CULTIVO DE LARVAS

UTILIDAD
 Las investigaciones sobre
inmunología en
parasitología también han
logrado ya la obtención de
vacunas a base de larvas
irradiadas, contra la
bronquitis verminosa de los
bovinos y ovinos.
 Estas investigaciones no
avanzan sin conocer el ciclo
del nematodo parásito y sus
estados evolutivo…
UTILIDAD
 Las especies de uncinarias presentes
 Diferencia en el poder patógeno de las especies
 Su desigual sensibilidad frente a la acción de los
diversos antihelmínticos
 Se puede establecer la cantidad de huevos de
cada grupo por gramo de materia fecal.
 Establecer el grado y tipo de contaminación larval
de
 Pastura para animales (ganado ovino, bovino, caprino, etc.)
 Cultivo alimenticio (vegetales, granos, frutas)
 Abonos en general (gallinaza, abonos orgánicos, fertilizados qm)
 Suelos
CICLO BIOLÓGICO
L1 A L2
 Strongyloides papillosus de
bovinos sale como L1 y en
1-2 días cambia a L2
 L1 se alimenta de
sustancias contenidas en
las materias fecales,
bacterias y agua.
 Se mueve bastante, pero no
tiene la facultad de trepar a
los pastos.
L1 A L2
 Después de un breve período de inmovilidad
(algunas horas), especie de letargo, la larva sufre
una primera muda y cambia su envoltura,
transformándose en larva de segundo estado.
 Su morfología es muy semejante a la larva
primera, solamente que es mucho más grande y
su esófago es menos rabditiforme, pero con
aparato valvular bien visible.
 Se alimenta en forma similar a la
L 1.
L2 A L3
 Después de 2-3 días, las larvas L 2 sufren una
nueva muda convirtiéndose en larvas de tercer
estado o larvas infectantes (L 3).
 Conservan la envoltura de la L 2, la que le
sirve de protección contra los factores
externos: frío, calor, sequedad, etc.
 L 3 no se alimenta del mundo externo,
consumiendo en cambio sus reservas
contenidas en las células intestinales.
 Por esta razón las larvas jóvenes son más
oscuras que las viejas, en las que las
granulaciones alimenticias de reserva han
desaparecido.
 Las larvas infectantes son muy activas,
pudiendo trepar por los tallos y subir a las
hojas de pasto.
 En los cultivos artificiales se las puede
encontrar en las gotas de agua condensada.
 CARACTERÍSTICAS
DIFERENCIALES
 La envoltura de la segunda muda ("vaina"), nos
sirve como punto de referencia para la
clasificación de las larvas infectantes de
nematodos gastrointestinales de los rumiantes.
 Los orificios (boca, ano) de la larva propiamente
dicha están encerrados por la "vaina”, pero son
igualmente visibles y nos sirven de puntos de
referencia para la clasificación y diferenciación.
 La cavidad bucal de la L 3 es menor que la de L
2, siendo característica para ciertas especies o
faltando en otras (por ej., en Trichostrongylus).
 El esófago de la L3 es filiforme.
 Las células intestinales dorsales y ventrales, de
diferentes formas (triangulares, rectangulares o
pentagonales) son bien diferenciables. La
cantidad de éstas, es característica para cada
especie.
 Llamaremos "cola de la vaina larval" a la
distancia que media entre el ano de la larva y la
punta de la cola de la vaina.
CULTIVO DE LARVA
 Principio: permitir que maduren y eclosionen los huevos y
que desarrollen las larvas, evolucionando hasta L3.
 Tres factores:
 Humedad
 Temperatura adecuada
 Oxigenación.
 Las materias fecales demasiado secas deben humedecerse,
las demasiado húmedas o diarreicas deben consolidarse
usando:
 Carbón vegetal
 Musgo estéril
 Materia fecal bovina u ovina previamente desecada, esterilizada
a 140-150° C y posteriormente pulverizada.
 Agua estéril sin cloro (de ser necesario)
CULTIVO DE LARVAS

 Métodos
 Corticelli
y Lai
 Harada-Mori

 Carbón vegetal

 Arena

 Morán

 Baermann

 Agar nutritivo (como el extracto de carne)

PROCEDIMIENTO DE CORTICELLI Y LAI
 Usa dos cajas de Petri con agua a altura de 1 cm,
aproximadamente.
 La caja menor va sin tapa, la grande tapada para
formar una "cámara húmeda“
 Se coloca en estufa oscurecida, a temperatura de 24-
27° C durante 7-8 días, o en temperatura ambiente
(10-15° C) durante diez.
 Diariamente se destapa
la caja grande durante
1-2 horas para airear
el cultivo.
RECUPERACIÓN DE LAS LARVAS
 Transcurridos 8-10 días, se invierte la
caja chica con cultivo dentro de la
grande y se deja más o menos doce
horas, término durante el cual la
mayoría de las larvas pasan al agua.
 Por sedimentación y/o centrifugación
se concentran las larvas.
 Observamos que con este método se
recupera un mayor porcentaje de larvas
y además se obtiene una suspensión
de ellas más limpia, libre de partículas
orgánicas y de tierra.
 La mayoría usa el método de Baerman
para la recuperación de las larvas
CUIDADOS!!!
 El material en examen debe ser lo más limpio posible,
desprovisto de partículas extrañas
 El materia fecal recolectada del suelo o pasto están siempre
contaminados con larvas y nematodos de vida libre.
 La purificación de esos materiales contaminados se
consigue volcando el material en capa fina, sobre papel de
filtro o secante.
 Los nematodos saprófitos y las larvas de vida libre,
expuestos durante 3 a 5 horas a temperatura de 35° C, en
su mayoría mueren, mientras que las larvas infectantes de
nematodos gastrointestinales resisten y pueden ser
recuperadas con el sistema de Baermann.
 Conviene utilizar para los exámenes cultivos frescos, pues
las larvas mantenidas mucho tiempo en frío, presentan
deformaciones tanto en su estructura interna como en sus
proporciones, que dificultan el diagnóstico.
INMOVILIZACIÓN DE LAS LARVAS
 Para poder apreciar los detalles morfológicos de las larvas,
se usan dos métodos:
 Por calentamiento cuidadoso del material sobre el portaobjeto,
pasando la suspensión de larvas sobre la llama,
 Ellas mueren con su cuerpo estirado, lo que facilita las
mediciones, pero en cambio se altera un poco la estructura por el
calor.
 Mediante el tratamiento con solución yodada (Yodo 2 gr, Yoduro
de potasio 4 gr, agua 100 ml), las larvas mueren, pero quedan
algo curvadas; sin embargo, la coloración de contraste que ellas
toman, facilita la observación de los detalles morfológicos y
permite diferenciar a las larvas infectantes, de los nematodos y
larvas de vida libre.
 Las primeras, protegidas por la vaina de la segunda muda, se
conservan más claras, en cambio los últimos se colorean
íntegramente de color marrón claro u oscuro.
OBTENCIÓN DE LARVAS PURAS
 Con la finalidad de infectar, por ejemplo, animales de
experimentación (evaluación de antihelmínticos,
estudios inmunológicos, etc.),
 Partir de cultivos de huevos obtenidos de hembras
maduras de dicha especie.
 Estas se lavan bien y se dejan en solución fisiológica en
estufa de 35° C, aproximadamente por uno o dos días.
 Se provoca la maduración de los huevos y ovoposición.
 Las hembras son disecadas y los huevos contenidos en
ellas junto con los obtenidos anteriormente, se ponen en
cultivo en materia fecal esterilizada, desecada y molida, por
espacio de 8 a 10 días a 24-25° C.
CLASIFICACIÓN DE LARVAS DE GANADO BOVINO Y OVINO

 Por el largo de la cola de la vaina larval:

 Larvas con cola de vaina corta
 Trichostrongylus (axei, colubriformis y vitrinus) y
Ostertagia (circumcincta y ostertagi)
 Larvas con cola de vaina mediana
 Haemonchus (contortus y placei) y Cooperia (oncophora,
punctata y ssp.)
 Larvas con cola de vaina larga
 Nematodirus(spathiger, battus, fillicolis y helvetianus),
Oesophagostomum (radiatum y venulosum) y Chabertia
ovina
L 3 de Strongyloides papillosus y Bunostomum spp.
STRONGYLOIDES PAPILLOSUS

 Tamaño pequeño (± 600μ)

 Esófago filiforme largo (1/3 de
cuerpo)
 Falta de vaina larval

 Terminación trifurcada de la cola

LARVA DE BUNOSTOMUM SPP.
 Es una de las más pequeñas L 3
 B. trigonocephalum 507-678 μ
 B. phlebotomum 443-647 μ
 Contiene dieciséis células intestinales poco
evidentes
 Cavidad bucal en forma de embudo con
engrosamiento cuticular.
 Esófago bastante largo, marcadamente
bulboso.
 La cola de la vaina larval muy fina, larga en
proporción con el largo total de la larva.
En bovinos
Tamaño
Ad – Ancylostoma duodenale;
Na – Necator americanus;
T - Trichostrongylus spp;
Ss – Strongyloides spp a – post end of S. stercoralis; b - post end of S. fuelleborni;
Td – Ternidens deminutus;
Rh – Rhabditis (Rhabditella) spp;
O sp - Oesophagostomum spp.

n – nerve ring; g – genital pore; j - buccal canal junction; mh – mouth spicule

DETALLES TÉCNICOS… ECDISIS
 La forma del extremo posterior de la larva
propiamente dicha (cola larval) nos permite
en muchos casos llegar a la clasificación de
la especie dentro de un género.
 Para poder observar bien dicha terminación
a veces es necesario provocar la ecdisis de
las larvas (despojarlas de su
 envoltura protectora o su vaina).
 Usar una solución de hipoclorito de sodio al
5 %, poniendo una gota sobre el preparado.
 A los uno a dos minutos las larvas
comienzan a abandonar sus envolturas.
HARADA-MORI
 Para uncinarias, Strongyloides, Trichostrongylus,
trematodos y cestodos
 Materiales
 Papel filtro
 Tubo de ensayo
 Agua destilada estéril
 Procedimiento:
 Homogenizar y filtrar las heces y untar con
bajalenguas el papel filtros con heces (10 cm)
 Introducir en el tubo con 5 ml de agua, y sobre
una gradilla incubar por 3 días.
 Examinar el sedimento
ARENA
CARBÓN VEGETAL (DANCESCU)

 Carbón vegetal molido o arena estéril en plato

Petri.
 Mezclar las heces y humedecer sin excesos. Tapar
el plato e incubar por 7 días, agregando agua de
ser necesario.
 Se buscan las larvas en las gotas de agua
condensadas en la tapa o donde haya lìquido
acumulado
 A los 3 días se encuentran larvas de Strongyloides
 A los 6 días se encuentran larvas de uncinarias
MORÁN MODIFICADO
CULTIVO DE LARVAS EN AGAR
 Para Strongyloides y uncinarias
 2 g de heces en plato Petri y agar nutritivo
 Incubar por 2 días a temperatura ambiente y la
caja sellada
 Se observa la huella macroscópica en forma de
canales del desplazamiento
de las larvas
 Agregar formol al 10% para
lavar la superficie, recoger el
líquido, sedimentarlo y
examinar bajo el microscopio.
BAERMAN

 8 a 10 g de material (heces, suelos, abono,

pasto, vegetales, etc).
MEDIOS DE CULTIVOS
 No se usa para fines diagnósticos, sino para
obtener parásitos vivos (trofozoitos) con fines
investigativos
 Cultivos axénicos (sin bacterias) se usan para
obtener antígenos
 Métodos
 Agar sangre para amebas
 Novy, McNeal y Nicole (NNN) (Leishmania y
Trypanosoma)
 PBS (cultivo axénico)
 Solución Ringer (cultivo axénico)
 Medio RPMI (cultivo axénico)
NOVY, MCNEAL Y NICOLLE (NNN)
 Para el aislamiento de Leishmania y T. cruzi
 Compuesto por
 Agar 14 g
 NaCl 6 g
 Agua destilada 9 ml
 Se prepara 6 ml del agar en un tubo inclinado, se esteriliza y
se deja enfriar a 48ºC.
 Se agrega 1-2 ml de sangre desfibrinada de conejo
 Se inclinan los tubos para enfriarlos rápidamente en un
congelador (para que se formen gotas de condensación en
que crecerán los parásitos)
 Control de esterilidad por 24 hras antes de sembrar
 Agregar si quiere, Penicilina
 Revisar a los 6 días para buscar parásitos
PBS 10 X (BUFFER SALINO DE FOSFATOS)
 Para nematodos adultos
 Extracción de antígenos de E/S
 Contiene:
 80 g de NaCl,
 2g de KH2PO4
 29 g de Na2HPO4. 12H2O
 2 g de KCl
 Llevar a un volumen final de 1000 ml.
 Esterilizar en autoclave
SOLUCIÓN RINGER

 Para nematodos adultos

 Extracción de antígenos de E/S
 8.5 g de NaCl
 0.2 g de CaCl2

 0.2 g de KCl

 1000 ml de H2O2 destilada