35 kDa y, sin embargo,
diferentes actividades a pesar de su alta homología. La actividad inactivadora de ribosomas de
la ricina es mucho mayor que la de la aglutinina, la cual posee una mayor actividad aglutinante
de eritrocitos (Loss-Morais et al., 2013).

6
 Introducción

La ricina representa el 5% de la proteína total de la semilla de ricino, está compuesta por

576 aminoácidos de los cuales los 35 primeros componen el péptido señal para su transporte
al retículo endoplásmico. La ricina es una RIP de tipo II dado que se divide en dos subunidades:
la subunidad A con 267 aminoácidos y la B de 262 aminoácidos, unidas por 12 aminoácidos
que actúan como secuencia de enlace o linker. La subunidad A alberga al dominio de unión al
ribosoma encargándose de su inactivación mientras la subunidad B presenta el dominio de
unión a la membrana de la célula permitiendo la internalización de la subunidad A dentro de la
misma. Se han descrito hasta 3 isoformas diferentes de ricina con un peso variable de entre
60-65 KDa. En su forma nativa, la ricina suele ir asociada a la aglutinina (Sehgal et al., 2010;
Severino et al., 2012).
La dosis letal de la ricina es DL50 es de 3µg/Kg por vía respiratoria y 30 µg/kg por ingestión
(Sook-Kyung et al., 2006). Su baja dosis letal ha posibilitado su uso como arma biológica y en
bioterrorismo. En los últimos 30 años la ricina se ha usado en un total de 9 atentados, el más
famoso fue el asesinato del disidente búlgaro Gueorgui Markov en Londres en 1978, a quien
supuestamente el KGB inyectó una dosis letal de ricina con la punta de un paraguas. El caso
más reciente ha sido en septiembre de 2018 en el que se envió una carta con ricina al
pentágono.
La supresión de la familia de genes que codifican las proteínas con actividad inhibidora de
ribosomas y sobre todo de la ricina es un aspecto de esencial para la explotación comercial
ricinode esta especie.

1.4.2. Proteínas alergénicas: albúmina 2S.

La albúmina 2S se sintetiza a partir de un gen de 776pb que codifica un precursor
compuesto por 258 aminoácidos. Este precursor produce dos albúminas heterodiméricas
distintas conocidas como RicC1 y RicC3 de 12 y 15 kDa respectivamente. La expresión de la
albúmina 2S se localiza en la semilla y se produce a partir de los 20 días después de la
polinización. Esta proteína es capaz de generar una respuesta alérgica considerable, algo que
ha de considerarse durante el cultivo y la manipulación del ricino. (Severino et al.; 2012).

1.4.3. Otros compuestos: ricinina.

La ricinina es un alcaloide encontrado en todos los tejidos de la planta y detectado en los
estadios más tempranos de la formación de la semilla (Figura 6). Este compuesto puede
detectarse en las hojas jóvenes, aunque desaparece con la senescencia. El contenido de
ricinina puede variar según el órgano, de 2,3-33g/kg en hojas, 10g/kg en flores, 7g/kg en raíz y
3g/kg en raíces (Severino et al., 2012) .

7
 Introducción

La ricinina es un compuesto estimulante del sistema nervioso central que mejora la

memoria en dosis bajas (Ferraz et al., 2000) aunque puede ser letal en dosis altas, con una
DL50 de 3g/kg por ingestión. Una intoxicación por ricinina se caracteriza por perdida de
equilibrio, incapacidad para caminar, temblores y salivación.
Este compuesto puede resultar tóxico para diversas especies de insectos y nematodos por
lo que tiene cierto interés como pesticida natural.
Además, la presencia de ricinina en la orina se ha usado como biomarcador para posibles
casos de envenenamiento por ricina.
Afortunadamente, la baja toxicidad de la ricinina y la posibilidad de ser degrada tras
periodos de fermentación hacen que ésta no afecte al cultivo y explotación del ricino.

Figura 6. Estructura química de la ricinina. (Hamelin et al., 2012).

8
 Introducción

2. Lípidos de plantas: estructura y distribución.

2.1. Naturaleza y función de los lípidos.
Clásicamente, los lípidos se han definido como la fracción de los seres vivos soluble en
disolventes orgánicos. Más recientemente se han buscado definiciones más rigurosas, como la
de Christie (Christie, 1987), que los define como un grupo de sustancias conformadas por los
ácidos grasos, sus derivados y las sustancias relacionadas biosintéticamente o funcionalmente
con ellos. Éstos son constituyentes esenciales de la célula viva y componen un grupo químico
variado y heterogéneo. Generalmente presentan un alto grado de insolubilidad en agua
siendo, en cambio, fácilmente solubles en disolventes orgánicos, que son empleados para
extraerlos de las células y los tejidos.
Al igual que en el resto de seres vivos, los lípidos desempeñan importantes funciones
biológicas en las plantas (Harwood, 1996):

i) Poseen un papel estructural fundamental, ya que son los componentes básicos de las
membranas, que actúan como barreras delimitando tanto las células como los
compartimentos celulares. Asimismo, en estas membranas tienen lugar importantes funciones
para la célula como la captación de luz, las reacciones de transporte de electrones o la
generación de ATP.
ii) Sirven como material de reserva. Las especies vegetales oleaginosas acumulan lípidos en
la semilla o el fruto, generalmente en forma de triacilgliceroles (TAG), que sirven para
alimentar al embrión durante la germinación y constituyen una importante materia prima
tanto en la industria alimentaria como química.
iii) Además están implicados en la regulación de procesos biológicos fundamentales, como
la transducción de señal, actuando como precursores en la síntesis de hormonas como el ácido
jasmónico y de segundos mensajeros como el inositol fosfato, la fotoprotección, la
modificación post-traduccional de proteínas, el reconocimiento celular, la especificidad de
especie, la inmunidad de los tejidos y la adaptación al frío;
iv) Y en último lugar, cabe destacar su función protectora en la superficie de muchas
plantas, formando parte de las ceras, la cutina y la suberina.

9
 Introducción

2.2. Ácidos grasos

2.2.1. Definición y clasificación
Los ácidos grasos son biomoléculas orgánicas formadas por una cadena hidrocarbonada
larga y lineal que contiene generalmente un número par de átomos de carbono en plantas, y
un grupo carboxilo terminal (Coultate, 1996). Son compuestos insolubles en agua y ricos en
energía. Se clasifican según:
- La longitud de la cadena:
Ácidos grasos de cadena corta: 4-6 carbonos.
Ácidos grasos de cadena media: 8-12 carbonos.
Ácidos grasos de cadena larga: 14-18 carbonos.
Ácidos grasos de cadena muy larga: 20 o más carbonos.

- El número y posición de los dobles enlaces:

Saturados: no presentan ningún doble enlace, siendo moléculas lineales (Figura 7A).
Insaturados: tienen un doble enlace (monoinsaturados) o más de un doble enlace
(poliinsaturados). Los dobles enlaces suelen ser de configuración cis, y cuando hay más de uno,
suelen estar separados al menos por un grupo metileno, es decir, no presentan conjugación.

2.2.2. Nomenclatura
Los ácidos grasos se pueden nombrar de diferentes formas. La mayoría de ellos tienen un
nombre común, además, todos ellos se pueden nombrar mediante la nomenclatura
sistemática y la abreviada (Tabla 1). La nomenclatura sistemática sigue las reglas adoptadas
por la IUPAC, donde se indica la longitud de la cadena y el número, posición y configuración de
los dobles enlaces contando el número de átomos de carbono a partir del grupo carboxilo (Δ).
En la nomenclatura abreviada, el ácido graso se simboliza por dos números separados por
dos puntos, indicando el primero la longitud de la cadena y el segundo el número de dobles
enlaces. A continuación, se indica la posición en la que se encuentra el doble enlace, ya sea
contando el número de átomos de carbono a partir del grupo carboxilo (Δ) o a partir del grupo
metilo terminal (n o ω). Finalmente, se indica la configuración cis (c) o trans (t) del doble
enlace.

10
 Introducción

2.2.3. Estructura tridimensional

Como se muestra en la (Figura 7B), los dobles enlaces con isomería cis (B) introducen
ángulos en las cadenas hidrocarbonadas, afectando con ello a sus propiedades físicas como,
por ejemplo, el punto de fusión. No sucede lo mismo con los dobles enlaces en configuración
trans (Figura 7C), que no introducen más que una pequeña irregularidad en la cadena, lo que
supone un cambio menor en las propiedades físico-químicas del compuesto y su
comportamiento es más parecido al de los ácidos grasos saturados (Figura 7A). Por ejemplo, el
ángulo que introduce el doble enlace cis en la molécula del ácido oleico, hace que su punto de
fusión baje desde 69°C del ácido esteárico hasta los 16°C. El doble enlace trans, sin embargo,
no distorsiona tanto la molécula, por lo que, el punto de fusión del ácido elaídico se mantiene
en 44°C.

Figura 7. Ejemplos de estructura de distintos tipos de ácidos grasos. A) Ácido esteárico, B) Ácido oleico,
C) Ácido elaídico.

2.2.4. Ácidos grasos más frecuentes en la naturaleza.

Los ácidos grasos se encuentran principalmente como componentes fundamentales de los
lípidos, mientras que en estado libre (no esterificados) sólo aparecen en pequeñas cantidades.
En la naturaleza existe una gran diversidad de ácidos grasos, pero no todos tienen la misma
importancia. Aunque se han aislado unos 300 tipos distintos de ácidos grasos, los más
comunes sólo tienen entre 12 y 22 átomos de carbono (Tabla 1).
Los ácidos grasos considerados mayoritarios constituyen, en la mayoría de los casos, más
del 95 % de los ácidos grasos totales en una planta y, son el ácido palmítico, esteárico, oleico,
linoleico y α-linolénico (Harwood, 1979).

11
 Introducción

Tabla 1. Ácidos grasos más comunes en los lípidos de reserva de las plantas.
NOMBRE COMÚN NOMBRE SISTEMÁTICO NOMBRE ABREVIADO

LÁURICO Dodecanoico 12:0

MIRÍSTICO Tetradecanoico 14:0
PALMÍTICO Hexadecanoico 16:0
PALMITOLEICO Cis-9-hexadecanoico 16:1 Δ9
ESTEÁRICO Octadecanoico 18:0
OLEICO Cis-9-octadecanico 18:1 Δ9
LINOLEICO Cis,cis-9,12-octadecenoico 18:2 Δ9,12
ALFA-LINOLÉNICO Cis,cis,cis-9,12,15 octadecatrienoico. 18:3 Δ3,6,9
GAMMA-LINOLÉNICO Cis,cis,cis-6,9,12-octadecatrienoico 18:3 Δ6,9,12
ARAQUÍDICO Eicosanoico 20:0
GONDOICO Cis-11-icosenoico 20:1 Δ9
BEHÉNICO Docosanoico 22:0
ERÚCICO Cis-13-docosenoico 22:1 Δ9
LIGNOCÉRICO Tetracosanoico 24:0

2.2.5. Ácidos grasos inusuales con interés industrial.

Además de los ácidos grasos mencionados existen otros con estructuras poco frecuentes,
característicos de determinados grupos o especies vegetales. Estos ácidos grasos presentan
dobles enlaces en posiciones poco comunes, triples enlaces, ramificaciones, sustituyentes
como grupos hidroxilo, epóxido, anillos de ciclopropeno, etc. Algunos de ellos son de interés
para el sector industrial por sus propiedades físico-químicas como lubricantes, base para
pinturas y recubrimientos, como base para la síntesis de polímeros etc. A continuación, se
describen algunos (Napier, 2007):

I) Ácido ricinoleico: como ya se ha mencionado, el ácido ricinoleico es el componente

mayoritario del aceite de ricino constituyendo el 85-90% del aceite, este ácido también se ha
detectado en el hongo Claviceps purpurea. Está formado por 18 carbonos, una insaturación en
la posición Δ9 en cis y un grupo hidroxilo (OH) en el carbono Δ12. El nombre sistemático es
ácido 12-Hidroxi-9-cis-octadecenoico (Figura 8) (Mensah et al., 2018)

12
 Introducción

Figura 8. Estructura del ácido ricinoleico.

II) Ácido lesquerólico: se encuentra en la semilla de las plantas del género Physaria
anteriormente denominado Lesquerella, género que otorgó el nombre al compuesto. Éste
ácido forma parte de entre un 40-50% del aceite de la semilla de este género de plantas. El
interés industrial de este ácido graso es similar al del ricinoleico, con la diferencia de que los
dos carbonos de más le confieren propiedades físicas diferentes y posibilitan la síntesis de
derivados químicos de mayor longitud. Su nombre sistemático es ácido 14-Hidroxi-11-cis-
icosenoico (Figura 9) (Smith et al., 1961).

Figura 9. Estructura química del ácido lesquerólico.

III) Ácido vernólico: este ácido graso inusual se encuentra en las semillas plantas de la
familia de las Asteraceas, en los géneros Stokesia, Vernonia y Crepis, también en plantas de la
familia de las Euforbiáceas en especies como Euphorbia lagascae (Kleinman et al., 1965) y
Bernardia pulchellla (Splitzer et al., 1996). En todas estas plantas el ácido vernólico puede
representar desde el 50% al 90% del total de ácidos grasos de la semilla. (Cahoon et al., 2002).
Es un ácido con un grupo epóxido en la posición Δ12, su nombre sistemático es 12-Epoxy-9-cis-
octadecenoico. El ácido vernólico se usa en la industria química como precursor para la
fabricación de resinas, pegamentos, barnices, pinturas, recubrimientos y para la síntesis de
ciertos plásticos, por lo que el ácido vernólico puede imponerse como una alternativa
renovable para la fabricación de estos componentes (Figura 10).

13
 Introducción

Figura 10. Estructura química del ácido vernólico

IV) Ácido dimorfecólico: se encuentra en semillas de plantas del género Dimorfoteca, se

trata de un ácido graso hidroxilado en la posición Δ9, que cuenta con 18 carbonos, pero
presenta dos dobles enlaces conjugados con conformación trans en las posiciones Δ10 y Δ12
que lo convierten en un ácido graso muy inusual. Su nombre sistemático es ácido 9-Hidroxi-
10,12-trans, trans-octadecanoico (Figura 11) (Cahoon et al., 2004).

Figura 11. Estructura química del ácido dimorfecólico

V) Ácido coriólico: se encuentra mayoritariamente en semillas de las especies del género

Coriaria. Este ácido graso presenta el grupo hidroxilo en la posición Δ13 y presenta dos dobles
enlaces conjugados en las posiciones Δ9 y Δ11 en conformación cis/trans. En Coriaria
myrtifolia puede alcanzar un 67% de la composición de ácidos grasos de la semilla.
Sistemáticamente es llamado ácido 9-cis, 11-trans-13-hidroxioctadecanoico (Figura 12) (Liang
et al., 2017).

14
 Introducción

Figura 12. Estructura química del ácido coriólico.

2.3. Acilgliceroles.
Los acilgliceroles, también llamados grasas neutras, son glicerolípidos compuestos por una
molécula de glicerol esterificada por uno, dos o tres ácidos grasos (Figura 13). Son solubles en
disolventes apolares y su densidad es más baja que la del agua.
En los monoacilgliceroles (MAG) hay un solo ácido graso esterificado a la molécula de
glicerol en las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3. Existen, por tanto, tres formas isoméricas: los 1(3)-
MAG y los 2-MAG. Los diacilgliceroles (DAG) tienen esterificadas dos posiciones con dos ácidos
grasos (1,2-DAG, 2,3-DAG y 1,3-DAG; Figura 13). Los 1,2-DAG de configuración L se han
descrito como importantes intermediarios del metabolismo, mientras que los 2,3-DAG y los
1,3-DAG sólo se encuentran en trazas (Stobart et al., 1997).
Los triacilgliceroles (TAG) tienen esterificadas las tres posiciones del glicerol. Pueden existir
TAG simples si los tres ácidos grasos son iguales o compuestos si son diferentes. Los TAG son
los componentes principales de los aceites vegetales y determinan las propiedades de estos.

2.1. Fosfolípidos.
Los fosfolípidos son glicerolípidos que presentan una molécula de ácido fosfórico en la
posición sn-3 en lugar de un ácido graso. Son de gran importancia ya que son los componentes
mayoritarios de las bicapas lipídicas que forman las membranas celulares.
El ácido fosfórico se encuentra esterificado al esqueleto de glicerol en el grupo hidroxilo
sn-3, mediante un enlace fosfoéster. Esto leconfiere una región polar, convirtiendo al
fosfolípido en una molécula con un marcado carácter anfipático (Figura 14).

15
 Introducción

Figura 13. Ejemplos de las estructurasde distintos acilgliceroles

El fosfolípido más simple sería el ácido fosfatídico (PA) que no presenta ninguna molécula
esterificada al grupo fosfato. Este compuesto es un importante intermediario en la biosíntesis
de fosfolípidos y TAG. Entre los compuestos que se forman a partir del PA se encuentran la
fosfatidilcolina (PC), la fosfatidiletanolamina (PE) y la fosfatidilserina (PSer) que contienen un
alcohol aminado en la cabeza polar del PA. La PC y la PE son los fosfolípidos más abundantes
en las plantas, dando cuenta de más del 50% del total de los mismos. Cabe destacar también el
fosfatidilinositol (PI) que presenta una molécula de inositol esterificada al grupo fosfato y que
desempeña un papel muy importante en la transducción de señales en las células vegetales
(Dörmann, 2005).

16
 Introducción

Figura 14. Ejemplo de la estructura química de la parte gliceroacílica de un fosfolípido. Los sustituyentes
más comunes en la posición X son la N,N,N-trimetiletanolamina o colina, la etanolamina, el glicerol, el
aminoácido serina o el polialcohol inositol. El fosfatidato, derivado donde no existe sustituyente en la
posición X, también es un componente común de esta familia de compuestos.

2.2. Glucolípidos.
Los glucolípidos son otra clase de glicerolípidos que presentan un azúcar esterificado en la
posición sn-3 del glicerol. Dentro de este grupo destacan el monogalactosildiacilglicerol
(MGDG) y el digalactosildiacilglicerol (DGDG) que presentan una molécula de galactosa o dos
en la posición sn-3 del glicerol. Éstos dos compuestos son los componentes mayoritarios de las
membranas cloroplásticas. (Block et al., 2013)

2.3. Esfingolípidos.
Los esfingolípidos son componentes de membranas de las células eucariotas y de algunas
bacterias, además, intervienen como mensajeros secundarios en procesos de proliferación
celular, apoptosis e inmunidad.
Se forman a partir de la unión de una molécula de serina con palmitil-coA para formar 3-
ketoesfinganina que se reduce para formar la esfinganina con la ayuda de la enzima
ketoesfinganina reductasa.
En plantas, a diferencia de animales y levaduras, la molécula de esfinganina puede
contener grupos hidroxilos e instauraciones en la cadena hidrocarbonada. (Sperling, 2003).

2.4. Ceras.
Las ceras son ésteres de ácidos grasos con alcoholes primarios de cadena larga, también
llamados alcoholes grasos. Las ceras son muy insolubles en agua y forman parte de las
cubiertas de hojas y frutos, tienen función protectora e impermeabilizante (Koch et al., 2008).

17
 Introducción

3. Biosíntesis, modificación y almacenamiento de ácidos grasos y glicerolípidos en

plantas.
3.1. Ruta biosintética de ácidos grasos en plantas.
La síntesis inicial de ácidos grasos en plantas tiene lugar en los plastidios de los órganos no
fotosintéticos y en los cloroplastos de los órganos fotosintéticos (Ohlrogge y Jaworski, 1997).
En los órganos heterótrofos como las semillas, la fuente de carbono para la misma son
carbohidratos que se importan a la célula y de degradan en el citosol a través de la ruta
glucolítica. El piruvato resultante de esta ruta es importado a los plastidios, donde es
descarboxilado por el complejo piruvato descarboxilasa para dar lugar a acetil-CoA, el sillar
fundamental de la síntesis de los ácidos grasos. (Harwood, 2005).
El primer paso metabólico específico de la ruta de síntesis de ácidos grasos es la activación
del acetil-CoA por parte de la enzima acetil-CoA carboxillasa (ACC), que cataliza la
condensación de acetil-CoA con una molécula de bicarbonato para formar malonil-CoA, una
molécula de tres carbonos (Sasaki & Nagano, 2004). Posteriormente la molécula malonil-CoA
formará malonil-ACP, paso catalizado por la enzima malonil-CoA transacilasa (MCAT)
(Harwood, 2005; Figura 15).
A continuación, el complejo ácido graso sintasa (FAS, Fatty Acid Synthase) llevará a cabo la
elongación del malonil-ACP en sucesivos pasos de condensación-reducción-deshidratación-
reducción. Las enzimas que conforman el complejo FAS son la β-cetoacil-ACP sintasa (KAS), la
3-oxoacil-ACP reductasa (KAR), la hidroxiacil-ACP dehidratasa (DH) y la enoil-ACP reductasa
(ENR) (Li-beisson et al., 2010; Figura 15):
I) Condensación inicial: Es llevada a cabo por la enzima KAS III y tiene lugar entre el
malonil-ACP y el acetil-CoA. Se formará el 3-cetobutiril-ACP (4:0-ACP) (Jaworski et
al., 1989).
II) Reducción: La enzima KAR formará 3-hidroxiburiril-ACP a partir de cetobutiril-ACP
(Slabas et al., 1991).
III) Deshidratación: La enzima DH generará trans-2-butenoil-ACP a partir del 3-
hidroxibutiril-ACP (Brown et al., 2009).
IV) Reducción: La enzima ENR finalmente sintetizará el butiril ACP que será el sustrato
para un nuevo ciclo (Fawcett et al., 1994).

Aunque la enzima KAS III es la responsable de la condensación inicial, es la enzima KAS I la

que lleva a cabo las elongaciónes entre 4 y 16 carbonos mediante la adición sucesiva de
moléculas de malonil-CoA. Finalmente, la molécula de palmitoil-ACP (16:0-ACP) puede
elongarse a estearil-ACP (18:0-ACP) por la acción de la KAS II.

18
 Introducción

Además, pueden producirse insaturaciones intraplastidiales. El estearil-ACP generado

puede ser sustrato de la estearil-ACP desaturasa (SAD), enzima específica de plantas, y se
producirá el oleil-ACP (18:1-ACP), que presenta un doble enlace en la posición delta 9 de la
cadena carbonada del ácido graso (Figura 15) (Shanklin and Somerville, 1991).

Figura 15. Reacciones de la sintasa de ácidos grasos. En el proceso existen tres puntos clave. La primera
reacción de condensación llevada a cabo por la KASIII donde el malonil-ACP y el acetil-CoA se condesan.
La segunda reacción llevada a cabo por la KASI en la la que tras varias reducciones y una deshidratación
se forma palmitoil-ACP. La tercera reacción, en la que se forma estearil-ACP a partir de palmitoil-ACP,
es llevada a cabo por la enzima KASII (Harwood et al., 2005).

Una vez sintetizados, los ácidos grasos pueden alimentar la síntesis de glicerolípidos
intraplastidiales a través de aciltransferasas específicas que dan lugar a lo que se ha
denominado como la ruta procariótica de síntesis de glicerolípidos (Somerville & John, 1991).
Los acilos que formarán parte de los lípidos de reserva o componenentes de otras membranas
celulares son, en cambio, exportados fuera del plastidio, a través de la llamada ruta
eucariótica, que es la que se seguirá de aquí en adelante. Las enzimas encargadas de este paso
19
 Introducción

de exportación son las acil-ACP tioesterasas. Actualmente, se encuentran descritas dos

tioesterasas diferentes, FATA y FATB. Las tioesterasas son proteínas homodiméricas
codificadas por genes nucleares. Las tioesterasas de tipo A u oleoil-ACP tioesterasas presentan
una gran especificidad por el 18:1-ACP mientras que las de tipo B tienen mayor afinidad por los
ácidos grasos saturados (Jones, 1995).
Los ácidos grasos libres exportados son rápidamente convertidos en los correspondientes
acil-CoA por la acción de la enzima sintetasa de acil-CoA de cadena larga (LACS),
incorporándose al conjunto citosólico de acil-CoAs (Bates et al., 2013).

3.2. Modificaciones de ácidos grasos.

Las modificaciones que experimentan los ácidos grasos una vez exportados del plastidio
están fuertemente relacionadas con el elevado intercambio de acilos que existe entre el
conjunto de acil-CoAs y la PC. Así, los grupos acilo de los acil-CoA pueden incorporarse a la
posición sn-2 de la lisofosfatidilcolina (LPC) mediante la acción de la lisofosfatidilcolina
aciltransferasa (LPCAT) para formar las moléculas de PC que conforman las membranas del
retículo endoplasmático. Este rápido intercambio de acilos entre dichas especies de lípidos
hace que la renovación de ácidos grasos de los lípidos de membrana sea continua (Bates et al.,
2013).
Las principales modificaciones que experimentan las cadenas carbonadas sintetizadas de
novo son desaturaciones sucesivas, que experimenta el oleato incorporado a la posición sn-2
de la PC. Las elongaciones por encima de los 18 átomos de carbono, sin embargo, tienen lugar
sobre ésteres de CoA en el retículo endoplásmico. (Bates et al., 2013). Las desaturaciones son
catalizadas de manera sucesiva por las enzimas FAD2 y FAD3, las cuales producen linoleato y
linolenato, en una reacción dependiente del suministro de equivalentes de reducción en forma
de NADH, que intervienen en la reacción a través del citocromo b5. El oxígeno atmosférico
también interviene en la reacción como sustrato, siendo el último aceptor del hidrógeno que
se elimina de las cadenas carbonadas y del proveniente del NADH. Estas reacciones poseen
una especificidad de substrato y producto extremadamente alta, dando lugar a linoleato y
linolenato a partir de oleato de manera exclusiva (Kumar et al., 2012) (Figura 16A;18).

20
 Introducción

Figura 16. Síntesis de linoleato (A) y ricinoleato (B). La enzima FAD2 produce linoleato a partir de oleato mientras la
enzima FAH12 cataliza la formación de ricinoleato. Ambas enzimas usan el citocromo b5 como transportador de
electrones.

3.3. Biosíntesis de ácido ricinoleico.

La enzima responsable de la síntesis de ácido ricinoleico es una Δ12-hidroxilasa (FAH12),
enzima que presenta una gran similitud a las FAD2 y FAD3 de retículo descritas en el apartado
anterior, siendo de la misma familia y presentando un mecanismo de reacción muy similar
(Figura 16B). Se han descrito hidroxilasas similares en otras especies como Hiptage
benghalensis o Claviceps purpurea que también acumulan ácidos grasos hidroxilados en sus
semillas. Al igual que la FAD2, la FAH12 actúa sobre el oleato esterificado en la posición sn-2 la
PC (18:1-PC), produciendo las cadenas de acilos hidroxiladas que posteriormente serán
canalizadas y almacenadas en los TAG (Figura 18). El contenido en ácido ricinoleico va
aumentando a medida que el endospermo se va desarrollando en la semilla hasta alcanzar
aproximadamente un 80-90% del total de ácidos grasos (Figura 17).
Tanto la enzima FAD2 como la FAH12 son proteínas alojadas en la membrana del retículo
endoplásmático (Sperling et al., 2003) y comparten un origen filogenético común. Ambas
enzimas contienen un sitio activo con dos átomos de hierro y tres cajas de histidina (H(X)3-4H,
H(X)2-3HH Y H/Q(X)2-3HH) (Shanklin & Cahoon, 2002), las cajas de histidina conforman dominios
conservados en todas las enzimas desaturasas, hidroxilasas y epoxigenasas.

21
 Introducción

Figura 17. Cambios en la composición de ácidos grasos en la semilla de ricino durante su desarrollo. Ell
proceso de síntesis y acumulación de ácido ricinoleico en la semilla de ricino tiene lugar a partir de los 20-
30DAP, momento en el que comienza a acumularse más aceite. Adaptado de Venegas et al., 2016.

Como ya se ha mencionado, ambas enzimas, tanto la FAD2 como la FAH12, están

estrechamente emparentadas y poseen una homología del 67%. La hidroxilasa de ricino es una
secuencia de 387 aminoácidos con un tamaño aproximado de 44kDa mientras que la FAD2
posee 383 aminoácidos (Van de Loo et al., 1995). Las secuencias de DNA genómico que
codifican éstas proteínas presentan un único intrón que se encuentra en el extremo 5’ de la
secuencia, siendo las secuencias codificantes (CDS) de 1149 nucléotidos para la FAD2 y 1161
nucleótidos para la FAH12 (Venegas et al., 2016).

3.4. Biosíntesis de ácido lesquerólico.

La síntesis del ácido lesquerólico tiene lugar principalmente en plantas del género
Physaria. Se han caracterizado diferentes enzimas implicadas en el proceso de elongación e
hidroxilación de ácidos grasos en Physaria fendleri.
Esta especie presenta una enzima bifuncional hidroxilasa/desaturasa LfFAH12, que cataliza
la formación de 18:1OH-PC a partir de 18:1-PC en la posición sn-2.
Además de la enzima LfFAH12, Physaria fendleri presenta otra enzima implicada en este
proceso, la cetoacil-CoA elongasa (LfKCS3) que cataliza la formación de 20:1OH-CoA a partir de
18:1OH-CoA. Esta enzima lleva a cabo a la elongación de ácidos grasos ya hidroxilados (Moon
et al., 2001) cuando estos se encuentran en el pool de acil-CoAs, al contratrio de lo que ocurre
en la hidroxilación, que se lleva a cabo cuando el ácido graso se encuentra esterificado a la PC
en la posición sn-2. Por lo tanto, debe existir un retorno de 18:1OH-PC desde el retículo hacia
22
 Introducción

el citoplasma en forma de 18:1OH-CoA y así podría elongarse para formar el 20:1OH-CoA

gracias a la LfKCS3. La sobreexpresión de esta enzima, junto con la correspondiente
hidroxilasa, ha inducido la formación de ácidos grasos hidroxilados de entre 18 y 20 carbonos
en semillas de Camelina sativa (Anna R. Snapp et al. 2014) (Figura 18).

Figura 18. Esquema general de síntesis de ácidos grasos inusuales. De color anaranjado se muestra la ruta de síntesis de
novo de ácidos grasos en el plastidio. De color azul las modificaciones que tienen lugar en el conjunto de acil-CoAs
citoplásmicos. De color verde, las modificaciones que tienen lugar en los ácidos grasos esterificados en la posición sn-2 de
la PC. PC: fosfatidil colina; ACP: proteína portadora de acilos; SAD: estearato desaturasa; KAS: beta-cetoacil-ACP sintasa;
FATA/FATB acil-ACP tioesterasas A ó B; FAD: ácido graso desaturasa; LACS: acil-CoA sintetasas; LPCAT: lisofosfatidilcolina
aciltransferasa; LPC: lisofosfatidilcolina; ElaFAEEpo12: E. lagascae 12-ácido graso epoxigenasa; CpFAH12: C. purpurea 12-
ácido graso hidroxilasa; HbFAH12 12-ácido graso: H. benghalensis 12-ácido graso hidroxilasa; RcFAH1: R. communis 12-
ácido graso hidroxilasa; LfKCS3: P. fendlerei 12-ácido graso hidroxilasa; DsFAD2-1: D. sinuata 12-ácido graso trans-
desaturasa; DsFAD2-2: D. sinuata conjugasa/hidroxilasa; LfFAH12: P. fendlerei hidroxilasa/desaturasa; VgFAEpo12: V.
galamensis 12-ácido graso epoxigenasa; CpaFAEpo12: C. palaestina 12-ácido graso epoxigenasa; SlFAEpo12: S.laevis 12-
ácido graso epoxigenasa.

3.5. Biosíntesis de ácidos dimorfecólico y coriólico.

La biosíntesis de ácido dimorfecólico se produce a partir del ácido oleico en plantas del
género Dimorphoteca, principalmente. En Dimorphoteca sinuata la molécula de oleil-PC
formará el trans-linoleil-PC. El ácido trans-linoleico presenta un doble enlace en cis en la
posición Δ9 y otro en trans en la posición Δ12, siendo la enzima encargada de este paso la
desaturasa de D. sinuata (DsFAD2-1). Posteriormente, la molécula de trans-linoleil-PC formará
ácido dimorfecólico esterificado con PC por medio de la conversión del doble enlace cis en la
posición Δ9, en uno trans en la posición Δ10 y la adición de un grupo hidroxilo en la posición

23
 Introducción

Δ9, gracias a la acción de la enzima bifuncional hidroxilasa/conjugasa de Dimorfoteca (DsFAD2-

2) (Figura 18) (Cahoon et al., 2004).
Las enzimas encargadas de la síntesis de ácido coriólico aún no están identificadas, no
obstante, por su similitud con el ácido dimorfecólico probablemente se trate de una ruta
análoga a la descrita para este último ácido graso.

3.6. Biosíntesis de ácido vernólico.

El ácido vernólico se ha detectado en diversas plantas, las más relevantes son Crepis
palaestina, Vernonia galamensis y Stokesia laevis. La síntesis de ácido vernólico es llevada a
cabo por Δ12-epoxigenasas que inducen la formación de un anillo epóxido en la posición Δ12.
Podemos diferenciar 2 tipos de epoxigenasas. En primer lugar, encontramos aquellas
epoxigenasas que pertenecen a la familia de las enzimas desaturasas, como la epoxigenasa de
C. palaestina. Este tipo de enzimas no se ven afectadas por la presencia de monóxido de
carbono o por un anticuerpo anti-citocromo P450, requieren NADPH y se inhiben por cianuro.
Catalizan la formación de un anillo epóxido en la posición Δ12 del linoleato esterificado en la
PC (Lee et al., 1998).
Por otra parte, existen epoxigenasas que no pertenecen a la familia de las desaturasas, son
las epoxigenasas dependientes de citocromo P450 y cuya actividad precisa de NADPH, se ve
afectada por la presencia de monóxido de carbono y por la presencia de anticuerpo anti-
citocromo P450. Es el caso de la epoxigenasa de E. lagascae. Estas enzimas actúan sobre el
oleato-PC a partir del cual forman linoleato-PC para catalizar la formación de un anillo epóxido
en la posición Δ12 del mismo (Figura 18) (Bafor et al., 1993 Liu, L. et al. 1998; Cahoon et al.
2002).

3.7. Síntesis y almacenaje triacilgliceroles en plantas.

Los ácidos grasos en plantas son almacenados principalmente en forma de glicerolípidos,
la mayoría triacilgliceroles. Existen dos rutas diferentes para síntesis de glicerolípidos, la ruta
intraplastidial y la extraplastidial.

3.7.1. Biosíntesis intraplastidial de glicerolípidos.

Esta ruta biosintética se ha mencionado anteriormente y es también llamada ruta
procariota (Somerville, 1991; Dormänn, 2005), genera lípidos de membrana típicos de los
tejidos fotosintéticos.
En esta ruta dos aciltransferasas transfieren los acil-ACP generados a las posiciones sn-1 y
sn-2 del glicerol-3-fosfato (G3P) formando ácido lisofosfatídico (LPA) en un primer paso, y PA

24
 Introducción

en un segundo paso. La primera enzima se denomina G3P-acil-ACPaciltransferasa, es una

enzima soluble con preferencia por el oleil-ACP. La otra enzima es la lisofosfatidil
aciltransferasa (LPAAT) situada en la membrana interna de los plastídios y que presenta
preferencia por el palmitil-ACP (Bates et al., 2013).

3.7.2. Biosíntesis extraplastidial de glicerolípidos.

La ruta extraplastial es la responsable de la síntesis de lípidos de reserva en semillas de
oleaginosas, principalmente TAG. Esta ruta transcurre en su totalidad en el retículo
endoplasmático y utiliza, como sustratos, el conjunto citoplásmico de acil-CoAs (Stobart et al.,
1997). La ruta clásica de síntesis de glicerolípidos implica la acilación sucesiva del G3P por
parte de aciltransferasas reticulares. Así, estas enzimas utilizan los acil-CoAs como sustratos
donadores de acilo que se esterifican en las distintas posiciones de la molécula de G3P. Esta
ruta es conocida como ruta de Kennedy y culmina con la síntesis de TAG. En primer lugar, se
forma LPA a partir de la esterificación de un grupo acilo al G3P en la posición sn-1. Esta
reacción es catalizada por una acil-CoA glicerol 3-fosfato aciltransferasa (GPAT) (Jayawardhane
et al., 2018). En la segunda reacción el LPA es acilado de nuevo en sn-2 para formar PA por la
acción de la enzima LPAAT esta enzima tiene alta preferencia por acilos insaturados (Ichihara,
1991). A continuación, el PA es transformado en DAG por la acción de la 3-sn-fosfatidato
fosfohidrolasa (fosfatidato fosfatasa, PAP) (Kocsis y Weselake, 1996). Finalmente, la
esterificación de un último ácido graso en la posición sn-3 de los DAG formará el producto
final, el TAG. Este paso es llevado a cabo por la enzima acil-CoA:1,2-diacilglicerol aciltransfersa
(diacilglicerol aciltransferasa, DAGAT) (Lung y Weselake, 2006). Ésta es una enzima específica
de esta ruta, con baja especificidad de sustrato y que resulta limitante en la formación de TAG
y, por tanto, en la acumulación de aceite en oleaginosas.
Durante muchos años ha sido ampliamente mantenido que ésta era la única ruta para la
biosíntesis de TAG en plantas, animales y microorganismos. Sin embargo, actualmente se
conoce que existen otras rutas alternativas y se describen a continuación. Una enzima de gran
interés, identificada en plantas y capaz de acilar los DAG para formar TAG es la
fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasa (PDAT), la cual transfiere el acilo de una molécula de PC
hasta una de DAG, de manera que es capaz de producir TAG de forma no dependiente de la
composición y del tamaño del conjunto de acil-CoAs (Karlsson, et al. 1997).
Además, publicaciones recientes han demostrado que una gran parte de los glicerolípidos
pueden ser sintetizados a través de la acilación de la LPC, por acción de las aciltransferasas de
retículo (Bates et al.,2007; 2009). La PC resultante puede dar lugar a DAG a través de la acción
de fosfolipasas de tipo D (PLD) más la acción de una PAP, de fosfolipasas de tipo C (PLC) o a

25
 Introducción

través de una reacción reversible catalizada por la enzima PC:DAG colinafosfotransferasa

(PDCT o CPT)(Hu et al.,2012), que intercambia la cabeza polar de una PC con una molécula de
DAG. El carácter reversible de esta reacción además produciría nuevas moléculas de DAG
generados a partir de PC, lo que permitiría la edición de la composición de ácidos grasos de los
DAG que posteriormente podrían destinarse para la síntesis de TAG (Figura 19).

Figura 19. Esquema de la síntesis y almacenamiento de triacilgliceroles. Adaptado de Bates et al.,

2013.TAG: triacilgliceroles; DAG: diacilgliceroles; PC: fosfatidil colina; LPC: lisofosfatidil colina; G3P:
glicerol-3-fosfato; PA: ácido fosfatídico; LPA: ácido lisofosfatídico; GPAT: glicerol-3-fosfato acil-CoA
transferasa; LPAAT: lisofosfatidato acil-CoA aciltransferasa; PAP: fosfatidato fosfatasa; CPT: colina
fosfato transferasa; PDCT: fosfatidil colina diacilglicerol fosfocolina transferasa; PLD/PLC: fosfolipasas D
ó C ; PDAT: fosfolípido diacilglicerol aciltransferasa; DGAT: diacilglicerol acil-CoA aciltransferasa.
.

3.7.3. Formación y acumulación de TAG en ricino.

La planta de ricino posee mecanismos especializados en la canalización y el
almacenamiento del ácido ricinoleico, un ácido graso inusual dado que presenta un grupo
hidroxilo en la posición Δ12. Se ha comprobado que el ricino presenta una fosfolipasa A2
específica que reconoce ricinoleil-PC y las hidroliza formando ácido ricinoleico y LPC. Esta
enzima, por tanto, liberaría el ricinoleico sintetizado en la PC, y posteriormente éste sería
activado por las LACS y pasaría a formar parte del conjunto de acil-CoAs citoplásmico.
Posteriormente, la molécula de ricinoleil-CoA entrará en las rutas de formación de TAG (Bafor
et al., 1991).
La expresión de las enzimas responsables de la acumulación de ricinoleico en plantas
distintas al ricino aportan evidencias claras acerca de la presencia de un mecanismo
especializado para la acumulación del ácido ricinoleico en las semillas de ricino. Así, la
expresión del gen de la hidroxilasa FAH12 en semillas de Arabidopsis da lugar a la acumulación
de apenas un 17 % de dicho ácido graso en su aceite. La expresión adicional de una PDAT y una
DGAT2 de ricino incrementa dicho porcentaje hasta un 27%. Además, la acción de una PDCT

26
 Introducción

específica parece también necesaria para proporcionar una canalización del ricinoleico a TAG
(Hu et al., 2012).
El mecanismo de acumulación de ricinoleico presente en ricino podría servir para acumular
otros ácidos grasos oxigenados de interés industrial como ya demostraron in vitro Dahlqvist et
al. (2000) para el ácido vernólico. Así, preparaciones de microsomas de ricino fueron capaces
de incorporar dicho ácido epoxidado a la fracción de TAG más eficazmente que otras especies,
como microsomas de Helianthus annuus (girasol) o Crepis palaestina, a partir de diferentes
intermediarios (Figura 20).

Figura 20. Metabolismo de diferentes acil-PC marcados radiactivamente en microsomas de

girasol, ricino y Crepis palaestina. Adaptado de Dahlqvist et al. (2000). A) Microsomas de semillas
en desarrollo. Ricino es la especie con mayor capacidad de asimilación de ácido vernólico en TAG.
B) Síntesis in vitro en microsomas de semilla de ricino en desarrollo de TAG compuesto por dos
vernoleil y un ricinoleil marcado radiactivamente. La semilla de ricino presenta mecanismos muy
eficientes que canalizan ácidos grasos inusuales (ricinoleico y vernólico) desde PC hasta TAG.

4. Domesticación y mejora genética en plantas.

La práctica totalidad de las especies vegetales (y animales) que consumimos han sido
modificadas genéticamente para obtener de ellas un mayor beneficio, así, podríamos
diferenciar tres vías principales que conducen al objetivo final de mejorar las especies que
consumimos: domesticación por selección clásica, mutagénesis al azar e ingeniería genética.

27
 Introducción

4.1. Domesticación por selección clásica.

Hace aproximadamente 12000 años, cuando tuvo lugar la revolución neolítica, se produjo
un cambio radical a la hora de obtener alimentos con el comienzo de la agricultura. Este
cambio fue gracias a la domesticación de diversas especies vegetales (Beltrán, 2018).
Las plantas que hoy cosechamos soy muy diferentes a sus ancestros y, en muchos casos,
éstas plantas domesticadas son incapaces de sobrevivir en su medio natural de origen. A lo
largo de su historia, el ser humano ha ido seleccionando mutaciones genéticas hasta obtener
las especies que consumimos hoy en día (Beltrán, 2018). El ejemplo más común en este campo
es el desarrollo del maíz (Zea mays) a partir del teosinte, cuya selección y domesticación
comenzó hace 8700 años en Centroamérica. Mediante la selección clásica se elegían y
propagaban aquellas variedades de teosinte que presentaban mayor rendimiento. En fases
posteriores, mediante cruces y selección de la progenie, se fueron seleccionando otras
características, como la uniformidad en la respuesta a fotoperiodo, de forma que todas las
plantas florezcan a la vez, o la dominancia apical, de forma que se facilita la recolección (Tabla
2). Así, el maíz actual no solo presenta hexaploidía sino también diversas mutaciones en
determinados genes que permiten la aparición de las características mencionadas. (Beltrán,
2018; Meyer & Purugganan, 2013).

Tabla 2. Ejemplos de genes mutados mediante selección clásica.

Gen modificado Función

TGA1 Protege los granos dentro de la mazorca e impide su caída.

TB1, PBF Modifica la actividad meristemática e incrementa el contenido

en proteína de la mazorca.

Podríamos dividir la selección clásica en cuatro estadios:

I) Comienzo de la domesticación: es la etapa inicial y tiene lugar sobre la variedad
salvaje, consistente en el cultivo de la misma. Permite la posibilidad de la
selección posterior.
II) Proliferación in situ los cambios deseados: consiste en reproducir con la mayor
frecuencia posible individuos con las características deseadas.
III) Selección de poblaciones adaptadas a regiones determinadas: en esta etapa se
seleccionan aquellas variedades adaptadas tanto al clima como a las
necesidades de una determinada región.

28
 Introducción

IV) Cruce de variedades: es la etapa final, consiste en el cruce de las variedades

anteriores con el fin de obtener híbridos con características agronómicas
óptimas (Figura 21).

Figura 21. Fases de la domesticación en maíz. Adaptado de Meyer & Purugganan (2013).

4.2. Obtención de variedades por mutagénesis inducida al azar.

Podemos definir mutagénesis como el proceso a través del cual se provocan cambios
heredables en la información genética de un organismo. Estos cambios son producidos
mediante agentes químicos, físicos o biológicos y no por segregación o recombinación
genética. La mutagénesis al azar se basa en mutaciones causadas en el genoma de forma no
dirigida, tras la generación de mutaciones se seleccionan los individuos que son viables y que
presentan las características deseadas. Posteriormente, mediante cruzamiento, se restauran
aquellos genes que hayan sido modificados y alteren características de interés en el
organismo. Finalmente, se seleccionan aquellos individuos que presenten viabilidad en el
crecimiento y en la reproducción pero que presenten alterada alguna característica de interés.
La actividad mutagénica de los rayos-X ya fue demostrada por Lewis John Standler en 1920
en trigo, maíz y cebada. En 1934 se comercializó la primera variedad mutante de tabaco. En
1995 el número de variedades comerciales obtenidas por mutagénesis era de 484, en la
actualidad existen más de 1000 variedades de mutantes en las que se incluyes árboles del
género Citrus, plantas ornamentales como el crisantemo y plantas destinadas a la alimentación
como el arroz o el girasol. (Beltrán, 2018)
Tradicionalmente, para llevar a cabo las mutaciones, se han usado agentes químicos y
físicos sobre diversos tejidos vegetales como células cultivadas in vitro, embriones, semillas,
etc. La característica principal que debe tener el tejido vegetal que se va a usar es que
presente totipotencia, esto es, la capacidad de poder generar una planta entera. Los agentes
físicos de uso más común en mutagénesis son los rayos-X, rayos gamma, neutrones, partículas
beta y partículas alfa. Por otra parte, los agentes químicos más usados son agentes alkilantes,
azidas, hidroxilaminas, antibióticos, ácido nitroso o análogos de bases nitrogenadas. Mientras
los agentes químicos suelen provocar mutaciones puntuales como transiciones,
transversiones, inserciones o deleciones puntuales, los agentes físicos provocan cambios

29
 Introducción

mayores tales como deleciones grandes o acortamiento de los cromosomas (Oladosu et al.,
2015).
Como ejemplo de mutantes que se comercializan podemos nombrar la mandarina sin
pepitas de la empresa española Mandanova, esta variedad procede de una variedad de
naranjo mutante producido por la misma empresa (Mandanova S.L. http://www.ivia.gva.es).
También cabe destacar la variedad de colza conocida como Cánola, libre de ácido erúcico y la
variedad de girasol Nutrisun, con fenotipo alto oleico alto esteárico, desarrollada en el grupo
de genética y bioquímica de lípidos de semillas del Instituto de la Grasa y explotada por la
empresa Advanta Seeds. La composición alto oleico alto esteárico otorgan a este aceite
potencial para convertirse en una alternativa viable al aceite de palma (Advanta,
http://www.advantaseeds.com).

4.3. OLE-1, la variedad de ricino alto oleico.

Los componentes mayoritarios del aceite de ricino en la variedad salvaje WT son ácido
ricinoleico en un 90% aprox., 5% en ácido linoleico y un 3% en ácido oleico. En cambio, la
variedad OLE-1 aislada por Rojas-Barros et al., (2004) contiene un 80% aprox. de ácido oleico,
un 17% de ácido ricinoleico y un 4% de ácido linoleico en su aceite (Venegas-Calerón et al.,
2016).
Un análisis de la secuencia de nucleótidos que codifica laFAH12 mostró 4 diferencias entre
OLE-1 y WT, estas diferencias repercutieron en cambios en la secuencia de aminoácidos,
concretamente, en los residuos F49S, V242A and H319Q. Las mutaciones en la FAH12 de la
variedad OLE-1 fueron las responsables del cambio en la composición en el aceite de las
semillas (Venegas-Calerón et al., 2016).
En ricino, el ácido oleico es el sustrato común por el que compiten las enzimas FAD2 y
FAH12. FAD2 formará ácido linoleico y FAH12 ácido ricinoleico (Figura 18). Una característica
llamativa de la variedad OLE-1 fue la acumulación de ácido oleico en lugar de ácido linoleico.

4.4. Ingeniería genética en plantas.

En 1978, Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith fueron galardonados con el
Nobel de Fisiología o Medicina por el descubrimiento de las enzimas de restricción, enzimas
capaces de cortar las secuencias de ADN de una forma precisa y no al azar. Este fue el inicio de
lo que conocemos como Ingeniería genética, la capacidad de modificar el genoma de los
organismos de forma más precisa y rápida mediante una serie de técnicas que trataremos a
continuación (Beltrán, 2018).

30
 Introducción

Hoy en día, existen varios métodos que permiten transferir genes de un organismo a otro
y que éstos se expresen de una manera determinada. Los diferentes métodos de
transformación se pueden diferenciar en métodos biológicos o métodos no biológicos.
En plantas, el método no biológico más empleado es la biolística, que consiste en
bombardear las células con partículas de metal que portan el material genético (circular o
lineal) que queremos introducir en el nuevo organismo. Otros métodos no biológicos son la
electroporación, que se basa en la introducción del material genético a través de poros
creados en la membrana de protoplastos (células vegetales sin pared) mediante impulsos
eléctricos, la microinyección, que consiste en introducir el material genético manualmente
dentro de la célula, o la lipofección, en la que el material genético se recubre de una
membrana lipídica que se fusionará con la membrana del protoplasto (Keshavaredd et al.,
2018).
Por el contrario, los métodos biológicos utilizan organismos vivos como vectores del ADN
que se desea introducir. A este respecto, pueden usarse virus para incorporar el material
genético en el núcleo de células vegetales a través de un proceso de infección dirigida.
Sin embargo, el método biológico más usado y a la vez el más económico es el que emplea
la bacteria Agrobacterium tumefaciens para introducir el material genético dentro de una
célula vegetal. Este método ha sido el usado en este proyecto y se detalla en el siguiente
apartado (Keshavareddy et al., 2018).

4.4.1. Transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens.

En la misma década en la que Arber, Nathans y Hamilton ganaron el premio Nobel de
medicina se descubrió que la bacteria A. tumefaciens era capaz de transferir, de manera
natural, sus propios genes al genoma de la planta que estaba infectando, usando el plásmido
Ti. Más tarde Jeff Schell y Marc Van Montagu, de la universidad de Gante, optaron por
modificar los genes del propio Agrobacterium, usando enzimas de restricción, e introducir en
su plásmido genes aislados por ellos mismos. En 1983, tres grupos independientes (el grupo de
Gante, un grupo de Monsanto encabezado por Rob Fraley, y el grupo de Chiltony) casi
simultáneamente demostraron que podían insertar nuevos genes en el genoma de una planta.
Los tres grupos utilizaron el promotor de la nopalina sintasa fusionado a un locus de
resistencia a los antibióticos que dio lugar a transformantes de tabaco resistentes a dichos
antibióticos (Fraley et al. 1983; Herrera-Estrella et al. 1983; Bevan et al. 1983). Estos
experimentos abrieron la era de la ingeniería genética de plantas y una posterior revolución
industrial en la agricultura. A día de hoy Agrobacterium es el vector más eficiente y económico
para la transferencia de genes a plantas.

31
 Introducción

Para transformar plantas utilizando Agrobacterium se usan los llamados plásmidos

binarios, plásmidos capaces de ser reproducidos tanto en bacterias como en plantas. Y son
éstos plásmidos binarios los que llevan el gen de interés al nuevo organismo.
La transformación de las células vegetales de una determinada especie por Agrobacterium
depende, en primer lugar, de la relación patógeno-huésped que se establezca entre ambas. La
gama de huéspedes de Agrobacterium es muy extensa, aunque en su mayor parte incluye
plantas dicotiledóneas. Tanto los genes de la región vir y algunos genes incluidos en el T-DNA
como los genes cromosómicos de virulencia chv están implicados en la determinación de la
gama de huéspedes específica de cada cepa bacteriana, y afectan a la capacidad de
Agrobacterium para transformar las células vegetales. Por otra parte, diferentes especies e,
incluso, variedades de una misma especie pueden mostrar distintas respuestas frente a una
misma cepa de Agrobacterium, indicando que hay factores genéticos de la planta que también
están implicados en la interacción.

4.4.1.1. Transformación estable. Obtención de la planta transgénica.

Cuando el gen transferido a la planta permanece en su genoma durante varias
generaciones sin ser eliminado hablamos de transformación estable y, por tanto, de planta
transgénica. Hablamos de transgénesis cuando el gen introducido procede de otro organismo
con el que no puede existir cruzamiento, hablamos de cisgenésis si la transferencia genética es
entre especies que pueden cruzarse y el gen de interés no ha sido modificado e intragénesis si
la transferencia genética tiene lugar entre especies que pueden cruzarse, pero el gen de
interés ha sido modificado en su secuencia o en secuencias próximas como la secuencia
promotora (Holme et al., 2013)
Cuando la transformación in planta (infiltración directa de los primordios florales con
Agrobacterium) no es eficiente o no es posible, es necesaria la posterior regeneración in vitro
de la/s célula/s o del tejido infectado. Esta regeneración se produce gracias a la totipotencia de
las células vegetales, esto es, la capacidad de la célula vegetal para multiplicarse y
diferenciarse hasta formar la planta completa.
Por lo tanto, para la obtención de una planta transgénica, se pueden transformar muchos
tipos de tejidos como discos de hoja, polen, embriones, protoplastos (células vegetales sin
pared), ejes apicales o laterales y flores. Y, por ello, los protocolos de regeneración varían en
función del tejido a regenerar y de la especie en cuestión, aunque todos comparten una serie
de características básicas. La aptitud de las células transgénicas para la regeneración se puede
conseguir mediante el uso de medios o condiciones de cultivo apropiados, que permitan a
algunas células transformadas exhibir su totipotencia. Los medios de regeneración, además de

32
 Introducción

poseer los nutrientes y sales necesarios, suelen suplementarse con una concentración
determinada de las siguientes hormonas vegetales:

I) Auxinas: Su estructura química es el ácido indol-acético (IAA) y sus derivados,

como el ácido indol-butírico o el ácido indol-propiónico. Las auxinas son claves en
la inducción de la proliferación y diferenciación celular. También intervienen en los
tropismos, como en el gravitropismo de las raíces, o en el fototropismo de los ejes
apicales. Son cruciales en el desarrollo y elongación de las raíces, en el
establecimiento de la dominancia apical, en la formación de tejidos vasculares, en
la formación y el crecimiento del fruto y en la síntesis de etileno. Las auxinas
pueden transportarse de forma polar por la planta con la ayuda de los
transportadores PIN y de forma no polar con los transportadores (AUX/LAX)
(Müller, 2000; Davies, 2010).

II) Citoquininas: Dentro de las citoquinas podemos diferenciar dos tipos. Citoquinas
de tipo adenina como la kinetina, zeatina y 6-benzilaminopurina (BAP), siendo ésta
última la más usada en los protocolos de regeneración. Y las citoquinas de tipo
fenilurea como la difenilurea y el tidiazuron (TDZ). Éste último también muy usado
en protocolos de regeneración. Las citoquininas intervienen en el crecimiento y la
proliferación celular, en la dominancia apical, en el crecimiento de meristemos
axilares y la senescencia foliar.

III) Giberelinas: Entre las giberelinas se encuentran la giberelina A1 (GA1), el ácido

giberélico (GA3), el ent-giberelano y el ent-kaureno. Tienen una función
importante en la dormición, ya que inducen la síntesis de α-amilasa de la aleurona
en la semilla, que es la enzima que degrada el almidón de la semilla y, por tanto,
favorece la germinación, la formación de la hoja, la elongación apical, la floración y
la senescencia del fruto. (Yamaguchi, 2008; Davies, 2010).

4.4.1.1.1. Transformación estable en Ricino.

La planta de ricino no cuenta con un protocolo eficiente, reproducible y bien establecido
de transformación y regeneración, si bien existen aproximaciones capaces de llegar a obtener
una planta transgénica completa.
McKeon & Chen (2003) fueron los primeros en introducir genes en ricino usando
Agrobacterium como vector. Un año más tarde, Sujatha & Sailaja, (2004) obtuvieron la
33
 Introducción

primera planta transgénica de ricino, aunque con una ratio de transformación muy baja
(0.08%) y un protocolo poco reproducible. La transformación era llevada a cabo mediante
infección con Agrobacterium de los ejes embrionarios. Unos años después, el mismo grupo
publicaba un protocolo similar en el que no se usaba Agrobacterium sino biolística para
transferir los genes a la planta, aunque la ratio de transformación continuaba siendo baja
(Sailaja et al., 2008)
La resistencia de la planta a ser transformada y la dificultad en su regeneración han
quedado patentes en cada uno de los protocolos publicados. La publicación más reciente en la
que se habla de una planta de ricino transgénica es de 2017. En esta planta se ha intentado
reducir la toxicidad de la semilla, disminuyendo el contenido en ricina de la misma. El método
usado para la transformación fue el bombardeo por biolística de los ejes apicales (Cabral et al.,
2017)
La obtención un de un protocolo de transformación de ricino eficiente y sencillo es un
objetivo importante, ya que permitiría explotar el potencial metabólico y agronómico de esta
planta.

4.4.1.2. Transformación transitoria.

La expresión transitoria en plantas es una técnica muy utilizada para estudios de
regulación, función génica y especificidad de promotores. En este procedimiento también usa
la bacteria Agrobacterium como vehículo para poder transportar los vectores virales y los
genes de interés dentro de la célula vegetal; sin embargo, a diferencia de la transformación
estable, las plantas no son capaces de heredar los transgenes, por lo que sólo van a
expresarlos por un periodo de tiempo suficiente como para evaluar la función del gen en
estudio.
La transformación transitoria puede darse in vitro o in vivo. Se realiza in vitro mediante la
disección de un determinado tejido y su co-cultivo en una solución de Agrobacterium con una
densidad óptica determinada. Sin embargo, la transformación transitoria in vivo, conocida
como agroinfiltración, es la más utilizada. Consiste en la infiltración en el tejido deseado de
una suspensión de Agrobacterium. El método más extendido de transformación transitoria in
vivo es la infiltración de hojas de tabaco (Nicotiana benthamina; Potrikus, 1991), sin embargo,
en los últimos años se ha aplicado a otras especies.
La agroinfiltracion en frutos de fresa reveló que este método es una herramienta muy útil
en el estudio del silenciamiento génico o la sobreexpresión génica (Carvalho et al., 2016).
También se ha usado para la expresión de proteínas de interés en frutos como el tomate
(Orzaez et al., 2006) y melón (Han et al., 2015) permitiendo el desarrollo de anticuerpos y

34
 Introducción

vacunas en la planta hospedadora. En semillas de soja, la agroinfiltración permite una

transformación transitoria eficiente donde la expresión del marcador GUS fue detectable entre
2 y 4 días después de la transformación (King et al., 2015).

4.4.1.2.1. Transformación transitoria en ricino.

Con el fin de determinar la localización de la expresión de distintas leguminas en la semilla
de ricino se ha llevado a cabo la transformación transitoria del endospermo de esta planta
introduciendo el gen reportero GUS precedido de los promotores de las mencionadas
leguminas. El protocolo de transformación in vitro en semilla de ricino implicó la disección de
la semilla encapsulada en el fruto, en condiciones de total esterilidad. Una vez diseccionada la
semilla se aplicó un tratamiento de sonicación y un breve vacío para permitir que una
suspensión de Agrobacterium se infiltre, infecte y transforme el endospermo de la semilla
(Chileh et al., 2010). Este método permite la observación de la expresión génica en la semilla
de ricino durante un periodo de 2 semanas, sin embargo, la extracción de la semilla del fruto
del ricino y su disección es una labor ardua con un riesgo alto de contaminación.
Además, la ruta de síntesis de ácidos grasos en la semilla, así como la acumulación de
ricina son procesos que se desarrollan en unas 4-5 semanas, por lo que el estudio de como
ciertos transgenes podrían afectar a estos procesos resultaría muy complicado utilizando
procedimientos in vitro similares a los descritos.

4.4.2. Silenciamiento génico en plantas.

El silenciamiento génico en plantas consiste en la reducción de la expresión de un
determinado gen aprovechando los mecanismos moleculares de defensa de la célula.
La expresión génica puede ser regulada tanto a nivel transcripcional como post
transcripcional. El silenciamiento génico transcripcional (en inglés, Transcriptional Gene
Silencing o TGS) es el resultado de la modificación del ADN o de las histonas presentes en la
cromatina. Estas modificaciones crean un ambiente de heterocromatina alrededor del gen,
que impide el acceso de la maquinaria transcripcional reprimiendo la expresión de dicho gen.
El silenciamiento génico post transcripcional (en inglés, Post-Transcriptional Gene Silencing o
PTGS), en cambio, es un mecanismo que implica la degradación de un ARN mensajero
específico. La destrucción de este ARNm impide su normal traducción y consecuentemente no
se sintetiza la proteína correspondiente (Vaucheret et al., 2001)
En el PTGS, la etapa de iniciación comienza con la presencia de un ARN de doble cadena
(ARNds, del inglés double stranded RNA). Este mecanismo, además incluye familias de
proteínas que son comunes en plantas, como son Dicer-like (DCL) y Argonauta (AGO). En la

35
 Introducción

ruta básica de silenciamiento, el ARN en horquilla (hpRNA) o en doble hélice (dsRNA) son
procesados por la proteína Dicer o DCL formando moléculas pequeñas de doble hélice de unos
21-24pb, con extremos 3’ de dos nucleótidos desapareados. Una de las cadenas del dúplex de
RNA es incorporada a la proteína AGO para formar el complejo de silenciamiento génico
inducido por RNA (RISC). La molécula de ARN de cadena simple guiará al complejo RISC hasta
una cadena de ARN simple homóloga a la secuencia de 21pb, la proteína AGO llevará a cabo
finalmente la degradación del ARN diana. A pesar de las diferentes rutas de silenciamiento
génico que han sido descritas en los últimos años la técnica con diferencia má usada es la de
ARN en horquilla o hairpin (hpARN) (Martínez de Alba et al., 2013; Guo et al., 2016)
La estructura hpARN típica consiste en dos brazos, sentido y antisentido, separados por
región espaciadora no complementaria denominada loop. Los brazos sentido y antisentido
formarán la estructura de ARN en doble hélice mientras el loop estabilizará la construcción
durante su clonación en células bacterianas. El tamaño de los brazos es de unos 100-120pb
mientras que el tamaño del loop puede variar. Las características más importantes que debe
poseer la región del loop es que no forme estructuras secundarias y que no interfiera con
genes de la planta hospedadora. También se ha comprobado que la presencia de un intrón
procesable en la región del loop incrementa el nivel de silenciamiento (Smith et al. 2000).

4.4.2.1. Silenciamiento génico en ricino.

La dificultad que entraña la transformación y regeneración de la planta de ricino, hace que
no existan muchos registros de experiencias de silenciamiento génico en esta planta.
Muy recientemente se han publicado resultados sobre el silenciamiento de la ricina en
plantas de ricino transformadas de manera estable (Cabral et al., 2017). Esto se llevó a cabo
mediante la transformación con una estructura de tipo hpARN que tomó como diana el gen de
la subunidad A de la ricina, consiguiendo un descenso de la toxina en la semilla de la planta
adulta.
Otras herramientas de modificación genética podrían permitir la creación de fenotipos de
ricino más estables con menor cantidad de proteínas tóxicas.
4.4.3. Herramientas de edición genética.
En la última década se han ido desarrollando instrumentos moleculares que permiten
editar el genoma de un organismo de forma precisa. Estos instrumentos moleculares son
enzimas denominadas nucleasas de sitio específico (SSNs). Las SSNs son capaces de llevar a
cabo cortes en la doble hélice del ADN de forma específica, estos cortes son reparados
posteriormente por dos mecanismos distintos, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la

36
 Introducción

recombinación de extremos homólogos (HDR). Ambas vías de reparación tienen como

resultado la inserción, la deleción o la sustitución en la región diana de las SSNs.
En la actualidad podemos diferenciar herramientas de edición genética de primera
generación y de segunda generación.

4.4.3.1. Herramientas de primera generación: ZFN y TALEN

Las herramientas de primera generación son las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o las
nucleasas similares al factor de transcripción (TALEN), consisten en enzimas endonucleasas con
un sitio de unión al ADN que les otorga especificidad de unión a sitios determinados del
genoma. Estas enzimas permiten la creación de mutaciones en sitios específicos del genoma,
no obstante, requieren procedimientos bastante tediosos y laboriosos para conseguir una
buena especificidad. Las ZFN han sido utilizadas para la edición genética tanto en plantas,
como animales, durante más de una década (Govindan & Ramalingam, 2016) aunque la
relativa baja especificidad limita mucho su uso. Por otro lado, las nucleasas TALEN son
diseñadas modificando el dominio efector de factores activadores de la transcripción (TALE),
de esta forma, estas enzimas pueden reconocer una secuencia exacta del ADN y cortarla. Las
TALEN poseen una especificidad mayor que las ZFN, sin embargo, los requerimientos
necesarios para su funcionamiento, como son un tamaño de secuencia de entre 14 y 20 pb,
una timidina inicial y motivos repetitivos, convierten a las TALEN en una herramienta difícil de
diseñar y manejar (Stephen & Barakate, 2016). Las TALEN se han utilizado en plantas como el
arroz (Li et al., 2012), Arabidopsis (Cermak et al., 2011), tabaco (Zhang et al., 2012) y
Brachypodium (Shan et al., 2013).

4.4.3.2. Herramientas de segunda generación: CRISPR/Cas9.

El reciente descubrimiento del sistema CRISPR/Cas9 ha revolucionado los sistemas de
edición genética. El acrónimo CRISPR viene del inglés clustered regulary interspaced short
palindromic repeats, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente
interespaciadas. Cas9 es el nombre de la proteína que lleva a cabo el corte en la cadena de
ADN (Jaganathan et al., 2018), aunque recientemente se han empezado a emplear otras
enzimas de la familia de las Cas que realizan diferentes cortes en la cadena (Murovec et al.,
2017).
Fue el español Francisco Mojica quien en 1987 comenzó a hablar de un mecanismo de
defensa de procariotas frente a infecciones víricas. Este mecanismo se basa en enzimas
capaces de diferenciar entre el genoma propio y el vírico y degradarlo (Mojica et al., 2005).
Investigaciones en años posteriores demostraron que los cortes en ADN se producían

37
 Introducción

obedeciendo a pequeñas repeticiones que aparecían en el genoma, a las cuales se les llamó
CRISPR (Mojica & Rodríguez-Valera, 2016).
No obstante, fueron las doctoras Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier quienes
convirtieron el hallazgo del Dr. Mojica en una herramienta útil y programable en biología
molecular (Jinek et al., 2012). Doudna y Charpentier demostraron que determinadas
secuencias de ARN eran capaces de guiar a la proteína Cas9 hasta esos sitios CRISPR y provocar
cortes en la doble hélice del ADN no sólo de virus sino de todo tipo de organismos. Aunque lo
más importante es que esas secuencias de ARN pueden ensamblarse a una guía que conduce a
la proteína Cas9 hasta la secuencia de ADN que se desee dentro del organismo de interés y
generar un corte. La nucleasa Cas9 consta de los dominios RuvC y HNH, encargados de la
rotura de la doble hélice (Ma et al., 2016).
En definitiva, podemos ensamblar una estructura genética que codifique para una guía de
ARN reconocible por la enzima Cas9, que se dirija a los sitios CRISPR y corte la doble hélice del
ADN. La posterior reparación, por el método NHEJ (unión de extremos no homólogos), que liga
extremos de DNA independientemente de su homología producirá inserciones o deleciones en
la secuencia deseada (Figura 22).
CRISPR/Cas9 no solo sirve para generar mutaciones sino también para realizar inserciones
por recombinación homóloga, vía reparación HDR (reparación dirigida por homología), que
repara el corte en el DNA ligando extremos homólogos. Este último proceso tiene una
frecuencia baja en plantas, por lo que la inserción de genes vía CRISPR/Cas9 en plantas es un
proceso dificultoso (Liu et al., 2017). A pesar de ello recientemente se ha logrado la inserción
eficaz de genes, vía HDR, en arroz usando la nucleasa Cpf1, otra nucleasa dependiente de
CRISPR (Begemann et al., 2017).
El diseño de una construcción genética para el uso de CRISPR/Cas9 debe tener en cuenta
los siguientes principios básicos.
a) Hay que identificar la secuencia diana a mutar en el genoma. La secuencia diana debe
tener una longitud de 20 pb y debe de cumplir una serie de requisitos. En primer lugar,
la secuencia debe terminar en lo que conoce como motivo PAM (motivo
protoespaciador adjunto, una secuencia NGG al final de la secuencia diana). En
segundo lugar, la secuencia diana debe empezar por una guanina o una adenina si se
emplea el promotor U6 o U3, respectivamente. Los promotores U6 o U3 son
nativamente promotores para la ARN polimerasa III en plantas, el promotor U6 se
usará en dicotiledóneas, mientras el U3 en monocotiledóneas. Estos promotores son
los que regularán la expresión de nuestra secuencia guía. Se recomienda que la
secuencia diana tenga un sitio de restricción en el sitio de mutación, ya que puede

38
 Introducción

facilitar la posterior comprobación de mutaciones. En tercer lugar, se deben

seleccionar aquellas dianas que tengan la menor cantidad de off-targets posibles, esto
es, sitios donde la enzima Cas9 pueda cortar por homología con la secuencia diseñada
(Belhaj et al., 2015)
b) Una secuencia guía. La enzima Cas9 reconoce una secuencia guía fija que es 5’-
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’, esta secuencia precederá a la secuencia diana sin
el dominio PAM, todo precedido por el promotor U6 o U3 y clonado en un plásmido
binario. (Brooks et al., 2014; Belhaj et al., 2015).
c) El gen de la enzima Cas9. Necesitaremos el gen de la enzima Cas9 bajo un promotor
fuerte como puede ser el promotor 35S (Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter) que
permita una expresión alta en el mismo plásmido.
d) Si se desea insertar un gen mediante HDR debemos incluir en nuestro plásmido la
secuencia a insertar flanqueada por dos secuencias homólogas al sitio de inserción
seleccionado. (Jaganathan et al., 2018).

Los pasos a seguir para llevar a cabo la edición génica de una planta mediante la técnica
CRISPR/Cas9 son:
I) Selección de una diana que cumpla con los requisitos mencionados, diseño y
ensamblaje de nuestra construcción genética y clonación en un plásmido binario.
II) Transformación de la planta con nuestro plásmido binario.
III) Comprobación o screening de las posibles mutaciones generadas. Este paso se
puede realizar por secuenciación directa de las bandas obtenidas por PCR del gen
de interés o bien realizar un screening usando enzimas de restricción. Como se ha
mencionado antes, una de las recomendaciones para la secuencia diana es que
tenga un sitio de restricción en el lugar en el que Cas9 genera la mutación. Al
generar la mutación en el sitio de restricción, éste se pierde y podremos
discriminar las copias mutadas por Cas9, ya que son las que no se han degradado
por la enzima de restricción en una digestión previa a una prueba de PCR.
IV) Observación del fenotipo de la planta. Una vez comprobadas las mutaciones se
comprueba si estas han tenido algún efecto en el metabolismo de la planta (Belhaj
et al., 2015; Jaganathan et al., 2018).

39
 Introducción

Figura 22. Esquema del sistema d edición genética CRISPR/Cas9. La enzima Cas9 guiada por sgRNA
reconoce a la secuencia diana y corta la doble hélice en los sitios HNH y RuvC. El dominio PAM es
necesario para el corte vía CRISPR. Adaptado de Ma et al., 2016.

Las aplicaciones que puede tener la técnica CRISPR/Cas9 son enormes. Desde la cura de
enfermedades genéticas humanas hasta la creación de cultivos adaptados y con alta
productividad. CRISPR/Cas9 ya se ha aplicado en al menos 20 especies de cultivo (Ricroch et
al., 2017) con varios objetivos como la mejora de la productividad o la resistencia a estrés
biótico y abiótico. Entre los cultivos en los que se ha aplicado CRISPR/Cas9 destacan el arroz
(Shan et al., 2014), el trigo (Shan et al., 2014; Kim et al., 2018), la yuca (Odipio et al., 2017) o el
tomate (Brooks et al., 2014).
Para la modificación del metabolismo de lípidos de plantas, CRISPR/Cas9 se ha aplicado en
Camelina sativa mutando el gen de la enzima desaturasa FAD2, y provocando un incremento
del contenido en ácido oleico en esas semillas (Jiang et al., 2017). También se ha utilizado para
mutar esa misma enzima en Brassica napus, obteniendose también un incremento significativo
de la cantidad de ácido oleico en las semillas (Okuzaki et al., 2018).
En ricino, CRISPR/Cas9 podría ser una potente herramienta para llegar a reducir la
toxicidad de las semillas, así como para bloquear la síntesis de ciertas proteínas como la
hidroxilasa, lo que permitiría por un lado profundizar en el conocimiento del metabolismo de
acumulación de TAG en esta especie y de disponer de plantas de ricino que pudieran acumular
ácidos grasos inusuales diferentes al ricinoleico.

40
 Introducción

5. Importancia del proyecto.

Por su gran adaptabilidad a distintos climas, su gran productividad, su rápido crecimiento y
la resistencia a sequías y a altas temperaturas, el ricino constituye una especie de interés
agronómico en amplias áreas de clima templado y subtropical. Además, la presencia de una
maquinaria de síntesis de ácidos grasos inusuales única en esta planta, unida a su alta
capacidad de producción de aceite, convierte al ricino en una planta de gran interés industrial
para la producción renovable de materias primas. La puesta a punto de un protocolo de
transformación y regeneración del ricino, puede abrir las puertas para que la explotación de
esta planta se extienda mucho más y sea una alternativa verde y eficiente a las fuentes de
carbono fósil.

41
 II. OBJETIVOS

43
 Objetivos

El objeto general de este proyecto es desarrollar un método para la transformación

genética del ricino, así como profundizar en el conocimiento de la biosíntesis de ácidos grasos
y triacilgliceroles en esta planta, con el objeto final de convertirla en una plataforma para la
producción de aceites vegetales de interés industrial. Para ello se abordaron los siguientes
objetivos:

Capítulo 1
1. Desarrollo de un método rápido y eficaz de transformación transitoria en semillas de
ricino.
2. Optimización del protocolo de transformación transitoria en ricino mediante la
realización de estudios de expresión génica con diferentes promotores en el
endospermo de la semilla de ricino en desarrollo.

Capítulo 2
1. Investigar la síntesis de ácidos grasos epoxidados e hidroxilados largos durante el
desarrollo de la semilla de ricino. ricino
2. Estudiar las consecuencias de una disminución del contenido en ácido ricinoleico en
semillas en desarrollo.

Capítulo 3
1. Desarrollo de un método de transformación y regeneración adaptado a la planta de
ricino para la producción de transformantes estables.
2. Obtención de líneas de ricino que presenten una disminución del contenido en ácido
ricinoleico mediante diferentes técnicas moleculares.
3. Obtención de líneas de ricino que presenten una disminución de la toxicidad de la
semilla suprimiendo la producción de ricina mediante la técnica CRISPR/Cas9.

Capítulo 4
1. Estudio del metabolismo de ácidos grasos hidroxilados distintos al ricinoleico por parte
de la semilla de ricino en desarrollo.

45
III. MATERIALES Y MÉTODOS

47
 Materiales y métodos

1. Materiales.
1.1. Material biológico y condiciones de cultivo.
1.1.1. Ricinus communis L.
Las semillas de la variedad de ricino IN15 fueron cedidas por el Dr. Leonardo Velasco
(IAS, CSIC, Córdoba, España). Para su cultivo, las semillas fueron esterilizadas durante 20
minutos con 150 mL de una disolución al 50 % de hipoclorito de sodio conteniendo unas gotas
de Tween-20. A continuación, las semillas se aclararon con agua abundante y fueron
germinadas en placas Petri con perlita expandida húmeda, en oscuridad a una temperatura de
26 C. El crecimiento de las plantas tuvo lugar en cámaras de cultivo en condiciones
controladas. La temperatura de crecimiento fue de 26 °C constantes con un 50% de humedad
relativa. La intensidad lumínica fue de 200 µE m-2 s-1, con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h
de oscuridad. El riego se programó de forma automática una vez al día.

1.1.2. Escherichia coli.

Para el desarrollo del proyecto se usó la estirpe XL1-Blue MRF´de E.coli cuyo genotipo
figura en la tabla 3.

Tabla 3. Genotipo de la estirpe XL1-Blue MRF´. ACada abreviatura del genotipo aparece en la sección F.

ESTIRPE GENOTIPOA
XL-BLUE MRF´ Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdS MR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1
gyrA96 relA1 lacI [F′proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]
de abreviaturas.

Para su cultivo, se empleó medio LB (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) previamente

esterilizado (en autoclave a 120 °C y en una atmósfera de sobrepresión durante 21 minutos).
La temperatura estándar de cultivo de E. coli fue de 37 °C. Para los cultivos en medio líquido se
usó una agitación continua de 230 rpm en incubadoras orbitales. Generalmente, el antibiótico
de selección utilizado fue la ampicilina (Materiales y métodos ap. 1.2.). En cultivo sólido,
además se empleó habitualmente el sistema IPTG/X-Gal para la identificación de colonias
transformadas con plásmidos recombinantes.

1.1.3. Agrobacterium tumefaciens.

Para los ensayos de transformación de ricino se usó la estirpe AGL-1 de A. tumefaciens
(Lazo et al., 1991) con el genotipo que aparece en la tabla 4.

49
 Materiales y métodos

Tabla 4. Genotipo de A. tumefaciens. ACada abreviatura del genotipo aparece en la sección E de

abreviaturas.
ESTIRPE GENOTIPOA

AGL1 RecA (rif R/carb R) Ti pTiBo542DT-ADN Mop+

Para su cultivo se usó medio LB líquido o sólido igual a los descritos en el apartado anterior
(Materiales y métodos ap. 1.3.1.). La temperatura de crecimiento fue de 28 °C. Para la
selección de esta estirpe se usó rifampicina y carbonicilina a una concentración de 50mg/L
junto con el antibiótico correspondiente al vector que porte.

1.2. Antibióticos.
A continuación, se detallan los antibióticos usados para la selección de bacterias y plantas
transgénicas.
- Ampicilina: Antibiótico β-lactámico que inhibe la síntesis de la pared celular
bacteriana. La resistencia al mismo es conferida por el marcador BLA (β-lactamasa)
que codifica a una enzima periplasmática que rompe al anillo β-lactámico del
antibiótico. La concentración usada fue de 100 mg/L para E. coli.

- Kanamicina: Es un antibiótico que afecta a la subunidad 70S de los ribosomas de

bacterias. El gen de resistencia es NTPII que codifica a una neomicina fosfotransferasa
que desactiva la sustancia antibiótica mediante fosforilación. Se usó a una
concentración de 50mg/L para la selección de E. coli o A. tumefaciens transformadas.

- Rifampicina: Inhibidor de la ARN polimerasa bacteriana. La rifampicina es soluble en

metanol y la concentración usada fue de 50mg/L. Se usó para la selección de las
colonias de Agrobacterium AGL1.

- Espectinomicina: Antibiótico que se une a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano

interfiriendo en la síntesis proteica, la concentración empleada fue de 50mg/L. Se usó
para la selección de colonias de E. coli transformadas con determinados plásmidos.

- Higromicina B: Potente inhibidor de la síntesis proteica tanto en eucariotas como en

procariotas. El plásmido pCambia 1305.1 posee el gen HYGR, una potente quinasa que

50
 Materiales y métodos

confiere resistencia a este antibiótico. Para la selección de plantas transgénicas de

ricino se usó higromicina a una concentración de 30mg/L.

- Cefotaxima: del grupo de las cefalosporinas de tercera generación. Tiene un amplio

espectro de acción contra las bacterias. Actúa inhibiendo la síntesis de la pared celular
bacteriana, ha sido utilizado para la prevención del crecimiento de Agrobacterium en
cultivo in vitro a la concentración de 300mg/L.

- Carbonicilina: del grupo de las carboxipenicilinas, pertene a la familia de las penicilinas.

Es suceptible a enzimas β-lactamasa que rompen el anillo β -lactámico. Ha sido
utilizado a una concentración de 50mg/L como antibiótico de selección para
Agrobacterium.

Todos los antibióticos preparados en agua fueron esterilizados mediante filtración,

utilizándose un filtro de jeringa de acetato de celulosa de 0,2μm y 25 mm Sartorius 16534-K
(Sartorius, Goettingen, Alemania). Aquellos que fueron preparados en etanol no precisaban
esterilización.

1.3. Tampones y soluciones empleados.

1.3.1. Biología molecular
Aislamiento de ácidos nucleicos.

● TAE: 40 mM Tris-acetato y 1 mM EDTA pH 8,0.

● Geles de agarosa: 0.5-2 % agarosa (p/v) en TAE, 5 µL RedSafe (RedSafe™,
intron biotecnology, Korea del Sur) por cada 100mL de solución.
● Solución de extracción de ADN: 1 M tris-HCl pH 7.5, 5 M NaCl, 0.5 M NaCl, 0.5
M EDTA pH 8, 10 % SDS (p/v).

Cultivo y transformación de E.coli y A. tumefaciens

● Medio Luria-Bertani (LB) líquido (Sambrook et al., 1989): Triptona 1 % (p/v),

extracto de levadura 0.5 % (p/v) y NaCl 1 % (p/v). Para medio sólido se añadió agar
bacteriológico al 1.5 % (p/v).
● Medio de infiltración: Medio Murashige & Skoog (MS) (Duchefa Biochemie) 4.4
g/L, sacarosa 30 g/L, 100 µM acetosiringona.
● Medio ΨBroth: 2 % (p/v) triptona, 0.5 % (p/v) extracto de levadura, 0.4 % (p/v)
MgSO4, 10 mM KCl.

51
 Materiales y métodos

Preparación de células competentes.

● Solución TjBI: 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2·4H2O, 30 mM acetato potásico, 10

mM CaCl2, 15% (v/v) glicerol; pH 5.8 ajustado con acético 0.2 M y esterilizado por
filtración.
● Solución TjBII: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM Cl2Ca, 15% (v/v) glicerol; pH
7.0 ajustado con NaOH, esterilizado por filtración.
● Solución CaCl2: 20 mM de CaCl2.

Soluciones para la transformación y regeneración de Ricinus communis

● Medio de transformación/infiltración: Medio Murashige & Skoog (MS)

(Duchefa Biochemie, Holanda) 4.4 g/L, sacarosa 30 g/L, 100 µM acetosiringona pH
5.78.
● Medio MS-sacarosa: Medio Murashige & Skoog (MS) (Duchefa Biochemie,
Holanda) 4.4 g/L, sacarosa 30 g/L, cefotaxima 300 mg/L, agar noble 6 g/L, pH 5.78.
● Medio de elongación del eje embrionario: Medio Murashige & Skoog (MS)
(Duchefa Biochemie, Holanda) 4.4 g/L, sacarosa 30 g/L, cefotaxima 300 mg/L, 0.5 mg/L
TDZ, agar noble 6 g/L, pH 5.78.
● Medio de regeneración adventicia: Medio Murashige & Skoog (MS) (Duchefa
Biochemie, Holanda) 4.4 g/L, sacarosa 30 g/L, cefotaxima 300 mg/L, 0.5 mg/L BAP, agar
noble 6 g/L, pH 5.78.
● Medio de propagación: Medio DKW/Juglans (Duchefa biochemie, Holanda) 5.1
g/L, 0.1 g/L vitaminas medio MS, 30 g/L sacarosa, cefotaxima 300 mg/L 0.5mg/L BAP,
0.5mg/L GA, agar noble 6 g/L pH 5.78.
● Medio de enraizamiento: Medio Murashige & Skoog (MS) (Duchefa Biochemie,
Holanda) 4.4 g/L, sacarosa 30 g/L, 1mg/L IBA, pH 5.78.

Soluciones para ensayos GUS.

● Solución ensayo GUS histoquímico: 100 mM Na3PO4 pH 7.5mM, EDTA pH 8.0,
0.1 % Tritón X-100, 2.5 mM Ferricianuro de potasio, 2.5 mM Ferrocianuro de
potasio, 0.3 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolilglcuronida (X-Gluc), duchefa
biochemie (Holanda) disuelto en dimetil formamida.
● Tampón de extracción ensayo GUS fluorimétrico: KH2PO4 50 mM pH 7, 10 mM
ditioteirol, 1mM EDTA, 0.1 % sarcosinato de lauril sodio y 0.1 % Triton X-100

52
 Materiales y métodos

1.3.2. Bioquímica
● Mezcla de metilar: 2.5 % H2SO4, 10 % de tolueno y 90 % de metanol (v/v).
● Tampón de extracción para acil-CoA: 2 mL isopropanol, 2mL KH2PO4 50 mM
pH 7.2, 50 µL de ácido acético glacial y 80 µL BSA 50 mg/mL.
● Tampón de molturación para microsomas: 50 mM KH2PO4pH 7.5, 0.6 M sorbitol,
1 mM EDTA, 1 mM MgCl2.
● Mezcla de incubación, experimentos de marcaje: KH2PO4 0.1 M pH 7.2, 0.5 mM
CoASH, 5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5 mM G3P y 7.8 KBeq de ácido graso
radioactivo

2. Métodos.
2.1. Biología molecular
2.1.1. Obtención de ácidos nucleicos.
2.1.1.1. Extracción de ARN total de plantas.
Un peso de aproximadamente 0.1 g de tejido previamente congelado a -80 °C, fue
machacado en un mortero con maza estéril hasta su trituración a polvo fino con nitrógeno
líquido. El ARN total fue aislado usando el kit comercial Spectrum Plant Total ARN kit (Sigma-
Aldrich, Missouri) siguiendo las instrucciones del fabricante.

2.1.1.2. Síntesis de ADNc.

La síntesis de ADNc a partir del ARNm extraído tal y como se indica en el apartado anterior,
se realizó con el kit Ready-To-GoTM T-Primed First-Strand Kit de Amersham-Biosciences,
Nueva York, siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit utiliza la enzima
retrotranscriptasa del virus “Moloney Murine Leukemia Virus” (MMuLV) y un cebador
oligo(dT) para generar la primera cadena de ADNc.

2.1.1.3. Extracción de ADN plasmídico de bacterias.

Para la obtención del ADN bacteriano se crecieron 4 mL de cultivo de bacterias en un tubo
de ensayo durante toda la noche a 37 °C. Una vez crecido se usó el kit Isolate II Plasmid Mini
Kit (Bioline, Estados Unidos) y se siguieron las instrucciones del fabricante.

2.1.1.4. Extracción de ADN genómico de plantas.

Para la extracción de ADN genómico de plantas se congeló en primer lugar un peso de 0.1
g aproximadamente de la muestra (hoja o semilla) en nitrógeno líquido. Posteriormente se
trituró en un mortero estéril sin perder la congelación hasta conseguir un polvo fino. A

53
 Materiales y métodos

continuación, se añadieron 500 µL de tampón de extracción (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) y

se aplicó agitación en vortex durante 5 segundos para dejar reposar a temperatura ambiente
no más de 1 hora. A continuación, se centrifugó la muestra a 13000 rpm durante 5 minutos, se
tomó el sobrenadante y se depositó en un tubo estéril. Se añadió un volumen de 400 µL de
isopropanol y se mezcló con cuidado. Tras centrifugar la muestra durante 5 minutos se
descartó el sobrenadante y se evaporaron los restos de isopropanol a 40 °C. Finalmente, los
ácidos nucleicos se resuspendieron en 100µL de agua MilliQ ultrapura.

2.1.2. Estimación de la concentración de ácidos nucleicos.

Tanto la concentración como la pureza del ADN y ARN extraídos se determinó mediante
espectrofotometría usando un espectrofotómetro compacto Nanodrop 2000 de Thermo
Scientific (Massachusetts, Estados Unidos) el cual determina la concentración a una
absorbancia de 260 nm. Para determinar la pureza de la muestra, el aparato detecta también
la absorbancia a 230 nm y a 280 nm. Un índice de pureza A260/A280 de ≈1.8 es generalmente
aceptado como “puro” en cuanto ADN (≈ 2.0 para ARN). Además, también se midió el índice de
pureza a A260/A230, en este caso para el AND y el ARN un índice de pureza entre 1.8 y 2.2 es
generalmente aceptado como “puro”. El volumen tomado para el análisis es de 1 µL de
muestra.

2.1.3. Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).

2.1.3.1. Amplificación de ADN mediante PCR.
Todas las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador MJ Thermal Cycler de Bio-Rad
(California, Estados Unidos). Podemos distinguir tres tipos de reacciones de PCR en este
trabajo:

I) Reacción estándar: para la reacción estándar de PCR se usó el kit MyTaq™ Red Mix
de Bioline (Estados Unidos). El cual consiste en una disolución de enzima
polimerasa MyTaq, oligonucleótidos y el tampón de carga de ADN. Para un
volumen final de 50 µL se aportaron entre 50-1000 ng de ADN molde y una
concentración final de oligonucleótidos de 20 µM cada uno. La reacción estándar se
desarrolló con una temperatura inicial de desnaturalización de entre 1-3 min a 95
°C dependiendo si el ADN es genómico o es un plásmido. Posteriormente 35 ciclos
de 15-30 segundos de desnaturalización a 95 °C, 15 segundos de unión de los
cebadores a 2 °C menos de la temperatura media del oligonucleótido y un tiempo
variable de extensión de 30 s/kb a 72 °C en función del tamaño de ADN a

54
 Materiales y métodos

amplificar. Finalmente, la mezcla se somete a 72 °C durante 10 minutos para una

extensión final de las cadenas.

II) Reacción de alta fidelidad: En aquellos ensayos en los que la fidelidad debía ser
mayor se usó la enzima Velocity de Bioline (Estados Unidos). La enzima posee
actividad correctora, es decir, actividad 3’-5’ exonucleasa, lo que aumenta 50 veces
la fidelidad en la copia, aunque al no poseer actividad transferasa terminal, los
fragmentos sintetizados poseen extremos romos.
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µL que contenían
1XHi-Fi buffer, 1mM dNTPs, 5-500 ng de ADN molde, 1 µL de enzima y 20 µM de
oligonucleótidos. Tras una etapa de desnaturalización inicial de 2-3 min a 98 °C, la
reacción se desarrolló durante 35 ciclos de 98 °C durante 30 s, una temperatura 2
°C inferior a la de hibridación de los oligonucleótidos al molde durante 30 s y 72 °C
durante un tiempo variable de 20 s/kb. Finalmente se aplicó un tiempo de
elongación final de 10 minutos a 72 °C.

III) PCR de colonias de E. coli: mediante esta técnica podemos amplificar secuencias
directamente a partir de la colonia bacteriana sin necesidad de extracción de
material genético. El fin de la técnica es detectar la presencia o ausencia del gen de
interés en la colonia. La técnica consiste en tomar una muestra de la colonia con un
palillo estéril e introducirlo momentáneamente en un tubo de PCR con la misma
mezcla de reacción citada en el apartado I). A continuación, se cerró el tubo y se
procedió con la reacción de PCR.

IV) PCR para cultivo de A. tumefaciens: A. tumefaciens no genera tantas copias de un

mismo plásmido por lo que no tenemos suficiente molde si picamos una muestra
de biomasa de la colonia. Para llevar a cabo la PCR directamente sobre material
biológico debemos tomar 1 mL de cultivo mantenido toda la noche a 28 °C,
centrifugarlo para recuperar las células y resuspenderlo en 50 µL de agua destilada
estéril. Posteriormente se toma 1 µL de la solución de células y se añade a la
reacción de PCR con las condiciones del apartado I).

55
 Materiales y métodos

2.1.3.2. Análisis de la expresión génica mediante PCR a tiempo real o

cuantitativa.
Base teórica
La PCR en tiempo real permite conocer el nivel de expresión de un determinado gen en
función de su presencia relativa en el ARN total de la célula.
En el proceso de la PCR de tiempo real puede observarse una fase exponencial en la que se
están generando copias del ADN, cuanta más cantidad tengamos de nuestro molde antes
aparecerá la fase exponencial. En una segunda fase la reacción alcanza un estado estacionario
debido a que los componentes de la reacción comienzan a ser limitantes y la actividad
polimerasa decae.
El aumento de la cantidad de copias se detecta por medio de una señal fluorescente.
Hablamos de parámetro Ct (ciclo umbral) como el ciclo en el que la fluorescencia supera la
línea base y entra en fase exponencial.
El análisis de PCR a tiempo real se realiza a partir del ADNc obtenido a partir del ARN. Si la
expresión de nuestro gen es mayor, existirán más copias de ARN, por lo que tendremos más
representación del mismo en el ADNc total. La presencia relativa de nuestra secuencia será
mayor y se verá reflejado en la reacción de PCR a tiempo real.

Descripción de la técnica
En primer lugar, se extrajo el ARN total de la muestra a analizar (Materiales y métodos, ap.
2.1.1.1), para eliminar restos de ADN genómico se llevó a cabo un tratamiento de degradación
del mismo usando el kit DNA-free de Ambion (Estados Unidos). Una vez tratado, se cuantificó
el ARN total (Materiales y métodos ap. 2.1.2.) y tomó 1 µg para la síntesis de ADNc (Materiales
y métodos ap. 2.1.1.2) el cual sirvió de molde para las reacciones de PCR cuantitativa.
El reactivo empleado fue SYBR Green (Quiagen, Alemania). Las reacciones se llevaron a
cabo en un volumen de 25 µl, conteniendo 12 µl de QuantiTect SYBR Green PCR Mix, 2.5 mM
de MgCl2, cebadores con una concentración final de 0.3 µM y agua libre de ARNasa y ADNasa y
2 µl de ADNc.
Los oligonucleótidos empleados deben tener como producto un amplicón de unas 100pb
para que el análisis de la expresión sea lo más fidedigno posible. El tamaño óptimo de los
oligonucleótidos es de 20 pb y con un porcentaje de G más C del 50 %.
Las reacciones se llevaron a cabo en el sistema MJ Mini Personal Thermal Cycler de Bio-
Rad (California) acoplado a un cabezal Mini Opticon Real Time PCR System de Bio-Rad que
permite trabajar simultáneamente con 48 pocillos. Los ciclos aplicados constan de una
incubación inicial de 50 °C durante 2 min, un tiempo de 15’ a 95 °C para la activación de la

56
 Materiales y métodos

polimerasa, un periodo de amplificación de 40 ciclos compuestos por una fase de

desnaturalización a 94 °C durante 15 s; un periodo de hibridación a 58 °C de 30 s y una última
fase de elongación a 72 °C por 15 s. Una vez terminada la reacción se comprueba la ausencia
de dímeros de oligonucleótidos y se confirma la especificidad de los mismos observando las
curvas de desnaturalización.
El nivel de expresión puede variar en gran medida entre tejidos e incluso entre células.
Para estandarizar estos valores se toma un gen referente sobre el que se analiza la expresión
del gen de interés. En este proyecto el gen referente tomado ha sido el de la Actina de ricino
(GenBank AY360221).
Una vez obtenidos los datos numéricos de los diferentes Ct, los valores del gen de
referencia se tomaron como cero y los datos del gen de interés se relativizaron al gen de
referencia siguiendo el método de doble incremente de Ct de Livak (Livak & Schmittgen, 2001).

2.1.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa.

Para separar los fragmentos amplificados por PCR se siguió el método descrito por
Sambrook et al., (1998). Los geles se prepararon en tampón TAE, tal y como se describe en el
apartado 1.3.1. de Materiales y métodos, aplicando mayor concentración de agarosa en los
casos en los que se desea separar fragmentos de menor tamaño. En el caso de las PCR de alta
fidelidad fue necesario añadir un tampón de carga de ADN, 6X DNA Loading Dye Purple (New
Englands Biolabs, Reino Unido) ya que no viene incluido en el tampón de PCR. Para determinar
el tamaño exacto de las bandas se usaron dos marcadores distintos: 100 pb gTPbio DNA-ladder
y 1 kb gTPbio DNA-ladder (Thermo Fisher, Massachusetts, Estados Unidos). La electroforesis se
llevó a cabo en una cubeta horizontal alimentada por la fuente PowerPac (Bio-Rad, California,
Estados Unidos).
La visualización de los genes se llevó a cabo bajo luz ultravioleta en un detector de
quimioluminiscencia ChemiDoc™Imagin System (Bio Rad, California, Estados Unidos)

2.1.5. Purificación de fragmentos de ADN en geles de agarosa y productos

de PCR.
Los fragmentos aislados del gel de agarosa se extrajeron del mismo usando una cuchilla
estéril. La agarosa se eliminó y se recuperó el ADN usando el kit Isolate II PCR & Gel kit (Bioline,
Estados Unidos). Se usó el mismo kit para aquellos ensayos en los que fue necesario recuperar
el producto de PCR sin cortar la banda en el gel de agarosa.

57
 Materiales y métodos

2.1.6. Tratamientos enzimáticos del ADN.

2.1.6.1. Digestión del ADN mediante enzimas de restricción.
La restricción consiste en un corte en la doble cadena del ADN mediante endonucleasas
específicas. En este proyecto se han usado endonucleasas proporcionadas por New Englands
Biolabs (Reino Unido). Estas enzimas pueden llevar a cabo el corte en la misma secuencia que
reconocen o cerca de la región de reconocimiento (enzimas de tipo II). Las reacciones de
restricción se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del suministrador en cuanto a
composición de la mezcla de reacción, tiempo y unidades de enzima en volúmenes que
variaron entre 20 y 50 µl. Las digestiones dobles, en las que se usan dos enzimas distintas, se
realizaron usando un tampón compatible para ambas enzimas.

2.1.6.2. Ligación de fragmentos de ADN.

Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron con la enzima T4 ADN ligasa (Canvax,
España). La proporción óptima entre inserto y vector para esta enzima es de 5:1, el volumen
de ligación final fue de 10 µl y los volúmenes de inserto y vector se calculan en función de la
concentración de los mismos empleando la siguiente fórmula:

50𝑛𝑔 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑥 𝑝𝑏 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 1

=
𝑝𝑏 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑥 𝑛𝑔 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 5

En el caso de ligaciones en pMBLT se usó el kit pMBL-T de Canvax (España), ambos llevan
una cola de deoxitimina de cadena simple en el extremo 3´ del sitio de inserción facilitando la
inserción del fragmento y previniendo la religación del plásmido.
Las reacciones de ligación se llevaron a cabo durante 2 h a 22 °C, en casos en los que la
ligación es especialmente complicada la ligación se llevó a cabo a 4 °C durante toda la noche.

2.1.6.3. Secuenciación del ADN.

Las secuencias de los productos de PCR y de ADN genómico, incluyendo las secuencias
resultantes de los análisis de la progenie de plantas transgénicas y mutantes obtenidos por
CRISPR/Cas9, fueron secuenciadas. Para la secuenciación se enviaron las muestras a la
empresa Secugen, S.A. (Madrid, España) y al servicio LighRun de GATC Biotech (Konstanz,
Alemania) que emplean la técnica Illumina para la secuenciación de fragmentos de ADN. Las
secuencias obtenidas fueron analizadas empleando el programa programa BLAST 2.0 (Basic
Local Alignment Search Tools) del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Para la comprobación del correcto ensamblaje de las construcciones
génicas y de su secuencia se usó la herramienta bioinformática Geneious®.
58
 Materiales y métodos

2.1.7. Diseño y ensamblaje de construcciones genéticas.

Las construcciones genéticas empleadas en esta tesis se han diseñado con la herramienta
bioinformática Geneious®. Los oligonucleótidos usados para el ensamblaje de las estructuras
se encuentran listados en el Anexo I, las secuencias usadas de los genes empleados se
muestran en el Anexo II.

2.1.7.1. Construcción de diseños genéticos mediante técnicas clásicas.

Hablamos de técnicas clásicas cuando la estructura se ha ensamblado mediante reacciones
de restricción y ligación estándar.

2.1.7.1.1. Diseño y ensamblaje de la horquilla de silenciamiento de la hidroxilasa de

ricino.
Para el silenciamiento de la hidroxilasa de ricino se optó por construir una estructura en
horquilla o hairpin (hpARN). La estructura consta de dos brazos, sentido directo y sentido
inverso o antisentido, y un loop o lazo. Se seleccionó una secuencia de aproximadamente
100pb que tenía poca semejanza con la secuencia de la desaturasa FAD2 de ricino (para evitar
el silenciamento de ésta) (Figura 23).

Figura 23. Comparación de las secuencias nucleotídicas que codifican para la Δ12 hidroxilasa y la Δ12
desaturasa de ricino. En amarillo se muestran las regiones no coincidentes.

I) Los brazos en sentido directo y antisentido se clonaron desde ADNc de semilla de

ricino mediante PCR de alta fidelidad (Materiales y métodos ap. 2.1.3.1.) usando
oligonucleótidos específicos (Anexo I). Para que la dirección de ambos brazos
fuera la correcta se añadieron dianas de enzimas de restricción a ambos lados de
los brazos. En el caso del brazo en sentido directo las enzimas seleccionadas
fueron XhoI en el extremo 3´ y SacII en el extremo 5´. Para el brazo antisentido
(complementario al de sentido directo) se seleccionaron las enzimas EcoRI en el
extremo 5´y NdeI en el extremo 3´. La secuencia final amplificada se muestra en la
tabla 5.
59
 Materiales y métodos

Tabla 5. Sencuencias de los brazos de la secuencia hpFAH12 generada.

Nombre Secuencia 5´->3´
SacII
TGCTTACCGCGGATGTCCACTGTCATAACCAGCAACAACAGTGAGAAGAAAGGA
Brazo en
GGAAGCAGCCACCTTAAGCGAGCGCCGCACACGAACTCGAGTGCTTA
sentido directo XhoI

NdeI_
Brazo TGCTTACATATGTCCACTGTCATAACCAGCAACAACAGTGAGAAGAAAGGAGGA
antisentido AGCAGCCACCTTAAGCGAGCGCCGCACACGAATTCTGCTTA
EcoRI

II) Para el lazo o loop se usó una construcción cedida por el Dr. Edgar Cahoon
(Nebraska) que contenía en el plásmido pMBLT una secuencia procedente del
intrón de la oleil desaturasa de Camelina sativa (CsFAD2) (Anexo II), que ha sido
utilizado anteriormente y satisfactoriamente para el silenciamiento génico
(Nguyen et al. 2013). Esta secuencia estaba flanqueada por las dianas de enzimas
de restricción SacII y XhoI. Mediante reacciones de restricción y ligación se
ensamblaron los dos brazos al intrón FAD2 en el plásmido pBMLT (Figura 24.)

Figura 24. Esquema de la secuencia genética hpFAH12 insertada en el plásmido pMBLT.

III) Finalmente, la construcción que incluía los dos brazos y el intrón FAD2 se insertó
en el sitio de clonación del vector pBinGlyRed cedido por el Dr. Cahoon. El
plásmido pBinGlyRed posee un sitio de clonación flanqueado por la secuencia
promotora de la glicinina (pGly) promotor de la proteína de soja (Glycine max)
glicinina-1 (Sims & Goldberg 1989) (Anexo II) por el extremo 5´y el terminador
(3´GlyUTR; Anexo II) por el extremo 3´. Mediante restricción-ligación se insertó la
construcción 5-’EcoRI-brazo antisentido::intrónCsFAD2:: brazo en sentido directo-
XhoI-3´entre el promotor pGly y el terminador GlyUTR (Anexo II). Este casete final
(que va desde el inicio del promotor hasta el final de la secuencia terminadora)
quedó flanqueado por los sitios de restricción 5´BamHI y 3´HindIII. Mediante
digestión y ligación se extrajo el casete 5´-BamHI-pGLy::brazo

60
 Materiales y métodos

antisentido::intronCsFAD2::brazo sentido directo::GlyUTR-HindII-3´del plásmido

pBinGlyRed y se clonó en el vector pCambia 1305.1 (Figura 25).

Figura 25. Estructura final del plásmido pCambia1305.1::hpFAH12 diseñado

para silenciar la traducción del gen FAH12 en semillas de ricino.

2.1.7.1.2. Diseño y ensamblaje del gen que codifica para la elongasa de Lesquerella
fendleri (LfKCS3).

El gen LfKCS3 que codifica para la elongasa de Lesquerella fendleri fue sintetizado por
GenScript Corp., los codones de la secuencia de 1492 pb (Anexo II) fueron optimizados para
ricino y se le añadieron los sitios de restricción EcoRI y XhoI en los extremos 5’ y 3’,
respectivamente. El gen fue cedido en el plásmido pUC57. La secuencia fue cortada con las
enzimas EcoRI y XhoI e insertada en uno de los sitios de clonación del plásmido pBinGlyRed3
mediante ligación. En este plásmido, el gen LfKCS3 quedó flanqueado por pGly en el extremo
5´ y por el terminador en el extremo 3´. Finalmente, el casete completo (que incluía el
protomor, la secuencia codificante y el terminador) se amplificó mediante una PCR de alta
fidelidad y se le añadieron los sitios de restricción 5´SacI y 3´KpnI, que posteriormente se
utilizaron para insertar el casete en el sitio de clonación de pCambia 1305.1 (Figura 26).

Figura 26. Esquema del plásmido final pCambia1305.1::LfKCS3 diseñado para sobre-expresar la proteína
LfKCS3 en semillas de ricino.

61
 Materiales y métodos

2.1.7.1.3. Ensamblaje del promotor pGly en pCambia 1305.1.

En el plásmido pCambia 1305.1, el gen GUS se encuentra bajo el promotor de fuerte
expresión constitutiva, 35S. La sustición de dicho promotor por el promotor específico de
semillas, pGly, se llevó a cabo mediante digestión con las enzimas EcoRI en el extremo´5´del
promotor 35S y NcoI en el extremo 3’ y la posterior ligación con el promotor pGly. El promotor
pGly se obtuvo a partir del plásmido pBinGlyRed3 cedido por el Dr. Cahoon y se amplificó
mediante PCR de alta fidelidad con oligonucleótidos específicos (Anexo I) que contenían dianas
de restricción en 5´EcoRI y 3´NcoI. Este plásmido se denominó pCambia1305.1::pGly.

2.1.7.1.4. Obtención del plásmido pCambia1305.1 sin promotor para GUS.

Otro diseño que se generó en este trabajo fue el plásmido pCambia1305.1::nulo sin el
promotor 35S regulando al gen GUS. Este plásmidol se usó como control en diferentes
ensayos.
Para ello, se llevó a cabo una digestión de pCambia1305.1 con las enzimas EcoRI y NcoI
para eliminar el promotor 35S. Los extremos fueron tratados con la enzima Klenow (New
Englands Biolabs) para poder ser religados con la enzima T4 ligasa.

2.1.7.2. Ensamblaje en lazo o Loop Assembly para la generación de construcciones

genéticas.
La técnica de clonación en lazo o Loop Assembly (Pollak et al., 2018) consiste en el
ensamblaje de genes de forma cíclica usando enzimas de restricción de tipo II y sitios de
ligación/recombinación específicos. Las enzimas de restricción de tipo II son capaces de cortar
la doble hélice del ADN unos nucleótidos por delante del sitio de reconocimiento. Para este
tipo de ensamblaje se usan plásmidos específicos que poseen sitios de reconocimiento para
estas enzimas y secuencias de recombinación que permiten el ensamblaje en tándem de las
secuencias de una forma ordenada.
Así, se establecen determinados niveles dentro de la técnica Loop Assembly. Cuando una
secuencia concreta se encuentra clonada en un plásmido específico flanqueada por los sitios
de restricción de las enzimas de tipo II y sitios de recombinación la secuencia se dice que se
encuentra en el nivel 0 o L0.
El ensamblaje de varias secuencias en L0 usando las enzimas de tipo II y mediante
recombinación dará lugar al nivel L1.
La unión de varias secuencias encadenadas en L1 utilizando el mismo método dará lugar a
la unión de varias ORF para formar el nivel 2, L2. El proceso puede repetirse sucesivamente
para formar estructuras genéticas complejas de una forma simple y rápida.

62
 Materiales y métodos

Las reacciones de restricción y ligación no suceden en pasos distintos como sucede en los
métodos clásicos, sino que ocurren en una sola reacción. Dichas reacciones se llevaron a cabo
en un volumen final de 20 µL, con 200 ng de plásmido aceptor, plásmido donador o inserto en
una ratio 2:1 molar, 1.5 µL de tampón de la ligasa T4 de New England Biolabs (Reino Unido),
1.5 µL de una disolución de BSA al 10 % (p/v), 200 unidades de la ligasa T4 de NEB y 5 unidades
de la enzima de restricción a usar.
La reacción consiste en una serie de ciclos de temperatura para que actúen tanto la ligasa
como la enzima de restricción. Esos ciclos son 20 s 37 C, 26 ciclos de 3 min a 37 C y 4 min a
16 C. Una vez terminados los 26 ciclos se aplica 50 °C durante 5 min para desactivar la ligasa y
80 C durante 5 min para desactivar las enzimas de restricción.
Una vez terminada la reacción las secuencias se habrán unido siguiendo los sitios de
recombinación diseñados.

2.1.7.2.1. Clonación y ensamblaje del gen que codifica para la epoxigenasa de Stokesia
laevis (SlEPX) con hpFAH12.

La secuencia de la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis (SlEPX) se obtuvo por síntesis

artificial en Eurofins Genomics y fue cedida en el plásmido pEX-A258. La secuencia usada está
adaptada la maquinaria metabólica de ricino y se muestra en el anexo II. Todos los plásmidos
usados para generar la construcción fueron cedidos por el Dr. Richard Smith y la Dra. Irene
González de Rothamsted Research (Reino Unido). El proceso de clonación y preparación del
gen para su expresión en ricino fue el siguiente:
1) Formación de un plásmido L0 con el promotor pGly: se clonó mediante PCR el
mencionado promotor, al cual se le añadió tanto en el extremo 5´como en el extremo
3´ un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BpiI y un sitio Pre-BsaI que
dará lugar a un corte con dicha enzima en el plásmido aceptor. La secuencia se
flanqueó con el sitio de recombinación GGAG en el extremo 5´y AATG en el extremo 3´
usando oligonucleótidos específicos (Anexo I). Mediante digestión con BpiI y ligación en
la misma reacción, se insertó el promotor pGly en el plásmido pAGM9121. El resultado
fue el promotor pGly inserto en el plásmido pAGM9121 flanqueado por sitios de
restricción para BsaI y por las secuencias de recombinación anteriormente citadas.
2) Formación de un plásmido L0 con el gen de la epoxigenasa de Stokesia laevis: El
procedimiento fue el mismo que para el promotor pGly, se cambiaron los extremos de
recombinación por las secuencias AATG en el extremo 5´y la secuencia GCTT en el
extremo 3´.

63
 Materiales y métodos

3) Preparación de un producto de PCR con el terminador Gly-UTR: Debido a que esta

secuencia poseía sitios de restricción para BpiI no pudimos elaborar un plásmido L0,
algo sumamente útil dado que una biblioteca de genes el L0 nos permite ensamblar los
genes sin necesidad de volver a clonarlos. Para poder usar el terminador Gly-UTR en la
reacción, se clonó por PCR añadiendo dianas de BsaI en ambos extremos y flanqueada
la secuencia con los sitios de recombinación GCTT en el extremo 5´y CGCT en el
extremo 3´ (Figura 27), oligonucleótidos en Anexo I.

El plásmido aceptor fue Lk_1, el cual presenta los sitios de recombinación GGAG en el
extremo 5´y el sitio CGCT en el extremo 3´precedidos de sitios de restricción de BsaI. Ambos
sitios coinciden con el sitio GGAG del extremo 5´del promotor y el sitio CGCT del extremo 3´del
terminador. Las secuencias intermedias tanto del promotor como del gen de la epoxigenasa
como del terminador coinciden entre sí de forma concatenada (Figura 27)
Tras una reacción conjunta de restricción con BsaI/ligación con T4 se ensamblaron todas
las partes para obtener 5´-pGly::SlEPX::Gly-UTR-3´ (Figura 27). Además, se añadieron los sitios
de restricción de KpnI en 5´ y BamHI en 3´ para la posterior digestión de la construcción
completa y su inserción en el sitio de clonación de pCambia 1305.1 que ya portaba la
estructura del hairpin para el silenciamiento de la hidroxilasa (hpFAH12), este plásmido se
denominó Este plásmido se denominó pCambia::SlEPX::hpFAH12.

1.1.1.1.1. Diseño y ensamblaje de la maquinaria genética de CRISPR/Cas9.

Todos los plásmidos usados para el ensamble de los genes necesarios para llevar a cabo la
edición genética mediante CRISPR/Cas9 fueron cedidos por el Dr. Vladimir Nekrasov de
Rothasmed Research (Reino Unido). Los pasos que se siguieron se detallan a continuación:

a) Selección de dianas para CRISPR. La selección de unas dianas correctas es crucial para
que la técnica CRISPR/Cas9 tenga éxito. En este proyecto se seleccionaron 2 dianas
para la mutación del gen de la hidroxilasa Δ12 de ricino y 2 dianas para la mutación de
la familia de genes de la ricina.

64
 Materiales y métodos

Figura 27. Ensamble del gen SlEPX mediante Loop Assembly. El terminador Gly-UTR 3´se generó por PCR de alta fidelidad y
se añadió en una segunda reacción para insertar el conjunto en Lk1.

En el caso de la hidroxilasa de ricino se seleccionaron aquellas dianas con el menor

número de OFF-Targets posible, esto es, dianas a las que la guía pueda unirse por
error. Las dianas 1 y 2 se diseñaron para ser usadas a la vez y distan 132 nucleótidos.
Además, cuentan con sitios de restricción (BsrDI para la guía 1 y Fnu4HI para la guía 2)
en el lugar de corte de la proteína Cas9. Al usar el promotor U6, las dianas deben
presentar una guanina en el extremo 5´ y el dominio PAM NGG-3´. En el caso de la
ricina se seleccionaron aquellas dianas con numerosos OFF-targets en la subunidad A,
para asegurar mutaciones en el mayor número posible de genes que codifican
proteínas RIP y aglutininas (Introducción ap. 1.4.1.). Las dianas 1 y 2 distaron 16 pb
entre sí, presentaron además dos sitios de restricción (HpyCH4II para la diana 1 y HaeII
para la diana 2) en el sitio de corte de Cas9. Al igual que las dianas para la hidroxilasa,

65
 Materiales y métodos

al usar el promotor U6, éstas deben presentar una guanina en el extremo 5´y el
dominio PAM NGG-3´. Las dianas seleccionadas se muestran en la tabla 6:

Tabla 6. Dianas de Cas9 seleccionadas para el gen de la hidroxilasa de ricino y la ricina. Marcado en
amarillo aparecen los dominios PAM (NGG) (CCN si el sentido es inverso) y la G (C si el sentido es
inverso) inicial acorde con el promotor U6. Las zonas subrayadas corresponden a las dianas de las
enzimas de restricción: BsrDI para la diana 1 de la hidroxilasa y Fnu4HI para la diana 2 de la hidroxilasa; y
HpyCH4II para diana 1 de la ricina y HaeII para la diana 2de la ricina.
Nombre Secuencia (5´->3´) Sentido

Hidroxilasa diana 1 CCACCCCATTGCTTTGAACGCTC Inverso

Hidroxilasa diana 2 CCAAGGCTGCATTCTCACTGGTC Inverso

Ricina diana 1 CCAACGGTTTATTTTAGTTGAAC Inverso

Ricina diana 2 GCTTTCTGTTACATTAGCGCTGG Directo

b) Formación de construcciones L0 y L1 con las guías 1 y 2: Las guías de ADN se clonaron

a partir de las dianas seleccionadas. Mediante PCR de alta fidelidad (Materiales y
métodos ap. 2.1.3.1) se construyeron las secuencias ARNsg para cada diana (Anexo II).
En la guía 1 se añadieron las dianas de restricción de BsaI en ambos extremos, además
se introdujeron las secuencias 5´-ATTG y CGCT-3´. También se usó el plásmido
pICSL9002 que porta el promotor U6 flanqueado por los sitios 5´-GGAG y ATTG-
3´seguido de los sitios de restricción de BsaI en ambos extremos. El plásmido aceptor
fue pICH47742, que lleva los sitios de recombinación 5´-GGAG y CGCT-3´precedidos de
sitios de restricción de BsaI. Además, pICH47742 cuenta con los sitios de
recombinación 5´-GCAA y ACTA-3´seguidos de un sitio diana para BpiI que servirán
para la formación de L2. Todos los oligonucleótidos utilizados aparecen en el Anexo I.
Tras una reacción de restricción/ligación conjunta con BsaI y T4 ligasa se obtuvo
pICH47742::pU6::guía1 con extremos de recombinación 5´-GCAA y ACTA-3´ como L1
(Figura 28). Para la guía 2 el procedimiento fue el mismo, aunque plásmido aceptor
usado fue pICH47751 que posee sitios de recombinación diferentes. El resultado fue
pICH47751::pU6::guía2 con extremos de recombinación 5´-ACTA y TTAC-3´ como L1.
(Figura 29).

66
 Materiales y métodos

Figura 28. Ensamblaje del promotor U6 junto con la guía 1 para Cas9 mediante la técnica de
Loop Asembly. Las guías se añadieron mediante PCR de alta fidelidad.

c) Ensamblaje final y formación del nivel L2. Para la obtención de la estructura genética
funcional se ensamblaron los plásmidos pICH47732 (que porta la enzima Cas9 junto
con el promotor 2x35S y el terminador NOS con los sitios de recombinación 5´-TGCC y
GCAA-3´), el plásmido pICH47742 (con el promotor U6 y la guía 1 flanqueados por las
secuencias 5´-GCAA y ACTA-3´) y el plásmido pICH47751 (con el promotor U6 y la guía
2 flanqueados por las secuencias 5´-ACTA y TTAC-3´). En este caso las secuencias de
recombinación no encajaron con las del plásmido aceptor por lo que se usó el
plásmido pICH41766 con las secuencias 5´-TTAC y GGGA-3´, que sirvió de unión entre
los extremos de recombinación. Todos los plásmidos presentaron un sitio de
restricción para BpiI tras la secuencia de recombinación. El plásmido aceptor fue
pICSL4723 con los extremos 5´-TGCC y GGGA-3´ precedidos del sitio de restricción de
BpiI. Tras una reacción de restricción con BpiI/Ligación con T4 se obtuvo la
construcción final L2 pICSL4723::2x35S::Cas9::NOST::pU6::Guía1::pU6::Guía2 (Figura
30).
d) Este procedimiento se llevó a cabo para todas las construcciones de CRISPR/Cas9
realizadas en el presente trabajo.

67
 Materiales y métodos

e) Finalmente, la construcción final se amplificó por PCR de alta fidelidad añadiendo sitios
de restricción para KpnI en ambos extremos. La construcción se insertó en el sitio de
clonación de pCambia 1305.1.

Figura 29. Ensamblaje del promotor U6 junto con la guía 2 para Cas9 mediante Loop Assembly.

2.2.7. Transformación de bacterias.

2.2.7.1. Transformación de E.coli mediante choque térmico.
El método seguido fue el descrito por Sambrook et al. (1989). Un volumen de 7.5 µL de
reacción de ligación, 0.5 µL si el ADN proviene de una purificación de un ADN plasmídico un
cultivo de bacterias, se mezcló con 100 µL de células competentes. La mezcla se incubó
durante 20 min en hielo, tras ese periodo se procedió a aplicar un choque térmico a 42 °C
durante 45 s. Inmediatamente después se añadieron 250 µL de medio LB y se incubó en
agitación (220 rpm) a 37 °C durante 1 h. Transcurrido ese tiempo se sembraron los 250 µL en
una placa LB sólido con los antibióticos específicos para cada plásmido.

68
 Materiales y métodos

Figura 30. Ensamblaje final del gen Cas9 junto con el promotor, el terminador y las dos guías bajo el promotor U6 utilizando la
técnica de Loop Asembly. La unión de varias estructuras en L1 forma una estructura más compleja que denominamos L2.

Así mismo, todos los plásmidos portaban el gen de la β-galactosidasa bajo un promotor
inducible con IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) que sería interrumpido por el gen
inserto. Así, las colonias recombinantes serían incapaces de degradar el compuesto 5-bromo-
4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) que da a las mismas una coloración azul y por lo
tanto pueden distinguirse de las no recombinantes (que serían azules) por su color blanco.
Para ello se suplementó el medio sólido de cultivo con 250mg/L de X-gal como sustrato y 250
mg/L IPTG como inductor.

Posteriormente se llevó a cabo una segunda comprobación de las colonias positivas

mediante la técnica de PCR de colonias (Materiales y métodos ap. 2.1.3.1.).

2.2.7.2. Transformación de E.coli mediante choque térmico.

El método seguido fue el descrito por Sambrook et al. (1989). Un volumen de 7.5 µL de
reacción de ligación, 0.5 µL si el ADN proviene de una purificación de un ADN plasmídico un
cultivo de bacterias, se mezcló con 100 µL de células competentes. La mezcla se incubó

69
 Materiales y métodos

durante 20 min en hielo, tras ese periodo se procedió a aplicar un choque térmico a 42°C
durante 45 s. Inmediatamente después se añadieron 250 µL de medio LB y se incubó en
agitación (220 rpm) a 37°C durante 1 h. Transcurrido ese tiempo se sembraron los 250 µL en
una placa LB sólido con los antibióticos específicos para cada plásmido.

2.2.7.3. Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens

para su transformación por choque térmico.
La cepa usada fue AGL1 (Materiales y métodos ap. 1.1.3.). Las células se incubaron a 28 °C
en una placa de LB sólido suplementada con 50 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de
carbonicilina. Tras tres días de incubación se tomó biomasa de una colonia aislada para
establecer el pre-inóculo de 5 mL de cultivo, el cual se incubó toda la noche a 28 °C.
Posteriormente, se tomó un volumen de 300 µL del cultivo anterior para inocular 50 mL de LB
líquido con los mismos antibióticos. El cultivo de 50 mL se mantuvo en agitación continua a
230 rpm en un matraz Erlenmeyer de 250 mL hasta que la D.O.600 fue de 0.2
(aproximadamente 16h). Una vez crecido y enfriado en hielo, se centrifugó el cultivo en tubos
de 50 mL a 4000 x g durante 10 min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y las células se
resuspendieron en un volumen de 50 mL de MgSO4 10 mM. Estas células fueron de nuevo
centrifugadas en las mismas condiciones y finalmente se resuspendieron en 1mL de una
solución de CaCl2 20 mM. La suspensión se dividió en alícuotas de 100 µL que se congelaron
con nitrógeno líquido para conservarse a -80°C.

2.2.7.4. Transformación de A. tumefaciens mediante choque térmico.

Para la transformación de A. tumefaciens se tomó una alícuota de células competentes y
se les añadió 1 µg de ADN del plásmido apropiado. Tras descongelarse completamente la
alícuota en hielo, se aplicaron 37 °C durante 5 minutos. Una vez aplicado el choque térmico se
añadió 1 mL de medio LB líquido sin antibióticos para incubarse durante 3 horas a 28 °C en
agitación continua de 230 rpm. Transcurrido ese tiempo se centrifugó la muestra para
recuperar las células y resuspenderlas en 100 µL de medio LB. Finalmente se tomaron los 100
µL y se sembraron en una placa de LB sólido suplementado con 50 mg/L de rifampicina, 50
mg/L de carbonicilina y el antibiótico de selección del plásmido usado en la transformación.
Las colonias aparecieron 3 días después de la transformación.
Para la comprobación de las colonias se tomó biomasa de una colonia y se inocularon 5mL
de LB líquido a 28 °C durante toda la noche en agitación continua de 230 rpm y con los
antibióticos apropiados. Se centrifugó 1 mL de cultivo para recuperar las células las cuales se

70
 Materiales y métodos

resuspendieron en un volumen de 50 µL de agua destilada autoclavada. Finalmente se

tomaron 2 µL como molde para llevar a cabo una PCR estándar.

2.2.7.5. Preparación del cultivo de Agrobacterium tumefaciens para la

transformación de ricino.
En todos los métodos de transformación de ricino seguidos en este proyecto se preparó el
cultivo de Agrobacterium de la forma que se describe a continuación.
En primer lugar, se preparó un preinóculo de 5 mL en LB líquido, suplementado con los
antibióticos apropiados, con la biomasa de una colonia de Agrobacterium portadora del gen a
transferir a Ricinus communis. El cultivo se mantuvo toda la noche a 28°C con agitación
continua de 230 rpm.
A continuación, se tomaron 300 µL del pre-inóculo y se añadieron a 50 mL de LB líquido con
los antibióticos adecuados, el cultivo se mantuvo a 28 °C en agitación continua de 230 rpm
hasta alcanzar una O.D.600 de 0.2. Las células resultantes se sedimentaron por centrifugación a
4000 x g durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en un volumen
de 50 mL de una solución 10 mM de MgSO4. A continuación las células se volvieron a recuperar
por centrifugación y se resuspendieron en 50 mL de solución de infiltración (Materiales y
métodos 1.3.1.). El cultivo se mantuvo en oscuridad a 20 °C en agitación continua a 230 rpm
durante al menos 3 horas antes de ser utilizado.

2.2.8. Transformación génica de ricino mediante A. tumefaciens.

En todos los métodos de transformación de ricino realizados en este trabajo, se usó
Agrobacterium tumefaciens cepa AGL1 como vector. Dentro de los métodos de transformación
podemos diferenciar el método de transformación transitoria, el cual no necesita protocolo de
regeneración y los métodos de transformación estables, los cuales sí necesitan protocolo de
regeneración in vitro.

2.2.8.1. Transformación transitoria de la semilla de ricino.

Para la transformación transitoria se emplearon dos métodos diferentes: método in vivo y
método in vitro.

2.2.8.1.1. Transformación transitoria in vivo.

La transformación transitoria in vivo se llevó a cabo a través de la infiltración de una

solución de A. tumefaciens AGL1 en el endospermo de la semilla de ricino en desarrollo.

71
 Materiales y métodos

En la infiltración se usó una suspensión de Agrobacterium incubada en oscuridad en medio

de infiltración (Materiales y métodos ap 1.3.1.). La solución se infiltró mediante inyección
directamente en el endospermo de la semilla de ricino a través del fruto en la planta. Para ello
se usó una jeringa con una aguja hipodérmica de 0.33 mm. El volumen de infiltración fue de
300 µL por fruto (Figura 31).
Las semillas infiltradas se recogieron en un periodo de tiempo variable en función del
ensayo a llevar a cabo. Dependiendo del análisis a realizar, se alteraron las condiciones de
recogida de las muestras, aunque todas las semillas fueron extraídas previamente del fruto.
Para el ensayo GUS histoquímico o fluorimétrico la semilla no se congeló, sino que se empleó
tejido fresco. Para la extracción de ADN o ARN el tejido se congeló en nitrógeno líquido y se
conservó a -80°C. Para análisis en cromatografía de gases las muestras se congelaron a -20°C.

Figura 31. Fotografía del momento de infiltración en el fruto de ricino. La aguja hipodérmica atraviesa
todas las capas del fruto y la cáscara de la semilla hasta llegar al endospermo.

Además, se realizaron pruebas de PCR para diferentes transgenes en la semilla, tomando

como molde tanto ADN como ADNc procedente de ARN. Los oligonucleótidos utilizados se
detallan en el Anexo I.

2.2.8.1.2. Transformación transitoria in vitro. Método de

transformación asistido por sonicación SAAT.
El método seguido fue el descrito por Chileh T. et al. (2010). El fruto se extrajo de la planta
y se esterilizó durante 20 minutos en una solución al 50% (v/v) de hipoclorito sódico con unas
gotas de Tween-20. Una vez estéril, la semilla se diseccionó del fruto en condiciones de
esterilidad con pinzas y escalpelo. Ya diseccionada, la semilla se dividió en dos mitades que se
72
 Materiales y métodos

depositaron en tubos de microcentrífuga conteniendo medio de transformación (Materiales y

métodos ap. 1.3.1). Una vez diseccionadas todas las semillas se sustituyó el medio de
transformación por la solución de Agrobacterium preparada y descrita en Materiales y
métodos ap. 2.1.8.5.) Posteriormente se aplicó el método de transformación asistido por
sonicación (SAAT) en el que la semilla de ricino diseccionada y en la solución de Agrobacterium
se sometió a un tratamiento de sonicación durante 15 s bajo una frecuencia de 40 kHz en
sonicador (Branson 3510 MT) con el fin de provocar heridas que faciliten la infección a
Agrobacterium.
Una vez transformadas, las semillas se lavaron con agua destilada y se depositaron sobre
una placa de medio MS-sacarosa sólido, 2.2 g/L de MS, 30 g/L de sacarosa, 100 µM de
acetosiringona, 6 g/L de agar noble. Tras un periodo de co-cultivo de 2 días a 26 °C con un
fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, las semillas se transfirieron a placas de MS-
sacarosa suplementado con 500 mg/L de cefotaxima para detener el crecimiento de
Agrobacterium durante 3 días más. Una vez transcurridos los 3 días las semillas fueron
analizadas con ensayo GUS histoquímico.

2.2.8.2. Métodos de transformación estable y regeneración de ricino.

2.2.8.2.1. Transformación y regeneración directa.
El tejido seleccionado para la realización de la transformación estable fue el eje
embrionario. Las semillas de ricino fueron peladas y esterilizadas en una solución al 10 % (v/v)
de hipoclorito sódico con unas gotas de Tween-20 y se le aplicaron 3 lavados de 5 minutos con
agua destilada autoclavada en condiciones de esterilidad. Posteriormente se mantuvieron en
imbibición durante un periodo no menor de 2 días a 26 °C en oscuridad.
Una vez hidratadas las semillas, se diseccionaron los embriones en condiciones de
esterilidad con escalpelo y pinzas. Los embriones se sumergieron en la disolución de
Agrobacterium descrita en el apartado 2.1.8.5. de Materiales y métodos para ser
transformados aplicando ultrasonidos durante 5 segundos usando la técnica SAAT.
Posteriormente los embriones se lavaron con agua destilada autoclavada y se eliminó el
exceso de agua con una gasa estéril para depositarlos en placas de medio sólido de
transformación, manteniéndose en co-cultivo durante 1 día a 26 °C y en oscuridad.
Tras el periodo de co-cultivo de transfirieron a tubos que contenían medio MS-sacarosa
(Materiales y métodos ap. 1.3.1.) suplementado con higromicina a 30 mg/mL para poder
seleccionar los embriones transformados. Los embriones permanecieron en este medio
durante 9 días a 26 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.

73
 Materiales y métodos

Se eliminó la radícula de los ejes germinados supervivientes y se transfirieron a medio de

propagación suplementado con 30 mg/L de higromicina. En este medio se incubaron los ejes a
26 °C con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad. Tras dos semanas, se eliminó el
hipocótilo y los brotes se transfirieron a tubos con medio de propagación (Materiales y
métodos ap. 1.3.2.) hasta obtener brotes de más de 2.5 cm de longitud.
Los brotes ya crecidos se transfirieron a tubos con medio de enraizamiento (Materiales y
métodos ap. 1.3.1.) donde permanecieron en balancín con agitación continua durante 3 días a
28 °C, fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Pasados los 3 días se transfirieron a tubos
con medio MS-sacarosa sólido (Materiales y métodos 1.3.1.), sin reguladores y suplementado
con 300 mg/L de cefotaxima donde permanecieron hasta formar raíces, entre 1 y 3 semanas.
Una vez enraizados, los brotes se transfirieron a tierra, el sustrato empleado fue turba
húmeda y los brotes permanecieron al menos los tres primeros días en alta humedad relativa
que fue descendiendo gradualmente.

2.2.8.2.2. Transformación y regeneración adventicia.

Para este método, las semillas se esterilizaron y permanecieron en imbibición durante 3
días al igual que el apartado anterior. Los embriones fueron diseccionados en condiciones de
esterilidad y se aplicaron cortes en el extremo apical del eje embrionario. Posteriormente se
aplicó la técnica SAAT, al igual que en el apartado anterior.
Los ejes sometidos a ultrasonidos y transformados se transfirieron a placas con medio de
transformación (Materiales y métodos ap. 1.3.1.), donde permanecieron en co-cultivo durante
1 día. Una vez pasado el periodo de co-cultivo, los ejes se lavaron con agua destilada
autoclavada y se secaron con una gasa estéril para depositarlos en una placa con medio de
elongación del eje embrionario (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) suplementado con 30 mg/L
de higromicina donde permanecieron durante 7 días a 26 °C en oscuridad.
Los ejes elongados supervivientes se transfirieron a placas con medio de regeneración
adventicia (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) suplementado con higromicina a 30 mg/L donde
permanecieron durante 2 semanas a la temperatura de 26 °C y con fotoperiodo de 16 h de luz
y 8 h de oscuridad.
Una vez superadas las dos semanas en medio de regeneración adventicia con higromicina,
se procedió a retirar la higromicina del medio e incubar los ejes en las mismas condiciones
hasta obtener ejes laterales.
Los ejes laterales fueron diseccionados e incubados en tubos con medio de propagación
hasta obtener ejes de al menos 2.5 cm de longitud. Una vez obtenidos, los ejes siguieron el

74
 Materiales y métodos

mismo tratamiento que en la regeneración directa descrita en el apartado anterior hasta

llevarlos a tierra.

2.2.8.2.3. Selección de plantas transgénicas.

Una vez se obtuvieron plantas transformadas se extrajo su ADN (Materiales y métodos ap.
2.1.1.4.) se realizaron pruebas de PCR (Materiales y métodos ap. 2.1.3.1.) para los distintos
transgénicos obtenidos. Los oligonucleótidos usados se detallan en el Anexo 1.
En el caso de las plantas a las que se aplicó CRISPR/Cas9, su ADN se trató con las enzimas de
restricción seleccionadas para cada diana (Materiales y métodos ap. 2.1.7.2.2.) para después
realizar una amplificación por PCR. La banda resultante se envió al servicio de secuenciación
(Materiales y métodos ap. 2.1.6.3.) para verificar la presencia de mutaciones en el sitio de
restricción. También se enviaron bandas de PCR obtenidas a partir de ADN no tratado con
enzimas de restricción para aquellos casos en los que la mutación provocada por Cas9 no
coincidiese con el sitio de restricción de las enzimas.

2.2.9. Ensayo de actividad GUS histoquímico.

La caracterización histoquímica de tejidos transformados se llevó a cabo mediante la
incubación del tejido en una solución de ensayo GUS histoquímico (Materiales y métodos ap.
1.3.1.) (Jefferson et al., 1987). Se aplicó un leve vacío con el fin de que la solución llegase a
todas las células para después incubar el tejido toda la noche a 37 °C en oscuridad y con
agitación (220 rpm), sumergido en la solución descrita.
Posteriormente el tejido se transfirió a una solución al 70 % (v/v) de etanol y agua destilada
y se incubó una noche más a 37 °C y 220 rpm. Finalmente la muestra se conservó en una
solución de etanol:glicerol al 50 % a 4 °C.

2.2.10. Ensayo de actividad GUS fluorimétrico.

La actividad GUS también se midió en semillas transformadas de forma transitoria
siguiendo el ensayo de actividad GUS fluorimétrico (Jefferson, 1987). Para llevar a cabo el
ensayo se pesaron entre 50-100 mg de endospermo que fueron homogeneizados en tubos de
microcentrífuga en un volumen de 0.5 mL de tampón de extracción de ensayo GUS
fluorimétrico enfríado sobre hielo (Materiales y métodos ap. 1.3.1.). Los homogenados
resultantes fueron centrifugados a 13000 x g durante 20 min a 4 °C.
Los sobrenadantes se recuperaron y se ensayó la actividad GUS en ellos. El medio de
ensayo consistió en un volumen de 225 µL de de ácido 4-trifluorometillumbeliferril-β-D-
glucurónico 0.6 mM en tampón de extracción con 50 µL de cada sobrenadante. La mezcla se

75
 Materiales y métodos

incubó a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente se tomaron alícuotas de 25 µL que se

mezclaron con 225 µL de Na2CO3 0.2M en una placa de lectura de fluorescencia.
La fluorescencia emitida fue detectada con el escáner de multifluorescencia Fluoroskan
Ascent (Thermo Fisher) usando el par de absorbancia de 355/460 nm. La actividad fue medida
en base a la fluorescencia emitida por peso fresco. Las actividades se calcularon empleándose
una recta de calibración previamente establecida con diferentes concentraciones de 4-metil
umbeliferona.

2.3. Técnicas bioquímicas.

2.3.7. Extracción de lípidos totales.
Para la extracción de lípidos totales de la semilla de ricino se usó el método Hara- Radin
(Hara & Radin, 1978). Para ello se añadieron 6ml de una mezcla 3:2 (v/v) de
hexano/isopropanol a la semilla de ricino sin cáscara y previamente pesada. La semilla de
trituró para después calentarse a 80 °C durante 10 minutos. No se sometieron a 80 °C aquellas
muestras en las que se quería cuantificar ácidos grasos epoxidados. Una vez frío se añadieron
3 mL de Na2SO4 al 6.7 % (p/v) y se agitó vigorosamente para después centrifugar durante 10
min a 1000 rpm. Se extrajo la fase superior y se depositó en un tubo limpio. El residuo acuoso
se volvió a extraer con 4.5 mL de una mezcla 7:2 (v/v) de hexano/isopropanol y se volvió a
centrifugar. Se recuperó la fase superior que se combinó con la fase orgánica extraída
anteriormente.

2.3.8. Metilación de muestras.

La metilación consiste en la formación de ésteres metílicos a partir de ácidos grasos
mediante el proceso de transesterificación. Para ello se añadieron 2 mL de mezcla de metilar
(Materiales y métodos 1.3.2.) a 2 mg de aceite a los que se añadieron previamente 0.25 mg del
patrón interno triheptadecanoína (THD). La reacción tuvo lugar a 90°C durante 1 hora.
En aquellos casos en los que no podía someterse la muestra a altas temperaturas, la
metilación se llevó a cabo en frío con 2 mL de KOH 2 M en metanol durante 15 minutos.
Los ésteres metílicos fueron recogidos en 2 mL de heptano los cuales se evaporaron en
atmósfera de nitrógeno.

2.3.9. Silanización de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxilados.

Para el análisis en cromatografía de gases de las muestras que contenían ácidos grasos
hidroxilados, se llevó a cabo una silanización previa de las mismas. Tras esta reacción los
ésteres metílicos de los ácidos grasos hidroxilados se transforman en sus correspondientes

76
 Materiales y métodos

trimetilsilil derivados. Para ello, la disolución de ésteres metílicos en hexano o heptano

obtenida en el apartado anterior se evaporó bajo corriente de nitrógeno. A continuación, el
residuo seco se trató con un volumen de 100 µL de mezcla de silanizar consistente en una
mezcla de clorotrimetil silano, hexametil disilazano y piridina seca en una proporción de
0.5:2:6 (v/v/v) al residuo de ésteres metílicos. La mezcla se dejó reaccionar durante 30 min a
temperatura ambiente, tras lo cual se añadieron 2 mL de heptano y se procedió al análisis
mediante cromatografía de gases.

2.3.10. Análisis de la composición de ácidos grasos mediante cromatografía

de gases (GC).
Los ésteres metílicos se analizaron mediante cromatografía gaseosa en un cromatógrafo
Agilent Technologies (California) 6890 Series GC System, con una columna capilar de sílice
fundida Quadrex (30m de longitud, 0.25 mm de luz interna y 0.1 µm de grosor) y un detector
de ionización de llama. El gas portador fue nitrógeno con un flujo de 40 ml/min.
La temperatura del detector fue de 220 °C, la del inyector fue de 200 °C, la temperatura del
horno 180 °C y la razón de división de la muestra (“Split”) 1:20, siendo el tiempo para cada
análisis de 20 min.
Se utilizó una rampa de presión empezando a 80 KPa durante 4 min y se fue aumentando la
velocidad de 10 en 10 KPa/min hasta llegar a 100 KPa/min. Por último, se llegó a 220 KPa/min
aumentando la velocidad de 30 en 30 KPa/min. La identificación de los picos cromatográficos
correspondientes a los ácidos grasos se determinó por comparación de patrones conocidos.

2.3.11. Análisis de acil-CoAs.

Los acil-CoAs fueron extraídos de la semilla en desarrollo y derivatizados a sus

correspondientes acil-eteno siguiendo el método de Larson y Graham (2001). Se pesaron 150-
250 mg de endospermo y se trituraron en un tubo de microcentrífuga después de añadir 1
nmol de heptadecanoil-CoA como patrón interno y 250 µL de tampón de extracción para acil
CoA (Materiales y métodos ap. 1.3.2.). El tejido fue triturado con la ayuda de una micromaza y
los lípidos fueron extraídos 3 veces en 200 µL de hexano saturado con isopropanol y agua.
Posteriormente se añadieron 5µL de una disolución saturada de sulfato de amonio, las
proteínas fueron precipitadas añadiendo 600 µL de una mezcla 2:1 (v,v) de
metanol/cloroformo. Los tubos fueron agitados y centrifugados a 13000rpm durante 2 min.
Los sobrenadantes fueron transferidos a tubos limpios y evaporados en atmósfera de
nitrógeno a 40 °C. Los residuos secos fueron disueltos en 40 µL de cloracetaldehído (0.5 M de

77
 Materiales y métodos

cloracetaldehído disuelto en 0.15 M de un tampón ácido cítrico/citrato pH 4, 0.5 % (p/v) de

SDS) y sometido a análisis por HPLC.
Los acil-CoA eteno derivados fueron analizados en un módulo de separación Waters 2695
dotado de una columna XBridge C18 (250 x 0.5 mm, 5µm de luz; Waters) y un detector de
fluorescencia Multi λ 2475 (Waters) usando una versión modificada del sistema de gradiente
cuaternario descrito por Larson y Graham (2001).
Los disolventes consistieron en A: ácido acético al 1 %; B: 90 % acetonitrilo, ácido acético al
1%; C: 0.25 %, trimetilamina, 0.1 % de tetrahidrofurano; D: 90 % acetonitrilo. El flujo fue de
0.75 mL/min y la temperatura de análisis 40 °C. El perfil del gradiente de elución se recoge en
la tabla 7:

Tabla 7. Perfil del gradiente utilizado para el análisis de acil-CoA.

Tiempo Composición inicial Composición final
0 – 7.0 min 90: 10 A – B 20: 80 A– B
7.0 – 7.1 min 20: 80 A – B 20: 80 B – C
7.1 – 9.0 min 20: 80 B – C 90: 10 C – D
9.0 – 34.0 min 90: 10 C - D 25: 75 C - D
34.0 - 35.0 min 25: 75 C – D 100 D
35.0 – 39.0 min 100 D 100 D
39.0 – 40.0 min D 100 90: 10 A– B
40.0 - 45.0 min 90: 10 A – B 90: 10 A – B

El detector fue fijado con una longitud de onda de excitación de 230 nm y una detección
de 420 nm. Los picos se cuantificaron atendiendo a la señal de un patrón interno. Los datos se
procesaron utilizando el software Empower Login.
Los acil-CoAs no comerciales como el ricinoleil-CoA fueron preparados por medio de la
reacción con éster de N-hidroxisuccinamida y ácidos grasos con coenzima A reducida, tal y
como está descrito por Al-Arif y Blecher (1969).

2.3.12. Producción de sustratos radioactivos

En el presente trabajo se investigó la capacidad de la maquinaria biosintética del ricino
para acumular ácidos grasos inusuales en forma de TAG. Para ello se realizaron incubaciones
de microsomas de semilla en desarrollo con distintos precursores radioactivos. Algunos de
estos precursores no eran comerciales y tuvieron que ser preparados en el laboratorio.

78
 Materiales y métodos

2.3.12.1. Preparación de ácido lesquerólico radioactivo ([1-

14
C]20:1∆11c∆14hydroxy)
El ácido lesquerólico marcado se preparó a partir de ácido ricinoleico comercial (Sigma-
Aldrich) empleando una modificación del método de Baumann y Mangold (1968). Este proceso
implicó dos ciclos de elongación de la cadena del ácido ricinoleico que consisten en la
reducción del precursor con AlLiH4, la producción de un derivado mesilado, la cianuración del
mesilo para producir un nitrilo y la hidrólisis del nitrilo para dar lugar a un éster metílico con un
carbono más en su cadena. En este caso, el primer ciclo de elongación se llevó a cabo en la
escala de 1 g con reactantes fríos. El segundo ciclo se llevó a cabo de igual manera, pero
realizando los dos últimos pasos en la escala de microgramos y utilizando cianuro marcado
radioactivamente ([14C]KCN). En el primer ciclo de elongaciones las reacciones se llevaron a
cabo de la siguiente forma:

a) Reducción del ricinoleico. Una cantidad de 1 g de ácido ricinoleico se disolvió en 50 mL

de éter etílico anhidro. A continuación, se añadió un exceso de H4AlLi con agitación continua
hasta cese de burbujeo de hidrógeno. Entonces se dejó finalizar la reacción en la campana de
extracción durante dos horas más. En ese punto se añadió gota a gota y con agitación
continua una disolución acuosa de HCl 1M hasta la formación de dos fases. Una vez se
comprobó el pH ácido de la fase inferior se procedió a su separación en un embudo de
decantación. La fase etérea se secó con sulfato sódico anhidro y se evaporó en rotavapor,
resultando un residuo aceitoso correspondiente al derivado dihidroxilado del ácido
ricinoleico.

b) Mesilación del dialcohol. Una cantidad de 1 g aproximadamente del dialcohol

resultante de la etapa anterior se disolvió en 25 mL de diclorometano conteniendo 0.75 mL
de trietilamina (TEA) y se hizo reaccionar con 3.2 mL de cloruro de mesilo (cloruro de
metansulfonilo) por 2h a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción se
extrajo 3 veces con una disolución 0.5 M de HCl para eliminar la TEA y se evaporó a
sequedad bajo corriente de nitrógeno en una campana de gases.

c) Cianuración del mesilato. El derivado mesilado resultante del paso anterior se sometió
a cianuración para la formación del correspondiente nitrilo. La reacción de cianuración
consistió en 1 g de mesilato en un volumen de 50 mL de dimetilsulfóxido (DMSO)/agua 25:1
donde previamente se habían disuelto 1.0 g de KCN. La reacción se llevó a cabo durante 16
h a 80 °C. A continuación, el nitrilo se extrajo mediante 3 extracciones con 2 mL de hexano.

79
 Materiales y métodos

Las fases orgánicas se combinaron y el disolvente se eliminó bajo nitrógeno en campana de

extracción.

d) Hidrólisis del nitrilo. La hidrólisis de nitrilos se llevó a cabo según el método descrito
por Luo & Jeevanandam (1998). En este método se produce una disolución concentrada de
HCl en metanol mediante la mezcla de trimetilsilano con metanol en proporción 1:2. De
esta manera se produce una disolución con una elevada concentración de HCl disuelto en el
exceso de metanol y con la presencia de metil-trimetilsilano inerte. Una cantidad de 1 g de
nitrilo se trató con 5 mL de esta mezcla por 2 h a 50°C. A continuación, se añadió agua a la
mezcla y se extrajeron los lípidos con 3 mL de hexano por 3 veces. El producto de reacción
se analizó mediante GC/MS, confirmando ser el producto deseado, el éster metílico del
ácido graso 19:1∆10c∆13hydroxy, análogo con un carbono más del ácido ricinoleico (Figura 32).

Figura 32. Ciclo de reacciones aplicado para la elongación en un carbono de un ácido graso.

2.3.12.2. Preparación de ácido lesquerólico radiactivo.

Para la preparación del lesquerólico marcado, el derivado 19:1-OH producido en la etapa
anterior fue sometido de nuevo a los pasos a y b para producir el correspondiente mesilato. La
reacción de marcaje con [14C]KCN fue desarrollada de manera diferente. Así, 10 mg de
mesilato se hicieron reaccionar con 100 µCi de [14C]KCN (50 Ci/mol, Amershan) en un volumen
de 0.5 mL de DMSO a 50°C durante 2 h. A continuación, se procedió a extraer el nitrilo
radioactivo con 1 mL de hexano por 3 veces. El producto se cargó en una placa de
cromatografía en capa fina (TLC) de sílice de 10 x20 cm (SiG60, Merk) y se desarrolló en un

80
 Materiales y métodos

tanque con hexano/éter etílico 60:40 (v/v) como el solvente. Una banda fuertemente marcada
se detectó con el scanner de placas de TLC RITA (Raytest-Elysia, Francia) a la altura del patrón
de nitrilos hidroxilados. Esta banda se raspó de la placa y el compuesto fue eluído de la sílice
con 10 volúmenes de éter etílico. El disolvente se eliminó bajo una corriente de nitrógeno y el
residuo se hidrolizó con 1 mL de mezcla trimetilsilano/metanol 1:2 (v/v) durante 2 h a 50 °C. El
éster metílico resultante se extrajo con 2 mL de hexano por 3 veces. El extracto fue evaporado
bajo nitrógeno y el residuo se saponificó con 1 mL de KOH 2M en etanol al 15% de agua. La
reacción se llevó a cabo a 80°C durante 1 h. A continuación, la mezcla de reacción se acidificó
con un exceso de disolución 1 M de HCl y el ácido lesquerólico marcado se extrajo por 3 veces
con 2 mL de hexano. A continuación, se examinó la pureza por TLC, empleándose una placa de
sílice de 10x20 cm (SiG60, Merk) y hexano/éter etílico/ácido acético (50:50:1; v/v/v) como
solvente. Una banda radioactiva con el mismo Rf que el patrón de ácido lesquerólico daba
cuenta de más del 95% de la radioactividad cargada en la placa. Empleando este
procedimiento se obtuvieron alrededor de 6 µCi del ácido graso marcado. Aunque el
rendimiento no fue elevado (6%) se consiguió una cantidad de precursor suficiente para la
realización de los experimentos de marcaje diseñados.

2.2.6.3. Preparación del ácido coriólico radioactivo.

Para la preparación de este ácido graso se partió de ácido linoleico radioactivo comercial
(Amershan Biosciences), que fue peroxigenado empleando lipoxigenasa (LOX) comercial de
soja (Sigma Aldrich) para producir el correspondiente hidroperóxido. El 13-hidroperóxido fue a
continuación purificado y reducido a su hidroxil derivado, el ácido 18:2∆9c∆12t∆13hidroxi, o ácido
coriólico (Figura 33).
El protocolo de preparación implicó una reacción inicial de oxidación del linoleico con LOX
comercial. La mezcla de reacción contenía 50µCi de [1-14C] 18:2 (55 Ci/mol, Amershan) que se
depositaron en un tubo Ependorff y se disolvieron en 0.5 mL de tampón Na3BO3 pH 9.0,
previamente saturado con O2. A continuación, se añadieron 5 U de LOX comercial de soja y se
llevó a cabo la reacción durante 1h en hielo. Durante ese tiempo la formación de
hidroperóxidos se siguió tomando alícuotas de 1 µL que se cargaban a distintos tiempos en
placas de sílice de 5x10 cm (SiG60, Merk) que se desarrollaron con hexano/éter etílico/ácido
acético (50:50:1; v/v/v) y fueron a continuación examinadas en el detector RITA. Se observó
que la máxima producción de hidroperóxidos se alcanzó a la media hora de reacción y a partir
de ahí comenzó a decaer. De esta forma el medio de reacción se acidificó con 1 mL de HCL 0.5
M y los lípidos se extrajeron aplicando el método de Hara y Radin (1978) descrito en la sección
2.2.1. de Materiales y métodos. A continuación, se eliminó el solvente bajo atmósfera de

81
 Materiales y métodos

nitrógeno y el residuo radioactivo se cargó en una placa de TLC de sílice de 20x20 cm (SiG60,
Merk) que se desarrolló con hexano/éter etílico/ácido acético (50:50:1; v/v/v). La banda
correspondiente a los hidroperóxidos, localizada justo debajo de la del sustrato 18:2, se raspó
de la placa y los hidroperóxidos fueron eluídos con 10 volúmenes de éter etílico. Los
hidroperóxidos se metilaron a continuación con diazometano (Materiales y métodos ap. 2.2.7.)
y sobre los ésteres metílicos disueltos en éter se añadió un exceso de NaBH 4. La reacción de
reducción de los hidroperóxidos a alcoholes se llevó a cabo a temperatura ambiente durante
un periodo de 16 h. A continuación, se filtró la fase etérea y se lavó con un volumen igual de
HCl 1M. La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro y se evaporó bajo nitrógeno. La
mezcla de hidroxiésteres resultante contiene una mezcla de isómeros posicionales con un
porcentaje de 80% de 13-hydroxil y un 20% de 9-hidroxil derivados. Así pues, fue preciso
separar los 13-de los 9- derivados, lo que se llevó a cabo en una placa de TLC de gel de sílice de
20x20 cm (SiG60, Merk) empleando un desarrollo de hexano/éter etílico (50:50; v/v). En estas
condiciones el 13-hydroxy derivado mostró un Rf superior al 9-hidroxilo. Las bandas
correspondientes a ambos se detectaron en el scanner de placas RITA. La banda
correspondiente al éster metílico del ácido coriólico se raspó de la placa y se eluyó con 10
volúmenes de éter etílico. Una vez eliminado el disolvente, el éster metílico purificado fue a
continuación saponificado con 1 mL de KOH 2 M en etanol con un 15% de agua. La
saponificación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante un periodo de 4h. A
continuación, se acidificó el medio con un exceso de HCl 1M y se extrajo el ácido coriólico
marcado con 2 ml de hexano por 3 veces.

82
 Materiales y métodos

Figura 33. Preparación de ácido coriólico a partir de ácido linoleico.

2.3.13. Metilación con diazometano

La metilación con diazometano se llevó acabo según el método establecido por Schlenk y
Gellerman (1960). El sistema de producción de diazometano consistía en dos tubos conectados
en serie, el primero de los cuales contenía éter etílico y el segundo una disolución compuesta
por 0.7 ml de carbitol (2-β-etoxietanol), 0.7 ml de éter etílico y 1 ml de KOH al 60%. La reacción
se comenzó añadiendo unos 5 mg de diazald (N-metil-N-p-toluensulfonamida) disuelto en 1 ml
de éter etílico en el segundo tubo. En el medio de reacción descrito, el diazald se descompone
para producir diazometano, un gas que se arrastra mediante una corriente de N2 burbujeada a
través del contenido de los dos tubos. La corriente de salida del segundo tubo, rica en
diazometano, se burbujeó finalmente a través de la muestra disuelta en éter etílico-metanol
(10:1) y colocada en un baño con hielo. La reacción de esterificación se dio por terminada
cuando la disolución etérea conteniendo la muestra tomó un color amarillo pálido.

83
 Materiales y métodos

2.3.14. Preparación de microsomas de semillas de ricino en desarrollo.

La preparación de microsomas de ricino se llevó a cabo a partir de tejido fresco de
endospermo de ricino en desarrollo recolectado en un periodo entre los 40 y los 50 DAP
aplicando el método establecido por Garcés et al. (1994) con ligeras variaciones.
Así, un peso de 5 g de endospermo fue molturado en un mortero con un volumen de 50
mL de tampón de molturación (Materiales y métodos ap. 1.3.2.) enfriado en hielo. La rotura
del tejido se realizó sobre un baño de hielo en tres pasos, con la adición de una parte del
tampón, seguida de molturación del tejido en el mortero y filtración a través de dos capas de
tejido Miracloth (Merk). El filtrado combinado se centrifugó a continuación a 30000 x g
durante 30 minutos a 4 C en una centrífuga preparativa Hitachi R22N y el sobrenadante
resultante fue a su vez centrifugado a 150000 x g por 2h en una ultracentrífuga Beckman L-
100XP a la misma temperatura. El precipitado resultante se resuspendió en un volumen de 10
mL de fosfato de potasio 50 mM pH 7.0, 1 mM MgCl2 y se volvieron a centrifugar en las
mismas condiciones que en el último paso. El precipitado resultante constituyó la fracción de
microsomas de ricino que se empleó en los experimentos de marcaje. Los microsomas se
resuspendieron en 2 mL de fosfato de potasico 50 mM pH 7.0, 1 mM MgCl2 y se almacenaron a
-80 C en alícuotas de 0.1 mL. La proteína en la fracción de microsomas se midió empleando el
ensayo de proteínas BCA de Pierce (Thermo Scientific).

2.3.15. Experimentos de marcaje con ácidos grasos radioactivos

Una cantidad de ácido graso radioactivo equivalente a 16.6 KBeq (9 nmol
aproximadamente), se colocaron en un tubo de metilar de pyrex y se disolvió en 0.5 mL de
etanol. A continuación, se añadió un volumen de 5 µL de amoniaco comercial (25%, Merk) y se
evaporó el disolvente bajo atmósfera de nitrógeno. La sal amónica resultante se disolvió en 0.1
mL de fosfato potásico 50 mM pH 7.2, 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) aplicando agitación
en vortex y calentamiento a 37 C durante 10 minutos. A continuación, se preparó una mezcla
de reacción portando los sustratos y cofactores necesarios para la síntesis de glicerolípidos a
partir de ácidos grasos por parte de las membranas de la semilla de ricino (Materiales y
métodos ap. 1.3.2.). El estudio de marcaje se realizó incubando 0.15 mL de la disolución de
reacción con 0.1 mL de microsomas de ricino a una temperatura de 25 C. El experimento se
llevó a cabo por triplicado a lo largo de un periodo de 5 horas, a lo largo de las cuales se
retiraron alícuotas de 50 µL de la mezcla de reacción a distintos tiempos. Estas alícuotas se
inactivaron con 50 µL de ácido acético glacial y se sometieron a extracción empleándose el
procedimiento de Hara & Radin (1978). A continuación, se midió la radioactividad de las fases

84
 Materiales y métodos

acuosas y orgánica mediante centelleo líquido en un contador Beckmann Coulter LS6500

tomando alícuotas de 0.1 mL.

2.3.16. Fraccionamiento de los glicerolípidos en TLC y estudio de la

distribución de la radioactividad.
La fase orgánica obtenida en el experimento de marcaje se evaporó bajo atmósfera de
nitrógeno y se resuspendió en 0.2 mL de triclorometano. A continuación, se realizaron dos
desarrollos de TLC tomando en cada uno la mitad del extracto lipídico, uno de lípidos polares y
otro de lípidos neutros. Para el desarrollo de lípidos polares, los lípidos marcados se cargaron
en placas de TLC de alta resolución de 20x20 cm previamente activadas a 80 C durante 1h. Las
placas se desarrollaron a continuación con CHCl3/MetOH/AcOH/H2O (85:15:10:3.5, v/v). En la
placa se cargaron patrones de varios lípidos polares (PC, PE, PA, LPC, LPA) para conocer su
localización, los cuales se marcaron después del desarrollo con iodo sublimado. A
continuación, las bandas radioactivas se localizaron y cuantificaron en un scanner de placas
RITA. En este desarrollo polar, los lípidos neutros y el exceso de ácido graso marcado se
desplazan con el frente de disolvente.
El desarrollo de lípidos neutros se realizó en placas similares que habían sido sumergidas
en una disolución 0.5 M de Na2CO3 en la zona de origen donde se carga la muestra. Las placas
se secaron sobre papel para eliminar el exceso de disolución alcalina y se activaron en una
estufa a 80 C durante 2 h. Los lípidos se cargaron en la placa sobre la zona tratada con el álcali
y la placa se desarrolló con hexano/éter etílico (50:50; v/v), incorporando en ella los patrones
correspondientes a las distintas especies de lípidos neutros que pudieran encontrarse (DAG,
TAG convencionales y DAG y TAG con ácidos grasos hidroxilados) obtenidos de la hidrólisis
parcial con lipasa pancreática de aceite de ricino común o aceite de ricino OLE-1. Los patrones
se localizaron por exposición de la placa a vapores de iodo, y las bandas radioactivas se
localizaron y cuantificaron en un scanner de placas RITA. En este desarrollo los lípidos polares y
el exceso de ácido graso marcado permanecieron en el origen de la placa.
Realizando un balance del precursor incorporado en las distintas especies de lípidos
neutros y polares y empleando los datos de contaje de las fracciones acuosa y orgánica es
posible calcular la incorporación del precursor en las distintas especies de glicerolípidos para
evaluar la capacidad de la maquinaria enzimática del ricino de acumularlos en sus lípidos de
reserva.

85
 IV. RESULTADOS

87
 Resultados. Capítulo 1

Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación

transitoria en ricino.

1. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vitro de la semilla de ricino.

Para alcanzar los objetivos planteados en este proyecto se pusieron a punto protocolos de
transformación transitoria de endospermo de ricino. Estos protocolos permitirían comprobar
la efectividad de diferentes construcciones antes de proceder a la transformación permanente
de las plantas, la cual implica procedimientos más largos y dificultosos.
El primer método por el que se optó fue el método de transformación transitoria in vitro
usando A. tumefaciens asistido por sonicación (SAAT), descrito por Chileh et al. (2010)
(Materiales y métodos ap. 2.1.9.1.2.). Se tomaron frutos de entre 40-50 DAP y se diseccionaron
en condiciones de esterilidad. Se tomaron 30 semillas para llevar a cabo una prueba
preliminar. Las semillas diseccionadas se sometieron al método de transformación descrito en
materiales y métodos, se utilizó el plásmido pCambia 1305.1 para evaluar el nivel de
transformación de la semilla. Tras 5 días de incubación (2 días de co-cultivo con Agrobacterium
y 3 sin Agrobacterium) se realizó un ensayo de actividad GUS histoquímico (Materiales y
métodos ap. 2.1.10.). Los resultados se muestran en la figura 34.
Los resultados en esta prueba preliminar mostraban una necrosis considerable en la
semilla después de los 5 días de incubación. A este aspecto, se une la ardua tarea de la
disección de frutos en esterilidad, con la ayuda de escalpelo y pinzas, y el alto riesgo de
contaminación que presenta el método.
Por todo ello, se decidió abandonar el protocolo de transformación in vitro y se decidió
optar por un procedimiento alternativo.

89
 Resultados. Capítulo 1

Figura 34. Semillas transformadas in vitro mediante A. tumefaciens asistido por sonicación.
.

2. Aplicación de un protocolo de transformación transitoria in vivo de la semilla de ricino.

2.1. Resultados de las pruebas preliminares.
En vista de los resultados mostrados en el apartado anterior se decidió optar un método
en el que las semillas pudiesen seguir desarrollándose y que fuese más rápido y simple. El
método elegido fue la agroinfiltración in planta del fruto de ricino en desarrollo. Este es un
método que ya se ha puesto a punto en otras especies (Introducción ap. 4.4.1.2.).
En primer lugar, se llevó a cabo un ensayo preliminar en el que se infiltró A. tumefaciens
suspendido a una D.O.600 de 0.2 en una solución de infiltración con aditivos específicos
(Materiales y métodos ap. 2.1.9.1.1.). Para la infiltración se tomaron 300µL de suspensión y se
inyectaron con una aguja hipodérmica de 0.33mm de luz directamente en el endospermo de la
semilla, atravesando todo el fruto y la envoltura de la semilla. El plásmido usado en la
transformación fue pCambia 1305.1.
El fruto infiltrado se mantuvo durante 3 días en la planta para después realizar un ensayo
histoquímico de GUS. El ensayo de GUS reveló un nivel mayor de transformación en la semilla
y era más homogéneo (Figura 35 C y D) que con el método anterior. Además, no afectaba

90
 Resultados. Capítulo 1

exclusivamente al endospermo, sino que además afecta a órganos adyacentes como son el
propio fruto (exocarpio, mesocarpio y epicarpio) (Figura 35 A) y la carúncula (Figura 35 B).

Figura 35. Resultado preliminar de la infiltración in vivo del fruto de ricino. Además de la semilla, se
transformaron tejidos adyacentes como el fruto (A) y la carúncula (B). El nivel de la actividad GUS de
marcaje fue muy alto en el endospermo (C, D).

Ante este resultado preliminar se optó por la puesta a punto del protocolo para su
adopción como método de transformación transitoria en ricino que permita la evaluación de
los diseños genéticos para su posterior transformación estable.

2.2. Puesta a punto del método de agroinfiltración in vivo de la semilla de ricino.

2.2.1. Elección del momento de infiltración y tasa de transformación.
Uno de los aspectos cruciales para el éxito de este fue el momento de infiltración. Se
observó que algunas infecciones de Agrobacterium terminaban induciendo una alta tasa de
abortos en la semilla, por lo que se decidió evaluar el momento correcto de infiltración.
Para ello se infiltraron 30 semillas en distintos estadios de desarrollo: 20-30 DAP, 30-40
DAP, 40-50 DAP y 50-60 DAP. Las semillas se recolectaron tras 5 días después de la infiltración
(DAI), 10 DAI y 20 DAI.
Los resultados revelaron que las semillas infiltradas entre 20-40 DAP sufrían una tasa
elevada de abortos, sobre todo las infiltradas entre 20-30 DAP cuya tasa de aborto fue del 100
% si se recolectaban a los 20 DAI. El 50 % de las semillas infiltradas en 30-40 DAP abortaron en
5 DAI, este porcentaje se redujo al 20 % infiltrando a 40-50 DAP. Por otra parte, la tasa de
abortos de semillas recogidas a 20 DAI se reducía del 90% al 60 % entre 30-40 DAP y 40-50
DAP. Las semillas infiltradas en 50-60 DAP presentaron la menor tasa de abortos tanto en 5, 10
como en 20 DAI (Figura 36).
91
 Resultados. Capítulo 1

Figura 36. Tasa de abortos de la semilla en función del momento de infiltración. Cada color representa
el momento de recolección de la semilla.

Atendiendo a los resultados obtenidos, se optó por infiltrar la semilla a 40-50 DAP en los
estudios posteriores. En este punto, se investigó la tasa de transformación de las semillas
infiltradas que sobrevivieron en dicho periodo para asegurar la validez del método. Este
parámetro se calculó como la relación entre el número de semillas transformadas frente al
total de infiltradas no abortadas (Figura 37). Las semillas fueron infiltradas a 40-50 DAP y
recuperadas tras 5, 10 y 20 DAI. Las semillas contadas para 5, 10 y 20 DAI fueron 80, 72 y 76,
respectivamente.
Se comprobó que la tasa de transformación de las mismas fue del aproximadamente 70 %
y que este porcentaje no presentó una gran variación entre los 3 estadios de recolección,
aunque se observa una tendencia a la disminución a medida que aumenta el tiempo de
desarrollo después de la infiltración.

92
 Resultados. Capítulo 1

Figura 37. Tasa de transformación en semillas no abortadas utilizando el método de agroinfiltración

in vivo. Las barras muestran el número de semillas transformadas respecto al número de semillas no
abortadas. Todas las semillas fueron transformadas en 40-50 DAP y recolectadas en 5, 10 y 20 DAI

2.2.2. Influencia del promotor en el nivel de expresión del marcador GUS en

ricino. Ensayo histoquímico.

Como prueba adicional para evaluar la transformación y el nivel de expresión de los

diferentes promotores las semillas infiltradas con Agrobacterium fueron sometidas al ensayo
histoquímico de GUS a distintos DAI. Los resultados se muestran en la figura 38. En los paneles
A, B y C de esta figura se muestran las imágenes de las semillas infiltradas con el plásmido
pCambia 1305.1 en el que el marcador GUS se encuentra regulado por el promotor 35S. En los
paneles D, E y F se muestran las semillas que fueron transformadas con el plásmido pCambia
en el que el marcador GUS se encuentra regulado por el promotor pGly. En el panel G, H e I se
muestran las semillas que fueron transformadas por pCambia::nulo sin ningún promotor
regulador del marcador GUS. Finalmente, el panel J, K y L muestra las semillas que no fueron
infiltradas, pero si sometidas a ensayo GUS histoquímico (Figura 38).
En las semillas A-F observamos una fuerte expresión del marcador GUS en el endospermo,
que contrasta con la leve tinción que se registró en las semillas sin promotor, G, H y I. Cabe
93
 Resultados. Capítulo 1

destacar, que de manera acorde a los resultados de fluorimetría, las semillas con el marcador
GUS bajo el control de pGly (D, E y F) presentaron una tinción más intensa que las que lo
tuvieron bajo el control del promotor 35S (A, B y C). Las semillas no infiltradas, J, K y L, apenas
presentaron actividad β-glucuronidasa, solo en algunos casos se observó una leve actividad
residual. La transformación también pudo observarse en el eje embrionario y en los
cotiledones en muchos casos.

Figura 38. Resultado del ensayo GUS histoquímico para semillas infiltradas mediante agroinfiltración in
vivo. A, B y C son semillas transformadas con pCambia 1305.1 con promotor 35S regulado al gen GUS.
Las semillas D, E y F con pCambia con el promotor pGly regulando al gen GUS. Las semillas G, H e I
fueron infiltradas con pCambia::nulo sin promotor que regulase a GUS. Finalmente, las semillas J, K y L
no fueron infiltradas.

94
 Resultados. Capítulo 1

2.1.1. Influencia de distintos promotores en el nivel de expresión de transgenes

en ricino. Estudios estudios cuantitativos.
En un segundo paso se decidió evaluar cuantitativamente diferentes promotores y con el
nuevo protocolo de expresión transitoria en semillas de ricino en desarrollo. Los promotores
elegidos para su evaluación fueron el promotor del virus del mosaico de la coliflor, p35S, un
promotor constitutivo de fuerte expresión, y el promotor pGly de soja un promotor de
expresión fuerte específico de semillas que no se expresa en otros tejidos. El uso de pGly
supone la ventaja de no afectar el desarrollo vegetativo de la planta si finalmente se usase
para las expresiones estables de ricino. El control para los ensayos fue el plásmido
pCambia::nulo que no presenta ningún promotor regulando a GUS (Materiales y métodos ap.
2.1.7.1.4.)
La infiltración de Agrobacterium con los plásmidos citados se llevó a cabo en 30 semillas
para cada promotor. Las semillas fueron infiltradas entre 40-50 DAP y recogidas a 5, 10 y 20
DAI. Finalmente, la expresión de GUS bajo cada promotor se evaluó mediante PCR cuantitativa
(Materiales y métodos ap. 2.1.3.2.).
Los resultados mostraron una expresión extremadamente fuerte del promotor 35S a los 5
días después de la infiltración, sin embargo, esta expresión cae de forma rápida a los 10 DAI y
20 DAI. La expresión de GUS con promotor pGly fue significativamente menor, aunque se
mantuvo constante entre 5, 10 y 20 DAI. (Figura 39 A)
Paralelamente, se analizó la actividad de la GUS expresada bajo cada uno de los
promotores mencionados. Esta actividad se analizó mediante el ensayo GUS fluorimétrico
(Materiales y métodos ap., 2.1.10). (Figura 39B)
El ensayo GUS fluorimétrico mostró, en contra de lo observado en el resultado de la
expresión cuantitativa, más actividad de la enzima GUS reportadora cuando su expresión se
encuentra regulada por el promotor de pGly que cuando se encuentra regulada con el
promotor 35S. Además, la actividad de GUS aumenta de 5 DAI a 10 DAI para después volver a
decaer a 20 DAI. En el caso de la actividad GUS bajo el promotor 35S, ésta se mantuvo
prácticamente estable entre 5,10 y 20 DAI, aunque se observa una tendencia al aumento de la
actividad hasta 20 DAI.

95
 Resultados. Capítulo 1

Figura 39. Resultados actividad de la β-glucuronidasa(GUS) y expresión de RNA medidos en la semilla.

En el panel A aparecen los resultados de actividad GUS. En el panel B se muestra el nivel de expresión
génica de GUS medido por qPCR en semillas transformadas a 40-50 dias después de la polinicación y
muestradas a tres tiempos distintos 5, 10 y 20 dias después de la infiltración.

96
 Resultados. Capítulo 2

Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos

de la semilla de ricino vía expresión transitoria in vivo.

El diseño de construcciones genéticas que modifiquen la composición de ácidos grasos en

la semilla de ricino es un aspecto fundamental en el desarrollo de este proyecto. Como ya se
ha citado anteriormente, dichas estructuras deben demostrar que tienen una repercusión
fenotípica en la semilla. Con ese objetivo, se transformaron de forma transitoria semillas de
ricino mediante agroinfiltración in vivo usando diferentes diseños genéticos.

1. Reducción del contenido en ácido ricinoleico.

1.1. Reducción del contenido de ácido ricinoleico mediante silenciamiento génico:
hpFAH12.

Se diseñó una estructura genética en horquilla o hairpin para el silenciamiento del gen de
la hidroxilasa de ricino, a la que se denominó hpFAH12. El ensamblaje de esta estructura, la
secuencia diana elegida, los plásmidos y enzimas usados se detallan en materiales y métodos
ap. 2.1.7.1.1.
Se eligió pCambia 1305.1 como vector de transformación dado que su efectividad se había
comprobado anteriormente. Para ello clónó la estructura hpFAH12 regulada por el promotor
pGly en dicho vector. Las semillas se infiltraron en el estadio 40-50 DAP con 300 µL de una
solución de Agrobacterium D.O.600 de 0.2 tal y como se describe en materiales y métodos ap.
2.1.9.1.1. Las semillas de muestrearon a 5, 10 y 20 DAI diseccionándose el fruto y extrayéndose
el endospermo.
El endospermo se dividió longitudinalmente en dos, una mitad se destinó a ensayo GUS
histoquímico y la otra a análisis de composición en ácidos grasos. Para éste análisis, se
seleccionaron aquellas mitades de semillas que fueron positivas en el ensayo GUS
histoquímico (mostraron tinción azul) y que, por tanto, habían sido, transformadas
eficientemente. Se analizaron 5 semillas en cada uno de los momentos de recolección (5, 10 y
20 DAI; Figura 40).
Como control se tomaron semillas transformadas con el plásmido pCambia 1305.1 (Figura
41), que no presenta ningún gen que pudiese modificar la composición de ácidos grasos. Se
recuperaron 4 semillas transformadas en cada momento de recolección a 5, 10 y 20 DAI. Al
igual que las semillas transformadas con hpFAH12, la mitad de la semilla se destinó a ensayo

97
 Resultados. Capítulo 2

GUS histoquímico y la otra mitad a análisis de composición de ácidos grasos. En todos los
casos, el corte de la semilla fue longitudinal.

Figura 40. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::hpFAH12 para el silenciamiento de la

expresión de la hidroxilasa de ricino. En estas semillas el gen que codifica para la beta-glucuronidasa
se encuentra bajo el promotor 35S y la secuencia hpFAH12 bajo el promotor pGly.

Figura 41. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1 sin portar ningún gen que
modifique la composición de ácidos grasos de la semilla. En estas semillas, el gen que codifica para
GUS también se encuentra bajo el promotor 35S.

98
 Resultados. Capítulo 2

Los resultados de la composición de ácidos grasos no mostraron diferencias

significativas entre el control y las semillas infiltradas con hpFAH12 a 5 y 10 días después de la
infiltración. No obstante, la composición de ácidos grasos en las semillas diseccionadas a 20
DAI si mostraron diferencias significativas. El contenido de ácido ricinoleico en estas semillas
resultó ser significativamente menor que en semillas infiltradas con pCambia 1305.1. La
disminución en ricinoleico tuvo lugar a expensas de un aumento en la acumulación de ácido
linoleico (18:2) (Figura 42).

Figura 42. Composición del aceite de las semillas transformadas transitoriamente con pCambia 1305.1
(color gris) y de las semillas transformadas con pCambia::hpFAH12 (color azul). Letras minúsculas indican
diferencias significativas, t student p<0.01. DAI: días después de la infiltración.

99
 Resultados. Capítulo 2

1.2. Reducción del contenido en ácido ricinoleico vía CRISPR/Cas9.

Como método alternativo para lograr la reducción del contenido en ácido ricinoleico en las
semillas de ricino, se diseñó una construcción con las herramientas moleculares para la edición
génica utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. Con el objeto de verificar la efectividad de nuestro
diseño y estructura CRISPR/Cas9 sobre el gen de la hidroxilasa de ricino, se llevó a cabo la
transformación transitoria mediante agroinfiltración in vivo de semillas de ricino. Para la
transformación, se usó el plásmido pCambia 1305.1 portando el gen de la enzima Cas9 con
guías sgARN para generar cortes en dos sitios diferentes del gen de la hidroxilasa (Materiales y
métodos ap. 2.1.7.2.2.). La infiltración se llevó a cabo en semillas en el estadio de 40-50 DAP y
fueron recuperadas tras 5, 10 y 20 DAI.
Nuevamente, las semillas se extrajeron del fruto y se diseccionaron longitudinalmente en
dos mitades. Una mitad se destinó a ensayo GUS histoquímico y la otra mitad para análisis de
composición de ácidos grasos. Un total de 13 semillas transformadas fueron seleccionadas.
Además, se utilizó un pequeño fragmento de la semilla para la extracción del ADN genómico
(Materiales y métodos ap. 2.1.1.4.) con el objeto de poder discriminar aquellas semillas con
mutaciones en el gen de la hidroxilasa.
El ADN extraído se sometió a la digestión con las enzimas BsrDI y Fnu4HI, de forma
independiente. Las enzimas citadas llevan a cabo el corte en la doble hélice en el sitio de corte
de la enzima Cas9. Por lo tanto, en aquellos casos en los que el corte con Cas9 hubiera
generado mutaciones, el sitio de corte de BsrDI y Fnu4HI se perdería, así, en el ADN de esas
semillas, estas enzimas no podrían llevar a cabo la digestión.
Una vez realizada la digestión previa, se realizó una prueba de amplificación por PCR en el
fragmento de ADN que se desea mutar. Por tanto, se obtuvieron bandas en aquellas semillas
que presentaban mutaciones en la hidroxilasa, ya fuera en un sitio de mutación o en los dos
(Figura 43). Los oligonucleótidos empleados para esta prueba se muestran en el anexo I.

Figura 43. Semillas transformadas con la construcción pCambia::CRISPR FAH12 diseñado para editar el gen de la
hidroxilasa. Las flechas discontinuas señalan las semillas que muy probablemente presentan una mutacion sólo en una
de las dianas Las flechas continuas señalan las semillas que muy probablemente presentan mutaciones en ambas dianas.

100
 Resultados. Capítulo 2

Las semillas 1, 2, 5 y 9 presentaron células que muy probablemente presentan mutaciones

en las dos dianas de Cas9 en el gen de la hidroxilasa. Las semillas 4, 6, 10 y 12 fueron mutadas
en la diana 1 del gen de la hidroxilasa mientras la semilla 3 presentó mutaciones en la diana 2.
Una vez seleccionadas las semillas mutadas se comprobó la presencia del gen de Cas9
mediante PCR, todas las semillas que fueron mutadas presentaron el gen de la enzima Cas9
(Figura 44) los oligonucleótidos usados se muestran en el anexo I.

Figura 44. Gel de agarosa que muestra los resultados de la reacción de PCR para la amplificación del gen que
codifica para la proteína Cas9. Los números del 1 al 12 indican las semillas analizadas.

Además, en el ensayo GUS histoquímico pudo comprobarse la transformación del endospermo

de las semillas seleccionadas (Figura 45).

Figura 45. Ensayo GUS histoquímico de las semillas transformadas con pCambia::CRISPR FAH12 con
guías para el gen de la hidroxilasa de ricino.
.

Finalmente, el análisis de composición de ácidos grasos de las semillas seleccionadas

confirmó cambios fenotípicos en las mismas (Figura 46). Las semillas transformadas vía

101
 Resultados. Capítulo 2

CRISPR/Cas9 nunca mostraron un contenido de ácido ricinoleico al mismo nivel que en las
semillas transformadas con el vector sin esta construcción. Si bien en 5 DAI y 10 DAI la
dispersión estadística de las composiciones es grande, ésta se reduce reduce a 20DAI, donde sí
se encontraron diferencias significativas donde se observó una proporción de ácido ricinoleico
de entre un 30-40% frente al 80-90% de la semilla transformada con el vector pCambia 1305.1.
La disminución de la proporción de ácido ricinoleico tuvo lugar a expensas del crecimiento de
la proporción del resto de especies de ácidos grasos, especialmente el ácido linoleico.

Figura 46. Resultado del análisis de composición de ácidos grasos para las semillas transformadas con pCambia 1305.1,
pCambia::hpFAH12 y pCambia::CRISPR FAH12. Las semillas fueron transformadas mediante agroinfiltración in vivo. Las
letras sobre las barras indican diferencias significativas, el test estadístico usado fue t-student p<0.01. DAI: días después
de la infiltración.

102
 Resultados. Capítulo 2

2. Producción de ácidos grasos hidroxilados de cadena larga: síntesis de ácido

lesquerólico.
Para la síntesis de ácido lesquerólico en la semilla de ricino se utilizó el gen de una enzima
elongasa de Lesquerella fendlerei LfKCS3 (Introducción ap. 2.1.7.1.2). Para la sobrexpresión de
este gen se usó el promotor pGly descrito previamente. Como control, se usaron semillas
agroinfiltradas y transformadas con pCambia 1305.1.
Un total de 20 semillas fueron agroinfiltradas y recuperadas a 5, 10 y 20 DAI. Las semillas
se diseccionaron de forma longitudinal, la mitad del endospermo se destinó a ensayo GUS
histoquímico y la otra mitad a análisis de composición de ácidos grasos. Se seleccionaron 9
semillas, tres para cada momento de recolección.
Un trozo de endospermo se destinó a la extracción de ARN del cual se obtuvo el ADNc
(Materiales y métodos ap. 2.1.1.2.).
Para comprobar la expresión del gen LfKCS3 y de GUS se llevó a cabo una PCR con
oligonucleótidos específicos sobre el ADNc obtenido, el cual se trató previamente para
eliminar restos de ADN genómico (Materiales y métodos ap. 2.1.1.2.). Todas las semillas
seleccionadas expresaron el gen de la elongasa (Figura 47). Como control negativo se
utilizaron semillas WT sin transformar.

Figura 47. Expresión de los genes que codifican la enzima LfKCS3 y GUS en semillas de ricino transformadas.

El ensayo GUS histoquímico reveló la transformación irregular del endospermo de las semillas
(Figura 48).

103
 Resultados. Capítulo 2

Figura 48. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia::LfKCS3.

En el análisis de la composición de ácidos grasos se observó un aumento significativo de

ácido lesquerólico con respecto al control a 5 y 10 DAI. Sin embargo, este aumento se perdió a
20 DAI. Aunque la diferencia entre la composición de semillas infiltradas con pCambia 1305.1 y
pCambia::LfKCS3 fue significativa, el aumento de ácido lesquerólico llegó a representar un
porcentaje muy bajo en la composición total de ácidos grasos, 0.5 % a 5 DAI y 0.4% a 10 DAI
(Figura 49).

Figura 49. Composición de ácidos grasos en semillas transformadas con pCambia::LfKCS3 y pCambia
1305.1. Las semillas fueron transformadas a 40-50 dias después de la polinización. Las letras sobre las
barras de error indican diferencias estadísticamente significativas, t-student p>0.01. DAI: días después
de la infiltración.

Dado que el sustrato de la enzima LfKCS3 es el ricinoleil-CoA, se decidió cuantificar la

disponibilidad del mismo en el conjunto de acil-CoAs. Los resultados se muestran en la figura
50. La cantidad de ricinoleil-CoA en el conjunto de acil-CoAs fue muy baja en comparación con
otros acil-CoA. Palmitoil-CoA y estearil-CoA fueron los acil-CoA más abundantes.

104
 Resultados. Capítulo 2

Figura 50. Composición del conjunto de acil-CoAs durante el desarrollo de la semilla de ricino.

3. Producción de ácidos grasos epoxidados en semillas de ricino.

Para la síntesis de ácidos grasos epoxidados se recurrió a la sobreexpresión del gen de la
enzima epoxigenasa de Stokesia laevis, SlEPX (codones optimizados de la secuencia AY462108;
Anexo II) usando el promotor pGly como regulador. Acompañando a este gen se clonó en el
mismo plásmido la estructura hpFAH12 para el silenciamiento del gen de la hidroxilasa de
ricino con la intención de reducir el contenido de 18:1OH en la semilla y que se viesen
incrementadas las proporciones de los ácidos grasos 18:1Δ9 y 18:2Δ9,12, ya que éste último es el
sustrato de la epoxigenasa. El diseño de estas construcciones y su ensamblaje se describen en
materiales y métodos ap. 2.1.7.2.1. La transformación transitoria de las semillas se llevó a cabo
mediante agroinfiltración de semillas a 40-50 DAP y su recolección se realizó a 5, 10 y 20 DAI.
Se infiltraron un total de 20 semillas de las cuales se seleccionaron 9, tres para cada
estadio de recolección, obedeciendo al resultado del ensayo GUS histoquímico. Las semillas
seleccionadas aparecen en la figura 51.

105
 Resultados. Capítulo 2

Figura 51. Semillas seleccionadas transformadas con pCambia 1305.1::SlEPX::hpFAH12.

La otra mitad de la semilla de destinó al análisis de la composición de ácidos grasos. Los

resultados de la composición de ácidos grasos no mostraron la presencia de ácidos grasos
epoxidados, no obstante, se apreció una disminución del contenido en ácido ricinoleico en
comparación con las semillas control (transformadas con el plásmido pCambia 1305.1 (Figura
52)), confirmando los resultados que ya habíamos obtenido en experimentos anteriores.

106
 Resultados. Capítulo 2

Figura 52. Análisis de composición de ácidos grasos para semillas transformadas con pCambia::SlEPX::hpFAH12 y pCambia
1305.1. No se observó la formación de ácidos grasos epoxidados. Las letras sobre las barras indican diferencias
significativas, t-student p<0.01. DAI: días después de la infiltración.

La disminución de ácido ricinoleico fue bastante fuerte en 5 DAI. Además, se observó una
disminución de ácido ricinoleico significativa en 20 DAI acompañada de una acumulación de
ácido linoleico (18:2 Δ9,12) (Figura 52).

107
 Resultados. Capítulo 3

Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro

y transformación estable. Generación de plantas transgénicas.

1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable.

La puesta a punto de un protocolo eficiente y repetitivo que permita la obtención de
plantas transgénicas estables de ricino es uno de los objetivos principales del proyecto. Para
lograrlo, fue necesario la combinación de un protocolo de transformación y un protocolo de
regeneración in vitro.
El eje embrionario fue el tejido usado tanto para la transformación como para la
regeneración in vitro.

1.1. Ensayo de eficiencia de transformación de embriones mediante SAAT.

La transformación de los ejes embrionarios se llevó a cabo mediante la técnica SAAT
(Materiales y métodos ap. 2.1.9.1.2.) Con esta técnica, 30 ejes embrionarios fueron
diseccionados de la semilla en condiciones de esterilidad. Los embriones fueron sumergidos en
una solución de Agrobacterium D.O.600=0.2 para posteriormente ser sonicados. El plásmido
usado para la transformación fue pCambia1305.1. Una vez transformados, los embriones
permanecieron en periodo de co-cultivo durante dos días en una placa con medio de
transformación sólido (Materiales y métodos ap. 1.3.1). Tras el periodo de co-cultivo, los
embriones se incubaron en una placa con medio MS-sacarosa (Materiales y métodos ap. 1.3.1)
durante un día más, previamente fueron lavados con agua destilada autoclavada y secados en
una gasa estéril. Finalmente, los ejes embrionarios se recuperaron y se sometieron a ensayo de
actividad GUS histoquímico para evaluar el número de embriones y el área transformada
(Figura 53).
El ensayo GUS mostró que 9 embriones de los 30 analizados (30%) presentaron actividad
GUS en todo el embrión o al menos en la zona apical.

109
 Resultados. Capítulo 3

Figura 53. Resultado del ensayo GUS histoquímico en embriones de ricino transformados empleando el
método de transformación con agrobacterium asistida por ultrasonidos (SAAT).

1.2. Puesta a punto de un protocolo de regeneración estable.

La regeneración de los embriones transformados puede llevarse a cabo de dos formas
diferentes. Mediante el procedimiento de regeneración directa o por regeneración adventicia.
Todos los explantos fueron incubados a 26 °C de temperatura con un fotoperiodo de 16h
luz/8h oscuridad a menos que se indique que la incubación se realizara exclusivamente en
oscuridad. A continuación, se exponen los resultados de los ensayos de optimización del
método desarrollado en esta tesis.

1.2.1. Imbibición de la semilla de ricino: un aspecto fundamental en la germinación del

embrión.
Para que el embrión de ricino se desarrolle es necesario someter a la semilla a un proceso
de imbibición a una temperatura determinada. Así, se llevaron a cabo ensayos de germinación
a diferentes temperaturas para periodos de imbibición de 1 y 2 días (tabla 8). Las semillas se
sometieron a temperaturas de 15 °C y 26 °C. El número embriones desarrollados fue mayor en
aquellas semillas incubadas a 26 °C. El número de embriones germinados disminuyó al
disminuir la temperatura de imbibición. Se usaron 100 semillas para cada ensayo.
Tabla 8. N° de embriones germinados in vitro, de los 100 ensayados, en función de la temperatura y el
tiempo de imbibición.
1 DÍA 2 DÍAS
16°C 70 77
26°C 89 95

110
 Resultados. Capítulo 3

1.2.2. Protocolo de transformación-regeneración directa.

El método de transformación-regeneración directa puede dividirse en 6 puntos (Figura 54):
1) Disección del embrión, transformación mediante SAAT y co-cultivo en medio MS-
sacarosa sólido de transformación durante un día (Materiales y métodos ap. 2.1.9.2.1) en
oscuridad.
2) Germinación de los embriones. Durante 9 días los embriones, previamente lavados con
agua destilada y secados con gasa estéril, se germinan sobre MS-sacarosa en presencia de
higromicina (Materiales y métodos ap. 2.1.9.2.1).
3) Eliminación de la radícula y generación de brotes a partir del hipocótilo. En este
estadio, el hipocótilo generará brotes que pueden provenir del meristemo apical (brotes
principales) o de meristemos laterales del hipocótilo (brotes adventicios). Los brotes
principales surgen en las 3 primeras semanas de incubación. Posteriormente, si la incubación
con hormonas se prolonga, aparecen brotes adventicios paralelos al brote principal. Este
paso puede durar entre 2 y 8 semanas. El medio de propagación (Materiales y métodos ap.
1.3.1) debe ser refrescado cada dos semanas.
4) Una vez los brotes alcanzaron un tamaño de más de 2.5 cm se transfieren a medio
líquido de enraizamiento (Materiales y métodos ap. 1.3.1) donde permanecerán 3 días en
agitación.
5) Posteriormente, los brotes se transfieren a medio MS con sacarosa sólido y sin
reguladores hormonales. Tras 1-3 semanas de incubación aparecen raíces.
6) Las plántulas se transfieren a sustrato de turba. El proceso de aclimatación comienza
con una humedad inicial del 70 % para disminuir posteriormente hasta un 40 %.

111
 Resultados. Capítulo 3

Figura 54. Esquema del método de transformación-regeneración directa para ricino.

112
 Resultados. Capítulo 3

1.2.2.1. Optimización del protocolo de transformación-regeneración directa.

El protocolo de transformación-regeneración directa consistió en combinar los protocolos
de transformación de embriones mediante SAAT y la regeneración directa del embrión de
ricino, descritos anteriormente. El protocolo de regeneración directa es un protocolo cedido
por la Dra. Eva Guzmán (Dupont-Pioneer, Sevilla). Este protocolo estaba diseñado para
embriones no transformados por lo que se necesitó una serie de mejoras para la regeneración
de embriones transformados con Agrobacterium. Las modificaciones aplicadas al protocolo y
sus resultados se recogen en los siguientes apartados:

I) Adición de cefotaxima: La adición de este antibiótico fue un requisito imprescindible

para la puesta a punto del protocolo de regeneración, ya que previene el crecimiento de
Agrobacterium durante el mismo. Este antibiótico debe añadirse en estadío 2 del protocolo y
debe mantenerse hasta el 5, de forma ininterrumpida, pare prevenir la infección no deseada
del tejido vegetal por parte del agente bacteriano. Así, se evaluó la presencia/ausencia de
Agrobacterium en los cultivos en función de la concentración usada de cefotaxima, los
resultados se recogen en la (tabla 9). Sólo una concentración de cefotaxima de 300 mg/mL
logró prevenir de forma total el crecimiento de Agrobacterium

Tabla 9. Presencia (sí) o ausencia (no) de contaminación con Agrobacterium en función de la

concentración de cefotaxima.

Concentración Etapa 2 Etapa 3 (4 primeras Etapa 3 (4 semanas Etapa 4 Etapa 5

Cefotaxima semanas) siguientes)

50mg/L sí sí sí sí sí
100mg/L no sí sí sí sí
150mg/L no sí sí sí sí
200mg/L no no no sí sí
300mg/L no no no no no

II) Adición de higromicina: La higromicina es el antibiótico de selección que llevan los

vectores de transformación que se han utilizado en este trabajo y que permite cribar las
plantas transformadas de las que no lo están. El gen de resistencia a higromicina se encuentra
inserto en pCambia 1305.1 bajo un promotor 35S. Se estudió la cantidad de higromicina
necesaria para seleccionar las plantas, tomando como referencia la cantidad utilizada en
algunos ensayos llevados a cabo por la Universidad de Almería. Los resultados fueron los que
se recogen en la tabla 10. Se analizaron 200 embriones en cada ensayo de concentración de
higromicina y se llevó un conteo de los supervivientes.
113
 Resultados. Capítulo 3

Tabla 10. Número de embriones de ricino supervivientes después de la selección con distintas
concentraciones de higromicina.

Concentración Etapa 2 Etapa 3 (4 primeras Etapa 3 (4 Etapa 4 Etapa 5

Higromicina semanas) semanas
siguientes)
20mg/L 120 53 16 0 0
30mg/L 110 45 0 0 0
40mg/L 65 17 0 0 0
50mg/L 48 13 0 0 0

III) Tiempo de selección en higromicina: La higromicina impide el desarrollo total de la

planta si se presenta permanentemente en el medio de cultivo, así, se optó por evaluar cuál
era el periodo de selección óptimo y la concentración óptima. Para una selección óptima, la
concentración mínima de higromomicina necesaria es de 30 mg/L y se observó que, por
encima de esta concentración, el antibiótico produjo la necrosis de los ejes embrionarios
inhabilitándolos para la regeneración (Figura 55).

Figura 55. Necrosis producida por exceso de higromicina. En la placa A se muestran

embriones sometidos a 50mg/L. En la placa B embriones sometidos a 30 mg/ de
higromicina.

Por tanto, para evaluar la duración del periodo de selección con higromicina se tomaron
420 embriones transformados con pCambia 1305.1. Se realizaron 3 repeticiones con 70
embriones cada una. Los embriones fueron regenerados incluyendo una concentración de 30
mg/L de higromicina en el medio de cultivo. Se ensayaron dos tiempos de exposición a
higromicina en la etapa 3: durante 2 ó 4 semanas, y se cuantificó el número de embriones que
llegaron a la fase de enraizamiento (etapa 5) (Figura 56).

114
 Resultados. Capítulo 3

Figura 56. Explantos supervivientes hasta la etapa de enraizamiento tras la exposición a higromicina
durante 2 o 4 semanas en la fase de propagación. La concentración de higromicina fue de 30 mg/L.
Las letras sobre las barras indican diferencias significativas, t-student p<0.01. El número inicial de
embriones fue de 70 en cada replicado.

Los resultados mostraron que el 10 % aproximadamente de los explantos llegaron a

sobrevivir a una concentración de higromicina de 30 mg/L durante dos semanas en la etapa 3.
Por otra parte, sólo un 1% de los explantos sobrevivieron a 4 semanas de higromicina durante
la etapa 3.

1.2.3. Protocolo de transformación-regeneración adventicia.

El protocolo de transformación-regeneración adventicia consta de 7 pasos (Figura 57):
I) Disección del embrión, realización de cortes apicales, transformación mediante SAAT y
co-cultivo en medio MS-sacarosa sólido de transformación durante un día (Materiales y
métodos ap. 2.1.9.2.2.) en oscuridad.
II) Elongación de los ejes. Los ejes se incubaron durante 7 días en oscuridad en medio de
elongación (Materiales y métodos 1.3.1.).
III) Los ejes elongados fueron transferidos a medio de regeneración adventicia (Materiales
y métodos 1.3.1.), previamente se eliminó la radícula. El medio se refrescó cada dos semanas,
este periodo puede durar de 2 a 8 semanas.
IV) Los brotes adventicios obtenidos se transfirieron a tubos con medio de propagación
donde se mantuvieron hasta tener una longitud mayor de 2.5 cm.
V) Enraizamiento de los brotes. Los brotes se incubaron en medio de enraizamiento
donde permanecieron 3 días.

115
 Resultados. Capítulo 3

VI) Posteriormente los brotes se transfieren a medio MS-sacarosa sin reguladores

hormonales. Tras 1-3 semanas de incubación aparecieron raíces.
VII) Las plántulas se transfieren a sustrato de turba. El proceso de aclimatación comienza
con una humedad inicial del 70% para disminuir hasta un 40%.

Figura 57. Esquema del método de transformación-regeneración adventicia.

116
 Resultados. Capítulo 3

1.2.3.1. Optimización del protocolo de transformación-regeneración adventicia.

Al igual que en el protocolo de transformación y regeneración directa, el protocolo de

transformación y regeneración adventicia surge de la combinación entre la transformación del
embrión siguiendo la técnica SAAT y el método de regeneración adventicia.
Lamentablemente, este método no logró acoplarse satisfactoriamente con el método de
transformación SAAT. La presencia de cefotaxima para prevenir el crecimiento de
Agrobacterium y de higromicina para llevar a cabo la selección de ejes transgénicos impidió en
todos los ensayos la formación de ejes adventicios por lo que se decidió abandonar esta vía y
optar por el protocolo de transformación y regeneración directa.

1.3. Evaluación del protocolo del protocolo de transformación-regeneración directa.

Se realizaron tres ensayos diferentes tomando 100 embriones en cada uno. Los embriones
fueron transformados con pCambia 1305.1 siguiendo el protocolo de transformación y
regeneración directa con las siguientes modificaciones: el periodo de imbibición de las semillas
fue de 2 días a 26 °C. Se mantuvo una concentración de cefotaxima de 300 mg/L durante todo
el proceso. Se añadió higromicina a una concentración de 30 mg/L durante la etapa 2 y las dos
primeras semanas de la etapa 3. Finalmente, se cuantificó el número de explantos que
permanecían en cada etapa tabla 11.
La aparición de contaminación en la fase enraizamiento, etapa 5, hace que el número de
plantas finalmente enraizadas en la etapa 6 se reduzca drásticamente. No obstante, el número
de explantos que llegan a la fase de enraizamiento suponen el 10% del número inicial de
embriones Figura 58.

Tabla 11. N° de explantos en cada etapa siguiendo el protocolo de transformación-regeneración directa

optimizado en este trabajo.

Etapa 1 Etapa 2 con Etapa 3 Etapa 3 Etapa 4 Etapa 5 Etapa 6

higromicina 2 semanas con sin
higromicina higromicina
Ensayo 1 100 54 31 21 17 11 0
Ensayo 2 100 32 20 13 9 9 1
Ensayo 3 100 50 25 15 10 10 0
Media 100.00 45.33 25.33 16.33 12.00 10.00 0.33
Desviación 0.00 11.72 5.51 4.16 4.36 1.00 0.58

117
 Resultados. Capítulo 3

Figura 58. Media de supervivientes en cada etapa.

2. Análisis de los transformantes.
2.1. Análisis de plantas transformadas con pCambia 1305.1.
Una vez establecido el método de transformación y regeneración se obtuvieron plantas
transformadas con diferentes construcciones genéticas. Así, como aproximación preliminar, se
produjeron plantas transformadas con el plásmido pCambia 1305.1. A este respecto, la planta
transgénica seleccionada se propagó de forma vegetativa para disponer de mayor coantidad
de material vegetal. En la Figura 59 se muestran distintas fotos del crecimiento y desarrollo de
las plantas transformadas.

118
 Resultados. Capítulo 3

Figura 59. Evolución de las plantas transformadas con pCambia1305.1 obtenidas mediante
transformación-regeneración directa. En primer lugar, la planta se aclimata a tierra con una alta
humedad inicial (A) que desciende gradualmente dentro de la cámara de cultivo (B). La presencia de
ejes laterales permitoió la propagación de la planta (C) en dos plantas diferentes (D y E).

2.1.1. Análisis genético mediante PCR.

Las plantas resultantes se sometieron a una serie de análisis para determinar si la
transformación había sido eficiente y si verdaderamente se conservaron los genes del
plásmido pCambia 1305.1. Para ello se extrajo ADN genómico de hoja de las plantas obtenidas
y se analizó por PCR (Materiales y métodos 2.1.3.1). Se amplificaron los genes GUS y de
resistencia a higromicina (HYGR) (Figura 60) confirmándose la presencia de ambos genes en el
genoma en ambas plantas (ausentes en las plantas WT).

119
 Resultados. Capítulo 3

Figura 60. Producto de PCR de cada planta transformada con pCambia1305.1. Se analizó la presencia de
GUS (A) y de HYGR (B).

2.1.2. Análisis de composición, peso y rendimiento de las semillas.

Las semillas de la planta 1, de la cual se obtuvo la planta 2 por propagación, se analizaron
mostrando los resultados que se recogen a continuación.
El análisis mediante cromatografía gaseosa de las semillas mostró una composición en
ácidos grasos igual a la del ricino silvestre (WT) (Figura 61A), lo cual es lo esperado puesto que
el plásmido pCambia1305.1 utilizado no lleva ningún gen que deba alterar los ácidos grasos en
las semillas. Sin embargo, el rendimiento de aceite de las semillas de las plantas transgénicas
fue ligeramente inferior al de las semillas de la planta WT (Figura 61B).

Figura 61. Resultados de composición y rendimiento para las plantas transgénicas transformadas con pCambia1305.1. La
composición de ácidos grasos de la planta transgénica fue la misma que en las plantas WT (A). El rendimiento fue menor en las
semillas transgénicas. Las letras minúsculas señalan diferencias significativas, t-student, p<0.01.

Los pesos de las semillas tanto en la planta transgénica como en la planta WT presentaron
la distribución que se muestra en la figura 62. Las semillas de la planta transgénica
transformada con pCambia 1305.1 presentaron un peso medio de µ=390.12 mg y una
desviación σ= 59.12 mientras las plantas WT presentaron una media µ=468.81 mg y una
desviación σ=70.66 (Figura 62). La diferencia de pesos entre las semillas transgenicas y WT no
fueron estadísticamente significativas (Figura 63).

120
 Resultados. Capítulo 3

Figura 62. Distribución del peso de las semillas de plantas WT y transgénicas transformadas con pCambia 1305.1

Figura 63. Medias del peso de las semillas de plantas WT y transformadas con pCambia 1305.1.

2.2. Análisis de las plantas estables transformadas con pCambia::hpFAH12.

Siguiendo el protocolo de transformación-regeneración directa se obtuvieron
transformantes portando el plásmido pCambia 1305.1 portando la estructura hpFAH12 que ya
demostró el silenciamiento de la hidroxilasa de ricino (Figura 64). La planta estudiada no
presentó retrasos en el crecimiento, aunque formó espigas de flores exclusivamente
femeninas durante dos periodos de floración. Un año después de su paso a tierra originó flores
masculinas y femeninas lo que permitió obtener las primeras semillas mediante
autofecundación
121
 Resultados. Capítulo 3

Figura 64. Evolución de la planta transformada con pCambia::hpFAH12.

2.2.1. Análisis genético mediante PCR.

Se extrajo ADN genómico de la planta y se realizó una prueba de PCR. Se amplificaron los
genes de resistencia a higromicina (Figura 65A) y un fragmento entre el intrón y el brazo con
sentido (Figura 65B y C) de la estructura hpFAH12. Este resultado confirmó que la planta era
transgénica. Los oligonucleótidos empleados aparecen en el anexo I.

Figura 65. Análisis PCR para determinar la presencia de hpFAH12 en la planta estable. Se amplificó,
usando DNA genómico como molde, el gen GUS (A) y un fragmento de la estructura hpFAH12 (B y C).
122
 Resultados. Capítulo 3

2.2.2. Peso y distribución de las semillas.

Para analizar las semillas de esta planta transgénica (T0) portadora de la estructura génica
hpFAH12, se tomaron 91 semillas. Se cuantificó el peso de cada una y se analizó su
distribución. Los resultados mostraron que el total de semillas pudo dividirse en dos
poblaciones denominadas G1 y G2. El grupo G1 presentó un peso medio de µ=54.22 mg y una
desviación σ= 13.17 mientras el grupo G2 presentó un peso medio µ=340.8 mg y una
desviación σ=32.49. Cada población estaba compuesta aproximadamente por el 50% de las
semillas totales (Figura 66). Las poblaciones G1 y G2 conformaron dos grupos con diferencias
significativas entre sus medias (Figura 67).

Figura 66. Distribución del peso de las semillas obtenidas de la planta transformada con pCambia::hpFAH12. Las semillas recolectadas
(A) pudieron dividirse en dos poblaciones bien diferenciadas en su peso (B y C). Las semillas se dividieron en un 50% aproximadamente
para cada grupo.

123
 Resultados. Capítulo 3

Figura 67. Diferencias entre las medias de los grupos de semillas G1 y G2

procedentes de la planta transgénica para pCambia1305.1::hpFAH12.

2.2.3. Análisis genético de las semillas.

Para al análisis genético y la propagación de la progenie de esta planta transformada se
diseccionaron embriónes de semillas con el fin de desarrollar una generación siguiente (T1).
Se empleó el endospermo para el análisis genético y de composición de ácidos grasos. Por
tanto, se se escogieron 19 semillas al azar y, se extrajo el DNA genómico de cada una de las
semillas y se realizó una prueba de PCR. En este conjunto se pudo amplificar el gen GUS y el
fragmento CsFAD2intron-brazo con sentido de la estructura hpFAH12 en 6 de las 19 semillas
analizadas (Figura 68).

Figura 68. Prueba de PCR para determinar si las semillas obtenidas son transgénicas. Los genes
analizaron fueron el fragmento de la estructura génica hpFAH12 y el gen GUS del plásmido pCambia
1305.1.

2.2.4. Composición de ácidos grasos y rendimiento.

El endospermo de las 6 semillas seleccionadas se analizó mediante cromatografía gaseosa.
El resultado del análisis mostró un menor porcentaje de ácido ricinoleico en las semillas
transgénicas que en el WT, mostrando por lo demás una amplia dispersión en sus valores. Así,
el contenido en ácido ricinoleico en las semillas transgénicas osciló alrededor del 50%, con
124
 Resultados. Capítulo 3

valores entre el 76 % y el 10 % (Figura 69A). Las semillas con menor contenido en ricinoleico
mostraron un aumento en la proporción de ácido linoleico.
Por otra parte, se cuantificó el contenido de aceite de las semillas, que resultó ser menor
que el encontrado en las semillas transformadas con pCambia 1305.1 y aún menor que el de
las semillas WT (Figura 69B). Además, se encontró una correlación lineal entre el peso de la
semilla y el contenido en ácido ricinoleico (R2= 0.93155) y una correlación exponencial entre el
rendimiento de la semilla y el contenido en ácido ricinoleico (R2= 0.99183) (Figura 70 A y B).
y B).

Figura 69. Análisis de composición y rendimiento en las semillas obtenidas a partir de la planta transformada con
pCambia::hpFAH12. Las semillas transgénicas mostraron un menor contenido en ácido ricinoleico (A) y una menor
cantidad de aceite (B). Las letras pequeñas indican diferencias significativas, t-student p<0.01.

125
 Resultados. Capítulo 3

Figura 70. Correlaciones encontradas en las semillas transgénicascon pCambia::hpFAH12. Se encontró

una correlación lineal entre el peso de la semilla y el contenido ácido ricinoleico (A) y una relación
exponencial entre el rendimiento en aceite y el contenido en ácido ricinoleico (B).

126
 Resultados. Capítulo 3

2.2.5. Obtención de la primera generación (T1).

Los embriones diseccionados de las semillas que resultaron ser positivas en la prueba de
PCR para hpFAH12 fueron germinados in vitro. Los embriones permanecieron en medio MS-
sacarosa (Materiales y métodos ap. 1.3.1.) durante 3 semanas hasta formar plántulas. Las
plántulas fueron transferidas a turba hasta formar plantas adultas (Figura 71).

Figura 71. Evolución de las plantas transformadas con pCambia::hpFAH12 obtenidas de la planta
transgénica madre.

Se repitió la prueba de PCR en la parte aérea de las planta para verificar el carácter
transgénico de éstas. Las pruebas de PCR amplificó el gen GUS y el fragmento CsFAD2intron-
brazo con sentido de la estructura hpFAH12 en 6 de las las 19 plantas analizadas por lo que se
confirmó que fueron portadoras de la estructura hpFAH12 de silenciamiento del gen de la
hidroxilasa de ricino. (Figura 72). El resultado fue el mismo dado las 6 plántulas obtenidas
proceden de los embriones diseccionados de las semillas usadas para el análisis de la figura 68.

Figura 72. Test de PCR para confirmar la presencia de pCambia::hpFAH12 en la primera generación de de la
progenie del transformante.

2.3. Análisis de plantas modificadas con CRISPR/Cas9.

2.3.1. Plantas con el gen de la hidroxilasa de ricino como diana para CRISPR/Cas9.
El gen que codifica para la enzima Cas9 junto con las guías de ADN para que llevan a cabo
cortes en el gen de la hidroxilasa de ricino se ensamblaron mediante la técnica Loop Asembly y
se clonaron en el plásmido pCambia 1305.1 tal y como se describe en (Materiales y métodos
2.1.7.2.2.). Se seleccionó una planta transgénica de la misma manera que en los apartados
anteriores a después de aplicar el método de transformación-regeneración directa (Figura 73).

127
 Resultados. Capítulo 3

Figura 73. Planta modifica con CRISPR/Cas9 con la hidroxilasa de ricino como diana.
.
2.3.1.1. Análisis genético de la planta modificada.
Los cortes generados por Cas9 en la doble cadena de ADN genómico en el gen de la
hidroxilasa deberían haber formado mutaciones de diversa índole.
Para la modificación genética de esta planta, se seleccionaron dos secuencias concretas en
el gen de la hidroxilasa separadas por 132 nucleótidos. La diana número 1 de la hidroxilasa
presentó un sitio de corte para la enzima BsrDI en el mismo sitio de corte que Cas9 mientras la
diana del sitio 2 presentó un sitio de corte para Fnu4HI. Las secuencias concretas de las dianas
aparecen en (Materiales y métodos ap. 2.1.7.2.2.).
Se extrajo el ADN genómico de hojas de la planta y se sometió a una digestión previa con
las enzimas BsrDI y Fnu4HI. El producto de la digestión se usó como molde para amplificar el
fragmento del gen en el que se encuentran las dianas de corte de Cas9 (RuvC) y las dianas de
BsrDI y Fnu4HI. Si el corte in vivo de Cas9 terminó produciendo mutaciones en la cadena de
ADN se perdería el sitio de reconocimiento para BsrDI y Fnu4HI por lo que la digestión in vitro
no se produciría y el fragmento de ADN se amplificaría por PCR. En una planta no modificada,
los sitios de BsrDI y Fnu4HI quedarían intactos y estas enzimas llevarían a cabo la digestión
impidiendo la obtención de un producto de PCR (Figura 74).

128
 Resultados. Capítulo 3

Figura 74. Esquema de los sitios de restricción para las dianas Cas9 del gen de la hidroxilasa de ricino. Si
no existe mutación provocada por Cas9, BsrDI y Fnu4HI provocarán un corte en la cadena y no se
encontrará producto de PCR.

Las digestiones se llevaron a cabo de manera independiente. La reacción de PCR generó

productos tanto en la planta transformada como en al WT debido a la presencia de copias de
ADN no digeridas Figura 75.

Figura 75. Productos de PCR obtenidos en la planta modificada con CRIPSR/Cas9 para el gen de la
hidroxilasa de ricino.

Por este motivo, la banda resultante de la PCR se recuperó del gel de agarosa (Materiales y
métodos ap. 2.1.5.) y se clonó en el plásmido pMBL-T. Se transformó E.coli y se envió para que
se secuenciase el ADN de 3 colonias independientes. El fragmento del gen de la hidroxilasa de
las muestras WT no presentó mutaciones en ninguna de las tres colonias analizadas. Sin
embargo, las secuencias de los fragmentos de la hidroxilasa de las plantas plantas modificadas
vía CRISPR/Cas9 resultaron tener copias sin mutaciones y otras copias mutadas (Figura 76).

129
 Resultados. Capítulo 3

10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** ** * ** ***** ** *** ** ************************** ***
Hidroxilasa WT GACCTCAAGAGAGCCATCCCACCCCATTGCTTTGAACGCTCTTTTGTGCGCTCATTCTCC
Hidroxilasa modificada GACATCTGGTGATCCATCACAGCCCGATGGTTTGAACGCTCTTTTGTGCGCTCATTGTCC

70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* *** * * ***** * * ****** **** ************ ******
Hidroxilasa WT TATGTTGCCTATGATGTCTGCTTAAGTTTTCTTTTCTACTCGATCGCCACCAACTTCTTC
Hidroxilasa modificada TGTGTGACTTCAGATGTGGGAG-AGCCAGTCTTTTATACTAGATCGCCACCAAATTCTTC

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***************************************************** ** ***
Hidroxilasa WT CCTTACATCTCTTCTCCGCTCTCGTATGTCGCTTGGCTGGTTTACTGGCTCTTCCAAGGC
Hidroxilasa modificada CCTTACATCTCTTCTCCGCTCTCGTATGTCGCTTGGCTGGTTTACTGGCTCTTGCAGGGC

190 200 210 220

....|....|....|....|....|....|....|....|...
****** ********** ************************
Hidroxilasa WT TGCATTCTCACTGGTCTTTGGGTCATCGGCCATGAATGTGGCC
Hidroxilasa modificada TGCATTGTCACTGGTCTGAGGGTCATCGGCCATGAATGTGGCC

Figura 76. Mutaciones generadas en el gen de la hidroxilasa de la planta de ricino mediante CRISPR/Cas9. Las
mutaciones aparecen no señaladas con la estrella, además, se encontró una deleción situada en el nucleótido 83.
Las zonas resaltadas en amarillo corresponden con las dianas para CRISPR/Cas9.

2.3.1.2. Análisis del peso y distribución de las semillas.

Se tomaron los pesos de 41 semillas obtenidas de la planta CRISPR/Cas9 en la que hemos
confirmado la presencia de mutaciones en el gen de la hidroxilasa. La distribución del peso de
las semillas pudo dividirse en dos poblaciones denominadas G1 y G2. El grupo G1 presentó un
peso medio de µ=76.95 mg y una desviación σ= 15.52 mg mientras el grupo G2 presentó una
media µ=333.71 mg y una desviación σ=22.26 mg. Cada grupo daba cuenta del 50%
aproximadamente del total de las semillas analizadas. (Figura 77). Cuando estos datos se
representan en comparación con las medias obtenidas en las semillas resultantes de la planta
transformada con hpFAH12, resultan grupos equivalentes en cuanto al peso de las mismas, no
hayándose diferencias significativas entre ellos (Figura 78).

130
 Resultados. Capítulo 3

Figura 77. Distribución del peso de las semillas obtenidas de la planta transformada con pCambia::CRISPR FAH12. Las semillas
recolectadas pudieron dividirse en dos poblaciones bien diferenciadas en su peso (A). Cada una de las poblaciones presentó una
distribución con medias y desviaciones distintas (B y C). Las semillas se segregaron aproximadamente al 50% para cada grupo.

131
 Resultados. Capítulo 3

Figura 78. Medias de los grupos G1 y G2 de la planta transgénica con la estructura génica hpFAH12 y
para la planta modificada con CRISPR/Cas9 contra el gen de la hidroxilasa. No hubo diferencias entre las
semillas con la estructura hpFAH12 y las modificadas mediante CRISPR/Cas9.
.

2.3.1.3. Análisis de la composición de las semillas.

Se analizaron 6 semillas del grupo G1 escogidas al azar. La composición de ácidos grasos
mostró un menor contenido en ácido ricinoleico acompañado de un aumento de ácido oleico y
linoleico (Figura 79A). La composición de las mismas no mostró diferencias significativas con
respecto a las semillas producidas con la construcción antisentido. Además, las semillas
obtenidas, al igual que las semillas transformadas con pCambia::hpFAH12, mostraron un
contenido en aceite muy bajo, del 1% aproximadamente (Figura 79B).

132
 Resultados. Capítulo 3

Figura 79 Datos de composición de las semillas obtenidas de plantas transgénicas para pCambia1305.1,
pCambia::hpFAH12, y pCambia::CRISPR FAH12 (A). En el panel B, se recogen los datos de rendimiento
para las mismas estructuras genéticas.

2.4. Plantas con el gen de la ricina como diana para CRISPR/Cas9.

El gen que codifica para la enzima Cas9 junto con las guías de ADN para que lleven a cabo
cortes en el gen de la ricina se ensamblaron mediante la técnica Loop Asembly y se clonaron en
el plásmido pCambia 1305.1 tal y como se describe en (Materiales y métodos ap. 2.1.7.2.2.). Se

133
 Resultados. Capítulo 3

seleccionaron dos dianas para el gen de la ricina (y otras aglutininas), ambas separadas por 16
nucleótidos.
Mediante el método de transformación y regeneración directa se seleccionaron 2 plantas
de entre los distintos transformantes (Figura 80).

Figura 80. Plantas modificadas mediante CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina como diana.
.
2.4.1. Análisis genético.
Las plantas obtenidas se sometieron a un análisis genético para determinar las posibles
mutaciones generadas.
La diana 1 se diseñó con la secuencia de reconocimiento para la enzima HpyCH4II en el
mismo sitio de corte de Cas9 (RuvC), la diana 2 se diseñó para ser reconocida para HaeII en el
mismo sitio RuvC. El número de off-targets en las dianas para la ricina fue elevado dado que la
ricina está dentro de una familia de 28 genes con homología variable (Introducción ap. 1.4.1.) y
el objetivo final es generar mutaciones en el máximo número de genes que codifiquen para
proteínas tóxicas. Las secuencias seleccionadas como diana para Cas9 en la ricina se
encuentran en materiales y métodos ap. 2.1.7.2.2.
Por tanto, se llevó a cabo la digestión del ADN genómico extraído de ambas plantas, con
las enzimas HpyCH4II y HaeII en reacciones de restricción independientes. Posteriormente se
realizó una prueba de PCR para amplificar el fragmento del gen en el que se encuentra el sitio
de corte de Cas9 y de las enzimas HpyCH4II y HaeII Figura 81.

134
 Resultados. Capítulo 3

Figura 81. Esquema del sitio de corte para Cas9 en el gen de la ricina. Si los sitios quedan mutados a
partir del corte con Cas9, HpyCH4II y HaeII perderían sus sitios de restricción y se obtendría producto de
PCR.
En este caso se obtuvo un producto de PCR en las dos plantas y en la planta WT. Los
productos se PCR tanto de lass bandas superiores como inferiores se purificaron del gel de
agarosa (Materiales y métodos 2.1.5.), se clonaron en el plásmido pMBL-T y se transformó
E.coli. Se recuperó el ADN de 3 colonias distintas para cada producto de PCR y se secuenció
(Figura 82).

Figura 82. Productos de PCR obtenidos en las plantas con el gen de la ricina modificado mediante
CRISPR/Cas9. Una vez sometido a digestión con HpyCH4II y HaeII, se usó el DNA molde para realizar la
reacción de PCR.

Las plantas WT y 1 no presentaron mutaciones en el gen de la ricina. La planta 2 sufrió una

deleción de 144pb y una inserción de 8pb en el mismo sitio además de presentar copias no
mutadas del gen de la ricina. La secuencia del gen de la ricina de la planta 2 y de las plantas no
mutadas se recoge en la figura 83.

135
 Resultados. Capítulo 3

10 20 30 40 50 60 70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******************** *
Ricina WT CTTTATCAGAGCTGTTCGCGGTCGTTTAACAACTGGAGCTGATGTGAGACATGAAATACCAGTGTTGCCA
Ricina Planta 2 CTTTATCAGAGCTGTTCGCGCGC-----------------------------------------------

80 90 100 110 120 130 140

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Ricina WT AACAGAGTTGGTTTGCCTATAAACCAACGGTTTATTTTAGTTGAACTCTCAAATCATGCAGAGCTTTCTG
Ricina Planta 2 ----------------------------------------------------------------------

150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....
** ********************
Ricina WT TTACATTAGCGCTGGATGTCACCAATGCATATGTGGTCGGCTAC
Ricina Planta 2 -------------------CAATGATGCATATGTGGTCGGCTAC

Figura 83. Mutación generada en la planta 2 modificada con CRISPR/Cas9. El resultado de la secuenciación reveló una deleción de
144 pb y una posterior inserción de 8pb. Las áreas resaltadas en amarillo corresponden a las dianas para CRISPR/Cas9.

136
 Resultados. Capítulo 4

Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a

glicerolípidos en microsomas de ricino.

En esta sección se exponen los resultados que se obtuvieron de los experimentos en los
que se estudió el metabolismo de distintos ácidos grasos marcados, por parte de microsomas
de semilla de ricino, con el objeto de conocer la capacidad de la maquinaria enzimática de esta
planta para acumularlos como lípidos de reserva.

1. Metabolismo de ácido oleico

Estos experimentos se realizaron incubando oleato radioactivo con microsomas y los
cofactores adecuados durante un periodo de 5 h, a lo largo de las cuales se tomaron alícuotas
a partir de las cuales se estudió la incorporación del precursor en la fracción soluble (acil-
CoAs), lípidos neutros y lípidos polares en dicho periodo. En el caso del ácido oleico se observó
una incorporación rápida y bastante elevada en la fracción de acil-CoA. Ésta se determinó por
la incorporación del precursor en la fase acuosa, que fue posteriormente confirmada por
cromatografía en capa fina. La incorporación de oleato en acil-CoA alcanzó su máximo a 1 h de
incubación (Figura 84; 2.5 pmol/mg prot) y fue decayendo a lo largo de todo el experimento.
Con respecto a los lípidos, se registraron incorporaciones similares tanto en lípidos polares
como en lípidos neutros (Figura 84).

137
 Resultados. Capítulo 4

Figura 84. Incorporación de ácido oleico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de
microsomas de semillas de ricino en desarrollo. PA: ácido fosfatídico; PC: fosfatidil colina; DAG:
diacilglicéridos; TAG: triacilglicéridos.

La fracción de lípidos polares mostró incorporación en dos especies, ácido fosfatídico (PA)
y en fosfatidilcolina (PC). La especie mayoritaria fue el PA, que mostró un incremento continuo
hasta las dos horas de incubación y fue decayendo a partir de aquel punto. La PC mostró un
perfil similar, aunque con unos niveles de incorporación mucho menores.
En cuanto a los lípidos neutros, de registró incorporación del precursor en TAG y DAG no
hidroxilados. La incorporación observada fue mayor en DAG, que se incrementó de manera
continua a lo largo del experimento alcanzando su máximo a 3 h de incubación con 116

138
 Resultados. Capítulo 4

pmol/mg prot de precursor. A partir de ese punto la incorporación tanto de DAG como de TAG
se estabilizó. La incorporación en TAG mostró un patrón similar, aunque los niveles de
incorporación se mantuvieron más bajos, con una incorporación máxima de 55 pmol/mg prot.

2. Metabolismo de ácido ricinoleico

Cuando se empleó ácido ricinoleico el patrón de incorporación del precursor mostró una
rápida incorporación en los acil-CoAs, que fue máxima a 30 min (1.1 nmol/mg prot, Figura 85),
y fue decayendo de manera importante a lo largo del experimento estabilizándose en las
últimas dos horas del mismo. A diferencia de lo observado con el ácido oleico, cuando se
emplearon ácidos grasos hidroxilados no se registró incorporación medible en lípidos polares y
las especies de glicerolípidos que se siguieron fueron todas lípidos neutros, en concreto DAG y
TAG con distintos grados de hidroxilación. En la figura 85 se muestra la evolución de los DAG
portando un solo ácido graso hidroxilado (DAG-H) y los que portaban dos de ellos (DAG-2H).
Ambas familias de especies mostraron perfiles similares a lo largo del experimento, con
cinéticas de saturación donde se registraron incrementos progresivos seguidos de un periodo
donde se estabilizó o decayó levemente. La forma DAG-2H fue la predominante, mostrando
una incorporación de precursor doble que la forma DAG-H.
Con respecto a los TAG, se siguieron 3 familias de especies de TAG con distinto grado de
hidroxilación, correspondientes a especies con una molécula de ácido ricinoleico (TAG-H), dos
(TAG-2H) o tres (TAG-3H). La forma TAG-H fue la que mostró un mayor nivel de incorporación,
mostrando de nuevo cinéticas de saturación con un ligero declive al final del experimento. La
incorporación en TAG-2H y TAG-3H mostraron perfiles y niveles de incorporación similares,
con máximos a 2 h y ligero declive posterior. La incorporación en TAG fue aproximadamente
doble que la observada en DAG.

139
 Resultados. Capítulo 4

Figura 85 Incorporación de ácido ricinoleico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de

microsomas de semillas de ricino en desarrollo. DAG: diacilglicéridos; TAG: triacilglicéridos. H, 2H o 3H
indica el número de ácidos hidroxilados esterificados en cada especie
.

3. Metabolismo del ácido lesquerólico.

En los experimentos de metabolismo del ácido lesquerólico por parte de los microsomas
de semilla de ricino se observó una rápida incorporación del precursor en los acil-CoA,
alcanzando un máximo a los 30 minutos de incubación (0.5 nmol/mg prot; Figura 86) y un
posterior declive de estos intermediarios a lo largo del experimento. Los productos en los que
el precursor se incorporó fueron lípidos neutros, DAG y TAG. No se detectó incorporación en
lípidos polares.

140
 Resultados. Capítulo 4

En la fracción de DAG se detectaron especies monohidroxiladas y dihidroxiladas,

mostrando perfiles de incorporación muy similares entre sí, en forma y niveles, con un rápido
incremento del marcaje en las dos primeras horas de incubación (Figura 86). Con respecto a
las especies de TAG sintetizadas se encontró una rápida aparición de especies trihidroxiladas
en la primera media hora de experimento, subida que se moderó hasta las dos horas y registró
una disminución hasta el fin del mismo (Figura 86). El patrón de incorporación de TAG-2H fue
similar, pero con niveles de incorporación 3 veces menor. Finalmente, los TAGs
monohidroxilados mostraron un perfil de incorporación diferente, con una subida progresiva
del marcaje en las dos primeras horas de incubación y posterior estabilización. Dentro de los
glicerolípidos neutros sintetizados predominaron los TAG sobre los DAG en una proporción
aproximada de 2:1.

Figura 86. Incorporación de ácido lesquerólico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de
microsomas de semillas de ricino en desarrollo. DAG: diacilglicéridos; TAG: triacilglicéridos. H, 2H o

141
 Resultados. Capítulo 4

3H indica el número de ácidos hidroxilados esterificados en cada especie.

4. Metabolismo del ácido coriólico.

El ácido coriólico se incorporó en forma de acil-CoA en la fracción soluble dando lugar a
una curva de saturación donde no se apreció ningún máximo y la incorporación fue subiendo a
lo largo del estudio (Figura 87). No se detectó incorporación en lípidos polares, siguiéndose la
incorporación en diferentes especies de lípidos neutros. Al igual que con los otros precursores
se siguieron los DAG y TAG con distintos grados de hidroxilación.
En el caso de los DAG las especies del tipo DAG-2H mostraron una cinética de saturación
mientras que los DAG-H mostraron un máximo a 1 h de incubación con una posterior
disminución a tiempos más largos (Figura 87). En el caso de los TAG la especie predominante
es TAG-H2 que creció a lo largo de todo el estudio. Las tendencias de las incorporaciones en
TAG-3H y TAG-H fueron más bajas y difíciles de interpretar, oscilando a lo largo del
experimento. En este caso las incorporaciones en DAG y TAG fueron similares.

142
 Resultados. Capítulo 4

Figura 87. Incorporación de ácido coriólico a la fracción de acil-CoA y glicerolípidos por parte de
microsomas de semillas de ricino en desarrollo. DAG: diacilglicéridos; TAG: triacilglicéridos. H, 2H o 3H
indica el número de ácidos hidroxilados esterificados en cada especie.
.

5. Incorporación en triglicéridos con los distintos precursores.

Para conocer la capacidad de la maquinaria enzimática del ricino para canalizar los
distintos ácidos grasos hacia lípidos de reserva se realizó un estudio comparativo donde se
muestra la incorporación registrada en TAG a partir de distintos precursores a partir de los
datos obtenidos de los experimentos de marcaje (Figura 88). Estas curvas muestran que el
ricinoleico es el ácido graso incorporado con mayor rapidez, siguiendo una curva con un
máximo a las 2 h de incubación y declive posterior. El ácido lesquerólico se incorporó a la

143
 Resultados. Capítulo 4

fracción de TAGs dando lugar a una curva similar al ricinoleico, pero con incorporaciones que
fueron aproximadamente la mitad que las observadas para el primero. En el caso del oleato la
incorporación mostró un perfil diferente, con un incremento lineal del contenido de TAGs que
abarcó un periodo de 3 h, estabilizándose finalmente a tiempos más largos. La velocidad de
síntesis de TAG con ácido coriólico fue muy baja en comparación con los otros precursores
hidroxilados, aunque mantuvo un patrón de incorporación de precursor similar a los mismos.
Con estos datos se establecieron las velocidades iniciales de síntesis de TAG con cada
precursor, que se muestran en la tabla 12, los cuales dan cuenta de la capacidad del ricino
para la acumulación de cada uno de ellos.

Figura 88. Incorporación de diferentes ácidos grasos a la fracción de triacilglicéridos por microsomas de
ricino.

Tabla 12. Velocidades iniciales de incorporación de distintos ácidos grasos en triacilglicéridos (TAG) por
parte de microsomas de semillas de ricino.
INCORPORACIÓN EN TAG (PMOL/MIN/MG PROT)
RICINOLEICO 6.37±1.23
LESQUERÓLICO 3.22±0.37
OLEICO 0.38±0.11
CORIÓLICO 0.29±0.09

144
 V. DISCUSIÓN

145
 Discusión. Capítulo 1

Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación

transitoria en ricino.

1. Transformación del fruto de ricino mediante agroinfiltración.

El ricino es una especie que no presenta un ciclo de vida corto. Desde el momento de la
germinación, y en condiciones óptimas, la planta de ricino puede necesitar entre 3 y 4 meses
hasta generar las primeras semillas. Además, el método de transformación-regeneración
directa (Resultados cap. 3 ap. 1.2.2.) puede requerir de 2 a 3 meses extra aproximadamente.
Por tanto, los largos periodos necesarios para desarrollar una planta transgénica de ricino
y disponer de sus semillas, hizo necesario el desarrollo de un método para comprobar si las
construcciones genéticas utilizadas tendrían algún efecto fenotípico en las semillas obtenidas.
Una posibilidad en este sentido sería desarrollar un método rápido de transformación
transitoria del endospermo capaz de producir cambios fenotípicos en la semilla.
En primer lugar, se recurrió al método de transformación transitoria in vitro de la semilla
de ricino asistido por SAAT descrito por Chileh et al. (2010). Este método requería la disección
de la semilla encapsulada en el fruto en condiciones de esterilidad, una labor ardua que
además presentaba un alto riesgo de contaminación.
Por otra parte, el método de transformación transitoria in vitro, solo permitía la incubación
de las semillas durante 5 días una vez realizada la transformación. Para los objetivos de este
proyecto se necesitarían periodos de desarrollo más largos tras la transformación para que
pudieran observarse cambios en el metabolismo lipídico. Finalmente, los resultados del ensayo
preliminar de transformación in vitro no resultaron muy alentadores, al dar lugar a una baja
tasa de transformación, con semillas transformadas de manera poco homogénea e irregular
(Figura 34).
Estos resultados llevaron a optar por el desarrollo de un método diferente, más sencillo y
versátil. Ya en otras especies como en fresa (Carvalho et al., 2016), tomate (Orzaez et al.,2006)
o melón (Han et al., 2015) se había llevado a cabo la transformación transitoria de frutos
mediante agroinfiltración, de manera similar a como se realiza enhojas de tabaco (Nicotiana
benthamina; Potrykus, 1991).
Atendiendo a la bibliografía se decidió optar por la inyección de Agrobacterium en la
semilla de ricino. Los resultados obtenidos en los primeros ensayos (Figura 35) mostraron un
nivel alto de transformación, que se extendió a tejidos adyacentes. Así, también
experimentaron transformación los tejidos del fruto (Figura 35A) y la carúncula (Figura 35B).
Los niveles observados en el endospermo fueron especialmente altos (Figura 35 C y D) lo que

147
 Discusión. Capítulo 1

desde el principio indicó que este método fue muy prometedor para los propósitos del
proyecto. Además, la transformación del fruto indica que este método podría usarse para
transformar otros órganos o tejidos del ricino además de la semilla.
Dado el éxito en los resultados y la simplicidad del método se decidió optimizar el mismo y
explorar esta vía para la comprobación, en el endospermo de las semillas de ricino, del
funcionamiento de las construcciones genéticas diseñadas.

2. Elección de momento de infiltración para la transformación transitoria in vivo de las

semillas de ricino y tasa de transformación.
Una vez desarrollado el protocolo de agroinfiltración de la semilla de ricino, se comprobó
que uno de los aspectos fundamentales que determinaban el éxito del método fue el
momento de infiltración del fruto.
El momento de infiltración es un punto crítico en el método de infiltración, la semilla debe
ser transformada en el estadio más temprano posible para que la proliferación celular permita
el mayor número de células transformadas en el endospermo durante el desarrollo de la
semilla.
Sin embargo, la exposición del endospermo a la infección de Agrobacterium en estadíos
demasiado tempranos conduce al aborto de la semilla y la necrosis del tejido.
La tasa de abortos en función del momento de la infiltración se muestra en la figura 36.
En el período de 20 a 30 DAP, las semillas fueron muy susceptibles y la inoculación de
Agrobacterium causó un gran número de abortos de semillas, que alcanzó casi el 50% después
de 5 DAI y aumentó al 100% al final del período de estudio, que fue 20 DAI. Resultados
similares fueron obtenidos con semillas inyectadas en el periodo de 30 a 40 DAP, sólo con
ligeras diferencias en la tasa de abortos a 20 DAP. En etapas más avanzadas de desarrollo, la
tasa de abortos se redujo de manera notable, sobre todo a 5 DAI, llegando a un valor cercano a
cero en semillas maduras. A tiempos más largos tras la infiltración los porcentajes de frutos
abortados fueron alrededor de 50-60% de los inoculados a 40-50 DAP y de 30 a 50% a 50-60
DAP (Figura 36).
El objetivo de este proyecto es el estudio de la influencia de diferentes genes en la
biosíntesis del aceite de la semilla y la acumulación de ricina durante su desarrollo, entre otros.
Debido a ello, necesitamos transformar la semilla durante un periodo de tiempo lo
suficientemente largo como para observar cambios en su composición sin dejar de tener frutos
viables para el estudio. De esta forma la selección del momento de infiltración debe ser en un
estadio en el que se obtenga el máximo número de semillas transformadas durante el máximo
tiempo posible.

148
 Discusión. Capítulo 1

Observando el resultado obtenido que se muestra en la figura 33, podemos ver que
alrededor de 40DAP se produce una reducción importante del número de abortos. Este
estadio es, además, el momento en el que la semilla dispara la síntesis y almacén de aceite
(Venegas-Calerón et al., 2016) y de proteínas tóxicas como la ricina (Loss-Morais et al., 2013).
Por lo que se tomó desde este punto como el momento idóneo para la agroinfiltración de la
semilla.

3. Estudio del efecto de diferentes promotores en la expresión génica en endospermo de

ricino. Ensayo histoquímico.
Uno de los potenciales usos de la transfromación transitoria es la de realizar estudios
previos del perfil de expresión inducido sobre los transgenes por distintos promotores en
ricino. A este respecto se realizó un estudio previo con el vector de transformación pCambia
1305.1 portando su promotor original promotor del virus del mosaico de la coliflor, abreviado
como 35S, (Franck et al., 1980) o el promotor pGly (Sims & Goldberg., 1989). El promotor 35S
es un promotor constitutivo de fuerte expresión y de uso extensivo en transformación
transitoria. El promotor pGly es especifico de semillas y usado frecuentemente para la
expresión de genes en este órgano (Zhang et al., 2018). Además, se realizaron varios ensayos
de control con el mismo vector pero en ausencia de promotor para GUS y también se
analizaron semillas no infiltradas.
El análisis de expresión se realizó aplicando el ensayo histoquímico de GUS. Como se ha
descrito en el apartado anterior, la infiltración se llevó a cabo a 40 DAP aproximadamente,
muestreándose semillas a 5, 10 y 20 DAI.
Las semillas transformadas con pCambia1305.1 y pCambia::pGly mantuvieron una fuerte
expresión de GUS hasta los 20 DAI. Esta alta persistencia de la transformación, así como los
altos porcentajes de transformantes, vuelven a confirmar que el método desarrollado es
apropiado para realizar estudios de expresión y comprobación de construcciones sin tener que
infiltrar un número excesivamente alto de frutos. Además, como puede observarse en la
figura 38, en muchos casos también resultaba transformado el eje embrionario en la semilla,
por lo que su germinación in vitro podría abrir las puertas para un nuevo método de
transformación estable.
Las semillas transformadas con pCambia 1305.1::nulo, sin promotor que regulase la
expresión de GUS, mostraron un tono ligeramente azul que indicaba una cierta actividad basal
de expresión del marcador GUS independiente de la regulación del gen. Las semillas no
infiltradas (Figura 38 J, K y L) presentaron una tonalidad azulada muy leve que nos indica que
el endospermo de ricino puede tener actividad glucuronidasa inespecífica derivada de otras

149
 Discusión. Capítulo 1

enzimas presentes en sus células, tal y como ocurre en semillas de otras plantas (Hu et al.,
1990).
A la vista de estos resultados, se concluye que la transformación transitoria in vivo del
ricino puede ser una herramienta que abra nuevas perspectivas para el estudio de la
biosíntesis de aceite y proteínas en esta especie, dado que permite la expresión de los genes
de interés en la semilla durante en los últimos 40 días de su desarrollo. Este método también
permite probar de forma rápida y sencilla todo tipo de construcciones genéticas, como son
promotores o construcciones de silenciamiento tipo ADN antisentido o CRISPR-Cas9, como se
demuestra en los siguientes apartados.

4. Estudio cuantitativo de la expresión inducida por distintos promotores en endospermo

de ricino.

En el presente apartado se pretendió ampliar el estudio anterior estudiando los niveles de

expresión del gen marcador en semillas inflitradas de manera cuantitativa. Para ello se empleó
la técnica de qPCR para analizar el nivel de expresión del gen. Como control para el análisis de
qPCR se usaron las semillas infiltradas con el plásmido pCambia1305::nulo, para estandarizar la
expresión se usó el gen de la actina de ricino. Se utilizó la determinación fluorimétrica de la
actividad GUS para estimar si estos ARNm son adecuadamente traducidos por la maquinaria
biosintética de la planta, para ello se emplearon las construcciones con los promotores 35S y
pGly.
La cantidad de transcritos, esto es, la expresión del gen GUS, bajo el promotor 35S fue
extremadamente alta 5 días después de la transformación. Este nivel de expresión cayó de
forma rápida a los 10 y 20 días después de la transformación (Figura 39 B). Sin embargo, se
observó que la actividad de la enzima GUS bajo la regulación del promotor 35S, fue
inicialmente baja y fue aumentando ligeramente de 5 a 20 DAI. En cambio, cuando el gen
marcador estuvo bajo el control del promotor pGly presentó un perfil diferente, con un nivel
de expresión génica mucho menor que el proporcionado por el promotor 35S, pero
paradójicamente, con una mayor actividad de la enzima GUS, que mostró su máximo a 10 DAI
(Figura 39 A). Esta diferencia en la actividad GUS regulada por distintos promotores es también
patente cuando se emplea el ensayo histoquímico de GUS (Figura 38 A-F), donde las semillas
transformadas con pCambia::pGly mostraron un color más oscuro que aquellas transformadas
con pCambia 1305.1.
Estos datos indican que el alto nivel de expresión de ARNm que codificaría para la proteína
GUS bajo el promotor 35S, provoca un descenso en la traducción del gen en el endospermo de

150
 Discusión. Capítulo 1

ricino. Esta reducción no se observa con el promotor pGly dado que se detecta mayor
actividad GUS. El rápido descenso de la expresión de ARNm de GUS bajo el promotor 35S y la
menor actividad del marcador podría deberse a mecanismos de silenciamiento presentes en la
planta de ricino. El silenciamiento génico ha sido frecuentemente observado en otras plantas
transgénicas, especialmente cuando se ha utilizado el promotor 35S para la expresión de
proteínas (Holtorf et al., 1995).
El problema del silenciamiento en expresión transitoria parece que puede variar
dependiendo de la planta hospedadora y de las condiciones de infiltración. Orzaez et al.,
(2006) encontraron bajos niveles de marcadores GUS y proteína amarilla fluorescente cuando
dichos marcadores fueron regulados por el promotor 35S. El problema se resolvió usando un
promotor de activación por choque térmico en el que la actividad GUS apareció tras someter la
planta a una temperatura de 45C. Sin embargo, en semillas oleginosas, King et al., (2015) no
observaron ningún evento de silenciamiento génico en endospermo de soja cuando utilizaron
este promotor.
Este silenciamiento se lleva a cabo mediante mecanismos epigenéticos que eliminan el
ARN de los genes transcritos e intervienen en la defensa de la planta (Schubert, 2004). Son
estos mecanismos los que llevaron al descubrimiento de las estructuras de silenciamiento
génicos, miARN, siARN y hpARN entre otras, una de ellas usadas en este proyecto (Introducción
ap. 4.4.2.). Sin embargo, en nuestro caso, no se observa un descenso en el número de copias
transcritas, sino que lo que se produce es una disminución de la actividad del gen marcador, lo
cual podría indicar que dicho mecanismo de silenciamiento implica a la traducción más que a
la transcripción. De cualquier manera, los promotores que inducen un nivel de transcripción
moderado como el promotor pGly no provocan un silenciamiento de la expresión en estadios
tempranos y esta expresión se mantuvo en el tiempo.
Finalmente, atendiendo a estos resultados, se decidió optar por el promotor pGly para
aquellas construcciones genéticas que requieran una expresión más duradera como la
estructura de silenciamiento génica hpFAH12, la enzima LfKCS3 y la enzima SlEPX. Para los
diseños con CRISPR se empleó el promotor 35S dado que en este caso no se requiere una
expresión de Cas9 duradera, sólo se necesita que se exprese en un momento determinado y
genere mutaciones en una población de células.

151
 Discusión. Capítulo 2

Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos

de la semilla de ricino vía expresión transitoria in vivo.

El método desarrollado de transformación in vivo permitió probar una serie de

construcciones encaminadas a la modificación de la composición de ácidos grasos en la semilla
de ricino con el objeto final de emplearlas en la generación de plantas transgénicas estables.
A continuación, se comentarán los resultados correspondientes a cada una de las
construcciones ensayadas.

1. Reducción del contenido de ácido ricinoleico.

Para la reducción del contenido en ácido ricinoleico y el estudio de su efecto sobre la
acumulación de aceite se emplearon las técnicas de ARN antisentido y CRISPR/Cas9 como se
menciona en las secciones anteriores. En ambos casos se empleó pCambia1305.1 como
plásmido vector. La reducción de ácido ricinoleico sirvió como prueba para demostrar la
modificación genética en ricino, además, la reducción en el contenido de este compuesto y la
consecuente acumulación de otros podría ser necesaria para la síntesis posterior de otros
ácidos grasos de interés.

1.1. Aplicación de la técnica de ADN antisentido mediante la expresión de hpFAH12.

La estructura de ADN en horquilla o hairpin diseñada contra la hidroxilasa de ricino
hpFAH12, produciría silenciamiento génico a nivel postranscripcional en un proceso en el que
intervendrían proteínas como argonauta y dicer (Introducción ap., 4.4.2.). Las semillas fueron
transformadas a 40-50 DAP aproximadamente, mediante agroinfiltración in vivo con el
plásmido pCambia::hpFAH12. La expresión de hpFAH12 estuvo regulada por el promotor pGly.
Las semillas fueron recolectadas a 5, 10 y 20 DAI. La composición de ácidos grasos del
endospermo mostró una reducción del 50% aproximadamente en el contenido de ricinoleico al
final del desarrollo de la semilla (20 DAI), la cual fue significativa frente al contenido de dicho
ácido graso observado en las semillas control transformadas con el plásmido vacío (Figura 42),
lo que indicaría que la construcción está funcionó según lo esperado y es capaz de inducir la
supresión de la FAH12 y la disminución del producto de esta enzima.
Por otra parte, los cambios en la composición no fueron apreciables a 5 DAI ni a 10 DAI. A
este respecto, hay que tener en cuenta que la expresión del promotor pGly es constante y
produjo un pico de actividad GUS en 10 DAI (Figura 39). Es probable que el aumento del
número de copias del hpFAH12, que se produjo hasta los 20 DAI, haya puesto en marcha la

153
 Discusión. Capítulo 2

maquinaria de silenciamiento génico de la planta, que ha terminado provocando un descenso

en la enzima hidroxilasa con la consecuente disminución del contenido en ácido ricinoleico.
Por otra parte, hay que tener en cuenta que la expresión del gen FAH12 experimenta un
aumento alrededor de los 40 DAP (Chen et al., 2007), momento en el que se produce la
transformación. No obstante, hasta que el promotor pGly no genera suficientes copias de
hpFAH12 no se produciría el silenciamiento de FAH12.
Así mismo, se ha observado que la disminución de ácido ricinoleico se produjo a expensas
de un aumento de los ácidos grasos oleico, pero sobre todo linoleico (Figura 42). Este
resultado sería en principio esperable, ya que la enzima hidroxilasa de ricino produce ácido
ricinoleico a partir de ácido oleico, y éste último también puede convertirse en ácido linoleico
por la acción de la desaturasa FAD2 (Figura 17; Figura 18). De hecho, en el ricino común, el
ácido graso no hidroxilado mayoritario es el ácido linoleico. En este sentido es interesante
destacar que, aunque las secuencias de la FAH12 y FAD2 tienen alta homología, se ha logrado
diseñar una construcción génica que únicamente está silenciando la expresión de la FAH12 y
parece que no se ve afectada la expresión de la FAD2.
Por otra parte, la composición obtenida en las semillas que están silenciando la FAH12
contrasta con la composición de ácidos grasos del mutante de ricino OLE1. Este mutante
presenta una serie de mutaciones en el gen FAH12 que alteran su centro activo y suprimen su
funcionalidad (Venegas-Calerón et al., 2016). En este caso, la supresión de la actividad FAH12
dió lugar a un fenotipo con alto contenido en ácido oleico y unos niveles muy bajos de ácido
linoleico. De esta forma, estos resultados parecen indicar que la ausencia o la disminución de
la cantidad copias traducidas del gen FAH12 causan un efecto diferente en el metabolismo
lipídico del ricino que la inactivación de la actividad por medio de mutaciones. Este hecho ha
de ser confirmado con más pruebas experimentales y será discutido a lo largo de esta tesis a la
vista de los resultados obtenidos en el silenciamiento de la hidroxilasa mediante distintas
técnicas.

1.2. Silenciamiento de FAH12 mediante la técnica CRISPR/Cas9.

Otra técnica empleada para la reducción de ácido ricinoleico fue la expresión, de forma
transitoria, del sistema CRISPR/Cas9 clonado en pCambia1305.1. En este caso, la enzima Cas9
fue regulada bajo el promotor 35S duplicado (2x35S). La función de Cas9 es la de provocar el
máximo número de mutaciones en el gen de la hidroxilasa, en el mayor número de células
posible inactivando la proteína de forma pretranscripcional. Como ya se ha discutido en el
capítulo anterior, el uso del promotor 35S podría inducir respuestas defensivas en la planta. En
el caso de Cas9 este riesgo no es demasiado importante ya que esta técnica, a diferencia de

154
 Discusión. Capítulo 2

del silenciamiento utilizando ADN antisentido, no requiere niveles de expresión constantes del
diseño genético con el que se transforma la planta para alterar su fenotipo ya que Cas9 edita el
ADN genómico de la planta de una manera permanente.
Las semillas mutadas fueron seleccionadas mediante PCR usando como molde el ADN
genómico de las mismas previamente tratado con las enzimas de restricción BsrDI y Fnu4HI
(Figura 43). Además, la presencia de Cas9 en el tejido transformado se confirmó mediante PCR
(Figura 44).
La transformación con la construcción CRISPR/Cas9 contra el gen FAH12 produjo una
reducción del contenido en ácido ricinoleico que pudo observarse a partir de 10 DAI. Así, el
contenido de ácido ricinoleico en estas semillas fue del 40% aproximadamente, porcentaje que
se mantuvo en las semillas recolectadas en 20 DAI, no presentando diferencias significativas
con las semillas infiltradas con hpFAH12 en este último periodo (Figura 46).
La reducción de ácido ricinoleico desde 10 DAI, con respecto a las semillas control, indica
que la herramienta CRISPR/Cas9 fue más potente a la hora de silenciar la actividad FAH12 y
que es totalmente válida para producir plantas modificadas de manera estable.
Al igual que con hpFAH12, en las semillas transformadas con la construcción CRISPR/CAS9,
se observa que no solo se produce una reducción en el contenido de ácido ricinoleico, si no
que se produce un aumento de los ácidos oleico y linoleico, incluso mayores que con el uso de
hpFAH12. Durante el diseño de las construcciones CRISPR/CAS9 contra FAH12 se seleccionaron
aquellas dianas con el menor número de OFF-targets posibles, de manera que solo afectara al
gen de la hidroxilasa, por lo que no cabe esperar que FAD2 (oleato desaturasa) se viera
afectada por Cas9. Esto se confirma por el elevado contenido de linoleico observado en las
semillas transformadas después de 20 DAI.
El uso de técnica CRISPR/Cas9 combinada con la transformación transitoria en plantas no
es una técnica muy común, sin embargo, algunos autores ya la han usado con éxito. Así,
Ludman et al. (2017), usaron CRISPR/Cas9 de forma transitoria mediante agroinfiltración en
hojas de N. benthamina con el fin de inactivar la proteína AGO1 que interviene en la respuesta
antiviral en la planta.
Ambas técnicas, hpFAH12 y CRISPR/CAS9, han demostrado en este estudio ser válidas para
la reducción del contenido de ricinoleico en ricino. Por otra parte, la técnica de agroinfiltración
in vivo se consolidó como un método eficaz para comprobar el efecto de diversas
construcciones genéticas.

155
 Discusión. Capítulo 2

2. Producción de ácido lesquerólico.

La producción de ácidos grasos hidroxilados distintos al ricinoleico es uno de los objetivos
principales de este trabajo. Con el fin de conocer el potencial de producción de ácido
lesquerólico en ricino empleando la elongasa LfKCS3 de Lesquerella fendleri, un grupo de
semillas fueron infiltradas con una construcción génica diseñada para expresar la mencionada
enzima bajo el control del promotor pGly (pCambia::LfKCS3; Materiales y métodos ap.
2.1.7.1.2.). Las semillas transformadas a los 40 DAP, se muestrearon a los 5, 10 y 20 DAI. La
expresión de LfKCS3 se verificó mediante PCR y usando como molde el cDNA de las semillas
transformadas (Figura 47). El análisis del endospermo mediante cromatografía gaseosa mostró
que la expresión de LfKCS3 aumentó de forma significativa el porcentaje de ácidos grasos de
cadena larga y muy larga a los 5 y 10 DAI.
La cantidad de ácido lesquerólico obtenida en las semillas transformadas con la
mencionada construcción fue hasta 8 veces mayor que en las semillas control (transformadas
con el vector sin modificar pCambia 1305.1) a los 5 DAI y 3 veces mayor en las semillas
recuperadas en los 10 DAI. No se apreciaron diferencias en las semillas recuperadas en los 20
DAI.
El perfil de producción de ácido lesquerólico en las semillas transformadas estuvo en
buena concordancia con el perfil mostrado por la actividad GUS bajo el control del promotor
pGly, que presenta un máximo de expresión a 10 DAI y disminuye a 20 DAI (Figura 39). De esta
manera, la elongasa LfKCS3 produciría cantidades apreciables de lesquerólico en dichas etapas
y se vería finalmente enmascarada en la etapa final del desarrollo por la disminución en su
expresión y por la síntesis masiva de ricinoleico que ocurre en dicho periodo.
A pesar de que el incremento de ácido lesquerólico fue importante, la cantidad total de
este compuesto no superó el 0.5% de la composición total de ácidos grasos del aceite de la
semilla, por lo que una transformación estable parece que no podría producir una acumulación
masiva o significativa de ácido lesquerólico. La causa de esta baja acumulación del producto
elongado podría estar en la baja concentración de sustrato que encuentra la enzima en las
células del endospermo de ricino en desarrollo (Figura 50). Así el ácido ricinoleico se produce
por hidroxilación de oleico esterificado a moléculas de PC y es posteriormente canalizado a
TAG a través de distintas vías. La síntesis de lesquerólico se produce por la elongación del
ricinoleil-CoA catalizada por un complejo ácido graso elongasa, cuya enzima determinante en
la enzima condensante LfKCS3. Así pues, la enzima LfKCS3 debería encontrarse una
concentración adecuada de ricinoleil-CoA en el citosol para producir el producto elongado a
buena velocidad. A este respecto se investigó la composición y el tamaño del pool de acil-CoA
en ricino en desarrollo, la cual se muestra en la figura 50. En esta figura se observa que la

156
 Discusión. Capítulo 2

composición de dicho conjunto dista bastante de la composición acílica del aceite de ricino,
siendo predominantes el palmitil-CoA y el ácido linoleil-CoA. En todos los estadios estudiados,
la concentración de ricinoleil-CoA fue muy baja, estando por debajo incluso de la proporción
observada para derivados de ácidos grasos muy minoritarios en ricino como el araquídico. Esta
baja concentración de ricinoleil-CoA en el endospermo de ricino es comprensible desde el
punto de vista de la alta capacidad de la maquinaria enzimática del ricino para acumular y
canalizar ácido ricinoleico a la fracción de TAG. De esta forma, las aciltransferasas de retículo
transferirían de manera tan eficiente el ricinoleil-CoA hacia glicerolípidos (Introducción ap.
3.7.2.) que no permitirían a la LfKCS3 elongar dicho intermediario en proporciones adecuadas
para su acumulación en grandes cantidades. Esto sería un importante impedimento
metabólico para la acumulación de ácido lesquerólico en ricino. Por tanto, la nueva estrategia
que debería adoptarse para incrementar la cantidad de ácido lesquerólico en semillas, podría
implicar pues el incemento de la concentración de ricinoleil-CoA en el conjunto citosólico de
las células del endospermo. Esto podría realizarse disminuyendo la actividad de las enzimas
canalizadoras mediante técnicas de silenciamiento génico. Las candidatas más claras a este
respecto sería las aciltransferasas de retículo, como la DAGAT, la LPAAT o la GPAT.

3. Expresión de la epoxigenasa de Stokesia laevis.

En esta sección se intentó la producción de ácidos grasos epoxidados mediante la
expresión de la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis (SlEPX) junto con la estructura de
silenciamiento del gen de la hidroxilasa hpFAH12.
Esta enzima cataliza la síntesis de ácido vernólico a partir de ácido linoleico. Éste último se
genera a partir del ácido oleico por acción de la enzima FAD2. El silenciamiento del gen de
FAH12 aumentaría la disponibilidad de ácido linoleico, como ya hemos visto en resultados
anteriores, para que SlEPX pueda catalizar la formación de ácido vernólico (Figura 18). Por este
motivo se decidió diseñar una construcción expresando el gen SlEPX junto con hpFAH12, para
incrementar la proporción del sustrato natural de la SlEPX.
Dahlqvist et al. (2000), mediante incubaciones de vernoleil-CoA con microsomas de ricino,
demostraron la capacidad de esta planta para canalizar el vernoleil-CoA hasta TAG, por lo que
en principio el ricino tendría la dotación enzimática adecuada para acumular vernoleato en sus
TAG de reserva. La tranformación de la semilla fue comprobada mediante ensayo GUS
histoquímico (Figura 51). Los resultados obtenidos mostraron los efectos del silenciamiento de
la FAH12, con una disminución del contenido en ácido ricinoleico acompañado de un leve
aumento del contenido en ácido linoleico (Figura 52). Sin embargo, no aparecieron siquiera

157
 Discusión. Capítulo 2

trazas de ácido vernólico en ninguna de las semillas infiltradas muestreadas a distintos DAI, lo
que indica que esta enzima parece no estar funcionando como se esperaba.
Por otra parte, y en un experimento más reciente se usó la epoxidasa de Vernonia
galamensis, en una construcción similar también sin resultados satisfactorios (resultados no
mostrados). Se deben seguir estudiando las causas del mal funcionamiento de estas enzimas
productoras de epóxidos en la planta de ricino. Es posible que la enzima que se esté
sintetizando no esté activa en el ricino. En futuros experimentos se deberían probar otros
genes que codifiquen otras epoxigenasas alternativas.

158
 Discusión. Capítulo 3

Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro

y transformación estable. Generación de plantas transgénicas.

1. Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable.

1.1. Transformación del embrión de ricino.
El embrión fue el órgano elegido para llevar a cabo la transformación estable del ricino
dado que es el que mejor se acomoda al protocolo de regeneración empleado a continuación.
En el método presentado en este trabajo el eje embrionario fue diseccionado de la semilla
en condiciones de esterilidad para después ser transformado a través de la sonicación e
incubación con una solución de Agrobacterium, empleando un método similar al descrito por
Chileh et al. (2010). Este método transformó los embriones de una forma efectiva y
reproducible tal y como puede aprecia en la figura 53. Un método alternativo para la
transformación de embriones sería la agroinfiltración in vivo de la semilla en desarrollo, no
obstante, esta técnica presenta el inconveniente de que no siempre provoca la transformación
del eje embrionario. Por otra parte, la disección en serie de un número elevado de embriones,
obtenido por germinación de las semillas y su transformación conjunta resulta más sencilla y
fácil de controlar que la infiltración de un número elevado de semillas en desarrollo, por lo que
finalmente se descartó esta posibilidad.
Existen métodos de transformación de ricino que usan la biolística para transformar el eje
embrionario o el meristemo apical (Sailaja et al., 2008; Cabral et al., 2017). No obstante, por su
simplicidad y por los medios disponibles se decidió optar por la transformación del eje
embrionario mediante Agrobacterium.

1.2. Selección de transformantes mediante la selección con higromicina.

El plásmido usado de rutina para las transformaciones fue pCambia 1305.1 el cual posee
un gen que codifica para una fosfotransferasa que induce resistencia a higromicina, un
antibiótico de tipo aminoglicósido. La concentración de higromicina y su tiempo de aplicación
son factores que varían entre las distintas especies que se deseen transformar. En el caso del
ricino, se aplicó una concentración de higromicina de 30 mg/L atendiendo a los resultados
mostrados en la tabla 10. La higromicina fue aplicada un día después de la transformación para
que la selección de células transformadas en el embrión tuviera lugar desde el estadio más
temprano posible y así evitar en lo posible la supervivencia de células no transformadas. La
higromicina se mantuvo durante la etapa 2 y las dos primeras semanas de la etapa 3 del
protocolo de regeneración empleado, ya que se tuvieron en cuenta los resultados mostrados

159
 Discusión. Capítulo 3

en la figura 56, en los que la supervivencia de los explantos fue mayor con la aplicación de
higromicina durante dos semanas en la etapa 3.
Por otro lado, se demostró que el exceso de higromicina tanto en concentración como en
tiempo terminó provocando necrosis en los tejidos imposibilitándolos para la regeneración
(Figura 55). En otras especies como Camelina sativa, la concentración de higromicina usada es
de 40 mg/L aunque el tiempo de exposición total es de 1-2 semanas (Sitther et al., 2008). En
Arabidopsis la concentración de higromicina nunca supera los 30 mg/L ya que una
concentración superior causa la muerte en todas las plantas (Ee et al., 2014). En el caso del
ricino, por ser una planta de desarrollo más lento, se optó por una concentración moderada
durante un tiempo de exposición más largo.
Existen precedentes en el empleo de diferentes formas de selección de plantas
transgénicas de ricino. Así, Cabral et al. (2017) obtuvieron plantas de ricino transformadas
usando como marcador de selección el gen de resistencia a imizapir, un herbicida de amplio
espectro. La concentración aplicada fue de 150 nM desde el momento de la transformación
para aumentarla a 200 mM 10 días después. La concentración de herbicida fue mantenida a
200 mM hasta generar explantos, y una vez generados fue disminuida a 50 nM.
En definitiva, el uso de una sustancia de selección es necesario para la obtención repetitiva
y consistente de plantas transformantes. Esta necesidad es aún más evidente en el caso del
ricino, en el que el tiempo necesario para la obtención de transformantes es más largo, si lo
comparamos con especies oleaginosas utilizadas más frecuentemente en experimentación
como Camelina o Arabidopsis.

1.3. Presencia de cefotaxima e higromicina en el medio de cultivo.

La transformación del eje embrionario se llevó a cabo a través de Agrobacterium, esto
obligó a usar cefotaxima en el medio de cultivo para detener la proliferación de Agrobacterium
durante la regeneración in vitro, ya fuera adventicia o directa.
La cefotaxima es un antibiótico de tipo cefalosporina perteneciente a la familia de los
antibióticos β-lactámicos que actúa como bacteriostático impidiendo el crecimiento de
Agrobacterium (Borrelli et al. 1992). La concentración necesaria para la inhibición del
crecimiento de Agrobacterium en el medio fue de 300 mg/L (Tabla 9). Por otra parte, la
presencia de cefotaxima/higromicina presenta el efecto de impedir la formación de ejes
adventicios, lo que fue un inconveniente a la hora de desarrollar métodos basados en este
fenómeno (Resultados ap. 1.2.3.1.).
Otros autores ya han descrito alteraciones en el crecimiento de explantos en otras
especies debido a la presencia de cefotaxima en el medio de cultivo. En cereales como el trigo

160
 Discusión. Capítulo 3

(Mathias & Boyd, 1986), la cebada (Mathias & Mukasa, 1987) o el arroz (Grewal et al., 2006), la
presencia de cefotaxima mejoró la respuesta in vitro para la generación de ejes embrionarios,
estando su empleo muy recomendado en la biotecnología de estas especies (Borrelli et al.,
1992). Esta respuesta ha sido atribuida a la transformación de la molécula de cefotaxima en
reguladores del crecimiento de la planta, a través de la acción de enzimas esterasas endógenas
(Mathias & Boyd, 1986). En otras monocotiledóneas como la caña de azúcar, también se
describieron efectos positivos en la respuesta del explanto para la diferenciación y formación
de ejes, además de la formación de callos con diferente textura y apariencia (Mittal et al.,
2009).
No obstante, en plantas dicotiledóneas, como algunas variedades de manzano, la
presencia de cefotaxima con una concentración de entre 300 mg/L-500 mg/L produjo una
caída en la cantidad de ejes regenerados (Stanišić et al., 2018). Por lo que podríamos pensar
que la respuesta a cefotaxima puede variar, de la misma forma que cualquier regulador del
crecimiento, en función de la especie y la concentración aplicada.
Por otra parte, la presencia de higromicina en bajas concentraciones, sin duda afectó de
forma drástica a la tasa de regeneración en algunas variedades de manzano (Harwood, 2005).
Por tanto, atendiendo a los resultados encontrados en la bibliografía, se podrían atribuir los
pobres resultados obtenidos en el proceso de regeneración adventicia en ricino, a la presencia
de ambos antibióticos, cefotaxima e higromicina, en el medio de cultivo.

1.4. Comparación con otros protocolos de transformación estable en ricino.

Durante los últimos años se han descrito varios métodos de transformación de la planta de
ricino. En este proyecto se desarrolló un método basado en la transformación del embrión de
ricino mediada por Agrobacterium mediante la técnica SAAT tal y como se ha mencionado
anteriormente. El protocolo de transformación-regeneración adventicia (Figura 57) no produjo
ejes transformados dentro de este proyecto.
El protocolo de regeneración adventicia testado en este trabajo guarda cierta analogía con
el método usado por Sujatha y Sailaja (2004) de transformación mediante Agrobacterium.
Ambos métodos usan la citoquina TDZ para la elongación del eje embrionario, además de la
misma concentración de citoquina BA para la elongación y formación de ejes. No obstante,
como ya se ha comentado anteriormente, el uso de antibióticos reduce considerablemente el
éxito en la obtención de ejes, produciendo una tasa de transformación muy baja, comparable a
la publicada por Sujatha y Sailaja (2004) con tasas de éxito del 0,08%. Dichos autores usaron 3
ciclos de selección con higromicina de 15 días cada uno en concentraciones crecientes de 20,
40 y 60 mg/L para cada ciclo, unida a la aplicación de 250 mg/L de cefotaxima para evitar el

161
 Discusión. Capítulo 3

crecimiento de Agrobacterium. Tal vez, el uso de concentraciones tan altas de higromicina

durante un periodo tan grande determinó el bajo éxito de esta técnica. Por otra parte Sailaja et
al., (2008) repitieron el método aunque usando transformación biolística de meristemos
apicales de los ejes embrionarios, en este caso, la tasa de éxito de esta técnica resultó mayor,
aunque se mantuvo en un nivel también bajo (1.04 %).
En este proyecto se optó por la transformación y regeneración directa del embrión (Figura
57), lo que permite la obtención de brotes de ricino transformados de forma más rápida y
fiable. Para asegurar la selección del mayor número de células transformadas en el embrión, se
redujo el periodo de co-cultivo con Agrobacterium a 1 día, frente a los 10 días usados por
Sujatha & Sailaja, (2004), para aplicar lo antes posible el antibiótico de selección y evitar el
crecimiento de células sin transformar. Por otra parte, se eliminaron los ciclos de selección
usados por Sujatha y Sailaja, para sustituirlos por un crecimiento sobre higromicina a 30 mg/L
de forma constante durante la etapa 2 y dos semanas de la etapa 3, cuando aparecen los
brotes.
El método usado en el este proyecto usa la citoquina BA y la giberelina GA3 a una
concentración de 0.5 mg/L. La combinación de ambas hormonas, aún en presencia de
antibióticos en el medio, permitió la formación de ejes con una frecuencia del 10 % en la etapa
final de enraizamiento. Lamentablemente, el cambio a medio líquido en la última etapa y la
agitación necesaria induce la aparición de contaminación, la cual reduce drásticamente el
número de supervivientes enraizados (Tabla 11; Figura 58).
Otros métodos llevan a cabo la transformación del meristemo apical del eje embrionario,
una vez que éste se haya elongado, método llevado a cabo por Cabral et al., (2017). Al igual
que en este proyecto, Cabral et al. someten a selección los ejes transformados lo antes posible.
Para el correcto crecimiento de los ejes, optaron por emplear la adición de giberelina GA3 a 1
mg/L combinada con la auxina IAA a la misma concentración. Además, estos autores añadieron
vitaminas como la tiamina y el inositol como suplemento. No obstante, el éxito del protocolo
fue del 0.83%.
Finalmente, tras analizar los resultados obtenidos y, debido a la dificultad de la planta de
ricino a ser transformada, se concluyó que lo deseable sería el uso de antibiótico de selección
en una concentración moderada, y aplicado lo antes posible una vez realizada la
transformación, para evitar la aparición de tejido no transformado que genere brotes no
transgénicos. Además, se debe tener especial cuidado ante la contaminación en la fase final de
enraizamiento, ya que si es evitada se puede aumentar hasta un 10% el éxito del ensayo.

162
 Discusión. Capítulo 3

2. Obtención de transformantes.
2.1. Ensayo de control. transformación del ricino con pCambia 1305.1.
Los ensayos de optimización del protocolo de transformación-regeneración directa
culminaron con la obtención de plantas transgénicas de ricino (Figura 59, A, B, C y E).
transformadas con el plásmido pCambia 1305.1 original. Una prueba de PCR confirmó la
presencia de los genes GUS e HYGR en ellas (Figura 60).
Estas plantas pudieron propagarse facilmente de forma vegetativa mediante
enraizamiento de ejes laterales, los cuales son frecuentes (Figura 59C) durante el desarrollo de
la planta de ricino.
El análisis de la composición de ácidos grasos de las semillas obtenidas no presentó
cambios respecto a las semillas WT (Figura 61A). Así, se reproduce el mismo resultado que
para la transformación transitoria mediante agroinfiltración con pCambia 1305.1 (Figura 42). El
rendimiento lipídico de las semillas de la planta transformada de forma estable fue
ligeramente inferior (Figura 61B), lo que indica que posiblemente la expresión del gen
marcador bajo el control del promotor 35S drena recursos de la semilla en una extensión
suficiente para repercutir en el contenido de aceite.
Por lo demás, el análisis de la distribución de peso de las semillas producidas por esta
planta mostró un perfil algo más irregular para la planta transgénica. Aún así, no existieron
diferencias significativas con respecto al peso de las semillas transformadas respecto a las
semillas WT (Figura 63).

2.2. Supresión de la hidroxilasa mediante tecnología antisentido. Transformación con

pCambia::hpFAH12 y obtención de la primera generación.
2.2.1. Características de la planta.
Siguiendo el método de transformación-regeneración directa se seleccionó una planta
transformada con pCambia::hpFAH12 (Figura 64). Durante dos ciclos de floración, la planta
transgénica hpFAH12 no presentó flores masculinas en la inflorescencia, algo que no se
observó en la planta transformada con pCambia 1305.1 ni en la planta WT.
La ausencia de flores masculinas podría deberse a un mecanismo natural de planta para
obligar un cruzamiento con el fin de deshacerse del transgén. Es conocido el mecanismo de
dicogamia en plantas, en el que la maduración de la flores masculinas y femeninas sucede en
tiempos diferentes para evitar la autopolinización (Jersáková & Johnson, 2007), no obstante,
no hay descritos mecanismos de este tipo para evitar la proliferación de una estirpe
genéticamente alterada.

163
 Discusión. Capítulo 3

El análisis de PCR confirmó la presencia de la estructura de silenciamiento hpFAH12 en

pCambia1305.1, además de la presencia del marcador GUS en la planta transgénica (Figura
65).

2.2.2. Características de las semillas

Como estudio preliminar del impacto de la construcción en las semillas producidas por la
planta se analizó la distribución de pesos de sus semillas. Este análisis reveló dos grupos claros
dentro de la población de semillas analizadas (Figura 66A), presentando a su vez cada grupo la
misma distribución (Figura 66 B y C) los pesos de ambos grupos presentaron diferencias
significativas (Figura 67). Cada grupo estuvo compuesto por la mitad de las semillas analizadas.
Este resultado podría indicar que no todas flores fueron genotípicamente iguales ya que es
muy probable que la planta analizada sea una quimera que contuviera líneas celulares
diferentes transformadas (con uno o más transgenes) además de lineas celulares no
transformadas.
Las semillas resultantes fueron analizadas mediante PCR. Partiendo de un número de 19
semillas del grupo 1, 6 de ellas fueron positivas para GUS y hpFAH12 (Figura 68). El
endospermo de las semillas se usó para análisis en cromatografía gaseosa mientras el eje
embrionario se destinó para formar la primera generación filial. Posteriormente se analizaron
19 semillas del grupo 2, no encontrándose ninguna semilla positiva ni para GUS, ni para
hpFAH12.
El análisis de la composición de ácidos grasos mostró una reducción considerable del
contenido en ácido ricinoleico con respecto a semillas transformadas con pCambia 1305.1
(Figura 69A). Mientras las semillas transformadas con pCambia 1305.1 llegaron a tener un 90%
de ácido ricinoleico en su aceite, las semillas con hpFAH12 contuvieron una cantidad variable
de entre el 76% y el 15%. El resultado es similar al obtenido con las semillas transformadas de
forma transitoria con la misma estructura genética (Figura 42).
Además del descenso en la cantidad de ácido ricinoleico se produjo un incremento del
contenido en ácido linoleico y oleico (Figura 69A), resultado que también se reprodujo en las
semillas transformadas mediante agroinfiltración transitoria (Figura 42) y que, como ya se ha
mencionado anteriormente, difiere del fenotipo presentado por el mutante OLE1 (Venegas-
Calerón et al., 2016). Lo que confirma que la presencia de una hidroxilasa inactiva tiene
incidencia en el metabolismo lipídico del ricino.
Así, la enzima hidroxilasa podría estar ejerciendo un papel regulador en la actividad de
FAD2. La presencia de la enzima hidroxilasa, aun siendo no funcional, podría estar inhibiendo a
la enzima FAD2 e impidiendo la formación de ácido linoleico en el mutante OLE-1. A este

164
 Discusión. Capítulo 3

respecto, las desaturasas de tipo FAD2 y las hidroxilasas guardan una homología muy alta.
Considerando que ambas enzimas son homodiméricas, cabe la posibilidad de que la FAH12
mutada actúe como subunidad tóxica al asociarse con la FAD2 de ricino, disminuyendo la
actividad de la misma e induciendo el fenotipo alto oleico. En el caso del mutante antisentido,
la hidroxilasa no estaría presente, por lo que liberaría a la FAD2 para la producción de ácido
linoleico, que finalmente se acumularía en los lípidos de reserva.
Otro aspecto muy interesante que se ha observado ha sido que el rendimiento en aceite
de las semillas transgénicas para hpFAH12 es mucho menor que el rendimiento de semillas
transformadas con pCambia 1305.1 y que la planta WT (Figura 69B). En el caso del mutante
OLE1 se observó una disminución del rendimiento de aceite que pasó de un 50 % a un 35 %
(Rojas-Barros et al., 2004; Venegas-Calerón et al., 2016), pero en ningún caso presentó un
fenotipo tan extremo como las semillas transformadas con hpFAH12. Lo que parece indicar
que existe un papel de la enzima FAH12 en la correcta canalización de los ácidos grasos a TAG
de reserva en la semilla de ricino en desarrollo.
A este respecto, en las semillas transformantes existe una correlación lineal directa entre
la cantidad de ácido ricinoleico acumulado y el peso de la semilla (Figura 70A), así como una
correlación exponencial entre la cantidad del aceite y el contenido en ácido ricinoleico (Figura
70B). Estos datos sugieren que además de una preferencia en la maquinaria metabólica del
ricino por la acumulación del ácido ricinoleico en TAG, existe un papel de la hidroxilasa FAH12
en el contenido de aceite que aún no había sido descrito y que habrá que seguir estudiando.

2.2.3. Obtención de la primera generación (T1) de plantas transgénicas para hpFAH12.

Los ejes embrionarios de las semillas obtenidas a partir de la planta transgénica madre
hpFAH12 fueron diseccionados y germinados in vitro. La viabilidad para la germinación en
muchos de ellos se vió mermada debido al bajo contenido en ácido ricinoleico, hecho que
también se observa en el mutante OLE-1 (Rojas-Barros et al., 2004; Venegas-Calerón et al.,
2016).
Una vez germinadas, las plantas T1 se sometieron a una prueba de PCR para confirmar la
presencia del transgén. El resultado fue el mismo que para las semillas analizadas de la planta
madre (Figura 72). Los embriones procedentes de aquellas semillas con menor cantidad de
ácido ricinoleico presentaron retrasos en el crecimiento.
La germinación de 6 embriones positivos para hpFAH12 significó la obtención, por primera
vez, de líneas transgénicas con una construcción génica de silenciamiento en horquilla para el
gen de la hidroxilasa. Además, todas las células de estas plantas proceden de un mismo cigoto
transgénico por lo que todas sus células son transgénicas y podemos descartar la presencia de

165
 Discusión. Capítulo 3

quimeras. A partir de este punto se trabajará en estudiar como segrega la progenie de cada
una de estas plantas y a la fijación del carácter. Además, se deberá analizar, en cada caso, el
número de copias del transgén insertado.

2.3. Supresión de la hidroxilasa mediante la técnica CRISPR/Cas9.

2.3.1. Características de la planta obtenida.
A través del método de transformación-regeneración directa se seleccionó una planta cuyo
embrión fue transformado con CRISPR/Cas9 con el gen de la hidroxilasa de ricino como diana
(Figura 73).
El resultado de la secuenciación mostró la presencia de mutaciones alrededor de las dianas
de Cas9 (Figura 76). Las mutaciones fueron de diferente naturaleza y fueron detectadas tanto
alrededor de la región de corte RuvC situada 3 nucleótidos aguas arriba del sitio PAM así como
entre las dianas de para Cas9. La presencia de varias mutaciones entre ambas dianas sugiere
que podría tratarse de una inserción asociada al mecanismo de reparación NHEJ (Introducción
ap. 4.4.3.2.)
Los cortes generados por Cas9 pueden generar deleciones e inserciones de diverso tamaño
que no tienen por qué coincidir con el sitio exacto de corte RuvC además de transversiones y
transiciones (Li et al., 2013;Brooks et al., 2014). Además de las secuencias mutadas, se
encontraron secuencias intactas de la hidroxilasa en la planta obtenida, esto podría deberse a
una heterocigosis entre el gen mutado e intacto o a la presencia de células no transformadas,
en cuyo caso hablaríamos de una quimera.

2.3.2. Características de la semilla.

La planta fue autofecundada y las semillas recuperadas, realizándose un estudio de la
distribución de pesos similar al llevado a cabo con la construccíon hpFAH12. El peso de las
semillas segregó en dos grupos bien diferenciados (Figura 77A) que a su vez presentaron la
misma distribución (Figura 77B y C). Este resultado coincide plenamente con el obtenido con la
autofecundación del transgénico hpFAH12 (Figura 66). Cada grupo posee una media de pesos
diferente que no se diferenció con la media de cada grupo de la planta transformada con
hpFAH12 (Figura 78).
Cada grupo contenía aproximadamente la mitad de las semillas recolectadas, al igual que
con hpFAH12. Este resultado, al igual que con las semillas transgénicas para hpFAH12, sugiere
una variabilidad genética entre las semillas obtenidas de la planta madre, indicando que esta
puede tener naturaleza quimérica.

166
 Discusión. Capítulo 3

El análisis de composición de ácidos grasos de las semillas del grupo 1 mostró una
disminución en la cantidad de ricinoleico acompañada de un aumento en la cantidad de ácido
linoleico (Figura 69A), y el análisis de las semillas del grupo 2 no vieron afectadas la
composición de su aceite, un fenotipo similar a la planta pCambia::hpFAH12. Estos resultados
indicarían que las mutaciones generadas por CRISPR/Cas9 terminan suprimiendo la expresión
de FAH12 sin afectar, en principio, a la actividad FAD2.
Finalmente, en las plantas con FAH12 mutada, se observó un menor contenido lipídico en
la semilla, de manera totalmente similar al de las semillas obtenidas de la planta hpFAH12.
Este menor contenido vuelve a confirmar la hipótesis formulada para las plantas
transformadas con hpFAH12, en la que la hidroxilasa podría estar desempeñando un papel en
la canalización y el almacenamiento de ácidos grasos en forma de TAG de reserva.

2.4. Planta modificada vía CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina y homólogos como
diana.
Otro de los objetivos para este proyecto fue el de la generación de una planta de ricino
cuyas semillas presentaran menor toxicidad. Para ello fue necesario la generación de
mutaciones en el gen de la ricina. Cuando se diseñaron las dianas CRISPR/Cas9 contra este gen,
se aceptó la presencia de off-targets o dianas colaterales en las que la enzima Cas9 podría
generar mutaciones, para intentar eliminar no sólo la toxicidad de la ricina si no también la
provocada por otras aglutininas.
Mediante el método de transformación-regeneración directa se obtuvieron plantas cuyo
embrión fue tratado con CRISPR/Cas9. Hasta la fecha se han obtenido dos plantas adultas
(Figura 80).
La planta 2 mostró una deleción de 144pb que abarcó ambas dianas de Cas9 para el gen de
la ricina (Figura 83) y que no estaba presente ni en la planta 1, ni la planta WT. Además, la
planta 2 no solo presentó copias de ricina con la deleción mencionada, sino que también
presentó copias intactas del gen de la ricina. Este resultado era esperable, ya que las plantas
mutadas vía CRISPR/Cas9 pueden presentar deleciónes grandes como la obtenida en dicha
planta (Brooks et al., 2014; Nekrasov et al., 2017).
Cabral et al., (2017) ya realizaron una aproximación a una planta de ricino no toxica a
través del silenciamiento del gen de la ricina mediante el uso de una estructura de horquilla
específica. Cabral et al. lograron producir semillas libres de ricina, cuya harina no resultó tóxica
para ratones. La eliminación de la ricina es un paso muy importante para convertir el ricino en
un cultivo de uso generalizado. A este respecto se debe asegurar la estabilidad de las nuevas
líneas libres de ricina, para evitar en la medida de lo posible, la reversión del carácter. Por lo

167
 Discusión. Capítulo 3

tanto, es de gran interés la supresión de de esta proteína mediante técnicas que aseguren una
mayor estabilidad que la que proporciona la tecnología antisentido. Las técnicas de edición del
genoma aseguran la estabilidad del carácter, por lo que la producción de mutantes a través de
la técnica de CRISPR/cas9 podría ser definitiva en este campo. En este punto se está esperando
a que las plantas transgénicas aisladas produzcan semillas. El contenido de proteías tóxicas de
las mismas y la distribución heredabilidad del carácter serán estudiados con el objeto de
producir mutantes con el carácter fijado que puedan ser la base para la producción de líneas
de ricino libres de proteínas tóxicas de alta estabilidad genética.

168
 Discusión. Capítulo 4

Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a

glicerolípidos en microsomas de ricino.

El estudio de la síntesis de TAG en ricino ha sido objeto de muchos trabajos previos debido
a que el ricino es una de las pocas especies capaces de almacenar en su aceite un ácido graso
inusual, el ácido ricinoleico, de manera muy específica (más del 80% del total de ácidos grasos;
Gunstone, et al. 1994). Así, el ricino en desarrollo posee una alta actividad hidoxilasa en su
retículo endoplásmico (Van der Loo et al., 1995), pero esta actividad no sería suficiente para
dar cuenta de esas elevadas acumulaciones de ricinoleico si no contara con mecanismos
especiales de canalización que les permita acumularlo de manera específica en TAG. Esto ya
fue puesto de manifiesto por Bafor et al., (1991), quienes describieron un mecanismo que
excluía los ácidos grasos hidroxilados de los lípidos polares (PC) con la probable participación
de una fosfolipasa específica, la cual ha sido clonada y caracterizada recientemente (Bayon et
al., 2015). Así mismo, cuando se expresa la FAH12 en otras plantas que carecen del mecanismo
de canalización del ricino, la acumulación de ricinoleico en semillas suele ser baja (Van der Loo
et al., 1995; Broun y Somerville, 1997) y se incrementa a medida que se añaden genes de
ricino que participan en esa canalización como son aciltransferasas (Chen et al. 2016; Burgal et
al., 2008), oleosinas (Lu et al., 2006) o enzimas del tipo PDCT que facilitan el intercambio entre
los conjuntos de PC y DAG (Hu et al., 2012). Otros estudios han investigado si estos
mecanismos de canalización funcionan para otros ácidos grasos oxigenados. Algunos
resultados positivos se han comunicado para el ácido vernólico (Dahqvist et al., 200), aunque
hasta la fecha no se han publicado resultados en este sentido para ácidos grasos hidroxilados
diferentes al ricinoleico. En la presente tesis se estudió la capacidad de asimilación de
lesquerólico y coriólico por parte de microsomas de ricino, estableciéndose una comparación
con los sustratos endógenos ácido oleico y ricinoleico.
En estos estudios se incubó una cantidad conocida de ácido graso libre con membranas
preparadas a partir de semillas de ricino en desarrollo, en presencia de los cofactores
adecuados: CoA libre, G3P, MgCl2 y ATP. En estas condiciones los ácidos grasos son
rápidamente activados a sus correspondientes acil-CoAs, que aparecen como incorporación en
la fase acuosa de la extracción. Estos acil-CoAs pueden ser empleados por las aciltransferasas
de la ruta de Kennedy para acilar el G3P o intercambiarse con los acilos del conjunto de PC por
acción de las LPCAT. A partir de estos intermediarios se incorporarían a diferentes especies de
lípidos neutros o polares, prestándose especial atención a la incorporación en TAG.

169
 Discusión. Capítulo 4

1. Incorporación de ácido oleico.

Atendiendo a los resultados obtenidos en los experimentos de metabolismo con ácido
oleico (Figura 84) se observó una rápida y elevada incorporación en la fracción de acil-CoAs, lo
que indica que las acil-CoA sintetasas (LACS) presentes en los microsomas son capaces de
activar con rapidez el ácido oleico. De todos los precursores empleados, el ácido oleico es el
que produjo una mayor incorporación en acil-CoA que se acumuló en cantidades muy
superiores a las observadas para los glicerolípidos. A partir de las 2 horas de incubación el
contenido de oleil-CoA tiende a bajar, bien por su incorporación a glicerolípidos o por la acción
de acil-CoA hidrolasas que liberarían ácido oleico libre. Cuando se empleó ácido oleico como
precursor, se observó a tiempos cortos una incorporación muy alta en PA, que alcanzó un
máximo a 2 h de incubación y posteriormente empezó a decaer. Se registró también
incorporación en PC, pero en menor proporción. Atendiendo a los lípidos neutros se observó
un aumento progresivo de DAG y TAG hasta las 3 h de experimento. Estos resultados son
compatibles con la incorporación del oleato a través de la ruta de Kennedy, que implica la
acilación progresiva del G3P, dando lugar a ácido lisofosfatídico, ácido fosfatídico, DAG y
finalmente TAG. Es remarcable que no se observó incorporación en TAG o DAG hidroxilados
que podrían provenir de la incorporación al esqueleto de glicerol de ácido ricinoleico no
marcado sintetizado por los microsomas o a la hidroxilación del precursor, más cuando la
cantidad de TAG no hidroxilados en el aceite de ricino es casi indetectable. La incorporación a
la ruta de síntesis de glicerolípidos a través de la edición de PC (Bates et al., 2007) parece que
es menos importante atendiendo al bajo marcaje registrado en dicho fosfolípido.

2. Incorporación de ácido grasos hidroxilados.

2.1. Incorporación de ácido ricinoleico.
La incorporación de precursor en glicerolípidos fue muy diferente cuando se empleó ácido
ricinoleico (Figura 85). En este caso, la acumulación de acil-CoA fue sensiblemente menor y
presentó un declive mucho más rápido, debido probablemente a que el ricinoleil-CoA con el
que se carga el conjunto de los acil-CoA es rápidamente incorporado a glicerolípidos. Es muy
destacable que cuando se emplean precursores hidroxilados no se observó incorporación en
lípidos polares, probablemente porque éstos están excluidos de los lípidos de membrana por
mecanismos específicos y canalizados de manera muy rápida a lípidos neutros. Así, se aprecia
una rápida incorporación en DAG hidroxilados, con mayor incorporación en los del tipo DAG-
2H.
Otra diferencia con respecto al oleato es la rapidísima incorporación del precursor en la
fracción de TAG, que fue significativa a tiempos cortos de incubación. Llama especialmente la

170
 Discusión. Capítulo 4

atención la especie mayoritaria de TAG acumulada, que fueron los del tipo TAG-1H. Esto puede
explicarse por la posible síntesis de TAG por acción conjunta de PDCT/DAGAT que posibilitaría
la producción rápida de TAG monohidroxilados a partir de DAG no hidroxilados provenientes
del conjunto de la PC y de los acil-CoAs formados a partir del ácido graso marcado, en este
caso ricinoleico. En este mecanismo también podría intervenir una fosfolipasa de tipo C,
aunque esta enzima no ha sido descrita hasta ahora en microsomas de ricino. La formación de
TAG es rápida, llega a su máximo al cabo de 1 h de incubación, se mantiene en el caso de TAG-
H y declinan al final del experimento. Este último resultado, indica la posible presencia de
hidrolasas o lipasas en los microsomas que degradan los glicerolípidos a tiempos muy largos.
Este fenómeno, sería evitado en la síntesis in vivo al acumularse los TAG en orgánulos
específicos (oleosomas), que los protegen de la degradación. La presencia de estas lipasas en
semillas ya ha sido reportada en el endospermo de ricino en desarrollo (Lu y Wallis, 2007). La
acumulación de TAG fue mucho más rápida que en el experimento llevado a cabo con oleato,
en el cual se tendían a acumular precursores como DAG o PA, lo que refuerza la existencia de
una canalización específica para los ácidos grasos hidroxilados.

2.2. Incorporación de ácido lesquerólico.

La hipótesis presentada en el apartado anterior se ve reforzada atendiendo a los
resultados obtenidos con ácido lesquerólico (Figura 86) que presentaron una forma muy
parecida a los registrados para el ácido ricinoleico. Así, el perfil de acil-CoAs presenta la misma
forma, aunque mostrando menor incorporación en valor absoluto. No se observó
incorporación en lípidos polares y sí, una rápida incorporación en DAG y TAG hidroxilados. Las
diferencias más remarcables con respecto al sustrato fisiológico estriban en mayores
incorporaciones relativas de en TAG-2H y en TAG-3H, lo cual podría ser debido a las diferentes
especificidades de sustrato de las aciltransferasas de la planta. Así, los resultados parecen
señalar que la DAGAT que tan eficientemente producía TAG-H a partir de DAG no hidroxilados
en el experimento anterior, no funcionó tan eficientemente con el lesqueroil-CoA. En cualquier
caso, el ácido lesquerólico se incorporó de manera eficiente a los TAG (Figura 88), dando lugar
a una elevada proporción de TAG hidroxilados.

2.3. Incorporación de ácido coriólico.

Finalmente, el procedimiento del estudio del metabolismo se empleó para estudiar la
capacidad del ricino en la acumulación del ácido coriólico, ácido hidroxilado diinsaturado que
se acumula mayoritariamente en las semillas de Coriaria myrtifolia. Los resultados en la figura
87 se muestran los resultados obtenidos. El ácido coriólico pudo ser activado a su éster de CoA

171
 Discusión. Capítulo 4

a niveles similares al ricinoleico, aunque su curva mostró diferente forma, más similar a una
cinética de saturación, sin disminución a lo largo del experimento lo que indica que
posiblemente este acilo no se incorpora a glicerolípidos con la misma facilidad que los
anteriores precursores. Esto viene confirmado por los perfiles de incorporación del precursor
que aparecen en la misma figura. Cabe destacar, que al igual que con los anteriores ácidos
hidroxilados no se registró incorporación en lípidos polares, observándose incorporación
rápida en DAG y TAG, por lo que, en forma, su incorporación fue muy similar. Sin embargo, los
niveles de incorporación observados fueron un orden de magnitud menores (Figura 88). Este
resultado indica que la maquinaria enzimática del ricino, aunque identifica al coriólico como
ácido hidroxilado, no es capaz de acumularlo en altas proporciones.

2.4. Incorporación en TAG de los diferentes precursores

Para establecer un mejor criterio de comparación que nos permita medir la capacidad del
ricino para acumular estos ácidos grasos se muestran en la Figura 88 las curvas de
incorporación de los distintos precursores en TAG en función del tiempo. Esta figura es
coherente con la composición de la semilla de ricino, donde el ácido ricinoleico se acumula en
una proporción mucho mayor que el ácido oleico y su derivado, el ácido linoleico. Los
resultados además nos indican que el ricino es capaz de canalizar el ácido lesquerólico a lípidos
de reserva de una manera muy eficiente, mientras que el ácido coriólico se acumuló a
velocidades muy inferiores. Las velocidades iniciales de incorporación de precursor, calculadas
a partir de los datos que conforman la Figura 88 nos indican que el ricino es capaz de
metabolizar el lesquerólico a una velocidad que fue aproximadamente la mitad de la mostrada
para el ricinoleico, mientras que las velocidades halladas para oleico y coriólico fueron del
orden de 20 veces inferiores a las mostradas para dicho ácido grasos. Este resultado indicaría
que la especificidad de la acumulación de ácidos grasos hidroxilados por parte del ricino
depende fuertemente de la estructura del ácido hidroxilado en cuestión y que estructuras más
alejadas de la del ácido ricinoleico no son metabolizadas ni canalizadas eficientemente,
aunque sean identificadas como ácidos grasos hidroxilados. Este resultado hace pensar que
posiblemente, aunque se transfiera al ricino la maquinaria enzimática de la síntesis de ácidos
grasos como el coriólico, no sería esperable la acumulación eficiente y en altas proporciones
del mismo. No ocurre así con el ácido lesquerólico, del cual cabría esperar altos niveles de
acumulación. Este último extremo se encuentra con la dificultad ya mencionada del bajo
contenido del sustrato ricinoleil-CoA en el conjunto de dichos intermediarios presentes en
semilla de ricino (Figura 50).

172
 VI. CONCLUSIONES

173
 Conclusiones

Capítulo 1: Desarrollo de un método de transformación transitoria en ricino.

1. Se ha desarrollado un método novedoso de transformación transitoria en semillas de
ricino in vivo que puede transformar de forma eficiente tanto el endospermo como
otras partes de la semilla de ricino.

2. El estudio del número de abortos en función del momento de infiltración reveló que a
semilla de ricino puede infiltrarse a lo largo de su desarrollo, aunque el riesgo de
aborto de la misma es alto, antes de 40 días después de la polinización. La tasa de
éxito de transformación de las semillas supervivientes fue suficientemente alta, entre
el 55 y el 70%.

3. La expresión de los promotores 35S y pGly, así como actividad GUS demostraron que
el método de agroinfiltración in vivo es válido para probar construcciones genéticas en
el endospermo de ricino, sin necesidad de llevar a cabo una transformación estable y
esperar a la formación de una planta adulta.

4. Los resultados de qPCR para la expresión de los promotores 35S y pGly indicaron que
la fuerte expresión del promotor 35S puede dar lugar al silenciamiento
postranscripcional o postraduccional del mismo en el endospermo de ricino. El
promotor pGly, al no presentar una expresión tan fuerte como 35S, no sufre
silenciamiento. Los datos de actividad de enzima GUS (β-glucuronidasa) mostraron que
se produce un pico de actividad a 10 días bajo la regulación del promotor pGly que no
se produce con el promotor 35S debido al silenciamiento del mismo.

Capítulo 2: Modificación de la composición de ácidos grasos de la semilla de ricino vía

expresión transitoria in vivo.
1. La transformación transitoria de semillas con pCambia::hpFAH12,
pCambia::CRISPR/Cas9 FAH12 y pCambia::SlEPX::hpFAH12 condujo a una disminución
significativa del contenido en ácido ricinoleico con respecto a semillas transformadas
solo con pCambia1305.1 y semillas sin transformar. La disminución de ácido ricinoleico
fue observable hasta 20 días después de la agroinfiltración. La reducción de ácido
ricinoleico fue mayor en las semillas transformadas con CRISPR/Cas9 con el gen de la
hidroxilasa como diana. Esta reducción vino acompañada de un aumento leve de ácido
oleico y algo mayor en ácido linoleico.

175
 Conclusiones

2. Las semillas transformadas transitoriamente con el gen de la elongasa LfKCS3 de

Lesquerella fendleri en pCambia1305.1, pCambia::LfKCS3, mostraron un aumento de
hasta 8 veces mayor en el contenido de ácido lesquerólico. Este aumento se perdió en
20 días después de la infiltración. A pesar de que el aumento respecto a las semillas
transformadas con pCambia 1305.1 fue mayor, el contenido total no superó el 0.5%
del total de aceite.

3. Aunque la semilla de ricino es capaz de incorporar ácido vernólico en TAG, la

transformación transitoria con el gen de la epoxigenasa de Stokesia laevis,
pCambia::SlEPX, no tuvo como resultado la presencia de ácido grasos epoxidados.
Tampoco funcionó la epoxigenasa de Vernonia galamensis.

Capítulo 3: Desarrollo de un protocolo de regeneración in vitro y transformación estable.

Generación de plantas transgénicas.
1. La técnica de transformación mediante Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT)
es válida para la transformación de embriones de ricino.

2. Un periodo de imbibición de al menos 1 día es necesario para inducir la germinación

en el embrión de ricino. La tasa de germinación es aún mayor si el periodo de
imbibición tiene lugar a 26 °C.

3. El antibiótico higromicina como agente de selección debe añadirse al medio de cultivo

lo antes posible tras el momento de la transformación. Se concluyó que la aplicación
de higromicina adecuada fue de 30 mg/L durante la etapa 2 y durante 2 semanas de la
etapa 3. Una mayor concentración y/o una mayor permanencia conduce a la necrosis
de los ejes embrionarios imposibilitando su regeneración.

4. El uso de cefotaxima a una concentración mínima de 300 mg/L es imprescindible si se

ha usado Agrobacterium para la transformación del eje embrionario. La cefotaxima
puede actuar como análogo de la regulación del crecimiento en plantas interfiriendo
en el proceso de regeneración.

5. La composición de aceite de las semillas transgénicas para pCambia 1305.1 no

presentó diferencias con las de semillas WT debido a la ausencia de genes en
pCambia1305.1 que modifiquen la composición de ácidos grasos en la semilla

176
 Conclusiones

6. El análisis de las semillas obtenidas por autofecundación de la planta transgénica para

pCambia::hpFAH12 mostró dos grupos bien diferenciados que contuvieron el 50% de
las semillas muestreadas. La distribución de sus pesos se atribuyó al cruce entre flores
genotípicamente diferentes asumiendo el carácter quimérico de la planta.

7. El análisis de la composición de ácidos grasos en las semillas positivas para hpFAH12

mostró una menor cantidad de ácido ricinoleico acompañado de un leve aumento de
ácido linoleico que no se observó en el mutante OLE-1. La enzima FAD2, responsable
de la síntesis de ácido linoleico, podría estar siendo inhibida por la FAH12 mutada en
OLE-1. Esta inhibición no ocurre en el transgénico hpFAH12 dado que el silenciamiento
impide la traducción del transcrito FAH12.

8. La baja riqueza grasa de las semillas hpFAH12 positivas, la correlación observada entre
contenido de aceite y porcentaje de ricinoleico indicaron un papel de la FAH12 en el
metabolismo de síntesis de ricino aún no descrito, además de la preferencia de la
maquinaria metabólica del ricino para la acumulación de ácido ricinoleico. Por otra
parte, se ha llegado a obtener una primera generación de plantas de ricino (T1) con la
estructura hpFAH12 en su genoma.

9. Las semillas obtenidas de la planta modificada vía CRISPR/Cas9 pudieron diferenciarse

en dos grupos, al igual que las semillas procedentes del transgénico hpFAH12. Las
semillas muestreadas se repartieron por igual entre los dos grupos, obedeciendo a un
reparto mendeliano fruto del cruce entre flores con carga genética distinta lo que
indicó el carácter quimérico de la planta.

10. El contenido en ácido ricinoleico fue del 40% aproximadamente, confirmando el efecto
fenotípico de las mutaciones. La disminución de ácido ricinoleico vino acompañada de
un aumento de ácido linoleico de manera similar al transformante hpFAH12. Las
semillas con bajo contenido en ácido ricinoleico mutantes para FAH12 también
presentaron una cantidad de aceite extremadamente baja de aceite en su semilla, al
igual que las semillas transformadas con pCambia::hpFAH12.

177
 Conclusiones

11. Se obtuvo, por primera vez, una planta de ricino modificada con la técnica
CRISPR/Cas9 con el gen de la ricina mutado. La planta también contuvo secuencias no
mutadas del mismo gen por lo que podría ser heterocigota o quimérica.

Capítulo 4: Estudios de incorporación de distintos ácidos grasos a glicerolípidos en

microsomas de ricino
1. El ricino posee mecanismos que canalizan los ácidos grasos hidroxilados hasta lípidos
de reserva. Este mecanismo no funciona de la misma manera con todos los ácidos
grasos, así los ácidos grasos ricinoleico y lesquerólico son canalizados a triacilglicéridos
con alta eficiencia, mientras que el ácido coriólico fue metabolizado a bajas
velocidades.

178
BIOTECHNOLOGY APPLIED TO CASTOR BEAN PLANT
(Ricinus communis) TO BE USED AS A BIOFACTORY.

DOCTORAL THESIS
VII. ENGLISH VERSION

179
 English version

Brief Introduction.
Castor plant (Ricinus communis L.) is an industrially important crop producing a very
unique oil, enriched over 85% in ricinoleic acid (12-hydroxyoleate). This composition confers
technological properties to castor oil, making it adequate for diverse industrial uses. Moreover,
castor oil commonly comprises up to 50-60% of the seed weight, being one of the highest
yielding oil-seed crops. A previous EU project, AIR-32324, with participation of research groups
from Germany, France, Italy, Spain and Greece, showed than cultivation and mechanical
harvesting of castor bean is possible in Europe, with productivities up to 3000 kg/ha.
Nevertheless, it is needed to reduce to negligible the content of toxic ricin and allergens. This
PhD project aims to demonstrate than castor bean seed is an excellent platform for chemical
synthesis, able to produce other special fatty acids, such as epoxy fatty acids or long hidroxy
fatty acids, acting as a plant biofactory. For this purpose, we have developed reliable and
efficient methods to transform (stably and transiently) castor seeds. These methods have
allowed us to transform castor seeds to produce lesquerolic acid, to silence its hydroxylase
gene (FAH12) and to produce some lines that could have negligible amounts of ricin and
relative toxins.

Chapter 1 summary: Development of a transient transformation

method in castor bean.

1. Transformation of developing castor endosperm.

Castor bean plant doesn´t have a short life cycle. The time needed to obtain a transgenic
castor plant made desirable to have available a transient transformation method to test
different genetic constructs prior permanent transformation. The first method that we tried
was the one described by Chileh et al., (2010). That method consists in the transformation of
the castor bean endosperm in vitro. Transformation is carried out by Agrobacterium in the
dissected seed endosperm subjected to a sonication treatment, this technique is called SAAT
treatment.
SAAT method requires high skilled staff, it is time consuming and it is difficult to achieve
because it requires seed dissection in sterile conditions and the risk of contamination is very
high. First approaches of using this technique showed a low rate of transformation.
Additionally, it did not allow us to study the effect of the constructs in the long term, due to
the fact that the endosperm tissue did not last more than one week in the in vitro conditions it
was cultivated (figure 1).
181
 English version

At that point we decided to try infiltration of the castor fruits , ass it had already been
described in other plants such as tobacco (Potrykus, 1991), melon (Han et al., 2015),
strawberry (Carvalho et al., 2016) or tomato (Orzaez et al., 2006) . Thus, a volume of 300µL of
an Agrobacterium solution with D.O.600 0.2 was injected through the fruit and the seed coat,
directly into the castor endosperm. Preliminary results showed transformation, not only in the
endosperm of the seed, but also in the caruncle and other tissues of the fruit (Figure 2).

2. Optimization of the agroinfiltration timing.

The developing seeds time of infiltration is a critical point in the method of transient
transformation in vivo. Seeds were very susceptible when infiltrated in the period from 20 to
30 days after pollination (DAP), because Agrobacterium inoculation caused a very large
number of seed abortions Abortions were almost 50% after 5 days after injection (DAI) and
rose to 100% at the end of the period of study, which was 20 DAI. Abortions were slightly
lower when 30-40 DAP seeds were injected.
At more advanced developmental stages, the rate of abortions decreased importantly,
specially at 5 days after infiltration (DAI) when abortions reached a value close to zero in
mature seeds. At longer times after inoculation, the percentage of aborted fruits were around
50-60% in 40-50 DAP infiltrated seeds and 30 to 50% at 50-60 DAP seeds (Figure 3). Since the
objective of our studies is investigating the influence of different genes on castor oil
biosynthesis, we need to express them during a long enough period to affect the oil
composition and to provide a suitable amount of viable fruits.
As a result, the time chosen for fruit injection was 40 DAP, when the oil synthesis is
starting, the endosperm is well defined and the number of fruits aborted after the injection
were around 50% after 20 DAI.

3. Studies of transformation rate.

Different constructs were used for castor fruit agroinfiltrations. In all cases the the AGL1
strain of Agrobacterium and the bone of the plasmid pCambia 1305.1 with the GUS gene
marker was used. Different modifications were made in the pCambia vector to assess the
marker and the transformation pattern. Thus, the first set of transformation was made with
the GUS marker under the regulation of the 35S promoter (Figure 4 A, B and C), GUS vector
under the regulation of the glycinin promoter (Figure 4 D, E and F) and no promoter (Figure 4
G, H and I). The seeds were infiltrated at 40 DAP and collected in three different groups at 5,
10 and 20 DAI.

182
 English version

Seeds transformed with pCambia1305.1::35S::GUS and pCambia1305.1::pGLY::GUS

displayed strong expression of GUS up to 20 DAI. Of all the infiltrated seeds, 70%, 65% and
60% of the non-aborted seeds were found to be transformed at 5, 10 and 20 DAI respectively
(Figure 5). In addition, in many cases the embryonic axis was also transformed in the seed.
Importantly, this fact could open the doors for a new method of stable transformation.
Seeds transformed with pCambia1305.1::GUS, a construct where GUS is not under any
promoter) showed a slightly blue tone indicating residual activity of the GUS marker (Figure 4
G, H, I). Finally, seeds not infiltrated but analysed trough histochemical GUS assay (Figure 4 J, K
and L) showed a very light bluish dying that indicates that the castor endosperm could have
some unspecific glucuronidase activity derived from endogenous enzymes as it occurs in other
plants seeds (Hu et al., 1990).

4. Testing promoters via qPCR and fluorimetric GUS assay.

The method of transient castor fruit agroinfiltration can be used to test the expression
pattern provided by different promoters in developing endosperm. The analysed promoters in
this work were the cauliflower mosaic virus, 35S promoter (Carvalho et al., 2016), and the soy
glycinin promoter (Iida et al., 1994). The expression of the GUS marker under the 35S
promoter was extremely high at 5 days after transformation. This level of expression fell down
quickly at 10 and 20 days after the transformation (Figure 6 B). On the other hand, the
measured activity of the GUS enzyme was low and increased slightly from 5 to 20 DAI. In
contrast, the glycinin promoter showed a lower level of gene expression, about 3-fold lower
than those found with 35S one. However, endosperm extracts transformed with GUS under
the regulation of glycinin promoter displays higher GUS activities and peaking at 10 DAI (Figure
6 A).
The rapid decrease in GUS expression under the 35S promoter and the lower activity
displayed could be due to mechanisms of gene silencing as already has been shown before in
other transgenic plants (Holtorf et al., 1995; Schubert, 2004). In fact, posttranscriptional gene
silencing is a fairly common fact when using the 35S promoter (Vaucheret et al., 1995).

183
 English version

Chapter 2 summary: Changes in castor bean fatty acid composition

vía transient expression in vivo.

1. Ricinoleic acid decrease through FAH12 hydroxylase silencing.

Within the objectives of this work was to study the role of the hydroxylation in castor oil
synthesis and to explore the possibility of silence castor hydroxylase (FAH12) for the
productions of fatty acids different to ricinoleic. A hairpin structure called hpFAH12 was
designed to produce gene silencing at posttranscriptional level using AGO and DICER proteins.
To investigate the efficiency of the designed hairpin seeds were infiltrated at 40 DAP with the
pCambia1305.1::hpFAH12 construct. Expression of hpFAH12 was regulated by the glycinin
promoter. Seeds were collected 5, 10 and 20 DAI (Figure 7, 8). Fatty acid composition of the
collected seeds showed a significant decrease of approximately 50% in the ricinoleic content at
the end of seed development, in 20 DAI (Figure 9). The decrease of ricinoleic acid took place at
expenses of increases of oleic and linoleic acid.

2. Ricinoleic acid decrease through CRISPR/Cas9 technology.

An alternative way of knocking out the FAH12 hydroxylase is though the newer technique
of CRISPR/Cas9. Thus, the FAH12 hydroxylase was targeted using this editing mechanism. The
final goal was the generation of changes in the castor hydroxylase gene in as many cells as
possible and inactivate the enzyme activity by inducing mutations or deletions. CRISPR/Cas9
structure was built by loop assembly with genes constructs and vectors kindly provided by Dr.
Nekrasov (Rothamsted research)
Seeds infiltrated with the CRISPR/Cas9 (Figure 10) construct were examined to look for the
editing action of this system. The DNA extracted from seeds was digested with Fnu4HI and
BsrDI, then the product of the digestion was used as a template for a PCR reaction (Figure 11,
12). PCR generates a product when CAS9 induces or deletions in Fnu4HI and BsrDI sites.
Furthermore, the bands obtained were sequenced. The PCR reactions confirmed that the
CRIPR/Cas9 mechanism was working. In this regard, sequencing showed a high variety of Cas9
induced mutations, as expected. (Figure 40).
The effect of the CRISPR construct on the fatty acid composition was also studied. Thus, a
reduction in ricinoleic acid content could be observed at 10 and 20 DAI. The ricinoleic acid
content of these seeds was about 40%. causing decreases in ricinoleic even higher than those
induced by hpFHA12 (Figure 13) also at expenses of increases of oleic and linoleic acids.

184
 English version

3. Transient transformation with the condensing enzyme elongase from Lesquerela

fedleri.
One of the goals of this project is the production of fatty acids of industrial interest in
castor different to ricinoleic acid. In this regard, the species Lesquerela fendlery contains high
levels of lesquerolic acid ((11Z, 14R)-14-hydroxyicos-11-enoic acid, 20:1-OH) an analogous of
ricinoleic acid, produced by elongation through the action of a specific elongase (LfKCS3)
(Moon, 2001). Thus, developing castor seeds were infiltratedat 40 DAP with a construct
expressing this gene (LfKCS3) under the control of the glycinin promoter. The LfKCS3 was
codon-optimized for a higher expression in castor by GenScript®. The castor transformed
endosperm was dissected at 5, 10 and 20 DAI (Figure 14), and the fatty acid composition and
the levels of the LfKCS3 transcripts were examined. The cDNA from the transiently
transformed endosperms were analyzed by PCR, and the presence of both LfKCS3 and the GUS
marker transcripts were confirmed (Figure 15). When we looked at the fatty acids composition
of these endosperms, we found that this transgene was able to significantly increase the
concentration of very long chain fatty acids at 5 and 10 DAI (Figure 16). Castor has small
amounts of lesquerolic acid in its oil, which indicates that there is a certain level of
endogenous elongase activity in their endosperm cells. At 5 DAI there was important changes
in lesquerolic acid concentration, which was 8-fold higher in the transient transformed seeds.
The increase of lesquerolic was also significant at 10 DAI, where it was 3-fold higher than in
control endosperms (transformed with the plasmid pCambia 1305.1). These differences were
not observed after 20 DAI, in which the proportion of lesquerolic was the same in transformed
and control endosperms. This fact could be due to a decrease in the expression of the LfKCS3
gene following the pattern showed in Figure 6 for genes regulated by glycinin. Nevertheless,
although the increase of lesquerolic acid was significant at 5 and 10 DAI, the total proportion
of this fatty acid did not exceed the 0.5% of the total fatty acids in any of the analysed seeds.
These results could be the consequence of an efficient removal of ricinoleoyl-CoA from the
acyl-CoA cytosolic pool by reticular castor acyltransferases, depleting the cytosol of the
physiological substrate of LfKCS3, ricinoleoyl-CoA. This hypothesis was investigated by
analysing the composition of the acyl-CoA pool of developing castor endosperm. Data in Figure
17 shows that among the acyl-CoA species present in the cytosolic pool from castor
endosperm cells, ricinoleoyl-CoA is underrepresented when compared with those from other
acyl species, like palmitoyl-, oleoyl- and linoleoyl-CoAs. These results point out that the low
production of lesquerolic acid by LfKCS3 could be related to a low substrate availability.

185
 English version

4. Transient transformation with Stokesia laevis epoxigenase

Other of the oxygenated fatty acids that could be produced in castor is vernolic acid.
Dahlqvist et al. (2000), through incubations of vernoloil-CoA in castor microsomes,
demonstrated that this plant was able to accumulate this fatty acid in its TAGs. Thus, the
enzyme epoxidase of Stokesia laevis (SlEPX) was expressed in developing castor endosperm in
combination with the silencing structure of the hydroxylase gene hpFAH12 under the glycinin
promoter. This genetic construct was built by loop assembly, with the genes kindly provided by
Prof. Johnathan Napier (Rothamsted research).
The vernolic acid synthesis catalysed by epoxygenase occurs using linoleic acid as a
precursor. In this regard, the silencing of the FAH12 gene could increase the availability of
linoleic acid, as demonstrated in our previous experiments, and as a consequence, the
synthesis of that epoxigenated fatty acid. Surprisingly, no vernolic acid was detected in any of
the castor endosperms infiltrated at 5, 10 or 20 DAI, although the effect of the hpFAH12 on the
ricinoleic acid content was observed (Figure 18). These results indicated that the
transformation has occurred as expected but there is any activity of the enzyme SlEPX.
Furthermore, a construct only expressing the epoxidase of Vernonia galamensis was also used
for infiltration in another series of experiments without any positive results.

186
 English version

Chapter 3 summary: Development of a transformation/regeneration

method for castor plant. Production of stable transgenic plants.

1. Development of a transformation/regeneration method for castor plant.

1.1. Castor embryo transformation and use of antibiotics.

The embryonic axis was dissected out of the seeds under sterile conditions and then
transformed through sonication and infection with Agrobacterium.
For the transformation of the embryo, the SAAT method of Chileh et al. (2010) was
followed. In the embryo transformation assay, it was observed that the embryo was
susceptible for transformation through sonication and incubation with Agrobacterium (Figure
19).
In the case of castor, a hygromycin concentration of 30mg / L was applied according to the
results shown in Table 1, in which higher concentration causes plant death. Hygromycin was
applied one day after the transformation in order to prevent the survival of non-transformed
cells. Hygromycin was maintained during stage 2 (Figure 20) and the first two weeks of stage 3
(Figure 20) according to results in figure 22.
An excess of hygromycin concentration or a long exposition to the antibiotic can cause
necrosis of the tissues making regeneration impossible (Figure 23).
Cefotaxime is a cephalosporin-type antibiotic belonging to the family of β-lactam ones that
acts as a bacteriostatic, preventing the growth of Agrobacterium (Borrelli et al., 1992).
The concentration necessary to avoid the proliferation of Agrobacterium in the used
medium during the regeneration step was 300mg / L (Table 2). The presence of cefotaxime /
hygromycin inhibited the formation of adventitious axes during the adventitious regeneration
method (Figure 24). This has been previously reported in other plants like apple tree (Stanišić
et al., 2018). So we can attribute the failure of adventitious regeneration to the presence of
both antibiotics, cefotaxime and hygromycin, in the culture media.

1.2. Transformation and regeneration of transformed embryos.

Castor seeds were decoated and sterilized in a 10% (v/v) solution of sodium hypochlorite
with a few drops of Tween-20 and then washed 3 times for 5 minutes with sterile distilled
water. Subsequently, seeds were kept in imbibition for a period of 2 days at 26 ° C in darkness.
The transformation and direct regeneration method involved the following steps:

187
 English version

I) Once the seeds were hydrated, the embryo axes were dissected in sterile
conditions with scalpel and forceps. The embryos were immersed in the
Agrobacterium suspension with D.O.600 0.2 in MS medium containing 4.4 g/L
MS, 30 g/L sucrose, 100 µM acetosyringone. Then, embryos were transformed
by applying ultrasound for 5 seconds following the SAAT technique.
II) The embryos were washed with sterile distilled water and the water excess
was removed with a sterile gauze. Embryos were deposited on plates of solid
MS containing 4.4 g/L MS, 30g/L sucrose, 100µM acetosyringone and 6g/L
agar, for 1 day at 26 ° C and in dark.
III) After the co-culture period they were transferred to tubes containing 4.4 g/L
MS, 30 g/L sucrose and 6 g/L agar,30mg/L hygromicin and 300mg/L cefotaxime
during 9 days for hypocotyl elongation with 16h/8h light/dark photoperiod.
IV) The radicle was removed from the surviving hypocotyls and transferred to
propagation medium DKW 5.1 g/L, 0.5 mg/L BA, 0.5 mg/L GA 3, 30 g/L sucrose,
30 mg/L hygromicin, 300 mg/L cefotaxime and 6g/L agar. In this medium the
axes were incubated at 26 °C with a photo period of 16 h light and 8 h dark.
After two weeks, the hypocotyl was removed and the shoots were transferred
to tubes with propagation medium without hygromycin until it reached 2.5cm
long.
V) The already grown shoots were transferred to tubes with rooting medium
containing MS 4.4g/L, 30 g/L sucrose, 1mg/L IBA, 300 mg/L cefotaxime and
where they remained in continuous shaking for 3 days at 26 °C, 16 h/8 h
light/dark photoperiod.
VI) After 3 days, they were transferred to tubes with solid MS-sucrose medium
containing 4.4 g/L MS, 30 g/L sucrose, 300 mg/L cefotaxime and 6 g/L agar
until rooting, 16 h/8 h light/dark photoperiod (1-3 weeks).
VII) Once rooted, the shoots were transferred to soil. The shoots remained at least
the first three days in high relative humidity that was gradually decreased.

The shoots obtained reaches a frequency of 10% in the final stage of rooting (stage VI).
Unfortunately, the change to liquid medium at this stage and the needed shaking induced the
appearance of different contamination that drastically reduced the number of rooted survivors
(Table 3).
Protocols used by Sujatha and Sailaja, (2004 and 2008) with Agrobacterium (2004) and
biolistics (2008) achieved successes of 0.08% and 1.04%, respectively. Additionally, their

188
 English version

protocol is much longer. There is another published method for castor transformation,
published by Cabral et al., (2007). This method uses biolistics for shoot transformation and the
regeneration protocol used was similar to the one that we have developeds.
It was decided not to apply the adventitious regeneration method (Figure 24) since
no axes were obtained.

1.3. Generated stable transgenic lines.

1.3.1. Transgenic pCambia 1305.1 plant.
Following the transformation and direct regeneration method, a transgenic plant
transformed with the plasmid 1305.1 was obtained (Figura 25, A, B, C y E). This plant was
propagated to give another plant by rooting on the ground of one of the lateral axes (Figure
25D). A PCR test confirmed the presence of the GUS and HYGR genes for both plants (Figura
26)
The analysis of the fatty acid composition of the seeds of these plants showed no changes
in comparison to WT seeds (Figure 27A), as expected.

1.3.2. Transgenic pCambia 1305.1::hpFAH12 plant.

Following the transformation-direct regeneration method, a plant transformed with
pCambia1305.1::hpFAH12 was obtained (Figure 28). The result of the PCR reactions showed
the presence of hpFAH12 and GUS in the transgenic plant (Figure 29).
Furthermore, the analysis of the seeds produced by the transformant revealed two clear
groups differing in weight (Figures 30, 31) . Each group was composed of aproximately half of
the analyzed seeds, which obey a Mendelian distribution obtained by crossing normal
homozygous flowers with transgenic flowers with one or more copies of hpFAH12 (a) (AA x
Aa). This result could indicate that not all flowers in this plant were genotypically the same and
that the plant could actually be a chimaera containing different transformed and non-
transformed cell lines.
Additionally, 19 seeds of group 1 were analyzed by PCR, of which 6 were positive for GUS
and hpFAH12 (Figure 32). The endosperm of these seeds was analysed by gas chromatography
while the embryonic axis was destined to obtain descendants.
The analysis of the fatty acid composition showed a considerable depletion of the ricinoleic
acid content with respect to seeds transformed with pCambia 1305.1 (Figure 33A). While seeds
transformed with pCambia 1305.1 reached 90 % of ricinoleic acid in their oil, seeds with
hpFAH12 contained a variable amount between 76 % and 15 %, results which were in good
agreement with those obtained in transient transformation trials.

189
 English version

The decrease in the amount of ricinoleic acid was accompanied by an increase in the
content of linoleic and oleic acid (Figure 33A), just like in the endosperm of transiently
transformed seeds (Figure 13). This accumulation of linoleic acid does not occur in the castor
OLE-1 mutant in which the reduction of ricinoleic acid was caused by a mutation generated in
castor hydroxylase. In this mutant, the decrease in ricinoleic acid was accompanied by an
increase in oleic acid and not linoleic acid. (Venegas-Calerón et al., 2016). Thus, it is likely that
the mutated enzyme FAH12 could be inhibiting the enzyme FAD2 in the mutant OLE-1 blocking
the synthesis of linoleic acid. This inhibition would not occur in the transgenic hpFAH12.
In addition, there is a direct linear correlation between the amount of ricinoleic acid and
the weight of the seeds (Figure 34A), also, there is an exponential correlation between the
amount of the oil and the ricinoleic acid content (Figure 34B). These data suggest the
preference of the metabolic machinery of castor for the ricinoleic acid accumulation in TAG.
Finally, the embryonic axes of the seeds obtained from the mother transgenic plant
hpFAH12 were dissected and germinated in vitro. Once germinated, PCR test confirmed the
presence of the transgene. This result was the same as for the seeds analyzed from the mother
plant (Figure 35).
The germination of 6 embryos that were positive for hpFAH12 stand for the first time
obtaintion of a castor transgenic line silenced by the mechanism of RNA interference, by using
a short hairpintargeting the castor hydroxylase gene FAH12.

1.3.3. Transgenic pCambia 1305.1::Cas9 FAH12 plant.

Through the transformation-direct regeneration method, a plant transformed using
CRISPR/Cas9 targeting the castor hydroxylase gene was obtained (Figure 36). To confirm the
presence of mutations, the DNA extracted from the plant was digested with BsrDI and Fnu4HI,
the product of the digestion was used as a template for a PCR reaction (Figure 38)
BsrDI and Fnu4HI are capable of digesting the non-mutated sequences (Figure 37) so it was
not expected to obtain any PCR products in the WT seeds. However, it was observed some
PCR products in the WT plants, and this was likely due to the fact that the digestion with the
enzymes was not completed. For this reason, the the PCR products were sequenced. The result
of the sequencing showed the presence of mutations around the targets of Cas9 (Figure 39).
The presence of several mutations between both targets suggests that there could be a DNA
insertion, associated with the NHEJ repair mechanism.
The seeds produced by one of the transformants displayed two well-differentiated groups
(Figure 40, 41). This result fully agrees with that obtained in hpFAH12 transformant (Figure 31).
This distribution also adjusts to a Mendelian proportion obtained by the crossing of normal

190
 English version

homozygous flowers with flowers heterozygous for the mutated hydroxylase gene (a) (AA x
Aa), pointing to a chimaeric transformant. However, this distribution may also be due to the
crossing of mutated homozygous flowers (aa) with heterozygous flowers Aa (aa x Aa), in the
case that the plant was chimeric for said cell lines.
The analysis of seed fatty acid composition showed a proportion of of 40 % of ricinoleic
acid and a concomitant increase in the amount of linoleic acid. Both, reduction of ricinoleic
acid and increase in linoleic acid, were greater than in the seeds of the hpFAH12 transgenic
plant (Figure 42)
The high number of mutations found in the sequence of these seedscould be blocking the
synthesis of FAH12. The absence of FAH12 would not block the FAD2 enzyme allowing the
synthesis of linoleic acid.

1.1.1. Modified CRISPR/Cas9 ricin gen plant.

Another objective of this project was the generation of a castor plant with less toxic seeds.
This objective required to mutate the ricin toxin gene. When the CRISPR / Cas9 targets were
designed against the subunit A of this gene, the presence of off-targets was accepted, since
the ricin gene is within a family of 28 genes that encode proteins with ribosome inactivating
activity (RIP) (Chan et al., 2010).
By using the transformation-direct regeneration method, two transformed plants were
obtained using CRISPR / Cas9 (Figure 43).
The DNA of both plants was extracted and subjected to digestion with the enzymes
HpyCH4II and HaeII. The product of the digestion was used as a template for the PCR test
(Figure 44,45). Additionally, PCR products of both modified plants were sequenced.
Plant 2 showed a deletion of 144 bp in the ricin gene (Figure 46). This deletion was not
detected in plant 1 and in WT analysed plants. In addition, plant 2 not only showed ricin copies
with a deletion, it also showed intact copies of the ricin gene, so it could be a heterozygous or
a chimaera plant.
Cabral et al., (2017) have already made an approach to a non-toxic castor bean plant
through the silencing of the ricin gene by using a specific hairpin structure. They achieved a
decrease in the amount of ricin but not in the seed toxicity. That is because ricin is not the only
toxin in castor bean. Ricin belongs to a family of 28 genes of which at least 6 of them encoded
proteins with ribosome-inactivating and agglutinin activity (Chan et al., 2010)
Thus, the use of CRISPR / Cas9 against ricin and its homologs could be a more powerful
tool for decreasing the toxicity of the castor seeds. To confirm that this mutation was

191
 English version

decreasing the toxicity of the plant, toxicity tests and agglutinin activity should be carried out
as soon as seeds are obtained.

192
 English version

Chapter 4 summary: Studies of metabolism of hydroxylated fatty

acids different to ricinoleic

In this section we investigated the capacity of the enzymatic machinery of castor seed to
incorporate to TAGs hydroxylated fatty acids different to ricinoleic. This was carried out by
studying the metabolism of different radiolabelled fatty acid precursors with microsomes from
developing castor endosperm. As control experiments, the metabolism of oleic and ricinoleic
acids were studied. The oleic acid labelling produced high accumulations of precursor in acyl-
CoAs and phosphatidic acid at short times, and a progressive increase of diacylglycerols
(DAGs), and finally triacylglycerols (TAGs). This profile was compatible with the synthesis of
TAGs through the classical Kennedy pathway.
Labelling with ricinoleic acid resulted in no labelling in polar lipids, which pointed this fatty
acid was excluded from them, and a quick incorporation in DAGs and more importantly in
TAGs. The TAG species with highest level of label at short times was those having a single
hydroxylated fatty acids, which pointed to a mechanism making possible the fast acylation of
DAGs coming from polar lipids.
The metabolism of radiolabelled lesquerolic acid, accumulated in Lesquerella fedleri and
coriolic acid (13-hydroxy-octadecadien-9,11-oic acid), accumulated in Coriaria myrtifolia was
studied with different results. Both fatty acids were also excluded from polar lipids, which
means that castor possess a mechanism that identify them as hydroxylated fatty acids, but the
levels of incorporation of precursor was very different for them. Lesquerolic acid was
accumulated into TAG at high rates, with patterns of incorporation similar to that for ricinoleic
acid, whereas, coriolic acid was accumulated at much lower rates, which sometimes were at
the limits of detection. The incorporation of the fatty acid precursors are shown in figure 47, in
which the higher incorporation took place with ricinoleic acid. The rate was about one half
with lesquerolic acid and 10-fold lower with oleic acid and coriolic acid. Therefore, these
experiments pointed that the enzymatic system of castor is able to identify and accumulate
hydroxylated fatty acids into TAGs. However, the rates of incorporation can vary importantly
depending on their structure. Lesquerolic acid, which was a chemical analogous of ricinoleic
acid but two carbons longer, was accumulated at high rates and so, they could be potentially
produced in castor seeds. On the contrary, coriolic acid was accumulated at much lower rates
and its production in castor seems to be less efficient.

193
 English version

Conclusions.
Chapter 1: Development of a transient transformation method in castor bean

1. A novel method for in vivo transient transformation of castor bean seeds has been
developed. It can efficiently transform both the endosperm and other parts of the
castor seed and fruit.
2. The study of the number of abortions based on the moment of infiltration revealed
that the rate of seed abortions raises before 40 days after pollination.
3. The expression of the GUS gene under the 35S and glycinin promoters, showed that
the in vivo agroinfiltration method is valid to test genetic designs in castor bean
endosperm.
4. qPCR results to analyzed the GUS expression by the 35S and glycinin promoters
indicated that strong expression of the 35S promoter may result in posttranscriptional
or posttranslational silencing. The glycinin promoter does not present an expression as
strong as 35S, so it did not display gene silencing. GUS enzyme activity (β-
glucuronidase) showed that a 10-day activity peak occurs under glycinin regulation, it
doesn´t occurs under 35S regulation.
5. Agroinfiltration method success rate showed that between 50-70% of the infiltrated
and non-aborted seeds were transformed.

Chapter 2: Changes in castor bean fatty acid composition via transient expression in vivo.

1. Transient seed transformation with pCambia::hpFAH12, pCambia::CRISPR/Cas9 FAH12

and pCambiaSlEPX::hpFAH12 led to a decrease in ricinoleic acid content respect to
pCABMIA1305.1 seeds and WT seeds. Decrease in ricinoleic acid was appreciable at 20
days after agroinfiltration. Ricinoleic acid reduction was greater in CRISPR/Cas9 seeds.
Reduction of ricinoleic acid was accompanied by an increase in oleic acid and linoleic
acid.
2. Although castor bean incorporates vernolic acid in TAG, transient transformation with
epoxygenase gene from Stokesia laevis in pCambia, pCambia1305.1::SlEPX, did not
result in the presence of epoxidized fatty acids.
3. Transiently transformed seeds with LfKCS3 gene from Lesquerella fendleri showed an
increase up to 8 times higher in lesquerolic acid. This increase doesn´t appear at 20
DAI. In spite of this increase total lesquerolic content did not exceed 0.5% of the oil.

194
 English version

Chapter 3 summary: Development of a transformation/regeneration method for castor

plant. Production of stable transgenic plants.
1. Transformation method using Agrobacterium assisted by sonication (SAAT) is valid for
castor embryos transformation.
2. One-day imbibition step is needed for germination induction in castor embryo.
Germination rate was greater if imbibition takes place at 26 ° C
3. Hygromycin as a selection agent should be added to the culture medium at 30mg / L
during stage 2 and during the first 2 weeks of stage 3. Higher concentration or a longer
permanence leads to necrosis of the embryonic axes.
4. Cefotaxime use is essential to avoid Agrobacterium growth during the regeneration.
It´s necessary 300 mg/L concentration. In addition, cefotaxime acts hampering
adventitious regeneration.
5. Transformation plus direct regeneration method allows obtaining up to 10% of
transformed shoots. However, the appearance of contaminations in the last stage
blocks the rooting of most of them. Transgenic pCambia1305.1 castor plants were
obtained. GUS and HYGR transgene was checked by PCR. Oil composition of seeds did
not differ of WT seeds.
6. Analysis of seeds obtained by self-crossing of a pCambia::hpFAH12 transgenic plant
showed two normal distributed groups embracing 50% of the seeds sampled. The
mendelian distribution 1:1 was attributed to the crossing between untransformed
flowers and flowers transformed with one or more copies of hpFAH12, (AA x Aa),
assuming that this plant was chimeric.
7. The analysis of the fatty acid composition in positive hpFAH12 seeds showed decrease of
ricinoleic acid accompanied by a slight increase in linoleic acid. Increase in linoleic acid was not
observed in OLE-1 castor mutant. FAD2 enzyme, responsible for the synthesis of linoleic acid,
could be inhibited by mutant FAH12 in OLE-1. Inhibition does not occur in transgenic hpFAH12
since the silencing prevents translation of the FAH12 transcript. Correlation between oil
content and ricinoleic acid content indicates the castor metabolic machinery
preference for ricinoleic acid accumulation.
8. Seeds obtained from the CRISPR/Cas9 FAH12 plants could be separated in two groups
on the basis of weight. Seeds were equally distributed in these two groups, showing a
mendelian distribution due to the cross between homozygous and heterozygous
flowers, which indicated the chimeric nature of the plant
9. Ricinoleic acid content of CRISPR/Cas9 FAH12 plants was about 40%, it confirms the
phenotypic effect of the mutations. Decrease in ricinoleic acid came accompanied by
an increase in linoleic acid, similar to the hpFAH12 transgenic plant. Seeds with low
195
 English version

ricinoleic acid mutants for FAH12 also showed an extremely decrease of oil in their
seed oil, as well as seeds transformed with pCambia: hpFAH12.
10. A castor CRISPR/Cas9-modified plant was obtained with mutations in ricin gene. The
plant also contained non-mutated sequences of the same gene so it could be
heterozygous or chimaeric.

Chapter 4: Incorporation studies of different fatty acids in castor microsomes

glycerolipids.
1. Castor beans have mechanisms that channel hydroxylated fatty acids to TAGs. This
mechanism does not work in the same way with all fatty acids. So ricinoleic and
lesqueroic acids are high efficiently channeled to triacylglycerides. Coriolic acid was
slowly metabolized.

196
English version
 English version

Figures & Tables.

Figure 1. Transiently transformed castor seeds through sonication assisted Agrobacterium

transformation (SAAT) method.

198
 English version

Figure 2. Preliminary results of castor seed agroinfiltration in vivo. Histochemical GUS

assay showed a good transformation level in different tissues. In addition, some seed,
adjacent tissues were also transformed as the fruit (A) and caruncle (B). GUS activity was high
in the endosperm (C). The solution of the histochemical assay became blue due to the high
level of transformation (D)

Figure 3. Rate of seed abortion at different developmental seed stages of infiltration. . Each

color represents the time of seed collection. DAP: days after pollination. DAI: days after
infiltration.

199
 English version

Figure 4. Histochemical GUS assay in agroinfiltrated seeds in vivo. A, B y C seeds transformed with
GUS marker under 35S promoter. D, E y F seeds transformed with with GUS marker under Glycinin
promoter. G, H e I seeds transformed with GUS marker under no promoter. J, K y L non agroinfiltrated
seeds.

200
 English version

Figure 5. Rates of transformation of non-aborted seeds using the in vivo agroinfiltration method.
Seeds were transformed at 40 to 50 days after pollination and harvested at 5, 10 and 20 days after
infiltration (DAI).

Figure 6. GUS activity (A) and relative gene expression (B)of GUS marker regulated under 35S and
glycinin promoter in developing castor endosperm.

201
 English version

Figure 7. Agroinfiltrated seeds with pCambia::hpFAH12.. GUS marker indicates endosperm

transformation ratio.

202
 English version

Figure 8. Seeds transformed with pCambia 1305.1. These groups of seeds were used as the
control.

203
 English version

Figure 9. Oil composition of modified seeds with pCambia1305.1 and pCambia::hpFAH12.. Letters
indicate statistical differences, t student p<0.01.

204
 English version

Figure 10. Transformed seeds with pCambia::CRISPR with hydroxylase gene as a targets. pCambia
plasmid induces GUS activity in the seed.

Figure 11. Seeds transformed with the CRIPR / Cas9 construction editing hydroxylase gene FAH12.
Dashed arrows indicate seeds with a mutation in one of the targets. Continuous arrows indicate seeds with
mutations in both targets.
.

205
 English version

Figure 12. Genomic PCR targeting CAS9 gene in transgenic CRIPR/CAS9 seeds. Seeds were transformed
via agroinfiltration in vivo.

Figure 13. Oil composition of seeds transformed with pCambia 1305.1, pCambia :: hpFAH12 orpCambia :: CRISPR
FAH12. Seeds were transformed by agroinfiltration in vivo. Letters on the bars indicate significant differences, t-student
p<0.01.

206
 English version

Figure 14. Castor seeds transformed with pCambia::LfKCS3.through agroinfiltration.

Figure 15. PCR targeting LfKCS3 and GUS genes in ransgenic seeds.

Figure 16. Lesquerolic acid accumulation in pCambia::LfKCS3 and pCambia 1305.1 seeds.
Different letters indicate statistical differences, t-student p>0.01

207
 English version

Figure 17. Acyl-CoA pool composition during castor seed development. It can be appreciated the
low level of ricinoleil-CoA. Palmitoyl-CoA and stearyl-CoA were the most abundant acyl-CoA species.

208
 English version

Figure 18. Oil composition of pCambia 1305.1 and pCambia::hpFAH12::SlEPX seeds. Epoxy fatty acids were not found
in any of the analysed seeds. Different letters indicate statistical differences, t-student p<0.01.

209
 English version

Figure 19. Castor embryo axes transformed with pCambia 1305.1. At least 9/30 embryos display
GUS activity.

Tabla 1. Survival of shoots in different hygromycin concentrations.

Hygromycin Stage2 Stage 3 (4 first Stage 3 (4 Stage 4 Stage5

Concentration weeks from 1 to 4) following
weeks
from 5 to
8)
20mg/L 120 53 16 0 0
30mg/L 110 45 0 0 0
40mg/L 65 17 0 0 0
50mg/L 48 13 0 0 0

210
 English version

Figure 20. Transformation and direct-regeneration method

211
 English version

Figure 22. Survival of shoots exposed for 2 weeks in stage 3, versus shoots exposed for 4

weeks in stage 3. Hygromycin was finally used during stage 2 and 2 weeks during stage 3 to
ensure plant survival, t-student p<0,01.

Figure 23. Induced necrosis by excess of hygromycin. Embryos expossed to 50mg / L are shown in
plate A. In plate B embryos expossed to 30 mg / of hygromycin

Table 9. Presence/Abscense of Agrobacterium at different cefotaxime concentrations.

Cefotaxime Stage 2 Stage 3 (4 first Stage 3 (4 second Stage 4 Stage 5

Concentration weeks) weeks)

50mg/L yes yes yes yes yes

100mg/L no yes yes yes yes
150mg/L no yes yes yes yes
200mg/L no no no yes yes
300mg/L no no no no no

212
 English version

Figure 24. Transformation and adventitious-regeneration method.

213
 English version

Table 3. Survival shoots in each stage in transformation using the direct regeneration protocol . A
high number of contamination appeared between stage 5 and 6, causing a fall in the number
of final explants.

Stage 1 Stage 2 + Stage 3 Stage 3 Stage 4 Stage 5 Stage 6

Hygromycin
2 weeks with Without
hygromycin hygromycin
Assay 1 100 54 31 21 17 11 0
Assay 2 100 32 20 13 9 9 1
Assay 3 100 50 25 15 10 10 0
Av 100.00 45.33 25.33 16.33 12.00 10.00 0.33
Error 0.00 11.72 5.51 4.16 4.36 1.00 0.58

Figure 25. pCambia 1305.1 transgenic plants obtained by direct transformation-regeneration.

First, plant was acclimated to soil with a high initial humidity (A) that gradually was lowered in
a culture chamber (B). Lateral axes allowed the propagation of the adult plant (C). Finally, two

214
 English version

Figure 26. PCR product of pCambia 1305.1 transgenic plants targeting the GUS marker (A) and
R
HYG (B ) gene.
plants, D and E, were obtained.

Figure 27. Oil composition (A) and oil content (B) of WT and pCambia 1305.1 transgenic seeds. Lowercase letters indicate
statistical differences, t-student p<0,01.

215
 English version

Figure 28. Transgenic pCambia::hpFAH12 plant. hpFAH12 induces gene silencing in castor hydroxylase.

Figure 29. Genomic DNA PCR product in plant expressing pCambia::hpFAH12 construct targeting
GUS marker (A) and hpFAH12 genes between intron and antisense arm (B & C).

216
 English version

Figure 30. pCambia::hpFAH12 seed weight distribution. Seeds collected were separated in two populations well differentiated
(A). Each population showed distributions with different average (B and C). Seeds were divided by 50% for each group.
.

217
 English version

Figure 31. Average weight of each group of seeds transformed with

pCambia1305.1::hpFAH12. Different letters indicate statistical differences, t-
student p>0.01

Figure 32. PCR product showing the presence of hpFAH12 intron and GUS marker in 6 transgenic
seeds

218
 English version

Figure 33. Oil composition of pCambia::hpFAH12 and pCambia1305.1 transgenic seeds (A) and oil
content (B) of WT, pCambia::hpFAH12 and pCambia1305.1 seeds. Lowercase letters indicates
statistical differences t-student p<0.01.

219
 English version

Figure 34. Correlation between seed weight and ricinoleic content (A) and correlation between oil
content and ricinoleic content (B). Both correlations indicates the preference of castor metabolism to
accumulate ricinoleic acid.

220
 English version

Figure 35. PCR test for the first generation of transgenic pCambia::hpFAH12 plants. Results were the same
for transgenic seeds.

Figure 36. Modified CRISPR/Cas9 plant with castor hydroxylase gen as a target.

Figure 37. Schematic diagram showing the CRISPR sites and the restriction sites BsrDI, Fnu4HI. Small
Arrows indicated PCR primers used for mutations test.

221
 English version

10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** ** * ** ***** ** *** ** ************************** ***
Hidroxilasa WT GACCTCAAGAGAGCCATCCCACCCCATTGCTTTGAACGCTCTTTTGTGCGCTCATTCTCC
Hidroxilasa modificada GACATCTGGTGATCCATCACAGCCCGATGGTTTGAACGCTCTTTTGTGCGCTCATTGTCC

70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* *** * * ***** * * ****** **** ************ ******
Hidroxilasa WT TATGTTGCCTATGATGTCTGCTTAAGTTTTCTTTTCTACTCGATCGCCACCAACTTCTTC
Hidroxilasa modificada TGTGTGACTTCAGATGTGGGAG-AGCCAGTCTTTTATACTAGATCGCCACCAAATTCTTC

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***************************************************** ** ***
Hidroxilasa WT CCTTACATCTCTTCTCCGCTCTCGTATGTCGCTTGGCTGGTTTACTGGCTCTTCCAAGGC
Hidroxilasa modificada CCTTACATCTCTTCTCCGCTCTCGTATGTCGCTTGGCTGGTTTACTGGCTCTTGCAGGGC

190 200 210 220

....|....|....|....|....|....|....|....|...
****** ********** ************************
Hidroxilasa WT TGCATTCTCACTGGTCTTTGGGTCATCGGCCATGAATGTGGCC
Hidroxilasa modificada TGCATTGTCACTGGTCTGAGGGTCATCGGCCATGAATGTGGCC

Figure 39. Sequencing results in CRISPR/Cas9 modified plant. Absence of star indicates the sites of mutations
in castor hydroxilase gene targets. Yellow mark indicates CRISPR targets.
Figure 38. PCR products after DNA digestion with BsrDI and Fnu4HI

222
 English version

Figure 40 Weight distribution in pCambia::CRISPR seeds targeting the hydroxylase FAH12 gene Seeds collected were separated in
two populations well differentiated (A). Each population showed normal distribution with different average (B and C). Seeds were
divided by 50% for each group.

223
 English version

Figure 41. Weight average of both groups of seeds obtained from transgenic plants transformed
with pCambia::hpFAH12 and from plants modified with CRISPR / CAS9 against the hydroxylase gene.
Groups G1 and G2 were clearly differentiated and statistically significant, however, there were no
differences between the seeds with the pCambia::hpFAH12 and those modified by CRISPR / CAS9.

224
 English version

Figure 42. Oil seed composition of seeds obtained from transgenic plants transformed with
pCambia1305.1, pCambia :: hpFAH12, and pCambia :: CRISPR FAH12 constructs(A). In figure B, seed oil
content of different plants.

225
 English version

Figure 43. Modified CRISPR/Cas9 obtained with Ricin like genes as targets.

Figure 44. Schematic representation of the CRISPR sites and HpyCH4II, HaeII targets. Small Arrows
indicated PCR primers used for mutations test.

Figure 45. PCR products after DNA digestions with Hpy4CH4II and HaeII in Cas9 targets. WT plants
were also present PCR product.

226
 English version

10 20 30 40 50 60 70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******************** *
Ricina WT CTTTATCAGAGCTGTTCGCGGTCGTTTAACAACTGGAGCTGATGTGAGACATGAAATACCAGTGTTGCCA
Ricina Planta 2 CTTTATCAGAGCTGTTCGCGCGC-----------------------------------------------

80 90 100 110 120 130 140

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Ricina WT AACAGAGTTGGTTTGCCTATAAACCAACGGTTTATTTTAGTTGAACTCTCAAATCATGCAGAGCTTTCTG
Ricina Planta 2 ----------------------------------------------------------------------

150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....
** ********************
Ricina WT TTACATTAGCGCTGGATGTCACCAATGCATATGTGGTCGGCTAC
Ricina Planta 2 -------------------CAATGATGCATATGTGGTCGGCTAC

Figure 46. Mutation detected in plant 2 modified with CRISPR / CAS9 in ricin gene. The result of the sequencing revealed a
deletion of 144 bp and a subsequent insertion of 8 bp. Yellow areas indicate Cas9 targets.

227
 English version

Figure 47. Incorporation into TAGs of different labelled fatty acid precursors. The study
included ricinoleic (red), lesquerolic (navy), oleic (green) and coriolic (purple) acids.

228
 VIII. BIBLIOGRAFÍA

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communis L.) mutant. Planta, 244(1), 245–258. https://doi.org/10.1007/s00425-016-
2508-4
Zhang, N., McHale, L. K., & Finer, J. J. (2018). Changes to the core and flanking sequences of G-
box elements lead to increases and decreases in gene expression in both native and
synthetic soybean promoters. Plant Biotechnology Journal, 0–1.
https://doi.org/10.1111/pbi.13010

234
 VIX. ANEXOS

235
 Anexo I

Anexo I
Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje de hpFAH12

Nombre Oligonucleótido (5´->3´)

ARM1_HPHIDRO_nde_afw
ARM1_HPHIDRO_eco_arv
Arm1_SacII_sFw
ARM1_HPHIDRO_XHOI_SRV
iFAD2_Nde_Fw
iFAD2_SacII_Rv
TGCTTACATATGTCCACTGTCATAACCAGCAAC
TAAGCAGAATTCGTGTGCGGCGCTCGCTTAAGG
TGCTTACCGCGGATGTCCACTGTCATAACCAGC
TAAGCACTCGAGTTCGTGTGCGGCGCTCGCTTAAGG
GGGCATATGCGTCAGCTCCATCTCCAGGTCC
GGGCCGCGGTTTCTGCAGAAAACCAAAAGC

Oligonucleótidos utilizados para insertar el promotor Glycinin en pCambia 1305.1

Nombre Oligonucleótido (5´->3´)
pRcGLIC-Eco-F CTG GAA TTC GTA CGT ACT CAA AAT GCC AA
pRcGLIC-Nco-R ATC CCATGG TTAAGGACCAATGGAGAGAA

Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje de SlEPX mediante Loop Assembly

Nombre Oligonucleótido (5´->3´)
pGLY-Fw loop A KpnI GTGAAGACTGCTCAGGAGGGTACCGATCCGTACGTAAGTACG
pGLY-Rv loop C GTGAAGACGTCTCGCATTCGCGGCCGCGGTGATGAC
SlEPX Fw LOOPC GTGAAGACTGCTCAAATGTCAGACTCTTATGAT
SlEPX Rv LOOPE GTGAAGACGTCTCGAAGCCATCTTGTGATACCAATA
GlyT Fw BsaI loopE GAGGTCTCAGCTTTCGAGGCGGCCGCAGCCC
GlyT Rv BamHI BsaI loopF GTGGTCTCGAGCGGGATCCTAAGTCATGAAGAACCTG

Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje de las estructuras para CRISPR/Cas9

Nombre Oligonucleótido (5´->3´)
Hydrox t1 sgRNA TGTGGTCTCAATTGAGCGTTCAAAGCAATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG
Fw CAAG
Hydrox t2 sgRNA TGTGGTCTCAATTGACCAGTGAGAATGCAGCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
Fw AAG
RicinA t1 sgRNA TGTGGTCTCAATTGTTCAACTAAAATAAACCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
Fw AAG
RicinA t2 sgRNA TGTGGTCTCAATTGCTTTCTGTTACATTAGCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
Fw AG
gRNA_AGCG_BsaI TGTGGTCTCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC
Rv
pCamb-Cas9 Fw GGTACCTGCCGAATTCGGATCCGGAG
KpnI
pCamb-Cas9 Fw GGTACCATGTGCATCCTCGTAAAGCG
KpnI
pCamb-Cas9 Rv GGTACCATGTGCATCCTCGTAAAGCG
KpnI
 Anexo I

Oligonucleótidos utilizados para comprobar la presencia de transgenes.

Nombre Oligonucleótido (5´->3´)
Gus_Plus_Fw CCGCACACTATCCGTACTC
Gus_Plus_Rv GTACCTGGGAGAAGATTCGG
HigroR_Fw GACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCG
HigroR_Rv TTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC
Cs_Fad2i_Fw ACCACAAGCAAGAGATGTGACC
Ricin_Fw_CRISPR_TEST CGGTCGTTTAACAACTGGAGCTGATG
Ricin_Rv_CRISPR_TEST GCATCTTCCTGATTGTCAGGATGAAA
Hydrox_Fw_CRISPR_TEST CGCACACGAAGCCTCCTTTC
Hydrox_Rv_CRISPR_TEST GATACTCACTAAAAGCATGATGG
Cas9_Fw6 ATTCATCAGTCAATTACGGGGC
 Anexo II

Anexo II
Secuencia del intrón usado para la estructura hpFAH12.
10 20 30 40 50
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TATGCGTCAGCTCCATCTCCAGGTCCGTCGCTTCTCTTCCATTTCTTCTC

60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ATTTTCGATTTTGATTCTTATTTCTTTCCAGTAGCTCCTGCTCTGTGAAT

110 120 130 140 150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TTCTCCGCTCACGATAGATCTGCTTATACTCCTTACATTCAACCTTAGAT

160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) CTGGTCTCGATTCTCTGTTTCTCTGTTTTTTTCTTTTGGTCGAGAATCTG

210 220 230 240 250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ATGTTTGTTTATGTTCTGTCACCATTAATAATAATGAACTCTCTCATTCA

260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TACAATGATTAGTTTCTCTCGTCTACAAAACGATATGTTGCATTTTCACT

310 320 330 340 350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TTTCTTCTTTTTTTCTAAGATGATTTGCTTTGACCAATTTGTTTAGATCT

360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TTATTTTATTTTATTTTCTGGTGGGTTGGTGGAAATTGAAAAAAAAAAAA

410 420 430 440 450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ACAGCATAAATTGTTATTTGTTAATGTATTCATTTTTTGGCTATTTGTTC

460 470 480 490 500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TGGGTAAAAATCTGCTTCTACTATTGAATCTTTCCTGGATTTTTTACTCC

510 520 530 540 550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TATTGGGTTTTTATAGTAAAAATACATAATAAAAGGAAAACAAAAGTTTT

560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ATAGATTCTCTTAAACCCCTTACGATAAAAGTTGGAATCAAAATAATTCA

610 620 630 640 650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) GGATCAGATGCTCTTTGATTGATTCAGATGCGATTACAGTTGCATGGCAA

660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ATTTTCTAGATCCGTCGTCACATTTTATTTTCTGTTTAAATATCTAAATC

710 720 730 740 750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TGATATATGATGTCGACAAATTCTGGTGGCTTATACATCACTTCAACTGT

760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TTTCTTTTGGCTTTGTTTGTCAACTTGGTTTTCAATACGATTTGTGATTT

810 820 830 840 850

 Anexo II

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) CGATCGCTGAATTTTTAATACAAGCAAACTGATGTTAACCACAAGCAAGA

860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) GATGTGACCTGCCTTATTAACATCGTATTACTTACTACTAGTCGTATTCT

910 920 930 940 950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) CAACGCAATCGTTTTTGTATTTCTCACATTATGCCGCTTCTCTACTCTTT

960 970 980 990 1000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ATTCCTTTTGGTCCACGCATTTTCTATTTGTGGCAATCCCTTTCACAACC

1010 1020 1030 1040 1050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) TGATTTCCCACTTTGGATCATTTGTCTGAAGACTCTCTTGAATCGTTACC

1060 1070 1080 1090 1100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) ACTTGTTTCTTGTGCATGCTCTGTTTTTTAGAATTAATGATAAAACTATT

1110 1120 1130 1140 1150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) CCATAGTCTTGAGTTTTCAGCTTGTTGATTCTTTTGCTTTTGGTTTTCTG

1160
....|....|
CsFAD2 intron (secuencia loop) CAGAAACCGC

Secuencia LfKCS3 original y optimizada.

10 20 30 40 50
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ***** ***** ** ** ***** ** ******** ** ** **
LfKCS3 original ATGACATCTCTAAACATAAAGCTCCTTTACCATTACATCCTAACCAACCT
LfKCS3 optimizada ATGACCTCTCTTAACATCAAACTTCTTTATCACTACATCCTTACTAATCT

60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******* * ***** ***** * ** ** ***** ** ** *****
LfKCS3 original TTTCAACCTCTGTCTCTTCCCTTTAACAGCATTTCTCGCCGGAAAAGCTT
LfKCS3 optimizada TTTCAACTTGTGTCTTTTCCCACTTACTGCTTTTCTTGCTGGTAAAGCAA

110 120 130 140 150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** * ** ** ** ***** * ******** ***** ** *****
LfKCS3 original CTCACTTAACCAAATCCGATCTCCTCATGTTCTTATCTCATCTCCAAGAC
LfKCS3 optimizada GTCATCTTACTAAGTCTGATCTTTTGATGTTCTTGTCTCACCTTCAAGAT

160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** * ** ** ** ** ** ** ***** ************** * **
LfKCS3 original AATCTTATAACTGTCATTGTACTCTTTACTTTCACTATCTTCTGTTTGGT
LfKCS3 optimizada AATTTGATCACAGTTATAGTGCTTTTTACCTTCACTATCTTCTGCCTTGT

210 220 230 240 250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* * ** ***** ** ** ** ** ***** ** ***** ******** *
LfKCS3 original TCTTTACATTGTAACCAAACCTAAACAGATTTATCTTGTGGATTACTCTT
LfKCS3 optimizada TTTGTATATTGTGACTAAGCCAAAGCAGATATACCTTGTTGATTACTCAT

260 270 280 290 300

 Anexo II

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** * ***** ******************** ** ** ******
LfKCS3 original GTTACCTTCCACCAGATCATCTTAAAGTTAGTATATCAAGTGTCATGGAT
LfKCS3 optimizada GTTACTTGCCACCTGATCATCTTAAAGTTAGTATTTCTTCAGTGATGGAT

310 320 330 340 350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******************** ******** * ** ** ***********
LfKCS3 original ATTTTCTATGAGTTGAGAAAAGTTGATCCTTTGTGTGAGGTGGGTTGTGA
LfKCS3 optimizada ATTTTCTATGAGTTGAGAAAGGTTGATCCACTTTGCGAAGTGGGTTGTGA

360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
**** ****************** ******** ** * ****** * *
LfKCS3 original TGATTCTTCTCTTGAGTTTATGAGGAAGGTTTTAGAACGTTCAGGTTTAG
LfKCS3 optimizada TGATAGTTCTCTTGAGTTTATGAGAAAGGTTTTGGAGAGATCAGGTCTTG

410 420 430 440 450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ***** ***** ***** ****** * ** ************** **
LfKCS3 original GTGATGAGACTTATGTTCCACTTGGACTCCATCAAGTGCCACCTCAAAAG
LfKCS3 optimizada GAGATGAAACTTACGTTCCTCTTGGATTGCACCAAGTGCCACCTCAGAAA

460 470 480 490 500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******** ** ** ***** ** ******** ** ** ** ****** *
LfKCS3 original ACTTTTGCAGCGATAAAGGACGAGACAGAGCAGGTAATCAAAGGTGCACT
LfKCS3 optimizada ACTTTTGCTGCAATTAAGGATGAAACAGAGCAAGTTATTAAGGGTGCATT

510 520 530 540 550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
** ***** ************** ** ** ***************** *
LfKCS3 original TGAGAATCTATTCGAGAACACAAAAGTAAACCCTAGAGAGATTGGTATAC
LfKCS3 optimizada GGAAAATCTTTTCGAGAACACAAAGGTTAATCCTAGAGAGATTGGTATTC

560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
**** ** ** ** ***** ************** ** ** ***
LfKCS3 original TTGTGATAAACTCAAGCATGTTTAATCCAACACCTTCTCTATCAGCCATG
LfKCS3 optimizada TTGTTATTAATTCTTCTATGTTCAATCCAACACCTTCACTTAGTGCTATG

610 620 630 640 650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ***** ** *** * * ***** ** ** ** ********
LfKCS3 original GTTATTAATACTTTCAAACTCCGAAGTAACATCAAAAGCTTTAATCTTGG
LfKCS3 optimizada GTTATCAATACCTTTAAATTGAGGTCAAACATTAAGAGTTTCAATCTTGG

660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*********** ******** ** ***** ****** * ********
LfKCS3 original AGGAATGGGTTGTAGTGCTGGTGTAATCGCCATTGATCTAGCTAAAGACT
LfKCS3 optimizada TGGAATGGGTTGCAGTGCTGGAGTTATCGCAATTGATTTGGCTAAAGATC

710 720 730 740 750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* *********** ** ***** *********** ** *********
LfKCS3 original TGTTGCATGTTCATAAAAACACTTATGCTCTTGTAATAAGCACTGAGAAC
LfKCS3 optimizada TTTTGCATGTTCACAAGAACACCTATGCTCTTGTGATTTCAACTGAGAAC

760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ** ******** ** ** ***** **** ********* **
LfKCS3 original ATCACCATAACCGCTTATGCTGGCGAAAATCGATCCATGAATGTTAGTAA
 Anexo II

LfKCS3 optimizada ATCACAATCACCGCTTACGCAGGTGAAAACAGATCTATGAATGTTTCAAA

810 820 830 840 850

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** * *** * ** ** ** ** ** ** * * ***********
LfKCS3 original TTGCTTGTTCCGAATAGGCGGGGCCGCGATTTTGCTCTCTAATAAGCCAA
LfKCS3 optimizada CTGCCTTTTCAGGATCGGTGGAGCTGCAATACTTTTGAGTAATAAGCCAA

860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
********************** ***** ** ** ****** **** **
LfKCS3 original GAGATAAGAGAAGGTCTAAGTACAAGCTAGCTCACACTGTTCGAACACAA
LfKCS3 optimizada GAGATAAGAGAAGGTCTAAGTATAAGCTTGCACATACTGTTAGAACTCAC

910 920 930 940 950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
************** ******** ************** ***** *****
LfKCS3 original ACAGGAGCTGATGACATGTCTTATAGATGTGTGCAACAAGAAGAAGATGA
LfKCS3 optimizada ACAGGAGCTGATGATATGTCTTACAGATGTGTGCAACAGGAAGAGGATGA

960 970 980 990 1000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*********** ***** * ** ** ***** ** ***** ** ** *
LfKCS3 original GATGGGTAAAGTAGGAGTTCGTCTCTCAAAGGACATAACTACTGTCGCGG
LfKCS3 optimizada AATGGGTAAAGTTGGAGTGAGGCTTTCTAAGGATATTACTACAGTTGCTG

1010 1020 1030 1040 1050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ** ***** ***** ** ** ***** * ** ***** *** * ***
LfKCS3 original GCACAGCAGTTAAGAAGAACATATCAACATTAGGTCCACTGATTCTTCCT
LfKCS3 optimizada GTACTGCAGTGAAGAAAAATATCTCAACTCTTGGACCACTTATTTTGCCT

1060 1070 1080 1090 1100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ** ****** * ** ******** ***** ** ***********
LfKCS3 original TTAAGCGAAAAGCTTCTTTATTTCGTTTCCTTCATCGCGAAGAAACTTTT
LfKCS3 optimizada CTTTCTGAGAAGCTTTTGTACTTCGTTTCATTCATAGCTAAGAAACTTTT

1110 1120 1130 1140 1150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
****** ** ** ******** ***** ** *** * ***** ***** *
LfKCS3 original GAAGGAGAAGATCAAGAACTATTACGTCCCGGATCTTAAGCTAGCTATCA
LfKCS3 optimizada GAAGGAAAAAATTAAGAACTACTACGTGCCAGATTTGAAGCTTGCTATTA

1160 1170 1180 1190 1200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******* ** ***** ***************** ** ****** * **
LfKCS3 original ATCATTTTTGTATCCATGCTGGTGGAAGAGGTGTGTTAGATGTGTTGGAA
LfKCS3 optimizada ATCATTTCTGCATCCACGCTGGTGGAAGAGGTGTTTTGGATGTGCTTGAG

1210 1220 1230 1240 1250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ** ***** ** ** ******** ***** ******** ** **
LfKCS3 original AAGAACTTAAGGCTATCACCAATTGATGTAGAAGCATCTAGATCGACTTT
LfKCS3 optimizada AAGAATTTGAGGCTTTCTCCTATTGATGTTGAAGCTTCTAGATCAACATT

1260 1270 1280 1290 1300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ** ** ** ** ***** ***** ** ******** * ** *
LfKCS3 original ACATAGATTTGGGAATACTTCTTCGAGTTCGATTTGGTATGAGTTGGCTT
LfKCS3 optimizada GCATAGGTTCGGAAACACCTCTTCAAGTTCTATATGGTATGAACTTGCAT

1310 1320 1330 1340 1350

 Anexo II

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ** ** ***** ** ************** ***** ** ***** ***
LfKCS3 original ATATTGAAGCTAAAGGAAGGATGAAGAAAGGTGATAAAGCTTGGCAAATT
LfKCS3 optimizada ACATCGAGGCTAAGGGTAGGATGAAGAAAGGAGATAAGGCATGGCAGATT

1360 1370 1380 1390 1400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ** ***** ***************** ******** *** * *
LfKCS3 original GCTTTAGGGTCAGGGTTTAAGTGTAATAGTGCTGTTTGGGTTGCTTTACG
LfKCS3 optimizada GCTTTGGGTTCAGGTTTTAAGTGTAATAGTGCAGTTTGGGTGGCTCTTAG

1410 1420 1430 1440 1450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
** ***** *** ** *** ********* ***** **********
LfKCS3 original TAATGTTAAAGCTTCGGCTAATAGTCCTTGGGAACATTGTATTGATAGGT
LfKCS3 optimizada AAACGTTAAGGCTAGTGCAAATTCTCCTTGGGAGCATTGCATTGATAGGT

1460 1470 1480 1490

....|....|....|....|....|....|....|....|.
**** *********** ***** ***** ** *******
LfKCS3 original ATCCTGTTCCTGATACTTGTGTAGAAAATGGTAAGTCTTAG
LfKCS3 optimizada ATCCAGTTCCTGATACATGTGTGGAAAACGGAAAGTCTTGA

Secuencia de la elongasa de Stokesia laevis SlEPX original y adaptada.

10 20 30 40 50
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ** ** *********** ***** ******** ***** *** *
SlEPX1 original ATGTCGGATTCATATGATGATCGAATGAAAGATCATGATATGGACGAACG
SlEPX2 optimizada ATGTCAGACTCTTATGATGATCGGATGAAGGATCATGACATGGATGAAAG

60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** *********** ** ** ***** ** ** ***** ******** *
SlEPX1 original AGCCCCGATTGATCCGGCGCCATTCTCGTTAAGTGATCTAAAGAAAGCAA
SlEPX2 optimizada AGCTCCGATTGATCCAGCACCTTTCTCATTGAGCGATCTGAAGAAAGCTA

110 120 130 140 150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ***** ** ** *** * **** ** ********* *** *****
SlEPX1 original TCCCTGCACATTGCTTCCGGCGATCCGCCGTCTGGTCATCCTGCTACGTA
SlEPX2 optimizada TTCCTGCTCACTGTTTCAGAAGATCTGCTGTCTGGTCAAGCTGTTACGTT

160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
** ** ** ** ** ********* * * ** ** ** ** ***** **
SlEPX1 original GTTCAGGATCTCATTATCACCTTCCTTTTATACACGGTCGCCAACACCTA
SlEPX2 optimizada GTGCAAGACCTTATCATCACCTTCTTGCTTTATACAGTTGCGAACACGTA

210 220 230 240 250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** ** ** * ** ** ***** ** *** **** ***** ** ****
SlEPX1 original CATTCCTCACCTCCCTCCTCCTCTAGTTTACTTAGCATGGCCGGTTTACT
SlEPX2 optimizada CATACCCCATTTACCACCACCTCTCGTATACCTAGCTTGGCCAGTATACT

260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
******* ** ******** ***** ** ***** ** ** ******
SlEPX1 original GGTTTTGCCAATCTTGCATCCTCACTGGTTTATGGGTCCTCGGCCATGAA
SlEPX2 optimizada GGTTTTGTCAGAGCTGCATCCTTACTGGATTGTGGGTTCTTGGTCATGAA

310 320 330 340 350

 Anexo II

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
** ** ******** ** ******** ******** ***** ** *****
SlEPX1 original TGCGGCCATCATGCCTTTAGTGAGTACCAGTGGATTGATAACGCCGTTGG
SlEPX2 optimizada TGTGGACATCATGCTTTCAGTGAGTATCAGTGGATCGATAATGCAGTTGG

360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
** ** ** ** ****** * ** ***** ** ************
SlEPX1 original ATTCGTCCTCCATTCGGCTCTCCTCACCCCTTACTTTTCTTGGAAATACA
SlEPX2 optimizada TTTTGTGCTGCACAGTGCTCTCTTAACTCCTTATTTCTCTTGGAAATACT

410 420 430 440 450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** ******* ** ***** ** ** ** * ***** ** ** **
SlEPX1 original GCCATCGAAAGCACCATGCAAACACAAATTCACTCGAAAACGAGGAAGTT
SlEPX2 optimizada CTCATAGAAAGCATCACGCAAATACCAACTCGTTGGAAAATGAAGAGGTG

460 470 480 490 500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ** ** ** ** ***** * * *********** ** ** **
SlEPX1 original TACATTCCTAGAACTCAGTCCCAGCTCAGGACTTACTCCACATACGAATT
SlEPX2 optimizada TACATACCAAGGACACAATCCCAATTGCGAACTTACTCCACCTATGAGTT

510 520 530 540 550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ***** ** ** *** **** ** ** * ***** ********
SlEPX1 original TCTTGACAACACGCCTGGTCGAATCCTCATCTTGGTCATCATGTTAACCT
SlEPX2 optimizada CTTAGACAATACTCCCGGTAGAATTCTGATTCTCGTCATTATGTTAACGC

560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
********** * *** * ** ** ***** ** ******** ***
SlEPX1 original TAGGATTTCCTTTATACCTCTTAACGAATGTTTCAGGCAAGAAGTACGAT
SlEPX2 optimizada TAGGATTTCCGCTCTACTTGTTGACAAATGTGAGTGGTAAGAAGTATGAT

610 620 630 640 650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ** ***** ***** ***** ** ***** ** ** *** * **
SlEPX1 original AGATTTACCAACCACTTTGATCCATTGAGCCCGATCTTCACCGAGCGTGA
SlEPX2 optimizada CGTTTCACCAATCACTTCGATCCTCTGTCTCCGATATTTACTGAGAGAGA

660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ******** * ** ** * ** ** ***** **********
SlEPX1 original GCGAATCCAGGTTGCGTTATCAGATCTTGGTATCGTTGCAGTGTTTTACG
SlEPX2 optimizada ACGAATTCAGGTTGCACTTTCTGACTTAGGGATTGTTGCCGTGTTTTACG

710 720 730 740 750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
**** ***** ** ***** ** ***** ***** ***** *********
SlEPX1 original GACTCAAGTTTCTTGTACAAACAAAAGGATTTGGTTGGGTGATGTGCATG
SlEPX2 optimizada GACTTAAGTTCCTCGTACAGACTAAAGGCTTTGGATGGGTAATGTGCATG

760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
***** ***** ***** ** ** ** ** ** ** ***** ***** **
SlEPX1 original TATGGAGTTCCAGTGATAGGTCTGAATTCCTTCATTATCGTAATCACTTA
SlEPX2 optimizada TATGGTGTTCCTGTGATTGGGCTTAACTCGTTTATAATCGTCATCACGTA

810 820 830 840 850

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** ** ** ***** ** ** ***** *********** ** *******
SlEPX1 original TCTGCACCACACACATCTGTCGTCACCCCATTACGATTCAACCGAATGGA
 Anexo II

SlEPX2 optimizada TCTCCATCATACACACCTTTCTTCACCACATTACGATTCCACAGAATGGA

860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
************* ** ******** ** *** * ***** ** *****
SlEPX1 original ACTGGATCAAAGGAGCCTTGACCACAATCGACAGAGATTTCGGTCTCCTG
SlEPX2 optimizada ACTGGATCAAAGGTGCTTTGACCACTATTGACCGTGATTTTGGCCTCCTT

910 920 930 940 950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
** **** ** ***** ******** ** ** ** * ** *** * **
SlEPX1 original AATCGGGTTTTCCACGACGTTACACACACCCACGTGTTGCACCATTTGTT
SlEPX2 optimizada AACAGGGTCTTTCACGATGTTACACATACACATGTTCTACATCATCTATT

960 970 980 990 1000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
*** ** ** ** ** ***** ** ** ** ** ** ** ***** *
SlEPX1 original TCCCTACATTCCACATTATCATGCAAAGGAGGCAAGCGAGGCCATCAAGC
SlEPX2 optimizada TCCGTATATACCTCACTATCACGCCAAAGAAGCGTCAGAAGCGATCAAAC

1010 1020 1030 1040 1050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
* ** * ** ****** * ***** ** *********** ** *****
SlEPX1 original CAATCTTGGGTGATTACAGGATGATCGACAGGACTCCATTTTTCAAAGCA
SlEPX2 optimizada CTATTCTTGGAGATTACCGTATGATTGATAGGACTCCATTCTTTAAAGCC

1060 1070 1080 1090 1100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
************** ***** ***** ***** *********** *****
SlEPX1 original ATGTGGAGAGAGGCCAAGGAATGCATTTACATCGAGCAAGATGCAGACAG
SlEPX2 optimizada ATGTGGAGAGAGGCAAAGGAGTGCATCTACATAGAGCAAGATGCTGACAG

1110 1120 1130

....|....|....|....|....|....|....
***** ******** ******** ** ** ***
SlEPX1 original CAAGCACAAAGGGACATATTGGTACCATAAAATG
SlEPX2 optimizada TAAGCATAAAGGGACGTATTGGTATCACAAGATG

Secuencia del promotor Glycinin

10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter GATCCGTACGTAAGTACGTACTCAAAATGCCAACAAATAAAAAAAAAGTTGCTTTAATAA

70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter TGCCAAAACAAATTAATAAAACACTTACAACACCGGATTTTTTTTAATTAAAATGTGCCA

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter TTTAGGATAAATAGTTAATATTTTTAATAATTATTTAAAAAGCCGTATCTACTAAAATGA

190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter TTTTTATTTGGTTGAAAATATTAATATGTTTAAATCAACACAATCTATCAAAATTAAACT

250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter AAAAAAAAAATAAGTGTACGTGGTTAACATTAGTACAGTAATATAAGAGGAAAATGAGAA

310 320 330 340 350 360

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter ATTAAGAAATTGAAAGCGAGTCTAATTTTTAAATTATGAACCTGCATATATAAAAGGAAA
 Anexo II

370 380 390 400 410 420

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter GAAAGAATCCAGGAAGAAAAGAAATGAAACCATGCATGGTCCCCTCGTCATCACGAGTTT

430 440 450 460 470 480

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter CTGCCATTTGCAATAGAAACACTGAAACACCTTTCTCTTTGTCACTTAATTGAGATGCCG

490 500 510 520 530 540

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter AAGCCACCTCACACCATGAACTTCATGAGGTGTAGCACCCAAGGCTTCCATAGCCATGCA

550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter TACTGAAGAATGTCTCAAGCTCAGCACCCTACTTCTGTG>ACGTGTCCCTCATTCACCTT

610 620 630 640 650 660

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly promoter CCTCTCTTCCCTATAAATAACCACGCCTCAGGTTCTCCGCTTCACAACTCAAACATTCTC

670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|...
Gly promoter TCCATTGGTCCTTAAACACTCATCAGTCATCACCGCGGCCGCG

Secuencia Gly 3´-UTR.

10 20 30 40 50
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T AGCCCTTTTTGTATGTGCTACCCCACTTTTGTCTTTTTGGCAATAGTGCT

60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T AGCAACCAATAAATAATAATAATAATAATGAATAAGAAAACAAAGGCTTT

110 120 130 140 150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T AGCTTGCCTTTTGTTCACTGTAAAATAATAATGTAAGTACTCTCTATAAT

160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T GAGTCACGAAACTTTTGCGGGAATAAAAGGAGAAATTCCAATGAGTTTTC

210 220 230 240 250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T TGTCAAATCTTCTTTTGTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTCTTTC

260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T TTCTGAGCTTCTTGCAAAACAAAAGGCAAACAATAACGATTGGTCCAATG

310 320 330 340 350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T ATAGTTAGCTTGATCGATGATATCTTTAGGAAGTGTTGGCAGGACAGGAC

360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T ATGATGTAGAAGACTAAAATTGAAAGTATTGCAGACCCAATAGTTGAAGA

410 420 430 440

....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Gly-T TTAACTTTAAGAATGAAGACGTCTTATCAGGTTCTTCATGACTTA
 Anexo II

Secuencia sgRNA.
10 20 30 40 50
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
sgRNA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC

60 70 80
....|....|....|....|....|....|...
sgRNA TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

Secuencia Cas9
10 20 30 40 50
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGG

60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAG

110 120 130 140 150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCC

160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAAC

210 220 230 240 250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGG

260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGG

310 320 330 340 350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCC

360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAA

410 420 430 440 450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGAC

460 470 480 490 500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACA

510 520 530 540 550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAAC

560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCG
 Anexo II

610 620 630 640 650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTC

660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGA

710 720 730 740 750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCC

760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAG

810 820 830 840 850

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCG

860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATT

910 920 930 940 950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCT

960 970 980 990 1000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTT

1010 1020 1030 1040 1050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATT

1060 1070 1080 1090 1100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGC

1110 1120 1130 1140 1150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGG

1160 1170 1180 1190 1200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGC

1210 1220 1230 1240 1250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGG

1260 1270 1280 1290 1300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGA

1310 1320 1330 1340 1350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTAC

1360 1370 1380 1390 1400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCG
 Anexo II

1410 1420 1430 1440 1450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAAATCAGAAGAGACTATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATA

1460 1470 1480 1490 1500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAA

1510 1520 1530 1540 1550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTA

1560 1570 1580 1590 1600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGA

1610 1620 1630 1640 1650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGAC

1660 1670 1680 1690 1700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGA

1710 1720 1730 1740 1750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGG

1760 1770 1780 1790 1800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATC

1810 1820 1830 1840 1850

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGA

1860 1870 1880 1890 1900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAG

1910 1920 1930 1940 1950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAG

1960 1970 1980 1990 2000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGAT

2010 2020 2030 2040 2050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTA

2060 2070 2080 2090 2100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGAC

2110 2120 2130 2140 2150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGG

2160 2170 2180 2190 2200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
 Anexo II

Cas9 optimizada GGACAGTCTCCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCA

2210 2220 2230 2240 2250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTA

2260 2270 2280 2290 2300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAA

2310 2320 2330 2340 2350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGA

2360 2370 2380 2390 2400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCA

2410 2420 2430 2440 2450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCA

2460 2470 2480 2490 2500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCT

2510 2520 2530 2540 2550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGAT

2560 2570 2580 2590 2600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAG

2610 2620 2630 2640 2650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGC

2660 2670 2680 2690 2700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTG

2710 2720 2730 2740 2750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCAT

2760 2770 2780 2790 2800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAA

2810 2820 2830 2840 2850

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATT

2860 2870 2880 2890 2900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTTTCAGATTTCAG

2910 2920 2930 2940 2950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATG

2960 2970 2980 2990 3000

 Anexo II

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAA

3010 3020 3030 3040 3050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGA

3060 3070 3080 3090 3100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCG

3110 3120 3130 3140 3150

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATT

3160 3170 3180 3190 3200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGG

3210 3220 3230 3240 3250

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCC

3260 3270 3280 3290 3300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTA

3310 3320 3330 3340 3350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGA

3360 3370 3380 3390 3400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGAT

3410 3420 3430 3440 3450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAG

3460 3470 3480 3490 3500

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCAC

3510 3520 3530 3540 3550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGG

3560 3570 3580 3590 3600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAG

3610 3620 3630 3640 3650

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGC

3660 3670 3680 3690 3700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTA

3710 3720 3730 3740 3750

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGATCTCCCGAA
 Anexo II

3760 3770 3780 3790 3800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada GATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGA

3810 3820 3830 3840 3850

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada TGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCG

3860 3870 3880 3890 3900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada ACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAG

3910 3920 3930 3940 3950

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada CCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAA

3960 3970 3980 3990 4000

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Cas9 optimizada CTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAA

4010 4020 4030 4040 4050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Cas9 optimizada AGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAG

4060 4070 4080 4090 4100

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Cas9 optimizada TCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGG

4110 4120 4130 4140

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Cas9 optimizada AGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGA